CN113151554A

CN113151554A - 用于鉴定棉花抗高温性状的InDel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113151554A
Application number: CN202110446725.3A
Authority: CN
Inventors: 陈全家; 郭亚萍; 陈琴; 郑凯; 曲延英
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113151554B

Abstract

本发明公开了用于鉴定棉花抗高温性状的InDel分子标记及其应用。本发明具体地公开了一种棉花抗高温基因InDel分子标记ProIn/ProDel22，所述InDel分子标记位于GhHSP70基因编码区起始密码子上游‑1590bp处的启动子区域，存在插入或缺失22bp的DNA片段。实验表明，本发明分子标记ProIn/ProDel22能准确、可靠、有效地区分抗高温棉花材料，且不受环境因素影响，可简便、快速、高通量地应用于棉花育种实践。ProDel22基因型棉花材料的抗高温性强，能用于陆地棉抗高温性GhHSP70的回交辅助育种。

Description

用于鉴定棉花抗高温性状的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明属于棉花抗性分子标记开发和分子标记辅助育种技术领域，涉及用于鉴定棉花抗高温性状的InDel分子标记及其应用，具体涉及一种适用于陆地棉非生物抗性种质快速筛选和回交育种的新型且简便的分子标记及辅助选择方法。

背景技术

棉花(Gossypium spp)为双子叶植物，是唯一由种子生产纤维的农作物，作为重要的纺织原料，棉花是全球范围内最重要的经济作物之一，也是我国重要的农产品之一，其中栽培最广泛的是陆地棉(Gossypium hirsutum)，其产量约占世界棉花总产量的90％。近年来，日益频发的高温热害天气严重影响着棉花的生长环境，持续极端高温虽然促使棉花阶段发育加快、生育期提前，但影响了棉花的正常生理代谢，缩短了棉铃及棉纤维的形成发育过程，进而影响棉纤维的生长发育，造成棉纤维变短，品质下降。同时高温胁迫会降低棉花种子萌发率，使根系生长及植株的生长受到抑制，导致棉花大幅度减产。因此，抗高温育种是应对全球气候变暖的根本对策，发掘棉花抗高温胁迫能力的需求越来越迫切，培育抗高温的棉花品种，有效应对棉花生长发育进程中的极端高温逆境，是当前棉花育种的重要任务。

插入缺失标记(Insertion-deletion,InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是同源序列比对产生空位(gap)的现象。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。InDel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，其本质仍属于长度多态性标记，可利用便捷的电泳平台进行分型。InDel分子标记准确性高、稳定性好，检测简单便捷，已被应用于种质资源分析、分子辅助遗传育种、遗传图谱的构建等方面。棉花重要性状的分子标记，主要集中在产量及其构成因子、纤维品质性状、抗枯及黄萎病抗性等分子标记的筛选，对于非生物胁迫抗性的分子标记研究较少，还缺乏与抗逆性状基因紧密连锁的分子标记，限制了分子标记辅助筛选抗逆新材料的育种进程。因此，亟需开发一种新型且快速简便的棉花抗高温性状的分子标记及辅助选择育种的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定抗高温棉花和/或加快棉花抗高温性选择育种进程。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种InDel分子标记或检测InDel分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定棉花抗高温性状中的应用，所述InDel分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子和/或SEQ ID No.7所示的DNA分子。

进一步地，所述InDel分子标记位于GhHSP70基因编码区起始密码子上游-1590bp处的启动子区域。

所述GhHSP70基因为陆地棉抗性基因GhHSP70。

所述GhHSP70基因为陆地棉遗传标准系TM-1的GhHSP70基因。

所述InDel分子标记名称为ProIn/ProDel22。

进一步地，所述InDel分子标记ProIn/ProDel22的核苷酸序列如SEQ ID No.6和/或SEQ ID No.7所示。

本发明所述InDel分子标记ProIn/ProDel22可为如核苷酸序列SEQ ID No.6所示的DNA分子，命名为ProDel22。其中，SEQ ID No.6由207个核苷酸组成。

本发明所述InDel分子标记ProIn/ProDel22还可为如核苷酸序列SEQ ID No.7所示的DNA分子，命名为ProIn。其中，SEQ ID No.7由234个核苷酸组成。

上述应用中，所述物质含有扩增包含所述InDel分子标记ProIn/ProDel22在内的棉花基因组DNA片段的PCR引物。

上述应用中，所述PCR引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物序列如SEQID No.4所示，所述反向引物序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了用于鉴定或辅助鉴定棉花抗高温性状的PCR引物，所述PCR引物用于扩增包含InDel分子标记ProIn/ProDel22在内的棉花基因组DNA片段。

进一步地，所述PCR引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物序列如SEQ IDNo.4所示，所述反向引物序列如SEQ ID No.5所示。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定棉花抗高温性状的试剂盒，所述试剂盒含有所述PCR引物。

进一步地，所述试剂盒还包括：dNTPs、DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

本发明还提供了一种鉴别棉花抗高温性状的方法，包括以下步骤：以待鉴定棉花基因组DNA为模板，利用所述PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；根据PCR产物确定待鉴定棉花的抗高温性状：将PCR产物含有SEQ ID No.6所示的DNA分子且不含有SEQ ID No.7所示的DNA分子的待鉴定棉花的基因型命名为ProDel22纯合基因型，将PCR产物含有SEQ IDNo.7所示的DNA分子且不含有SEQ ID No.6所示的DNA分子的待鉴定棉花的基因型命名为ProIn纯合基因型，将PCR产物含有SEQ ID No.7所示的DNA分子且含有SEQ ID No.6所示的DNA分子的待鉴定棉花的基因型命名为ProDel22/ProIn杂合基因型；ProDel22纯合基因型的待鉴定棉花的抗高温能力大于和/或高于ProIn纯合基因型的待鉴定棉花，ProIn纯合基因型的待鉴定棉花的抗高温能力与ProDel22/ProIn杂合基因型的待鉴定棉花之间没有显著差异；ProDel22纯合基因型的的待鉴定棉花的抗高温能力与ProDel22/ProIn杂合基因型之间没有显著差异。

本发明还提供了一种鉴别棉花抗高温性状的方法，包括以下步骤：以待鉴定棉花基因组DNA为模板，利用所述PCR引物进行PCR扩增，得到PCR产物；根据PCR产物确定待鉴定棉花的抗高温性状：将PCR产物含有SEQ ID No.6所示的DNA分子且不含有SEQ ID No.7所示的DNA分子的待鉴定棉花的基因型命名为ProDel22纯合基因型，将PCR产物含有SEQ IDNo.7所示的DNA分子且不含有SEQ ID No.6所示的DNA分子的待鉴定棉花的基因型命名为ProIn纯合基因型；ProDel22纯合基因型的待鉴定棉花的抗高温能力大于和/或高于ProIn纯合基因型的待鉴定棉花。

所述待鉴定棉花的基因型为ProDel22纯合基因型和/或ProIn纯合基因型。

上述方法中，所述待鉴定棉花可为陆地棉。

进一步地，所述PCR的扩增程序可为：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35次循环；72℃延伸10min。

本发明还提供了棉花育种方法，所述方法包括采用ProDel22纯合基因型的棉花作为亲本进行棉花育种，所述ProDel22纯合基因型的棉花是携带SEQ ID No.6所示的DNA分子且不携带SEQ ID No.7所示的DNA分子的棉花。

上述方法中，所述棉花育种为培育抗高温棉花。

上述方法中，所述棉花为陆地棉。

上文中，所述待鉴定棉花或棉花为陆地棉。所述抗高温能力可通过电导率体现。

所述InDel分子标记ProIn/ProDel22也属于本发明的保护范围。

本发明所述PCR引物或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定棉花抗高温性状和/或棉花育种中的应用。

本发明所述高温可为35℃或以上，36℃或以上，37℃或以上，39℃或以上，40℃或以上，42℃或以上，44℃或以上，45℃或以上。

本发明分子标记ProIn/ProDel22基于陆地棉基因GhHSP70的起始密码子上游-1590bp启动子区域在不同陆地棉材料中存在的In/Del等位变异的特点而开发设计，该区域的In/Del变异导致在高温胁迫下GhHSP70基因的表达量和棉花叶片电导率具有显著差异。本发明以陆地棉TM-1作为遗传标准系，分子标记位于测序品系TM-1的GhHSP70基因(GenBank登录号：FJ415196.1)起始密码子上游-1590bp处的启动子区域。通过PCR扩增可准确鉴定出抗高温棉花材料。因此，本发明分子标记ProIn/ProDel22能准确、可靠、有效地区分抗高温棉花材料，且不受环境因素影响，可简便、快速、高通量地应用于棉花育种实践。

附图说明

图1为本发明实施例2不同陆地棉材料的电泳结果图。其中M为Marker，207bp带型材料为抗高温棉花，234bp带型材料为非抗高温棉花。M为Marker；1、3、5-14为207bp；15-31、33-38为234bp；2、4、32为207bp/234bp杂合带型。

图2为不同ProIn/ProDel22分型材料中GhHSP70基因在高温胁迫下表达量差异结果图。

图3为不同ProIn/ProDel22分型材料中电导率差异。CK表示没有经过高温胁迫的对照组。

图4为不同ProIn/ProDel22分型材料中电导率变化量差异。

图5为高温胁迫下38份陆地棉电导率与GhHSP70基因表达量的相关性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。

实施例1棉花抗高温基因InDel分子标记ProIn/ProDel22的开发

本发明的主要步骤和内容为：根据陆地棉遗传标准系“TM-1”序列为模板，设计引物克隆GhHSP70基因起始密码子ATG上游-1874bp到-1215bp区段，以陆地棉ND359-5和新陆早26的基因组DNA为模板，通过PCR扩增目的片段、测序。所获得的目的片段在-1590bp处含有插入/缺失(In/Del)的22bp(SEQ ID No.1)。

详细实施步骤如下：

根据https://cottonfgd.org/网站获得GhHSP70基因(Ghir_D06G018900.1)启动子序列，设计引物1874F/1215R，利用棉花品种“ND359-5”和“新陆早26”的叶片基因组DNA为模版进行PCR扩增。

扩增引物为1874F-5’-TGGGCCACTAAACCTTGACT-3’

1215R-5’-GGTGGAGGAGCCATTCTAAAT-3’

PCR反应体系和程序见表1：

表1 PCR反应体系和程序

其中，5×

FastPfuFly buffer和

FastPfu Fly DNAPolymerase来自全式金生物有限公司。

扩增得到的PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶检测。

PCR扩增产物的回收和纯化：

将PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统(Bio-Rad)中观察目的条带，并切下目的条带于离心管中，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物技术有限公司)回收和纯化目的条带。操作步骤按照厂商提供的说明书进行。

目的DNA片段的连接与转化：

①连接体系(5μL)：4μL PCR回收纯化产物(15-30ng/μL)和1μ

-T5ZeroCloning vector(全式金)，轻柔混合，在PCR仪中反应20min，28℃。反应结束后置于冰上。

②从-80℃冰箱中取出大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(全式金)，待感受态细胞刚刚解冻时加入全部连接产物。轻柔混匀，冰浴25-30min。

③连接结束后，42℃热激40s(水浴)后，迅速放至冰上3min。

④加入450μL室温未加抗生素的液体LB培养基，转速200rpm，温度37℃的摇床中培养1h复苏。

⑤取出离心管4000×g离心1min，弃部分上清，保留150μL，轻弹混匀，均匀涂抹于含50μg/mL Kan抗生素的LB固体培养基上。

⑥待菌液吸收后，倒置平板，过夜培养(37℃)。

阳性克隆测序：

①挑取平板培养基上的单克隆菌株，分别放置于500μL LB液体(Kan 50μg/mL)培养基的离心管中，200rpm，37℃培养2-4h。

②取1μL菌液作物DNA模板，利用通用引物M13进行PCR扩增，PCR扩增体系与反应程序见表2，产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

③检测结果为阳性单克隆的菌株送华大基因科技有限公司测序。

测序结果表明：

以陆地棉品种“ND359-5”基因组DNA为模板，利用引物1874F和引物1215R扩增得到628bp的DNA片段，其序列如SEQ ID No.2所示。

以陆地棉品种“新陆早26”基因组DNA为模板，利用引物1874F和引物1215R扩增得到660bp的DNA片段，其序列如SEQ ID No.3所示。

表2 PCR扩增体系与反应程序

实施例2、利用棉花抗高温基因InDel分子标记ProIn/ProDel22鉴定棉花抗高温性状

1、利用棉花抗高温基因InDel分子标记ProIn/ProDel22对38份棉花材料进行基因型检测，具体步骤如下：

以38份棉花材料(表3，九圣禾种业股份有限公)的基因组DNA为模板，利用正向引物F(SEQ ID No.4)和反向引物R(SEQ ID No.5)(正向引物F：5′-TGCCACGTCAGCCATCAAATAA-3′；反向引物R：5′-ATGGCACCACCAATGTAATAT-3′)，进行PCR扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后对电泳产物进行检测，对检测结果进行带型统计。不同条带大小区分不同标记材料，条带大小为207bp(测序结果表明该特异条带的DNA分子的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.6)是ProDel22纯合基因型；条带大小为234bp(测序结果表明该特异条带的DNA分子的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.7)是ProIn纯合基因型。结果显示，在38份材料中，12份为ProDel22纯合基因型，23份为ProIn纯合基因型，3份为ProDel22/ProIn杂合基因型。分型结果如图1所示。PCR扩增体系和程序如表1所示，取3μL PCR产物于6％(V/V)聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5小时，电压70V。

2、高温胁迫条件下电导率的检测

本实验通过高温胁迫后电导率来体现棉花的抗高温性能，电导率越低抗高温性能越强。将棉花幼苗转移到人工气候室进行高温胁迫处理，光照设置为150molm²/s¹,RH＝60％，温度＝40℃，培养8h后，分别采集样品，冷冻在液氮中待提取RNA，和用来测定电导率(该处理记为“40℃_8h”)。对照处理植株培养温度设定为25℃，其他条件与处理组相同(该处理记为“CK”或“40℃_0h”)。

检测了上述38份棉花幼苗材料高温胁迫8h后的电导率(图3中表示为“40℃_8h”)，同时以未进行高温胁迫的处理作为对照(图3中表示为“CK”)。

电导率的测量：从每片测定的叶片上打孔5个10毫米的重复样本，放入试管中，每个试验3次重复。先去离子水冲洗2次，每管加入5mL去离子水，在29℃培养箱中，130rpm/min摇动1h。将渗滤液转移至50mL管中，加入25mL去离子水，用电导率仪测量(METTLER TOLEDOFE30K)初始电导率。样品经煮沸30min，冷却至室温后测定总电导率。计算电导率百分值和电导率变化量。电导率百分值＝[初始电导率*100/总电导率]，电导率变化量＝40℃_8h处理的电导率百分值-40℃_0h处理的电导率百分值。

采用SPSS version 19.0的T检验比较ProDel22纯合基因型、ProIn纯合基因型和ProDel22/ProIn杂合基因型材料的指标间差异。用Windows的R语言绘制图形，数据以3次及以上重复的平均值±标准差(SD)表示。结果表明，进行40℃8小时的高温胁迫处理后，ProDel22纯合基因型材料的电导率变化量显著低于ProIn纯合基因型(P＜0.05)，ProIn纯合基因型材料的电导率变化量与ProDel22/ProIn杂合基因型之间没有显著差异；ProDel22纯合基因型材料的电导率变化量与ProDel22/ProIn杂合基因型之间没有显著差异。说明ProDel22纯合基因型的棉花抗高温能力显著高于ProIn纯合基因型，ProIn纯合基因型材料的棉花抗高温能力与ProDel22/ProIn杂合基因型之间没有显著差异；ProDel22纯合基因型材料的棉花抗高温能力与ProDel22/ProIn杂合基因型之间没有显著差异。ProDel22纯合基因型的棉花抗高温能力最强，可以选择ProDel22纯合基因型的棉花进行抗高温棉花育种。采用SPSS version 19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用test检验，P＜0.05(*)表示ProDel22纯合基因型材料的电导率变化量与ProIn纯合基因型材料相比具有显著性差异(图4)。

表3 38份棉花的基因型与电导率百分值

实施例3不同棉花材料中GhHSP70基因在高温胁迫下的表达量分析

为了检测不同ProDel22/ProIn分型材料中GhHSP70基因在高温胁迫下表达量的差异，通过实时荧光定量分析了高温胁迫后38份材料GhHSP70基因的相对表达量；当材料幼苗为4-5片真叶时，将植物转移到40℃下进行高温胁迫，高温胁迫8h后，提取总RNA，通过实时荧光定量PCR检测GhHSP70基因表达量，结果显示ProDel22纯合基因型材料基因的相对表达量均极显著高于ProIn纯合基因型材料(P＝0.002，图2)，表明在高温胁迫下，GhHSP70启动子上游-1590bp处缺失22bp的等位变异类型有利于GhHSP70基因上调表达，从而增强棉花的抗热性能。

具体操作如下：

总RNA的提取通过多糖多酚总RNA提取试剂盒(天根)，步骤按照厂商提供的说明书进行。然后迅速检测总RNA浓度和质量，并通过一步法反转录试剂盒(Thermofisher)直接逆转录成cDNA的第一链。以上操作均按照试剂厂商的说明书进行。

荧光定量PCR的内参基因为棉花肌动蛋白基因(GhUBQ7)，以反转录cDNA为模板，目的基因GhHSP70和内参基因GhUBQ7荧光定量PCR引物和反应体系见表4和表5：

表4荧光定量PCR引物

表5荧光定量反应体系(20μL)：

qRT-PCR反应程序采用两步法，具体为预变性94℃40s；94℃5s，61℃30s，40个循环。

数据用Microsoft Excel进行统计和计算。qRT-PCR反应采用荧光定量PCR仪(ABI7500Fast)和PCR mix Tip Green Supermix(Trans)进行分析。相对表达量的计算采用2^-△△Ct方法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expressiondata using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)。

采用SPSS version 19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用test检验，P＜0.01(**)表示ProDel22纯合基因型材料GhHSP70基因的相对表达量与ProIn纯合基因型材料相比具有极显著性差异。

实施例4高温胁迫条件下GhHSP70基因相对表达量与电导率的相关性试验

为了检测棉花抗高温性与基因表达量的相关性，检测了实施例3中的38份棉花幼苗材料高温胁迫8h后的电导率(表3、图3)。利用GhHSP70基因相对表达量与电导率进行一元线性回归分析，发现二者呈显著正相关(P＝0.0076，图5)，表明GhHSP70基因相对表达量的增加对棉花幼苗的抗高温性具有正向贡献。

电导率的测量：从每片测定的叶片上打孔5个10毫米的重复样本，放入试管中，每个试验3次重复。先去离子水冲洗2次，每管加入5mL去离子水，在29℃培养箱中，130rpm/min摇动1h。将渗滤液转移至50mL管中，加入25mL去离子水，用电导率仪测量(METTLER TOLEDOFE30K)初始电导率。样品经煮沸30min，冷却至室温后测定总电导率。计算电导率：[初始电导率*100/总电导率]

采用SPSS version 19.0的T检验比较等位变异位点材料的指标间差异。用Windows的R语言绘制图形，数据以3次及以上重复的平均值±标准差(SD)表示。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业大学

<120> 用于鉴定棉花抗高温性状的InDel分子标记及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 1

ctgtataaat acaagggaca tc 22

<210> 2

<211> 628

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 2

tgggccacta aaccttgact caaattatta tttttacaat aaaaatatta aaaaataggt 60

tttttcaagt taggtataat ttttaatggt gacaaatatg aggttttttt ttgattaaaa 120

tgacttcaat tttttaataa attacgaaaa tgatatatat ttttttgatt atatacataa 180

ataatctgaa atggatagta aaagttgatg gagccaaaga gaatggcgcc accaacatgc 240

cacgttagcc atcaaataaa aaaaattaaa tttttagtgg aggcaagtaa aatgatgcca 300

cttgaaattt atcaataatt ggagggccaa aaaataaata atgatggtgg agccattcaa 360

taaaacaatt tttttaaaat ttaaaacaaa aactaataaa ataaaaaaaa gaaaatgggt 420

gatatattac attggtggtg ccatttaaaa tgactccacc aaataaaata atttttaaaa 480

attaaaaaat ataataaaaa ttaaaaaaag aaattgggcg atatatattg gcggcgccat 540

atagaatggc tccaccattt tttaaattta aaataaaaac taaaaaaaat atcctgtggt 600

ggcacaattt ggaatggctc ctccacca 628

<210> 3

<211> 654

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 3

tgggccacta aaccttgact caaattaatt ttttaacaat aaaaatatta aaaaataggt 60

tttttcaagt taggtataat ttttaatgtt gacaaatatg agggtttttt ttttattaaa 120

atgacttcaa ttttttaata aattacgaaa atgatatata ttttctatta tatacgtaaa 180

taatctgaaa tgaatagtaa aagttgatgg aggcaaagag aatggtgcca ccaacatgcc 240

acgtcagcca tcaaataaaa aaaatcaaat ttttagtgga ggcaagtaaa atgatgccac 300

ctgtataaat acaagggaca tcttgaaatt tttcaataat tggagggcca aaaaataaat 360

aatgatggtg gagccattca ataaaataac atttttttaa atttaaaaca aaaactaata 420

aaatttaaaa aaaaaagaaa atgggtgata tattacattg gtggtgccat ttaaaatgac 480

tccaccaaat aaaataattt tttaaaatta aaaaatataa taaaaattat aaaaagaaat 540

tgggcgatat atattggcgg cgcgatatag aatggctcca ccatttttta aatttaaaat 600

aaaaactaaa aaaaatatcc tgtggtggcg caatttagaa tggctcctcc acca 654

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

tgccacgtca gccatcaaat aa 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

atggcaccac caatgtaata t 21

<210> 6

<211> 207

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 6

tgccacgtta gccatcaaat aaaaaaaatt aaatttttag tggaggcaag taaaatgatg 60

ccacttgaaa tttatcaata attggagggc caaaaaataa ataatgatgg tggagccatt 120

caataaaaca atttttttaa aatttaaaac aaaaactaat aaaataaaaa aaagaaaatg 180

ggtgatatat tacattggtg gtgccat 207

<210> 7

<211> 234

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 7

tgccacgtca gccatcaaat aaaaaaaatc aaatttttag tggaggcaag taaaatgatg 60

ccacctgtat aaatacaagg gacatcttga aatttttcaa taattggagg gccaaaaaat 120

aaataatgat ggtggagcca ttcaataaaa taacattttt ttaaatttaa aacaaaaact 180

aataaaattt aaaaaaaaaa gaaaatgggt gatatattac attggtggtg ccat 234

Claims

1.InDel分子标记或检测InDel分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定棉花抗高温性状中的应用，其特征在于，所述InDel分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子和/或SEQ ID No.7所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述物质含有扩增包含所述InDel分子标记在内的棉花基因组DNA片段的PCR引物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述PCR引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物序列如SEQ ID No.4所示，所述反向引物序列如SEQ ID No.5所示。

4.用于鉴定或辅助鉴定棉花抗高温性状的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物用于扩增包含权利要求1所述的InDel分子标记在内的棉花基因组DNA片段。

5.根据权利要求4所述的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物序列如SEQ ID No.4所示，所述反向引物序列如SEQ ID No.5所示。

6.鉴定或辅助鉴定棉花抗高温性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求4或5所述的PCR引物。

7.棉花育种方法，其特征在于，所述方法包括采用ProDel22纯合基因型的棉花作为亲本进行棉花育种，所述ProDel22纯合基因型的棉花是携带SEQ ID No.6所示的DNA分子且不携带SEQ ID No.7所示的DNA分子的棉花。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述棉花育种为培育抗高温棉花。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述棉花为陆地棉。

10.权利要求1所述的InDel分子标记。