CN108384783A - 一种环状rna成环序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环状RNA成环序列及应用。该序列通过构建表达载体从而诱导非环形结构RNA成环表达。本发明普遍适用于各种circRNA的成环表达，表达效率高效、稳定；该序列内部包含多个酶切位点，满足绝大多数circRNA的表达需求；且该序列能整合到各种类型的表达载体，能应用于普通真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、逆转录病毒表达、原核表达等各种表达体系中；应用含有该序列的载体表达circRNA操作简单易行，易于推广。本发明为研究circRNA的功能和机制提供了一个有力的研究工具，为进一步确定circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发提供理论支持。

Description

一种环状RNA成环序列及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于帮助环状RNA成环的DNA序列及其应用。

背景技术

人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNAElements Project,ENCODE)研究成果表明，蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。非编码RNA尽管不编码蛋白质，但由于广泛参与了细胞内基因表达调控，在生物医学研究领域一直备受关注。研究得较多的是线性的ncRNA分子，从RNA序列长短可分为微小RNA(microRNA,miRNA,19-23nt)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs,>200nt)，它们在包括恶性肿瘤在内的多种人类常见疾病的发生发展中发挥着重要的功能。最近，一类全新的ncRNA分子，环状RNA(circular RNA,circRNA)由于其独特的构型和被日益发现的重要生物学功能，已经成为生物医学领域新的前沿和热点。

circRNA曾一度被当做基因转录后加工过程中的错误产物。和mRNA及lncRNA等线性RNA的加工过程很相似，circRNA的形成也是由剪接复合体对RNA前体进行剪接加工时生成的，只不过在这一过程中，侧翼的成环序列首先结合成环，随后剪接复合体进行剪接，最终将侧翼序列切除形成circRNA。近年来随着测序技术尤其是RNA-seq等新一代测序技术的发展，越来越多的circRNA被人们发现，并已经通过研究揭示了部分circRNA在众多的生命活动中都发挥着重要的作用。此外由于其独特的结构导致circRNA对核酸酶不敏感，在作为分子标志物的开发应用方面circRNA也具有明显优势，因此极有可能作为一种重要的分子标志物和新兴的药物开发的靶点。但由于本领域刚刚兴起，大部分circRNA尚未被发现或者尚无研究。

要研究circRNA的功能和调控机制一个必不可少的手段就是在细胞内过表达感兴趣的circRNA，观察其对细胞功能的影响。那么，要提高circRNA在细胞中的表达效率进而研究其功能和调控机制，需要高效、稳定的过表达基因研究的工具。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种帮助circRNA成环的DNA序列及其应用，该序列通过构建表达载体从而诱导非环形结构RNA成环表达。本发明普遍适用于各种circRNA的成环表达，表达效率高效、稳定；该序列内部包含多个酶切位点，满足绝大多数circRNA的表达需求；且该序列能整合到各种类型的表达载体，能应用于普通真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、逆转录病毒表达、原核表达等各种表达体系中；应用含有该序列的载体表达circRNA操作简单易行，易于推广。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种环状RNA成环序列，包括5’成环序列和3’成环序列，以及两个成环序列中间的多克隆位点区域，所述5’成环序列包含45个碱基组成，核苷酸序列如SEQ NO：1所示：GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTT；所述3’成环序列包含47个碱基组成，核苷酸序列如SEQ NO：2所示：GAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA；多克隆位点区域用于酶切插入需要成环的序列。

所述的多克隆位点区域序列为：

CTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGA如SEQ NO:3所示；依次包括AflII、HindIII、KpnI、BamHI、ClaI、EcoRI、EcoRV、SacII、NotI、XhoI、XbaI限制性内切酶识别位点。

所述的环状RNA成环序列在诱导非环形结构RNA成环中的应用。具体的所述的环状RNA成环序列用于制备表达环状RNA的载体从而诱导非环形结构RNA成环表达。

所述的表达环状RNA的载体包括真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、逆转录病毒表达或原核表达载体。

上述表达环状RNA的普通真核表达载体的构建过程如下：

(1)根据circRNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本法则，设计出适用于circRNA表达的上、下游成环序列；根据载体的序列信息，设计多克隆位点；

上游成环序列：

GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTT；

下游成环序列：

GAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA，

上、下游成环序列中间为多克隆位点序列；人工合成从而得到完整的实现circRNA过表达的DNA序列；

(2)将上述合成的实现circRNA过表达的DNA序列的两端添加酶切位点序列，通过双酶切后构建入载体中，得到pcCirc空白质粒，测序确认质粒正确；添加的酶切位点是与原始载体上的酶切位点相对应的，酶切位点选择的是原始载体多克隆位点区域中的两个端点的酶切位点；能使合成的实现circRNA过表达的DNA序列替换掉原始载体中的多克隆位点区域；

(3)选择多克隆位点序列中的酶切位点用于酶切pcCirc空白质粒，并将需要成环的序列插入载体的上、下游成环序列之间。

上述步骤(3)的具体过程如下：

1)将扩增出的需要成环序列经双酶切后电泳，胶回收；

2)pcCirc空白质粒经步骤1)相同的双酶切后电泳胶回收目的片段；

3)以T4DNA连接酶连接1)和2)步胶回收产物，即得到表达环状RNA的普通真核表达载体。

4)将第3)步得到的包含成环序列的真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

上述步骤(1)中原始载体为pcDNA3.1，多克隆位点区域序列为：

CTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGA；依次包括AflII、HindIII、KpnI、BamHI、ClaI、EcoRI、EcoRV、SacII、NotI、XhoI、XbaI限制性内切酶识别位点。

上述步骤(2)将合成的实现circRNA过表达的DNA序列一端添加NheI酶切位点序列，另一端添加ApaI酶切位点序列，通过NheI和ApaI酶切后构建入pcDNA3.1载体中，得到pcCirc空白质粒，测序确认质粒正确。

上述步骤(3)选择Cla I和Sac II酶切位点用于酶切pcCirc空白质粒，并将需要成环序列插入载体的上、下游成环序列之间。

本发明以表达circRNF13真核表达载体为例的构建过程如下：

(1)根据circRNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本法则，设计出适用于circRNA表达的成环序列；根据商业化载体pcDNA3.1的序列信息，设计多克隆位点，从而得到完整的实现circRNA过表达的DNA序列如下：

GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTTCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATC GATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA如SEQ NO:4所示，中间下划线部分为多克隆位点，两端分别为上、下游成环序列；

(2)将上述合成的实现circRNA过表达的DNA序列一端添加NheI酶切位点序列，另一端添加ApaI酶切位点序列，通过NheI和ApaI酶切后构建入pcDNA3.1载体中，得到pcCirc空白质粒，测序确认质粒正确，序列如SEQ NO:5所示；

(3)选择Cla I和Sac II酶切位点用于酶切pcCirc空白质粒，并将circRNF13序列插入载体的上、下游成环序列之间，circRNF13序列如SEQ NO:6所示，具体过程如下：

1)以舌鳞癌细胞Tca8113cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行PCR扩增全长circRNF13序列；circRNF13全长序列扩增引物如下：

上游引物：5’-GTGATTTTACAACGAGAT-3’；如SEQ NO:7所示，

下游引物：5’-CTTTCTTGAATTTATGTA-3’；如SEQ NO:8所示，

在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Cla I和Sac II识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游引物：5’-AGGAATCGATGTGATTTTACAACGAGAT-3’如SEQ NO:9所示，下划线部分为Cla I识别位点；

下游引物：5’-ATGCCCGCGGCTTTCTTGAATTTATGTA-3’如SEQ NO:10所示，下划线部分为Sac II识别位点；

2)PCR扩增，circRNF13全长序列，PCR反应条件如下：

PCR反应步骤

3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Cla I和Sac II双酶切后电泳，再次胶回收；

4)pcCirc空白质粒经Cla I和Sac II双酶切后电泳胶回收目的片段；

5)以T4DNA连接酶连接3)和4)步胶回收产物，即得到表达circRNF13的真核表达质粒；

6)将第5)步得到的包含circRNF13全长序列的真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

本发明以表达circRNF13真核表达载体为例将其转入舌鳞癌细胞中发现并证实在舌鳞癌细胞中过表达circRNF13，可以抑制舌鳞癌细胞的增殖，且在舌鳞癌耐药细胞中过表达circRNF13，可以明显逆转舌鳞癌细胞的耐药性。进一步说明表达circRNF13真核表达载体的成功构建，并具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

同时，本申请的实验过程中设计了多种帮助RNA成环的DNA序列，经过筛选和可靠的实验结果证实本发明涉及的成环序列及其相应的表达载体效果最佳，操作简便、结果稳定、表达高效。该成环序列及相应的载体能广泛应用于各种circRNA的表达，为研究circRNA的功能和机制提供了一个有力的研究工具，为进一步确定circRNA分子作为新型标志物及疾病治疗靶标的研究和开发提供理论支持。

附图说明

图1：是本发明的pcCirc质粒整体结构图。

图2：是本发明所构建的circRNF13过表达载体结构图。

图3：是本发明的pcCirc质粒过表达效果图。

图4：设计并成功构建circRNF13过表达载体，以pcDNA3.1载体为基本骨架，通过在其CMV启动子下游加入两段成环序列以及限制性酶切位点，将RNF13的第2-8号外显子通过PCR，酶切，连接到载体中(左)，然后转染到舌鳞癌细胞中，成功地在舌鳞癌细胞中过表达了circRNF13(右)。

图5：针对circRNF13环状拼接位点(外显子8和外显子2连接处)设计了特异性靶向该环状RNA的siRNA序列(左)，然后转染到舌鳞癌细胞中，成功地在舌鳞癌细胞中敲低了circRNF13的表达(右)。

图6：MTT增殖实验表明与对照组(NC)相比，过表达circRNF13(OE-circRNF13)可以抑制舌鳞癌细胞的增殖，而敲低circRNF13的表达(si-circRNF13)可以促进舌鳞癌细胞的增殖。

图7：流式细胞仪分析发现与对照组(NC)相比，过表达circRNF13(OE-circRNF13)后舌鳞癌细胞G2/M期分布比例明显增高，表明细胞周期阻滞于G2/M期，而敲低circRNF13的表达(si-circRNF13)后，S期分布显著增多，表明细胞周期进程加速。

图8：流式细胞仪分析细胞凋亡情况，发现与对照组(NC)相比，过表达circRNF13(OE-circRNF13)后舌鳞癌细胞凋亡比例明显增高，正常培养情况下，肿瘤细胞凋亡比例较低，所以敲低circRNF13的表达，凋亡细胞比例稍有降低。

图9：与对照组(NC)相比化疗耐药细胞(CR)中circRNF13表达显著降低。

图10：在原始舌鳞癌细胞(NC)中敲低circRNF13的表达(si-circRNF13)或者在耐药细胞(CR)中过表达circRNF13(OE-circRNF13)后，用相同浓度的顺铂处理细胞，然后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，发现敲低circRNF13的表达可以增加细胞对顺铂的耐受(凋亡减少)，而过表达circRNF13则可以显著降低耐药细胞的耐药性。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，pcCirc的质粒的构建

本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。

本发明环状RNA成环序列，包括5’成环序列和3’成环序列，以及两个成环序列中间的多克隆位点区域，所述5’成环序列包含45个碱基组成，核苷酸序列为SEQ NO：1所示：GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTT；所述3’成环序列包含47个碱基组成，核苷酸序列为SEQ NO：2所示：GAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA多克隆位点区域用于酶切插入需要成环的RNA序列。

所述的多克隆位点区域序列为：

CTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGA；依次包括AflII、HindIII、KpnI、BamHI、ClaI、EcoRI、EcoRV、SacII、NotI、XhoI、XbaI限制性内切酶识别位点。

所述的环状RNA成环序列在诱导非环形结构RNA成环中的应用。具体的所述的环状RNA成环序列用于制备表达环状RNA的载体从而诱导非环形结构RNA成环表达。

所述的表达环状RNA的载体包括普通真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、逆转录病毒表达或原核表达载体。

以商业化表达载体(pcDNA3.1)为例，我们构建了过表达载体pcCirc，其中的多克隆位点区域序列为：

CTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGA依次包涵AflII、HindIII、KpnI、BamHI、ClaI、EcoRI、EcoRV、SacII、NotI、XhoI、XbaI等限制性内切酶识别位点，载体结构图见附图1。

为验证本发明的DNA序列及其载体对circRNA的表达效果，我们选择了circRNF13的线性序列信息，设计引物从人cDNA模板中扩增，通过ClaI和SacII位点将该序列插入到了pcCirc载体中，得到circRNF13过表达质粒，质粒结构图见附图2。

构建circRNF13真核载体步骤如下：

(1)根据circRNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本法则，设计出适用于circRNA表达的成环序列；根据商业化载体pcDNA3.1的序列信息，设计多克隆位点，从而得到完整的实现circRNA过表达的DNA序列如下：

GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTTCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATC GATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA，中间下划线部分为多克隆位点，两端分别为上、下游成环序列；

(2)将上述合成的实现circRNA过表达的DNA序列一端添加NheI酶切位点序列，另一端添加ApaI酶切位点序列，通过NheI和ApaI酶切后构建入pcDNA3.1载体中，得到pcCirc空白质粒，测序确认质粒正确，序列如SEQ NO:5所示；

(3)选择Cla I和Sac II酶切位点用于酶切pcCirc空白质粒，并将circRNF13序列插入载体的上、下游成环序列之间，circRNF13序列如SEQ NO：6所示，由于circRNF13是一个环状RNA，序列表中只是展示了其完整的716bp序列，该RNA首尾相连，无始无终。

具体如下：

1)以舌鳞癌细胞Tca8113cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行PCR扩增全长circRNF13序列；circRNF13全长序列扩增引物如下：

上游引物：5’-GTGATTTTACAACGAGAT-3’；

下游引物：5’-CTTTCTTGAATTTATGTA-3’；

在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Cla I和Sac II识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游引物：5’-AGGAATCGAT GTGATTTTACAACGAGAT-3’，下划线部分为Cla I识别位点；

下游引物：5’-ATGCCCGCGG CTTTCTTGAATTTATGTA-3’，下划线部分为Sac II识别位点；

2)PCR扩增，circRNF13全长序列，PCR反应条件如下：

PCR反应步骤

3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Cla I和Sac II双酶切后电泳，再次胶回收；

4)pcCirc空白质粒经Cla I和Sac II双酶切后电泳胶回收目的片段；

5)以T4DNA连接酶连接3)和4)步胶回收产物，即得到表达circRNF13的真核表达质粒；

6)将第5)步得到的包含circRNF13全长序列的真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒；并经测序验证。

实施例2，在舌鳞癌细胞中过表达circRNF13

1.材料与方法

1.1细胞培养与转染

将生长状态良好的舌癌细胞Tca8113和Cal27按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始circRNF13过表达载体的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入100μl制备好的携带circRNF13真核表达质粒多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒悬液，与100μl无血清培养基温和混匀；用D-Hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用空载体的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。

1.2实时荧光定量PCR检测细胞内circRNF13的表达水平

细胞处理后，在合适的时间点收集细胞，抽提总RNA，1μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。circRNF13正向引物为5-GTCCAGGATAGACATAGAGC-3如SEQ NO:11所示，和反向引物5-GTGTAGACTTGTGTGGCTGA-3如SEQ NO:12所示。

用于对照的GAPDH正向引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’如SEQ NO:13所示，和反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’如SEQ NO:14所示。

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2.结果

转染circRNF13真核表达载体后，我们通过实时荧光定量PCR检测了细胞中circRNF13的表达，发现circRNF13表达水平明显升高(图3)。表明本发明能稳定、高效的表达circRNA，操作简单易行。

实施例3

细胞培养与转染

将生长状态良好的舌鳞癌细胞Tca8113和Cal27或者耐药细胞按2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中，待培养细胞生长至50-70％密度即可开始circRNF13过表达载体或siRNA的转染；转染过程如下：

在无菌EP管中加入100μl制备好的携带circRNF13真核表达质粒或siRNA的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒悬液，与100μl无血清培养基温和混匀；用D-Hank's液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800μl无血清培养基(无抗生素)，温和混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO₂培养箱中，37℃培养6小时，然后弃上清，加入完全培养基继续培养过夜。用空载体或者Scramble序列的多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒作为实验对照。

1、实时荧光定量PCR检测细胞内circRNF13的表达水平

细胞处理后，在合适的时间点收集细胞，抽提总RNA，1μg RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。circRNF13正向引物为5-GTCCAGGATAGACATAGAGC-3，和反向引物5-GTGTAGACTTGTGTGGCTGA-3。

用于对照的GAPDH正向引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

实时荧光定量PCR反应体系

实时荧光定量PCR反应步骤

反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，各基因的表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(GAPDH)标化后，采用group t-test检验计算P值。

2、MTT细胞增殖实验

1)消化上一步得到的细胞，用细胞计数仪对细胞进行计数，将转染circRNF13和pcDNA3.1空载体的细胞接种于96孔板中，每孔接种1000个细胞，每种细胞接种5孔，结果取其均值。

2)37℃，5％CO₂培养箱培养6小时，待细胞贴壁后，每孔加MTT液(5mg/ml)20μl。继续孵育4小时，终止培养，弃去培养液。每孔再加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物溶解。

3)选择490nm波长，同时设定调零孔，在酶联免疫检测仪上，测定各孔吸光度值并记录结果。

4)每隔24小时重复步骤同上，共检测6天。以吸光度值为纵坐标，间隔时间为横坐标绘制MTT曲线。

5)实验重复三次。以各时间点为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

3、流式细胞仪分析细胞周期

1)培养细胞达到85％融合时用胰酶消化细胞，1200rpm/min离心5min，收集细胞沉淀。

2)1xPBS重悬细胞，1200rpm/min，离心5min，收集细胞。重复此步骤2次。

3)1xPBS重悬细胞，加入预冷的70％乙醇固定细胞过夜。

4)1000rcf/min，离心5min，收集细胞沉淀。

5)PH7.4PBS洗涤细胞1次，离心后加入PBS重悬细胞，并调整细胞浓度至Ix 10⁶/ml。

6)加入碘化丙锭(PI)染色液(含50mg/L PI,1g/L Triton X-100，100g/L RNase)混匀，4℃避光孵育30min。

7)流式细胞仪FACStar(美国BD公司)检测。接收的信号经Cellquest软件处理，对检测细胞的荧光强度进行分析。实验重复3次。

4、流式细胞仪分析细胞调亡率

1)培养细胞达到85％融合时，用胰酶消化各组细胞并收集于离心管内，同时收集各组上清悬浮细胞。注意轻轻吹打细胞，避免胰酶过度消化。

2)分别合并各组细胞并转移至离心管内，1000rpm离心5min，弃上清收集细胞，PBS轻轻重悬后，细胞计数。

3)取5～10万重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入195ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

4)加入5ul Annexin V，轻轻混匀。避光室温孵育10min。

5)1000rpm离心5min，弃上清，加入190ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

6)加入10ul PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光。

7)随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

结果

1、circRNF13抑制舌鳞癌细胞的生长

转染circRNF13真核表达载体后，我们通过实时荧光定量PCR检测了细胞中circRNF13的表达，发现circRNF13表达水平明显升高(图4)；而转染靶向circRNF13的小干扰RNA(siRNA)后，细胞内circRNF13的表达水平明显下调(图5)；

与转染空载体的细胞相比，过表达circRNF13的舌鳞癌细胞Tca8113和Cal27的生长速度显著减慢，而利用siRNA干扰序列敲低circRNF13的表达后，细胞生长速度加快(图6)。

2、circRNF13通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡抑制舌鳞癌细胞的生长。

流式细胞仪分析表明，在舌鳞癌细胞中转染circRNF13后，G2/M期细胞比例显著增加，而S期细胞比例减少，表明circRNF13可将舌鳞癌细胞阻滞于G2/M期，使其细胞分裂减慢速度(图/7)。同时，在舌鳞癌细胞中转染circRNF13后凋亡细胞比例明显增加(图8)，这也是circRNF13抑制舌鳞癌细胞生长的原因之一。而敲低circRNF13则得到了相反的结果。

3、circRNF13在舌鳞癌耐药细胞中表达下调

我们通过在培养基中逐步增加顺铂浓度，经过几个月地培养，成功地诱导得到了Tca8113和Cal27对顺铂耐药的细胞，实时定量PCR检测了细胞中circRNF13的表达水平，发现circRNF13在耐药细胞株中的表达与原始细胞株相比显著下调了(图9)。

4、过表达circRNF13可以逆转舌鳞癌细胞耐药表型

在原始舌鳞癌细胞(NC)中敲低circRNF13的表达(si-circRNF13)或者在耐药细胞(CR)中过表达circRNF13(OE-circRNF13)后，用相同浓度的顺铂处理细胞，然后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，发现敲低circRNF13的表达可以增加细胞对顺铂的耐受(凋亡减少)，而过表达circRNF13则可以显著降低耐药细胞的耐药性(图10)。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种环状RNA成环序列及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gtgctgggat tacaggtgtg agctaccacc cccggcccac ttttt 45

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

gaaaagaatt aggctcggca cggtagctca cacctgtaat cccagca 47

<210> 5

<211> 85

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

cttaagcttg gtaccgagct cggatccaca tcgattggtg gaattctgca gatatccacc 60

gcggtggcgg ccgctcgagt ctaga 85

<210> 6

<211> 177

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

gtgctgggat tacaggtgtg agctaccacc cccggcccac tttttcttaa gcttggtacc 60

gagctcggat ccacatcgat tggtggaatt ctgcagatat ccaccgcggt ggcggccgct 120

cgagtctaga gaaaagaatt aggctcggca cggtagctca cacctgtaat cccagca 177

<210> 7

<211> 5515

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtgctgggat tacaggtgtg agctaccacc cccggcccac ttttttttaa acttaagctt 960

ggtaccgagc tcggatccac atcgattggt ggaattctgc agatatccac cgcggtggcg 1020

gccgctcgag tctagagaaa agaattaggc tcggcacggt agctcacacc tgtaatccca 1080

gcagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 1140

gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 1200

tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 1260

ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg 1320

gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat 1380

ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 1440

accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 1500

gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 1560

tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 1620

gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 1680

agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 1740

ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 1800

tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct 1860

ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa 1920

agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa 1980

ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 2040

ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct 2100

ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 2160

tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc 2220

gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat 2280

tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt 2340

cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac 2400

tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg 2460

tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc 2520

aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa 2580

tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc 2640

gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg 2700

aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg 2760

acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa 2820

atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg 2880

acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct 2940

tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc 3000

ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa 3060

cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat 3120

cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt 3180

cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 3240

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 3300

caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg 3360

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 3420

cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 3480

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 3540

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 3600

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 3660

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3720

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 3780

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 3840

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 3900

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 3960

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4020

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4080

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4140

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4200

aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4260

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca 4320

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4380

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4440

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 4500

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 4560

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 4620

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 4680

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 4740

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 4800

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 4860

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 4920

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 4980

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 5040

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 5100

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 5160

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 5220

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 5280

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 5340

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 5400

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 5460

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtc 5515

<210> 7

<211> 716

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

gugauuuuac aacgagaugc ugcucuccau agggaugcuc augcugucag ccacacaagu 60

cuacaccauc uugacugucc agcucuuugc auucuuaaac cuacugccug uagaagcaga 120

cauuuuagca uauaacuuug aaaaugcauc ucagacauuu gaugaccucc cugcaagauu 180

ugguuauaga cuuccagcug aagguuuaaa ggguuuuuug auuaacucaa aaccagagaa 240

ugccugugaa cccauagugc cuccaccagu aaaagacaau ucaucuggca cuuucaucgu 300

guuaauuaga agacuugauu guaauuuuga uauaaagguu uuaaaugcac agagagcagg 360

auacaaggca gccauaguuc acaauguuga uucugaugac cucauuagca ugggauccaa 420

cgacauugag guacuaaaga aaauugacau uccaucuguc uuuauuggug aaucaucagc 480

uaauucucug aaagaugaau ucacauauga aaaagggggc caccuuaucu uaguuccaga 540

auuuagucuu ccuuuggaau acuaccuaau ucccuuccuu aucauagugg gcaucugucu 600

caucuugaua gucauuuuca ugaucacaaa auuuguccag gauagacaua gagcuagaag 660

aaacagacuu cguaaagauc aacuuaagaa acuuccugua cauaaauuca agaaag 716

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

gtgattttac aacgagat 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

ctttcttgaa tttatgta 18

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

aggaatcgat gtgattttac aacgagat 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

atgcccgcgg ctttcttgaa tttatgta 28

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

gtccaggata gacatagagc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

gtgtagactt gtgtggctga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (10)

1.一种环状RNA成环序列，其特征在于，包括5’成环序列和3’成环序列，以及两个成环序列中间的多克隆位点区域，所述5’成环序列包含45个碱基组成，核苷酸序列：GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTT；所述3’成环序列包含47个碱基组成，核苷酸序列：GAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA；多克隆位点区域用于酶切插入需要成环的序列。

2.根据权利要求1所述的环状RNA成环序列，其特征在于，多克隆位点区域序列为：CTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGA，依次包括AflII、HindIII、KpnI、BamHI、ClaI、EcoRI、EcoRV、SacII、NotI、XhoI、XbaI限制性内切酶识别位点。

3.权利要求1或2所述的环状RNA成环序列在诱导非环形结构RNA成环中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的环状RNA成环序列用于制备表达环状RNA的载体从而诱导非环形结构RNA成环表达。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，表达环状RNA的载体包括真核表达、慢病毒表达、腺病毒表达、逆转录病毒表达或原核表达载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，表达环状RNA的真核表达载体的构建过程如下：

(1)根据circRNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本法则，设计出适用于circRNA表达的上、下游成环序列；根据载体的序列信息，设计多克隆位点；

上游成环序列：

GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTT；

下游成环序列：

GAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA；

上、下游成环序列中间为多克隆位点序列；人工合成从而得到完整的实现circRNA过表达的DNA序列；

(2)将上述合成的实现circRNA过表达的DNA序列的两端添加酶切位点序列，通过双酶切后构建入载体中，得到pcCirc空白质粒，测序确认质粒正确；

(3)选择多克隆位点序列中的酶切位点用于酶切pcCirc空白质粒，并将需要成环的序列插入载体的上、下游成环序列之间。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)的具体过程如下：

1)将扩增出的需要成环序列经双酶切后电泳，胶回收；

2)pcCirc空白质粒经步骤1)相同的双酶切后电泳胶回收目的片段；

3)以T4DNA连接酶连接1)和2)步胶回收产物，即得到表达环状RNA的普通真核表达载体；

4)将第3)步得到的包含成环序列的真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，

步骤(1)中原始载体为pcDNA3.1，多克隆位点区域序列为：

CTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGA；依次包括AflII、HindIII、KpnI、BamHI、ClaI、EcoRI、EcoRV、SacII、NotI、XhoI、XbaI限制性内切酶识别位点。

9.根据权利要求6或7或8所述的应用，其特征在于，

步骤(2)将合成的实现circRNA过表达的DNA序列一端添加NheI酶切位点序列，另一端添加ApaI酶切位点序列，通过NheI和ApaI酶切后构建入pcDNA3.1载体中，得到pcCirc空白质粒，测序确认质粒正确；

步骤(3)选择Cla I和Sac II酶切位点用于酶切pcCirc空白质粒，并将需要成环序列插入载体的上、下游成环序列之间。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，表达circRNF13真核表达载体的构建过程如下：

(1)根据circRNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本法则，设计出适用于circRNA表达的成环序列；根据商业化载体pcDNA3.1的序列信息，设计多克隆位点，从而得到完整的实现circRNA过表达的DNA序列如下：

GTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCTACCACCCCCGGCCCACTTTTTCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCA CATCGATTGGTGGAATTCTGCAGATATCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGAAAAGAATTAGGCTCGGCACGGTAGCTCACACCTGTAATCCCAGCA，中间下划线部分为多克隆位点，两端分别为上、下游成环序列；

(2)将上述合成的实现circRNA过表达的DNA序列一端添加NheI酶切位点序列，另一端添加ApaI酶切位点序列，通过NheI和ApaI酶切后构建入pcDNA3.1载体中，得到pcCirc空白质粒，测序确认质粒正确，序列如SEQ NO:5所示；

(3)选择Cla I和Sac II酶切位点用于酶切pcCirc空白质粒，并将circRNF13序列插入载体的上、下游成环序列之间；步骤(3)具体过程如下：

1)以舌鳞癌细胞Tca8113cDNA为模板，利用TaKaRa LA酶进行PCR扩增全长circRNF13序列；circRNF13全长序列扩增引物如下：

上游引物：5’-GTGATTTTACAACGAGAT-3’；

下游引物：5’-CTTTCTTGAATTTATGTA-3’；

在上、下游引物的5’端分别加上限制性内切酶Cla I和Sac II识别位点及保护碱基后，引物序列如下：

上游引物：5’-AGGAATCGATGTGATTTTACAACGAGAT-3’，下划线部分为Cla I识别位点；

下游引物：5’-ATGCCCGCGGCTTTCTTGAATTTATGTA-3’，下划线部分为Sac II识别位点；

2)PCR扩增，circRNF13全长序列，PCR反应条件如下：

PCR反应步骤

5返回到第2步，共进行39次反应循环；

3)将PCR产物电泳、胶回收目的片段后经Cla I和Sac II双酶切后电泳，再次胶回收；

4)pcCirc空白质粒经Cla I和Sac II双酶切后电泳胶回收目的片段；

5)以T4DNA连接酶连接3)和4)步胶回收产物，即得到表达circRNF13的真核表达质粒；

6)将第5)步得到的包含circRNF13全长序列的真核表达质粒转化感受态大肠杆菌，以扩增质粒。