CN110747262A - 谷子在干旱胁迫下h2s处理后dna甲基化水平的变化检测方法 - Google Patents

谷子在干旱胁迫下h2s处理后dna甲基化水平的变化检测方法 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体为谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，该方法包括以下步骤：提取谷子基因组DNA，获得DNA提取液；对样本DNA做甲基化修饰；酶切与连接；扩增与纯化和银染等多个步骤，该方法具有方便、快速、无污染，非常灵敏的特点，可用于多种农业植物的检测，同时还包括植物叶片、根茎和果实中DNA；尤其可对谷子进行基因学检测；同时本方法中采用的扩增、酶切和银染等步骤所需要的试剂和设备的成本低，使得检测所需的费用降低。

Description

谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法。
背景技术
谷子为二倍体C4禾本科植物，与青狗尾草具有较近的亲缘关系。谷子最早发现于中国黄河流域附近，栽培历史有8700多年，为最古老的传:统栽培农作物之一。谷子适宜在干旱和半干旱地区栽种，是亚洲重要的粮食作物和饲料，对于像中国和印度这样的人口大国尤其重要。
谷子是一种优异的抗旱资源,特别是谷子已完成全基因组测序其基因组大小约为510MB，基因组序列相对较小，且重复序列少、基因高度保守，并且有一些转录组测序也已完成，为功能基因的研究提供了良好条件。北方旱区谷子经过长期栽培与驯化，其耐旱性增强、水分利用率升高，并且形成了对干旱和半干早环境的适应机制。因此，谷子研究抗旱分子机制和抗旱基因工程方面具有重要价值，对农作物生产的发展具有非常重要的意义。
植物在逆境胁迫下往往会引起DNA甲基模式的变异，甲基化模式的改变会成功的启动相关胁迫基因的表达、激活某些相关转座子的活性以及调控启动子区域开关，以增强植物抵抗不良环境的能力，并且这种甲基化的变异可以通过细胞分裂的方式遗传给下一代，这些在水稻、拟南芥以及高梁中得到了证明。经过长年的驯化，DNA甲基化变异可以影响植株的高矮、叶子的形状、开花的时间等，从而通过表型的改变适应植株此时的生存条件。
在逆境胁迫中干旱胁迫最为普遍，并且对植物的伤害最大。干旱胁迫也会:对DNA甲基化发生变化，最终调节干旱胁迫相关基因的表达，有研究表明，在水稻中，降低叶和根的甲基化程度有利于激活基因的表达，促使水稻适应干旱环境而在豌豆中，干旱胁迫会使基因组胞嘧啶发生超甲基化。这表明了甲基化变异在抗旱研究中存在潜在的应用价值。在抗旱性育种等研究中可利用DNA甲基化的多态性实现对作物的遗传改良。在研究中，可以利用改变特定的DNA位点，使其发生甲基化或者是去甲基化形成相应的突变体，可能创造出具有抗旱性的新种质。因此，近年来科学家对于干旱胁迫下的表观遗传学机制研究更加迫切，期望能找到植物抗旱的表观基因，对作物的抗早性进行改良，提高作物的抗旱能力。
目前，定量检测甲基化的方法一般采用荧光定量PCR法，这种方法先用甲基化修饰处理待测DNA片段，再用特异性的引物和Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的DNA。但是一种探针通常只包含一个CpG位点，需要通过不同荧光素标记的探针，才可以检测多个位点的甲基化水平。而且荧光标记的探针费用较为昂贵，且受较多因素影响，检测的步骤复杂，为此提出一种能够快速检测甲基化变化的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案来实现：
一种谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，该方法包括以下步骤：
S1、提取谷子基因组DNA，获得DNA提取液；
S2、对样本DNA做甲基化修饰；
S3、酶切与连接：利用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ两组限制性内切酶进行剪切，剪切后在8℃的条件下与人工双链接头连接，获得扩增的DNA模板；
S4、扩增与纯化：对DNA模板进行PCR扩增，对扩增后的产物进行电泳；
S5、银染：电泳结束后，将大小玻璃板撬开，将大板放入已预冷的10％冰醋酸中进行固定，在摇床上震荡50分钟后，将玻璃板放入双蒸水中震荡2次，每次2分钟，然后将玻璃板放入已预冷的硝酸银溶液中进行染色，在摇床上震荡20分钟后，立即将染色后的玻璃板放入双蒸水中漂洗5-10秒，迅速取出放入预冷的碳酸钠溶液中进行显影，在摇床上震荡直到条带已全部显现并且条带清晰时，则可以终止显影；终止显影是将板放入10％冰醋酸中就可以完成；
S6、记带及变异条带的回收：对引物组合进行筛选，选择条带多且清晰的条带进行最后的跑板实验，胶板上的每一条带即代表样本的一个CCGG位点，对于每一DNA样品来说，CCGG位点被切开标记为“1”，如果没有被切开，则标记为为“0”，注意的是记带时要挑选清晰明显的条带；最后将发生变异的条带进行切割回收,放入1XTE中冷冻保存；以作为连接转化的DNA模板；
S7、变异片段的连接转化和测序；
S8、将变异条带测序完成后，将测序结果放入BioEdit Sequence AlignmentEditor软件进行分析，首先将载体和引物的序列找到并删除，即可得到变异条带完整序列；
S9、通过检索数据库，得到的变异序列通过blastN对其在谷子全基因组中进行探寻和定位，再将变异序列通过blastX对其进行同源性蛋白的探寻与分析。
作为本发明优选的技术方案，在步骤1中所采用的DNA提取方法为改良的CTAB法提取基因组DNA，在DNA提取后，用1％的琼脂糖凝胶检测提取的谷子DNA质量，再采用NanoDrop仪检测提取的DNA的浓度和纯度，剩余的DNA置于-20℃冰箱中保存。
作为本发明优选的技术方案，在步骤2中所述的DNA甲基化是将样本DNA中非甲基化的胞嘧啶转化为其他种类的碱基。
作为本发明优选的技术方案，在步骤4中所采用的电泳为5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
作为本发明优选的技术方案，在步骤7所述的连接转化是将DH5a感受态细胞放置于冰上融化；按连接体系和感受态细胞之比1:10进行转化反应，此过程需要用已预冷的枪头轻轻吸打感受态细胞，使其得到充分混匀，放置冰上孵育30分钟；然后将0.2ml离心管放入42C水浴锅进行水浴，其间不可摇动，精确热激90秒后，放入冰水混合物中4-5分钟；将离心管中的反应液转移到预先准备好的装有300ul不含有Amp的LB液态培养基的离心管中，在37C、150rpm的培养箱中摇动1小时，让感受态细胞得以复苏；取上步菌液150ul涂平板，此培养基为含有Amp的LB固体培养基，室温放置10分钟后再倒置培养，目的为使菌液完全被培养基吸收；在37C的条件下，进行培养12小时；最后用连接转化专用引物M13-47对培养好的单菌落进行扩增检测，通过对PCR产物大小的估测，检验载体是否连接在目的片段。
作为本发明优选的技术方案，在步骤7所述的测序是将检测成功的单菌落用牙签挑取到含有Amp的500ulLB液态培养基中，在37C、150rpm的条件下，摇菌液12小时后送去生物公司完成变异序列的测序工作。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，该方法具有方便、快速、无污染，非常灵敏的特点，可用于多种农业植物的检测，同时还包括植物叶片、根茎和果实中DNA；尤其可对谷子进行基因学检测；同时本方法中采用的扩增、酶切和银染等步骤所需要的试剂和设备的成本低，使得检测所需的费用降低。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，该方法包括以下步骤：
S1、提取豫谷基因组DNA，获得DNA提取液；利用改良的CTAB法提取基因组DNA，在DNA提取后，用1％的琼脂糖凝胶检测提取的谷子DNA质量，再采用NanoDrop仪检测提取的DNA的浓度和纯度，剩余的DNA置于-20℃冰箱中保存；
S2、对样本DNA做甲基化修饰；将样本DNA中非甲基化的胞嘧啶转化为其他种类的碱基；
S3、酶切与连接：利用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ两组限制性内切酶进行剪切，剪切后在8℃的条件下与人工双链接头连接，获得扩增的DNA模板；人工双链接头由引物合成仪合成；
S4、扩增与纯化：对DNA模板进行PCR扩增，对扩增后的产物进行5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
S5、银染：电泳结束后，将大小玻璃板撬开，将大板放入已预冷的10％冰醋酸中进行固定，在摇床上震荡50分钟后，将玻璃板放入双蒸水中震荡2次，每次2分钟，然后将玻璃板放入已预冷的硝酸银溶液中进行染色，在摇床上震荡20分钟后，立即将染色后的玻璃板放入双蒸水中漂洗5-10秒，迅速取出放入预冷的碳酸钠溶液中进行显影，在摇床上震荡直到条带已全部显现并且条带清晰时，则可以终止显影；终止显影是将板放入10％冰醋酸中就可以完成；
S6、记带及变异条带的回收：对引物组合进行筛选，选择条带多且清晰的条带进行最后的跑板实验，胶板上的每一条带即代表样本的一个CCGG位点，对于每一DNA样品来说，CCGG位点被切开标记为“1”，如果没有被切开，则标记为为“0”，注意的是记带时要挑选清晰明显的条带；最后将发生变异的条带进行切割回收,放入1XTE中冷冻保存；以作为连接转化的DNA模板；
S7、变异片段的连接转化：将DH5a感受态细胞放置于冰上融化；按连接体系和感受态细胞之比1:10进行转化反应，此过程需要用已预冷的枪头轻轻吸打感受态细胞，使其得到充分混匀，放置冰上孵育30分钟；然后将0.2ml离心管放入42C水浴锅进行水浴，其间不可摇动，精确热激90秒后，放入冰水混合物中4-5分钟；将离心管中的反应液转移到预先准备好的装有300ul不含有Amp的LB液态培养基的离心管中，在37C、150rpm的培养箱中摇动1小时，让感受态细胞得以复苏；取上步菌液150ul涂平板，此培养基为含有Amp的LB固体培养基，室温放置10分钟后再倒置培养，目的为使菌液完全被培养基吸收；在37C的条件下，进行培养12小时；最后用连接转化专用引物M13-47对培养好的单菌落进行扩增检测，通过对PCR产物大小的估测，检验载体是否连接在目的片段；
测序：将检测成功的单菌落用牙签挑取到含有Amp的500ulLB液态培养基中，在37C、150rpm的条件下，摇菌液12小时后送去生物公司完成变异序列的测序工作；
S8、将变异条带测序完成后，将测序结果放入BioEdit Sequence AlignmentEditor软件进行分析，首先将载体和引物的序列找到并删除，即可得到变异条带完整序列；
S9、通过检索数据库，得到的变异序列通过blastN对其在谷子全基因组中进行探寻和定位，再将变异序列通过blastX对其进行同源性蛋白的探寻与分析，检索数据库时，可以通过NCBI网站进行检索。
经过对条带位点的统计，成功检测到了968个清晰的位点，扩增得到1241条带。根据对其进一步的总结和计算得出干旱胁迫后谷子的胞嘧啶甲基化水平，分别把酶切后的四种条带情况命名为I型带、II型带、I型带和IV型带。从表中可以看出，I型带有1179条，占总位点的95％，II型带有21条，占总位点的1.69％、III型带共有46条，占总位点的3.7％，甲基化带(III+IV)共有89条，占总位点的7.11％。通过以上数据可以看出各个处理的谷子中CCG位点甲基化模式都存在全甲基化模式和半甲基化模式，并且全甲基化占大部分，约高出半甲基化3.49％-7.11％。
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (6)

1.一种谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
S1、提取谷子基因组DNA，获得DNA提取液；
S2、对样本DNA做甲基化修饰；
S3、酶切与连接：利用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ两组限制性内切酶进行剪切，剪切后在8℃的条件下与人工双链接头连接，获得扩增的DNA模板；
S4、扩增与纯化：对DNA模板进行PCR扩增，对扩增后的产物进行电泳；
S5、银染：电泳结束后，将大小玻璃板撬开，将大板放入已预冷的10％冰醋酸中进行固定，在摇床上震荡50分钟后，将玻璃板放入双蒸水中震荡2次，每次2分钟，然后将玻璃板放入已预冷的硝酸银溶液中进行染色，在摇床上震荡20分钟后，立即将染色后的玻璃板放入双蒸水中漂洗5-10秒，迅速取出放入预冷的碳酸钠溶液中进行显影，在摇床上震荡直到条带已全部显现并且条带清晰时，则可以终止显影；终止显影是将板放入10％冰醋酸中就可以完成；
S6、记带及变异条带的回收：对引物组合进行筛选，选择条带多且清晰的条带进行最后的跑板实验，胶板上的每一条带即代表样本的一个CCGG位点，对于每一DNA样品来说，CCGG位点被切开标记为“1”，如果没有被切开，则标记为为“0”，注意的是记带时要挑选清晰明显的条带；最后将发生变异的条带进行切割回收,放入1XTE中冷冻保存；以作为连接转化的DNA模板；
S7、变异片段的连接转化和测序；
S8、将变异条带测序完成后，将测序结果放入BioEdit Sequence Alignment Editor软件进行分析，首先将载体和引物的序列找到并删除，即可得到变异条带完整序列；
S9、通过检索数据库，得到的变异序列通过blastN对其在谷子全基因组中进行探寻和定位，再将变异序列通过blastX对其进行同源性蛋白的探寻与分析。
2.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，其特征在于：在步骤1中所采用的DNA提取方法为改良的CTAB法提取基因组DNA，在DNA提取后，用1％的琼脂糖凝胶检测提取的谷子DNA质量，再采用NanoDrop仪检测提取的DNA的浓度和纯度，剩余的DNA置于-20℃冰箱中保存。
3.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，其特征在于：在步骤2中所述的DNA甲基化是将样本DNA中非甲基化的胞嘧啶转化为其他种类的碱基。
4.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，其特征在于：在步骤4中所采用的电泳为5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，其特征在于：在步骤7所述的连接转化是将DH5a感受态细胞放置于冰上融化；按连接体系和感受态细胞之比1:10进行转化反应，此过程需要用已预冷的枪头轻轻吸打感受态细胞，使其得到充分混匀，放置冰上孵育30分钟；然后将0.2ml离心管放入42C水浴锅进行水浴，其间不可摇动，精确热激90秒后，放入冰水混合物中4-5分钟；将离心管中的反应液转移到预先准备好的装有300ul不含有Amp的LB液态培养基的离心管中，在37C、150rpm的培养箱中摇动1小时，让感受态细胞得以复苏；取上步菌液150ul涂平板，此培养基为含有Amp的LB固体培养基，室温放置10分钟后再倒置培养，目的为使菌液完全被培养基吸收；在37C的条件下，进行培养12小时；最后用连接转化专用引物M13-47对培养好的单菌落进行扩增检测，通过对PCR产物大小的估测，检验载体是否连接在目的片段。
6.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法，其特征在于：在步骤7所述的测序是将检测成功的单菌落用牙签挑取到含有Amp的500ulLB液态培养基中，在37C、150rpm的条件下，摇菌液12小时后送去生物公司完成变异序列的测序工作。
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