CN107034262B - 一种基于同步光源的x-射线遗传标记探针及其制备方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于同步光源的X‑射线遗传标记探针的制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)构建同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将所述融合表达质粒转染进入细胞；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；3)加入底物分子反应液，冰浴反应；4)去除反应液，使用固定液固定细胞；以及5)同步X射线成像观察；其中，所述酶具有针对所述底物分子的催化活性。本发明还提供一种根据上述制备方法制得的基于同步光源的X‑射线遗传标记探针以及该探针在细胞成像中的应用。根据本发明，提供了一种能对细胞内生物分子进行高特异性识别和高分辨成像的方法，具有良好的生物医学应用前景。

Description

一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针及其制备方法以及 应用

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，更具体地涉及一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针及其制备方法以及应用。

背景技术

显微成像技术是细胞生命科学发展的主要推动力之一。特别在过去的几十年中，荧光显微技术的出现结合标记技术实现了对细胞内各种生物大分子的示踪，给探究细胞的各种生命活动提供了革命性的手段。但是，亚细胞结构和细胞内各种生物大分子大多处于10-100nm尺度，由于阿贝(Ernst Abbe)光学衍射极限的存在(200-300nm)，传统的荧光显微技术很难对100nm以下的细胞超微结构和细胞内重要生物分子进行成像观测。免疫电镜技术或电镜遗传标记技术可在极高的空间分辨率(<10nm)下对感兴趣的生物分子进行成像，但是由于电子的穿透深度较差(100-150nm)，并且实验中需要对细胞样品进行复杂的预处理，常常导致污染，并且超薄切片还会导致结构信息的损失。上世纪九十年代发展的超分辨荧光成像技术在纳米分辨细胞成像领域取得了长足的发展。这类技术主要通过减小激光焦点的尺寸(以受激发射损耗显微技术STED为代表)或单分子定位和位置重构提高分辨率(以随机光学重建显微技术STORM为代表)。但是，这些技术仍普遍存在成像速度慢，难以实现对多种生物分子同时标记等问题。并且，超分辨荧光成像大多只能对标记的蛋白分子成像，缺乏对亚细胞形态和结构进行观察的手段。

基于同步辐射的X射线成像技术是纳米分辨细胞成像领域的“第三条道路”。由于X射线的波长在0.1-10nm范围内，因此其天然就是一种纳米显微成像技术，分辨率理论上能够达到数个纳米。该技术具有独特的优势:1)与电子束相比，X射线对生物样品的穿透力更强，因此不需要经过切片等处理就能对完整细胞进行成像。2)X射线显微技术能够对细胞形貌结构进行自然衬度成像，较好地反映细胞的自然状态。3)X射线显微成像技术具有很好的能量分辨，能精确分辨很多元素的吸收谱。因此，结合X射线敏感的纳米探针，能够给出多种生物大分子的细胞内空间定位信息。目前，研究人员已经尝试在含金属元素的纳米颗粒上连接生物分子，赋予其对特异生物分子识别定位的功能。但是，这些工作中大多采用免疫标记的原理，而细胞内含有大量竞争性生物分子，如何保证对感兴趣蛋白(Protein ofinterest,POI)的标记特异性是一大瓶颈。并且，当应用多种纳米颗粒-生物分子同时标记多个蛋白分子时还会互相干扰，影响识别效率。因此，现阶段迫切需要开发高特异性的X射线探针，实现对细胞内生物分子的精确识别和定位。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针及其制备方法以及应用，从而解决现有X射线显微成像技术还无法对细胞内生物分子进行高特异性识别和成像的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针的制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)构建同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将所述融合表达质粒转染进入细胞；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；3)加入底物分子反应液，冰浴反应；4)去除反应液，使用固定液固定细胞；以及5)同步X射线成像观察；其中，所述酶具有针对所述底物的催化活性。

根据本发明所提供的方法，其工作原理为：质粒在细胞内同时表达具有催化活性的酶和目的蛋白，酶催化底物分子聚合，生成X射线可见的聚合物，从而实现目的蛋白在细胞内的定位的观察。

其中，步骤1)中的所述酶包括：抗坏血酸过氧化物酶(APEX、APEX2)、迷你单线态氧产生蛋白(miniSOG)、四半胱氨酸肽(tetracysteine)或辣根过氧化物酶(HRP)等等。最优选为APEX2。其中，APEX、APEX2、miniSOG、tetracysteine适用于细胞内任意蛋白，HRP最适用于内质网相关蛋白。

步骤1)中所采用的转染试剂为Lipofectamine 3000Transfection Reagent、Lipofectamine 2000Transfection Reagent、Lipofectamine 2000CD TransfectionReagent、Lipofectamine LTX Reagent或jetPRIME Transfection Reagent。

其中的转染方法为常规方法，转染试剂和质粒的比例为3:1～1:1，最佳地为1.5:1。转染时间为12～48h，最佳地为24h。

所述细胞为常规传代或原代培养的细胞株，并在实际应用过程中根据细胞的种属来源在构建融合表达质粒时设计表达具有催化活性的酶和目的蛋白的DNA序列。优选地，可根据不同物种在密码子使用上的偏好性，对DNA序列进行设计与优化，使其在细胞中更好地表达。

步骤2)中所使用的固定液仅限戊二醛，因为戊二醛可以最大程度地保持酶的催化活性。所述戊二醛固定液的浓度为1.5～3％。其中较佳的为2％。固定时间为20～60min，最佳为40min。

步骤3)中的所述底物分子为3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)、金属增强型DAB(Metal Enhanced DAB)或EnzMet。

针对不同的酶，可考虑在底物分子反应液中增加双氧水的成分。例如，APEX和APEX2可以催化H₂O₂产生¹O₂，¹O₂可以进一步催化底物分子聚合，因此对于APEX和APEX2来说，底物分子反应液中必须含有双氧水。对于miniSOG和tetracysteine来说，双氧水则并非必需成分。

其中，步骤3)中的冰浴反应时间为30s～2h。根据不同目的蛋白选择最优冰浴反应时间。

步骤4)中所使用的固定液可选地是多聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮或福尔马林等等。其中，最优选地为多聚甲醛，特别是4％多聚甲醛固定液。多聚甲醛固定液使得细胞内的蛋白固定，保持其结构，利于进一步的脱水和观察。

应当理解，步骤2)中所使用的固定液仅限戊二醛，而步骤4)中所使用的固定液并不仅限戊二醛，还可以是其他种类的固定液，但是最优选地是多聚甲醛。

步骤4)中固定液的固定时间为10min～2h。较佳时间为15min。

步骤5)中所述同步X射线成像能量为280～20000eV，根据不同的底物分子选择不同的入射能量。

其中，DAB最优成像能量为350～850eV，金属增强型DAB最优成像能量为500～8000eV。EnzMet最优成像能量为500～7000eV。

步骤5)中所述同步X射线成像的分辨率可以达到20～200nm。

根据本发明的第二方面，还提供一种根据上述制备方法制得的基于同步光源的X-射线遗传标记探针。

根据本发明的第三方面，还提供一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针在细胞成像中的应用。

该应用可包括细胞生命活动所涉及的任何蛋白的识别及成像。

本发明的积极进步效果在于：1)现有的电镜遗传标记主要应用锇酸染色形成的高电子密度产物进行成像，属于物理反应，而且该过程易引入高电子密度的杂质，对区分POI的空间分布形成干扰。而本发明提供的方法应用同步X射线对该聚合物的天然吸收进行成像，本质上属于化学反应，可使DAB分子聚合到很小的区域(几十甚至几纳米)，特异性非常好。2)目前已有的同步X射线敏感的纳米探针大都应用纳米颗粒-生物分子复合物，通过免疫染色过程识别细胞内POI，标记过程受到细胞内大量竞争性生物分子的影响，无法确保良好的特异性。并且，基于X射线的蛋白免疫成像技术也无法实时监测细胞在传代分裂中功能蛋白定位和分布的变化。该方法基于遗传标记的原理，因此在细胞分裂传代后也能保持非常好的特异性，不会丢失信号。3)应用先进的同步X射线进行成像，穿透深度较深，不但能对完整细胞进行成像，而且可达到组织水平。目前，组织甚至器官水平的高特异性遗传标记成像是生物医学领域的一大空白，而我们发展的基于同步光源的X-射线遗传标记探针预期能在该领域有良好的应用前景。

总之，本发明提供了一种能对细胞内生物分子进行高特异性识别和高分辨成像的方法，具有良好的生物医学应用前景。

附图说明

图1是同步X射线遗传探针对细胞连接蛋白的标记成像图；

图2A是同步X射线遗传探针对细胞微管蛋白的标记成像图，图2B是对图2A中虚线框的放大图；

图3A和图3B是X射线遗传探针与电镜遗传探针在同步X射线细胞成像中的应用比较图，以细胞连接蛋白为例，图3A为电镜遗传标记，图3B为X射线遗传标记，圆圈指示高电子密度的杂质；

图4A、图4B、图4C是基于APEX2、miniSOG、Tetracysteine的同步X射线遗传标记探针在细胞成像中的应用比较图，以细胞连接蛋白为例，图4A为APEX2，图4B为miniSOG，图4C为Tetracysteine。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本专利选择人HEK293T细胞，催化活性的酶以APEX2为主，目的蛋白选择相邻细胞间的连接蛋白Cx43和细胞内微管蛋白为代表，底物分子选择DAB为代表，构建X-射线遗传标记探针并应用于该细胞的成像研究，以下实施例具体说明本专利的实施效果。

实施例1同步X射线遗传标记探针的制备及在细胞连接蛋白成像中的应用

pcDNA3-Cx43-APEX2质粒的构建。该质粒的构建过程采用常规分子生物学手段进行，具体如下：首先，根据人源的Cx43蛋白序列，使用人源偏性的密码子优化了其DNA序列并合成全序列，全序列由上海权阳生物科技有限公司合成。APEX2序列克隆自pEGFP-APEX2-Tubulin质粒(Addgene plasmid#66171)。使用Q5定点突变试剂盒(购自NEB，货号E0552S)将该Cx43序列和APEX2序列之间连接linker序列。然后将Cx43-APEX2序列克隆进入pcDNA3哺乳动物表达载体骨架中，从而构建出pcDNA3-Cx43-APEX2质粒。测序并验证质粒序列。该质粒序列如SEQ ID NO:1所示。其中，pcDNA3是一种商业化的哺乳动物表达载体骨架。将Cx43-APEX2融合蛋白的序列克隆进入pcDNA3载体后，会驱动Cx43-APEX2融合蛋白的表达。在实际应用过程中根据细胞的种属来源在构建融合表达质粒时设计相应的DNA序列为Cx43的序列和APEX2的序列。

HEK293T细胞的培养。其中，HEK293T细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。采用DMEM(含10％FBS)培养基，37℃，5％CO₂，饱和湿度培养。将氮化硅窗置于细胞培养板中，紫外灭菌，2×10⁵细胞/孔的密度接种，贴壁过夜。

将pcDNA3-Cx43-APEX2质粒转染进入HEK293T细胞。使用脂质体Lipo3000法进行转染，每孔加入0.75μL Lipo3000，500ng pcDNA3-Cx43-APEX2质粒和1μL P3000。24h后去除培养基，2％戊二醛冰浴固定。加入含有0.03％H₂O₂的3,3'-二氨基联苯胺(DAB)反应液，冰浴反应1min，去除孔内反应液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水，同步X射线成像观察。

X射线成像实验在上海光源BL08U1软X射线谱学显微线站进行，实验方法为软X射线透射成像。X射线经波荡器引出，经过平面光栅单色器单色化后由波带片聚焦到样品上，空间分辨率为30nm。样品放置在真空样品室中，选取X射线入射能量为525eV。移动运动电机，完成细胞样品的寻找、对焦，然后进行X射线成像。获得清晰的相邻细胞连接处连接蛋白的图像，成像分辨率为30nm。

标记结束后，可在同步X射线显微镜下清楚地观察到相邻细胞连接处连接蛋白的定位分布。结果见图1，其中虚线方框内黑色阴影即为细胞连接蛋白部分。

实施例2同步X射线遗传标记探针的制备及在细胞内微管蛋白成像中的应用

pEGFP-APEX2-Tubulin质粒(Addgene plasmid#66171)购自Addgene。该质粒序列如SEQ ID NO:2所示。

HeLa细胞的培养。其中，HeLa细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。MEM(含10％FBS)培养基，37℃，5％CO₂，饱和湿度培养。将氮化硅窗置于细胞培养板中，紫外灭菌，8×10⁴细胞/孔的密度接种，贴壁过夜。

将pEGFP-APEX2-Tubulin质粒转染进入HeLa细胞。使用脂质体Lipo3000法进行转染，每孔加入0.75μL Lipo3000，500ng pcDNA3-Cx43-APEX2质粒和1μL P3000。24h后去除培养基，2％戊二醛冰浴固定。加入含有0.03％H₂O₂的3,3'-二氨基联苯胺(DAB)反应液，冰浴反应1h，去除孔内反应液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水，同步X射线成像观察，方法与实施例1相同。

标记结束后，可在同步X射线显微镜下清楚地观察到细胞内微管蛋白的分布。结果见图2A和图2B，其中，图2B为图2A中虚线框的放大图，特别是从图2B中可以清楚地观察到细胞内微管蛋白的分布。

实施例3电镜遗传探针的制备与X射线遗传探针在同步X射线细胞成像中的应用比较

将pcDNA3-Cx43-APEX2质粒转染进入HEK293T细胞。其中，HEK293T细胞培养和pcDNA3-Cx43-APEX2质粒的转染方法与实施例1相同。

电镜遗传探针的标记方法为：转染结束后，除去孔内培养基，使用2％戊二醛冰浴固定细胞。加入含0.03％H₂O₂的DAB反应液，冰浴反应1min。去除孔内反应液，加入2％锇酸，冰浴复染1h。去除孔内反应液，梯度乙醇脱水，同步X射线成像观察，方法与实施例1相同。

X射线遗传探针的标记方法以及X射线成像观察方法和实施例1相同。

以细胞连接蛋白为例，标记结束后，结果见图3A和图3B。同步X射线显微镜下，电镜遗传探针标记方法难以区分细胞和相邻细胞间连接蛋白的分布，此外，锇酸复染引入了很多具有高电子密度的杂质，干扰了对目的蛋白定位分布的正确观察，如图3A所示。应用X射线遗传标记方法则能在X射线显微镜下很清楚地观察到目的蛋白的定位分布，并且没有任何高电子密度的杂质干扰，如图3B所示。

实施例4基于APEX2、miniSOG、Tetracysteine的同步X射线遗传标记探针在细胞成像中的应用比较

分别构建pcDNA3-Cx43-miniSOG和pcDNA3-Cx43-Tetracyseine质粒。然后分别将pcDNA3-Cx43-miniSOG和pcDNA3-Cx43-Tetracyseine质粒转染进入HEK293T细胞。其中，HEK293T细胞培养以及各质粒的转染方法和实施例1相同。

转染结束后，基于APEX2的X射线遗传标记方法和X射线成像观察方法和实施例1相同。

基于miniSOG的X射线遗传标记方法为：除去孔内培养基，使用2％戊二醛冰浴固定细胞。加入DAB反应液，向反应液中缓慢通入氧气。使用150W，488nm激光照射感兴趣的区域2min。去除孔内反应液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水，同步X射线成像观察，方法与实施例1相同。

基于Tetracyseine的X射线遗传标记方法为：除去孔内培养基，加入ReAsH-EDT₂。使用2％戊二醛冰浴固定细胞。加入DAB反应液，向反应液中缓慢通入氧气。使用150W，585nm激光照射感兴趣的区域10min。去除孔内反应液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水，同步X射线成像观察步骤与实施例1相同。

结果见图4A、图4B和图4C。以细胞连接蛋白为例，标记结束后，可在同步X射线显微镜下观察到三种同步X射线遗传标记探针标记的细胞连接蛋白的定位分布，其中，图4A为APEX2，图4B为miniSOG，图4C为Tetracysteine。图中可见，基于APEX2的同步X射线遗传标记探针在细胞成像中的应用效果明显优于其它两种。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

序列表

<110> 中国科学院上海应用物理研究所

<120> 一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针及其制备方法以及应用

<160> 2

<210> 1

<211> 7295

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> pcDNA3-Cx43-APEX2质粒

<400> 1

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aaggccacca tgggtgactg gagcgcctta ggcaaactcc ttgacaaggt 960

tcaagcctac tcaactgctg gagggaaggt gtggctgtca gtacttttca ttttccgaat 1020

cctgctgctg gggacagcgg ttgagtcagc ctggggagat gagcagtctg cctttcgttg 1080

taacactcag caacctggtt gtgaaaatgt ctgctatgac aagtctttcc caatctctca 1140

tgtgcgcttc tgggtcctgc agatcatatt tgtgtctgta cccacactct tgtacctggc 1200

tcatgtgttc tatgtgatgc gaaaggaaga gaaactgaac aagaaagagg aagaactcaa 1260

ggttgcccaa actgatggtg tcaatgtgga catgcacttg aagcagattg agataaagaa 1320

gttcaagtac ggtattgaag agcatggtaa ggtgaaaatg cgaggggggt tgctgcgaac 1380

ctacatcatc agtatcctct tcaagtctat ctttgaggtg gccttcttgc tgatccagtg 1440

gtacatctat ggattcagct tgagtgctgt ttacacttgc aaaagagatc cctgcccaca 1500

tcaggtggac tgtttcctct ctcgccccac ggagaaaacc atcttcatca tcttcatgct 1560

ggtggtgtcc ttggtgtccc tggccttgaa tatcattgaa ctcttctatg ttttcttcaa 1620

gggcgttaag gatcgggtta agggaaagag cgacccttac catgcgacca gtggtgcgct 1680

gagccctgcc aaagactgtg ggtctcaaaa atatgcttat ttcaatggct gctcctcacc 1740

aaccgctccc ctctcgccta tgtctcctcc tgggtacaag ctggttactg gcgacagaaa 1800

caattcttct tgccgcaatt acaacaagca agcaagtgag caaaactggg ctaattacag 1860

tgcagaacaa aatcgaatgg ggcaggcggg aagcaccatc tctaactccc atgcacagcc 1920

ttttgatttc cccgatgata accagaattc taaaaaacta gctgctggac atgaattaca 1980

gccactagcc attgtggacc agcgaccttc aagcagagcc agcagtcgtg ccagcagcag 2040

acctcggcct gatgacctgg agatcggatc caagggctcg ggctcgacct cgggctcggg 2100

cggaaagtct tacccaactg tgagtgctga ttaccaggac gccgttgaga aggcgaagaa 2160

gaagctcaga ggcttcatcg ctgagaagag atgcgctcct ctaatgctcc gtttggcatt 2220

ccactctgct ggaacctttg acaagggcac gaagaccggt ggacccttcg gaaccatcaa 2280

gcaccctgcc gaactggctc acagcgctaa caacggtctt gacatcgctg ttaggctttt 2340

ggagccactc aaggcggagt tccctatttt gagctacgcc gatttctacc agttggctgg 2400

cgttgttgcc gttgaggtca cgggtggacc taaggttcca ttccaccctg gaagagagga 2460

caagcctgag ccaccaccag agggtcgctt gcccgatccc actaagggtt ctgaccattt 2520

gagagatgtg tttggcaaag ctatggggct tactgaccaa gatatcgttg ctctatctgg 2580

gggtcacact attggagctg cacacaagga gcgttctgga tttgagggtc cctggacctc 2640

taatcctctt attttcgaca actcatactt cacggagttg ttgagtggtg agaaggaagg 2700

tctccttcag ctaccttctg acaaggctct tttgtctgac cctgtattcc gccctctcgt 2760

tgacaaatat gcagcggacg aagatgcctt ctttgctgat tacgctgagg ctcaccaaaa 2820

gctttccgag cttgggtttg ctgatgccta actcgagtct agagggcccg tttaaacccg 2880

ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 2940

gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3000

tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3060

caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 3120

ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg 3180

cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 3240

cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 3300

ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 3360

cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 3420

ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 3480

tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 3540

ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg 3600

tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg 3660

caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 3720

ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact 3780

ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 3840

atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag 3900

tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc 3960

attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga 4020

ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 4080

cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 4140

ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 4200

ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 4260

gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 4320

cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 4380

gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 4440

cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 4500

ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 4560

acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 4620

atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 4680

gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 4740

gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg 4800

ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg 4860

attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct 4920

ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta 4980

ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 5040

ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 5100

gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 5160

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 5220

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 5280

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5340

gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 5400

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 5460

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 5520

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 5580

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 5640

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 5700

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 5760

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 5820

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 5880

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 5940

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 6000

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 6060

aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 6120

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 6180

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 6240

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 6300

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 6360

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 6420

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 6480

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 6540

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 6600

ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 6660

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 6720

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 6780

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 6840

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 6900

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 6960

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 7020

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 7080

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 7140

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 7200

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 7260

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtc 7295

<210> 2

<211> 6132

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> pEGFP-APEX2-Tubulin质粒

<400> 2

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600

ccggtcgcca ccatggacta caaggatgac gacgataagg ggaaatcata cccaacagtg 660

tccgcagact accaggatgc cgtggagaaa gccaagaaga agctgagagg gtttatcgca 720

gaaaagaggt gcgcacctct gatgctgaga ctggctttcc acagcgcagg cacctttgac 780

aagggaacca aaacaggcgg accctttgga acaatcaagc accctgctga actggcacat 840

agtgccaaca atgggctgga catcgccgtg cggctgctgg aacctctgaa agcagagttc 900

ccaattctgt cctacgccga tttttatcag ctggcaggag tggtcgctgt ggaggtcact 960

gggggcccca aggtgccttt ccacccagga cgggaggaca aaccagaacc acctccagag 1020

gggcgcctgc cagatccgac aaagggctcc gaccatctgc gagatgtgtt tgggaaagct 1080

atgggcctga ctgaccagga tatcgtcgca ctgtctggag ggcacaccat tggcgccgct 1140

cataaggaaa ggtcaggctt cgagggaccc tggacaagca accccctgat tttcgacaat 1200

tcttacttta ctgaactgct gagtggagag aaggaagggc tgctgcagct gcccagcgac 1260

aaagccctgc tgtccgatcc cgtgttcaga cctctggtcg ataagtatgc agccgacgag 1320

gatgcttttt tcgcagatta cgcagaagca catcagaagc tgtcagaact gggatttgcc 1380

gacgccaagg gctcgggctc gacctcgggc tcgggctccg gactcagatc tcgagtgcgt 1440

gagtgcatct ccatccacgt tggccaggct ggtgtccaga ttggcaatgc ctgctgggag 1500

ctctactgcc tggaacacgg catccagccc gatggccaga tgccaagtga caagaccatt 1560

gggggaggag atgactcctt caacaccttc ttcagtgaga cgggcgctgg caagcacgtg 1620

ccccgggctg tgtttgtaga cttggaaccc acagtcattg atgaagttcg cactggcacc 1680

taccgccagc tcttccaccc tgagcagctc atcacaggca aggaagatgc tgccaataac 1740

tatgcccgag ggcactacac cattggcaag gagatcattg accttgtgtt ggaccgaatt 1800

cgcaagctgg ctgaccagtg caccggtctt cagggcttct tggttttcca cagctttggt 1860

gggggaactg gttctgggtt cacctccctg ctcatggaac gtctctcagt tgattatggc 1920

aagaagtcca agctggagtt ctccatttac ccagcacccc aggtttccac agctgtagtt 1980

gagccctaca actccatcct caccacccac accaccctgg agcactctga ttgtgccttc 2040

atggtagaca atgaggccat ctatgacatc tgtcgtagaa acctcgatat cgagcgccca 2100

acctacacta accttaaccg ccttattagc cagattgtgt cctccatcac tgcttccctg 2160

agatttgatg gagccctgaa tgttgacctg acagaattcc agaccaacct ggtgccctac 2220

ccccgcatcc acttccctct ggccacatat gcccctgtca tctctgctga gaaagcctac 2280

catgaacagc tttctgtagc agagatcacc aatgcttgct ttgagccagc caaccagatg 2340

gtgaaatgtg accctcgcca tggtaaatac atggcttgct gcctgttgta ccgtggtgac 2400

gtggttccca aagatgtcaa tgctgccatt gccaccatca aaaccaagcg cagcatccag 2460

tttgtggatt ggtgccccac tggcttcaag gttggcatca actaccagcc tcccactgtg 2520

gtgcctggtg gagacctggc caaggtacag agagctgtgt gcatgctgag caacaccaca 2580

gccattgctg aggcctgggc tcgcctggac cacaagtttg acctgatgta tgccaagcgt 2640

gcctttgttc actggtacgt gggtgagggg atggaggaag gcgagttttc agaggcccgt 2700

gaagatatgg ctgcccttga gaaggattat gaggaggttg gtgtggattc tgttgaagga 2760

gagggtgagg aagaaggaga ggaatactaa ggatccaccg gatctagata actgatcata 2820

atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc 2880

ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat 2940

aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 3000

cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt aacgcgtaaa ttgtaagcgt 3060

taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata 3120

ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt 3180

tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 3240

aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt 3300

ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc 3360

ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg 3420

cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct 3480

taatgcgccg ctacagggcg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 3540

tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 3600

ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtcctgag gcggaaagaa ccagctgtgg 3660

aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa 3720

agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 3780

agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 3840

cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt 3900

ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga 3960

ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaagatcgat caagagacag gatgaggatc 4020

gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag 4080

gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg 4140

gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa 4200

tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc 4260

agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc 4320

ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga 4380

tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa 4440

acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct 4500

ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat 4560

gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt 4620

ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta 4680

tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 4740

ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 4800

ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg 4860

cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc 4920

ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 4980

ttcttcgccc accctagggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga 5040

acccgcgcta tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt 5100

cataaacgcg gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat 5160

tggggccaat acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa 5220

ggcccagggc tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca 5280

tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 5340

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 5400

gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 5460

tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 5520

ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 5580

ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 5640

gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 5700

ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 5760

tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 5820

ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 5880

agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 5940

agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 6000

gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 6060

tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 6120

accgccatgc at 6132

Claims (13)

1.一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

1)构建同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将所述融合表达质粒转染进入细胞；

2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；

3)加入底物分子反应液，冰浴反应；

4)去除反应液，使用固定液固定细胞；以及

5)同步X射线成像观察；

其中，所述酶具有针对所述底物分子的催化活性。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中的所述酶包括：抗坏血酸过氧化物酶、迷你单线态氧产生蛋白、四半胱氨酸肽或辣根过氧化物酶。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中在质粒转染时转染试剂和质粒的比例为3:1～1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的所述戊二醛固定液的浓度为1.5～3％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的所述戊二醛固定液的固定时间为20～60min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中的所述底物分子为3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐，金属增强型DAB或EnzMet。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的冰浴反应时间为30s～2h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所使用的固定液包括：多聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮或福尔马林。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中固定液的固定时间为10min～2h。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述同步X射线成像的能量为280～20000eV，根据不同的底物分子选择不同的入射能量。

11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述同步X射线成像的分辨率为20～200nm。

12.一种根据权利要求1-11中任意一项所述的制备方法制得的基于同步光源的X-射线遗传标记探针。

13.一种根据权利要求12所述的基于同步光源的X-射线遗传标记探针在细胞成像中的应用。

Images