CN113846121B - 一种番茄侧枝发生的调控方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于植物基因工程技术领域，提供了一种番茄侧枝发生的调控方法，包括一种番茄SlERF025基因，其核苷酸序列如Seq No.1所示，还包括以下步骤：步骤（1）：番茄SlERF025基因的克隆；步骤（2）：目的基因片段的回收；步骤（3）：将目的基因连接到表达载体；步骤（4）：重组质粒转化大肠杆菌；步骤（5）：农杆菌介导番茄遗传转化。本发明所提供的一种番茄侧枝发生的调控方法为调控植物分枝方面的应用，是将SlERF025基因利用根癌农杆菌介导的方式转入番茄植株，观察转基因植株与野生型植株的表型差异并进行对比和生理指标的测定，同时研究该基因对植物分枝的控制，探索关于调控植物分枝的新方法。

Description

一种番茄侧枝发生的调控方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种番茄侧枝发生的调控方法。
背景技术
随着经济的迅速发展与技术的不断更新，人们对蔬菜水果等园艺作物的需求与品质要求也日益增高，同时番茄(Solanum lycopersicum)作为餐桌上最常见的几种蔬菜之一，因具有比较独特的口感与很高的营养价值，一直深受群众喜爱，且其品种也不断进行优化改良。影响番茄产量的因素有许多，传统农业常常通过改进种植技术，如提供肥厚的土壤、适宜的温度光照、充足的水分肥料、合理的修剪方式等，获得更高品质与产量的番茄。
分枝的数量是决定植物株型的重要农艺性状，并且植物分枝的数量角度与植物产量的形成以及对逆境的抵抗强弱方面有着不可分割的联系，分枝的数目影响植物的经济指标，改变番茄分枝数目，对今后改良番茄株型和提升番茄产量具有重要意义。
分枝数目受到遗传、环境、植物激素等因素的影响，植物分枝是一个重要可塑的植物发育过程。植物的分枝来源于叶片的叶腋处，首先在叶腋处形成腋芽，然后激活产生分枝。随着分子生物学的不断发展，已经可以从分子层面对分枝机理进行研究，迄今为止，在拟南芥、水稻等模式作物中都分离鉴定出与分枝有关的基因。
ERF(Ethylene-responsive factor)是一类广泛存在于植物中具有AP2特征结构域的乙烯应答转录因子，能与GCC-box(保守序列为AGCCGCC)特异性结合，在乙烯响应中发挥着重要的作用。随着对ERF转录因子不断深入研究发现，ERF转录因子在植物生长发育过程主要与非生物逆境胁迫有关系，但在分枝方面研究较少。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种番茄侧枝发生的调控方法，旨在解决上述问题。
本发明实施例是这样实现的，一种番茄侧枝发生的调控方法，包括以下步骤：
(1)番茄SlERF025基因的克隆，番茄SlERF025基因的核苷酸序列如Seq No.1所示；
(2)目的基因片段的回收；
(3)将目的基因连接到表达载体；
(4)重组质粒转化大肠杆菌；
(5)根癌农杆菌介导遗传转化。
进一步的技术方案，所述步骤(1)的具体操作步骤如下：
取野生型番茄植株叶片的总RNA，反转录出cDNA的第一条链，以获得的cDNA为模板，扩增全长，引物为：
SlERF025-L：TACGAACGATACTCGACCCCATGGCTGCTTATCATTTTAATG，SlERF025-R:CTAGAGTCGACGGATCCCCCTGGATAACCCCAGAGACTATCT进行PCR扩增(20μL)。
进一步的技术方案，所述步骤(2)的具体操作步骤如下：
a.将上一步骤中的PCR产物在150V电压条件下进行琼脂糖凝胶电泳；
b.紫外光照射，观察琼脂凝胶中的条带，将所需目的基因条带切下，放入离心管中，称量、加入同体积的PN溶液，50℃水浴将凝胶进行融化；
c.柱平衡：向吸附柱CA2中加入500μL的平衡液，放入离心机，转速为12000r/min，离心1min后倒掉废液；
d.将第二步骤中获得的溶液加入吸附柱CA2中，于室温静置2min，以12000r/min的转速离心1min，倒掉废液；
e.向吸附柱CA2中加600μL漂洗液PW，放入离心机，12000r/min离心1min，倒掉废液；
f.重复操作步骤5；
g.将吸附柱放于收集管，12000r/min离心2min，除去多余的漂洗液，室温晾干；
h.将吸附柱放到一个新的离心管，向吸附柱中央加入40μL ddH2O，静置2min后，12000r/min离心2min洗脱DNA。
进一步的技术方案，所述步骤(3)的具体操作为：采用同源重组的原理，用限制性内切酶SmaI酶切pCambia1300-YFP载体，利用无缝克隆技术将目标基因片段连接到pCambia1300-YFP载体上，构建过表达载体。
进一步的技术方案，所述步骤(4)的具体步骤如下：
i.取低温-80℃保存的50μL Trans1-T1感受态细胞，将其置于冰上进行融化；
ii.打开超净工作台进行紫外消毒后，在上面把2μL的重组产物加入到感受态细胞中，轻轻拨打离心管壁混匀，冰上静置30min；
iii.42℃水浴30s，之后迅速转移到冰上冷却2min；
iv.加入400μL的LB液体培养基，在37℃摇床中200r/min培养1h；
v.将混合液12000rpm离心1min，留取50μL上清液左右，菌液重悬后均匀地涂在含有Kan抗性的LB固体培养基上，37℃静置培养一夜
vi.挑取培养好的大肠杆菌菌落，进行菌落PCR，通过琼脂糖凝胶电泳验证，选取验证为阳性的菌落，重新加入含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃，12000r/min，过夜培养，将剩余菌液与约25％浓度甘油混合，保存于-80℃冰箱中备用。
进一步的技术方案，所述步骤(5)的具体操作步骤如下：
1)取-80℃低温保存的农杆菌感受态，处于冰上进行融化；
2)在超净工作台上，取50μL感受态细胞加入5μL的重组产物，拨打离心管壁混匀，静置于冰上5min，静置于液氮5min，静置于42℃水浴5min，再置于冰上5min；
3)加入500μL LB液体培养基，在28℃摇床中振荡培养3～5h，放入离心机，12000rpm离心1min，取大约100μL上清液重悬菌块涂于含利福平和Kan的LB平板上，放于28℃培养箱培养2d，选取阳性菌甘油保存，存放于-80℃冰箱；
4)进行菌落PCR，通过琼脂糖凝胶电泳验证，选取验证为阳性的菌落。
进一步的技术方案，所述PCR扩增的反应条件为94℃，3min；94℃，25s；55℃，25s；72℃，15s；72℃，5min。
本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法为调控植物分枝方面的应用，是将SlERF025基因通过农杆菌介导的方式转入番茄植株，观察转基因植株与野生型植株的表型差异并进行对比和生理指标的测定，同时研究该基因对植物分枝的控制，探索关于控制植物分枝的新方法。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的胶回收琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的大肠杆菌菌落PCR检测琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的农杆菌菌落PCR检测琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的转基因植株PCR检测电泳图；
图5为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的不同过表达株系中SlERF025基因的表达情况；
图6为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的野生型番茄植株与SlERF025过表达植株主视图；
图7为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的野生型番茄植株与SlERF025过表达植株俯视图；
图8为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的野生型番茄植株与SlERF025过表达植株叶片比较；
图9为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的野生型番茄植株与SlERF025过表达植株侧枝比较；
图10为本发明实施例提供的一种番茄侧枝发生的调控方法中的SlERF025不同过表达株系的株高情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
一、植物材料的播种和培养条件
在垫有滤纸的培养皿中加入适量蒸馏水，将种子均匀放于培养皿中，在黑暗中培养2-3d进行催芽处理。出芽后播在由泥炭土和蛭石(体积比为3：1)混合作为基质的营养钵中，顶部覆盖厚度适中的基质，并放置在培养室中培养，培养温度25/20℃(昼/夜)，光周期16/8h光暗循环，光照强度600μmol.m-2·s-1，用1g营养肥加1L蒸馏水配制营养液进行培养。
二、转基因植株的获得
(一)植物过表达载体的构建
1.番茄SlERF025基因的克隆
取野生型番茄植株叶片的总RNA，反转录出cDNA的第一条链，以获得的cDNA为模板，扩增全长。引物为：
SlERF025-L：TACGAACGATACTCGACCCCATGGCTGCTTATCATTTTAATG，
SlERF025-R:CTAGAGTCGACGGATCCCCCTGGATAACCCCAGAGACTATCT进行PCR扩增(20μL)，
扩增条件如下：
Figure BDA0003352950890000061
Figure BDA0003352950890000071
反应条件为：
Figure BDA0003352950890000072
2.目的基因片段的回收
(1)将上一步骤中的PCR产物在150V电压条件下进行琼脂糖凝胶电泳；
(2)紫外光照射，观察琼脂凝胶中的条带，将所需目的基因条带切下，放入离心管中，称量、加入同体积的PN溶液，50℃水浴将凝胶进行融化；
(3)柱平衡：向吸附柱CA2中加入500μL的平衡液，放入离心机，转速为12000rpm，离心1min后倒掉废液；
(4)将第二步骤中获得的溶液加入吸附柱CA2中，于室温静置2min，以12000r/min的转速离心1min，倒掉废液；
(5)向吸附柱CA2中加600μL漂洗液PW，放入离心机，12000r/min离心1min，倒掉废液；
(6)重复操作步骤5；
(6)将吸附柱放于收集管，12000r/min离心2min，除去多余的漂洗液，室温晾干；
(7)将吸附柱放到一个新的离心管，向吸附柱中央加入40μL ddH2O，静置2min后，12000r/min离心2min洗脱DNA。
3.将目的基因连接到表达载体
采用同源重组的原理，用限制性内切酶SmaI酶切pCambia1300-YFP载体，利用无缝克隆技术将目标基因片段连接到pCambia1300-YFP载体上，构建过表达载体。
4.重组质粒转化大肠杆菌
(1)取低温-80℃保存的50μL Trans1-T1感受态细胞，将其置于冰上进行融化；
(2)打开超净工作台进行紫外消毒后，在上面把2μL的重组产物加入到感受态细胞中，轻轻拨打离心管壁混匀(不可以涡旋)，冰上静置30min；
(3)42℃水浴30s，之后迅速转移到冰上冷却2min；
(4)加入400μL的LB液体培养基，在37℃摇床中200r/min培养1h；
(5)将混合液12000r/min离心1min，，留取50μL上清液左右，菌液重悬后均匀地涂在含有Kan抗性的LB固体培养基上。37℃静置培养一夜；
(6)菌落PCR验证：
挑取培养好的大肠杆菌菌落，进行菌落PCR，通过琼脂糖凝胶电泳验证，选取验证为阳性的菌落。重新加入含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃，12000r/min，过夜培养。将剩余菌液与约25％浓度甘油混合，置于-80℃冰箱中，保存备用。
5.农杆菌介导遗传转化
(1)取-80℃低温保存的农杆菌感受态，处于冰上进行融化。
(2)在超净工作台上，取50μL感受态细胞加入5μL的重组产物，拨打离心管壁混匀，静置冰上5min、液氮5min、42℃水浴5min、再置于冰上5min。
(3)加入500μL LB液体培养基，在28℃摇床中振荡培养3～5h。放入离心机，12000rpm离心1min，取大约100μL上清液重悬菌块涂于含利福平和Kan的LB平板上，放于28℃培养箱培养2d。
选取阳性菌甘油保存，存放于-80℃冰箱。
(4)菌落PCR验证：
进行菌落PCR，通过琼脂糖凝胶电泳验证，选取验证为阳性的菌落。
(二)转基因阳性苗的鉴定
取叶片样品提取DNA，DNA的提取采用2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液。引物为：
35SF：GACGCACAATCCCACTATCC；
SlERF025-R：CTAGAGTCGACGGATCCCCCTGGATAACCCCAGAGACTATCT；
进行PCR扩增，PCR反应体系(10μL)如下：
Figure BDA0003352950890000091
反应条件为：
Figure BDA0003352950890000101
PCR结束后，按1g：100mL的比例配制琼脂糖和TAE缓冲液，转基因载体作为阳性对照，以野生型番茄作为阴性对照。与阳性对照有相应的条带的即为阳性植株，挑选阳性植株保留。
三、野生型番茄植株与过表达植株SlERF025表达情况
利用实时荧光定量技术检测SlERF025在野生型番茄植株与过表达番茄植株SlERF025的表达情况。每一组做3次生物学重复。根据目的基因表达的结果，分析该基因的表达情况。反应体系以及反应条件如下：
根据上表进行加样，放人qPCR仪器中，以番茄SlActin作为内参基因，程序为：
Figure BDA0003352950890000102
预变性：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。熔解曲线程序为95℃5s,60℃1min，95℃15s，50℃30s。每个样品3次重复，待反应结束后分析荧光值变化曲线。
四、过表达SlERF025植株与野生型植株表型观察
在植株生长过程中发现，处在同一生长时期的野生型植株和SlERF025转基因植株在株高方面存在明显差异，野生型植株显著高于SlERF025过表达植株。同一批次播种的两组植株生长约三个月左右，此时的植株高度几乎不再变化趋于稳定，此时对两组植株进行表型观察，测量其株高并且观察其分枝情况。每组选取相同生长环境下长势一致的番茄植株，株高测量，单位为cm。
通过表型观察可以发现，过表达SlERF025后植株明显矮化、株高降低，叶片与野生型相比叶色更深，叶片深绿且较厚，成花率显著低于野生型植株。对株高进行统计分析，野生型的株高平均值为8.80cm，转基因植株不同株系分别为3.10cm、3.46cm、4.60cm、3.15cm、5.63cm、5.50cm，均明显矮于野生型。过表达植株分枝数目明显多于野生型植株，叶片大小明显小于野生型植株，植株节间明显短于野生型植株。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003352950890000121
Figure BDA0003352950890000131
Figure BDA0003352950890000141
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种番茄侧枝发生的调控方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctgctt atcattttaa tgacaattct ccttcattag aaaatctttc acccactggg 60
ggaggaagta gcactaggca tcccaatttc agaggaattc gacagaggaa tgggaaatgg 120
gtctccgaaa ttcgcgagcc tcgaaagacc acacgtatat ggttaggtac ttttcccatt 180
cctgaaatgg cagctgtcgc ttacgatgtt gcagctttgg cattaaaagg tcctgatgcg 240
caattaaact ttcctgatcg tgcatactcc taccctgtcc ctgcttctct gtcagccgca 300
gatattcgta ctgcggctgc taatgctgct gctgctagag cacctccttt gtcagaaatc 360
aatacagcag caggaggagg acaagggcaa gagtttgtgg acgaagagga aatatttgga 420
atgccgaaat tgcttgatga tatggcagag gcaatgcttg ttagcccgcc aaggatgcat 480
cagtacgacg aatcacctga aaactctgat gcagatagtc tctggggtta tccatga 537
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Ala Tyr His Phe Asn Asp Asn Ser Pro Ser Leu Glu Asn Leu
1 5 10 15
Ser Pro Thr Gly Gly Gly Ser Ser Thr Arg His Pro Asn Phe Arg Gly
20 25 30
Ile Arg Gln Arg Asn Gly Lys Trp Val Ser Glu Ile Arg Glu Pro Arg
35 40 45
Lys Thr Thr Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Ile Pro Glu Met Ala
50 55 60
Ala Val Ala Tyr Asp Val Ala Ala Leu Ala Leu Lys Gly Pro Asp Ala
65 70 75 80
Gln Leu Asn Phe Pro Asp Arg Ala Tyr Ser Tyr Pro Val Pro Ala Ser
85 90 95
Leu Ser Ala Ala Asp Ile Arg Thr Ala Ala Ala Asn Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Arg Ala Pro Pro Leu Ser Glu Ile Asn Thr Ala Ala Gly Gly Gly Gln
115 120 125
Gly Gln Glu Phe Val Asp Glu Glu Glu Ile Phe Gly Met Pro Lys Leu
130 135 140
Leu Asp Asp Met Ala Glu Ala Met Leu Val Ser Pro Pro Arg Met His
145 150 155 160
Gln Tyr Asp Glu Ser Pro Glu Asn Ser Asp Ala Asp Ser Leu Trp Gly
165 170 175
Tyr Pro

Claims (6)

1.一种番茄侧枝发生的调控方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：番茄SlERF025基因的克隆，番茄SlERF025基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤（2）：目的基因片段的回收；
步骤（3）：将目的基因连接到植物表达载体；
步骤（4）：重组质粒转化大肠杆菌；
步骤（5）：农杆菌介导遗传转化。
2.根据权利要求1所述的番茄侧枝发生的调控方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体操作步骤如下：
提取野生型番茄植株叶片的总RNA，反转录出cDNA的第一条链，以获得的cDNA为模板，扩增全长，引物为：
SlERF025-L：TACGAACGATACTCGACCCCATGGCTGCTTATCATTTTAATG，SlERF025-R: CTAGAGTCGACGGATCCCCCTGGATAACCCCAGAGACTATCT进行PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的番茄侧枝发生的调控方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作步骤如下：
a.将上一步骤中的PCR产物在150V电压条件下进行琼脂糖凝胶电泳；
b.紫外光照射，观察琼脂凝胶中的条带，将所需目的基因条带切下，放入离心管中，称量、加入同体积的PN溶液，50℃水浴将凝胶进行融化；
c.柱平衡：向吸附柱CA2中加入500 μL的平衡液，放入离心机，转速为12000 r/min，离心1 min后倒掉废液；
d.将第二步骤中获得的溶液加入吸附柱CA2中，于室温静置2 min，以12000 r/min的转速离心1 min，倒掉废液；
e.向吸附柱CA2中加600 μL漂洗液PW，放入离心机，12000 r/min离心1 min，倒掉废液；
f.重复操作步骤e；
g.将吸附柱放于收集管，12000 r/min离心2 min，除去多余的漂洗液，室温晾干；
h.将吸附柱放到一个新的离心管，向吸附柱中央加入40 μL ddH2O，静置2 min后，12000r/min离心2 min洗脱DNA。
4.根据权利要求1所述的番茄侧枝发生的调控方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体操作为：采用同源重组的原理，用限制性内切酶SmaI酶切pCambia1300-YFP载体，利用无缝克隆技术将目标基因片段连接到pCambia1300-YFP载体上，构建过表达载体。
5.根据权利要求1所述的番茄侧枝发生的调控方法，其特征在于，所述步骤（4）的具体步骤如下：
i.取低温-80℃保存的50 μL Trans1-T1感受态细胞，将其置于冰上进行融化；
ii.打开超净工作台进行紫外消毒后，在上面把2 μL的重组产物加入到感受态细胞中，轻轻拨打离心管壁混匀，冰上静置30min；
iii.42℃水浴30 s，之后迅速转移到冰上冷却2 min；
iv.加入400 μL的LB液体培养基，在37℃摇床中200 r/min培养1 h；
v.将混合液12000 rpm离心1min，留取50 μL上清液，菌液重悬后均匀地涂在含有Kan抗性的LB固体培养基上，37℃静置培养过夜；
vi. 挑取培养好的大肠杆菌菌落，进行菌落PCR，通过琼脂糖凝胶电泳验证，选取验证为阳性的菌落，重新加入含有Kan抗性的LB液体培养基中，37℃，12000 r/min，过夜培养，将剩余菌液与30%浓度甘油混合，保存于-80℃冰箱中备用。
6.根据权利要求2所述的番茄侧枝发生的调控方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为94℃，3min；94℃，25s；55℃，25s；72℃，15s；72℃，5min。
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