CN110836903B - 一种同步x射线可见的多色成像标签及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种同步X射线可见的多色成像标签及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：1)将DAB和金属离子溶解于缓冲体系中，获得DAB‑金属络合物，所述金属离子选自由：Fe、Co、Ni、Cu、Zn、La、Sn、Cd组成的组中的至少一种；2)加入针对所述DAB具有催化活性的酶或者小分子，混匀；3)反应一段时间至DAB‑金属聚合物生成；以及4)将含有所述DAB‑金属聚合物的悬液滴加在同步成像基底上，同步X射线成像观察。本发明成功制备了一种同步X射线可见的多色成像标签，为进一步制备多种X射线成像探针以及实现同时对细胞内多种生物分子的特异性识别和成像打下了良好的基础。

Description

一种同步X射线可见的多色成像标签及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，更具体地涉及一种同步X射线可见的多色成像标签及其制备方法。

背景技术

显微成像技术是细胞生命科学发展的主要推动力之一。细胞的每一项生理活动均是一个复杂的生物学过程，涉及多种蛋白分子之间的相互作用及其定位变化。这在客观上要求研究细胞成像的技术能够同时对多个生物分子发出的信号进行获取与成像，从而对生命过程做出完整的阐述。基于同步X射线的显微技术在细胞成像领域具有独特的优势。由于X射线的波长在0.1-10nm范围内，因此其天然就是一种超分辨显微成像技术，分辨率理论上能够达到数个纳米。另外，与电子束相比，X射线对生物样品的穿透力更强，因此不需要经过切片等处理就能对完整细胞进行成像。更重要的是，X射线显微成像技术对不同元素具有独特的X射线荧光特征谱且互不干扰。因此，结合X射线敏感的成像探针，能够实现同时对细胞内多种生物分子的高分辨识别和成像。

在光学显微成像中，具有不同荧光发射光谱的标签常被用来标记生物分子和多色成像。在X射线成像中，同样可以利用不同元素X射线荧光发射谱的差异来开发多色标签，从而应用于制备生物探针，实现对细胞内生物分子的识别和成像。我们之前的专利中，发展了一种同步X射线可见的成像标签的制备方法。但是，该标签无特征金属元素的X射线发射光谱。因此，现阶段开发新型同步X射线可见的多色成像标签，实现同时对细胞内多种生物分子的精确识别和定位具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种同步X射线可见的多色成像标签及其制备方法，从而解决现有X射线显微成像技术中无法实现对细胞内多种生物分子同时进行识别和定位的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种同步X射线可见的多色成像标签的制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)将DAB和金属离子溶解于缓冲体系中，获得DAB-金属络合物，所述金属离子选自由：Fe、Co、Ni、Cu、Zn、La、Sn、Cd组成的组中的至少一种；2)加入针对所述DAB具有催化活性的酶或者小分子，混匀；3)反应一段时间至DAB-金属聚合物生成；以及4)将含有所述DAB-金属聚合物的悬液滴加在同步成像基底上，同步X射线成像观察，即得一种同步X射线可见的多色成像标签。

根据本发明所提供的制备方法，其工作原理为：DAB分子和选自Fe、Co、Ni、Cu、Zn、La、Sn或Cd的金属离子发生络合反应，具有催化活性的酶或者小分子催化含金属的底物分子聚合，生成在一定X射线成像能量范围内可见的聚合物，从而制备出同步X射线可见的多种成像标签。

步骤1)中的所述金属离子以硝酸盐、硫酸盐、或盐酸盐中任意一种或多种形式提供。

根据不同金属离子可选择最适的离子浓度。优选地，步骤1)中的所述金属离子的终浓度为0.01～2.5mg/mL。金属离子浓度高于2.5mg/mL会影响催化聚合反应的酶的活性，影响生成甚至无法生成DAB-金属聚合物，低于0.1mg/mL时则可能影响DAB-金属聚合物的同步X射线成像信号强度。以金属Co，Ni，Cu，Zn为例，金属离子浓度范围是0.01～2.5mg/mL，较佳地为0.1～2.5mg/mL,最佳地为2.5mg/mL。

步骤1)中的缓冲体系包括磷酸盐缓冲液、二甲胂酸钠缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或其他适合的缓冲液，优选地，所述缓冲液的pH值为7.2～7.6。其中，最佳地为7.4。

步骤1)中DAB为3,3'-二氨基联苯胺或3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐。其中，该底物分子DAB浓度优选为0.2～5mM。

步骤2)中针对所述DAB具有催化活性的酶或者小分子包括：抗坏血酸过氧化物酶，迷你单线态氧产生蛋白，辣根过氧化物酶，曙红，亚甲基蓝，二溴荧光素，荧光素，TAMRA，Br-TAMRA，Bromo-Cy5，AF488，AF633，ReAsH-EDT₂或

700DX。

针对具有催化活性的酶或小分子，可考虑在反应时加入光照条件。例如，对于APEX，APEX2和HRP来说，光照并非必需条件。对于miniSOG，eosin，methylene blue，DBF，Fluorescein，TAMRA，Br-TAMRA，Bromo-Cy5，AF488，AF633，ReAsH-EDT₂和

700DX来说，光照则为必需条件。其中的混匀方法为使用枪头吹打混匀或者漩涡振荡器振荡混匀。

步骤3)中的反应温度为4～37℃，实际应用过程中根据选择的不同的酶或小分子，可选择最优的温度。

步骤3)的反应时间为5min～2h。根据选择的不同的酶或小分子，可选择最优的反应时间。

步骤4)中，根据不同的金属离子选择不同的入射能量，适用于Fe的入射能量为7112～15000eV、适用于Co的入射能量为7709～16000eV、适用于Ni的入射能量为8332～17000eV、适用于Cu的入射能量为8979～18000eV、适用于Zn的入射能量为9659～20000eV、适用于La的入射能量为5483～12000eV和38925～78000eV、适用于Sn的入射能量为3929～11000eV和29200～50000eV、适用于Cd的入射能量为3538～11000eV和26711～50000eV。

选取的X射线入射能量范围内都能对相应的金属元素进行成像，但也有最优入射能量选择，以Co、Ni、Cu、Zn为例，入射能量选择为10000eV。

步骤4)中的同步X射线成像的分辨率为20nm～300μm。

步骤4)中的成像基底包括氮化硅窗口、铜网碳支持膜、Mylar膜、聚四氟乙烯或塑料。应当理解，上述几种成像基底并非用于限制，实际上，无金属的X-ray稳定的基底均适用于本发明。

步骤4)中的所述成像基底中，氮化硅窗口厚度为50-150nm，最佳为100nm。铜网碳膜厚度为5～100nm，最佳为20nm。Mylar膜厚度为2～25μm，最佳为10μm。

根据本发明的第二方面，提供一种根据上述制备方法制得的同步X射线可见的多色成像标签。

根据本发明提供的一种多色成像标签，其中“多色”体现在DAB-金属聚合物中所含各金属元素均具有独特的X射线荧光特征谱且互不干扰。将DAB与不同的金属离子络合，得到的X射线荧光特征谱也是特异性的。将不同的荧光特征谱定义为不同的颜色，为进一步利用不同的DAB-金属络合物标记不同的分子，使用同步X射线分析得到对应的多种X射线荧光特征谱，从而得到多种颜色打下基础。

本发明的发明点在于，研究了DAB聚合物与不同金属离子的络合量，结果显示DAB聚合物与不同金属离子的络合量有显著差异，筛选出了能够用于同步多色成像标签的金属离子种类；以金属Co，Ni，Cu，Zn为代表，研究了金属离子浓度对DAB-金属聚合物聚合能力及同步X射线荧光成像信号的影响，筛选出了这几种金属最优的浓度范围，还研究了同步X射线的能量对DAB金属络合物发射荧光光谱强度的影响，并筛选出了这几种金属最优的X射线成像能量。

本发明的积极进步效果在于：同步X射线显微成像技术和与之相适合的多种分子探针对于理解细胞生命过程具有十分重要的意义。但是，目前X射线显微技术多用于对细胞内单一生物靶标进行成像，和该技术相适合的特异性识别细胞内重要生物靶标的分子探针种类仍有限。本发明利用X射线显微成像技术对不同元素具有独特的X射线荧光特征谱且互不干扰的特点，将底物分子和不同金属离子混合，经体外化学催化反应以及DAB和金属离子之间的络合反应成功制备了多种同步X射线成像标签，为进一步制备多种X射线成像探针以及实现同时对细胞内多种生物分子的特异性识别和成像打下了良好的基础。

附图说明

图1是纯化的APEX2蛋白的SDS-PAGE图，其中泳道1为标准分子量蛋白Marker，泳道2为纯化的APEX2蛋白；

图2是DAB聚合物对不同金属离子的络合量；

图3是金属离子浓度对DAB-金属聚合物聚合能力的影响；

图4是DAB-金属聚合物在不同金属离子浓度下的荧光光谱图；

图5是DAB-金属聚合物的实物图；

图6是DAB-金属聚合物在不同同步辐射X射线成像能量下的荧光光谱图；

图7是DAB-金属聚合物的同步X射线荧光成像图和荧光光谱图(黑色为DAB-金属聚合物沉淀)；

图8是DAB-多金属聚合物实物图；

图9是DAB-多金属聚合物的同步X射线荧光成像图和荧光光谱图(黑色为DAB-金属聚合物沉淀)；

图10A、10B、10C、10D分别是APEX2，HRP，miniSOG和

700DX催化生成DAB-Ni聚合物的同步X射线成像图和相应的荧光光谱图(黑色为DAB-Ni聚合物沉淀)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明主要选择Co、Ni、Cu，Zn作为底物分子中金属离子的代表，催化活性的酶以APEX2为主，制备了同步X射线多色成像标签，并应用于同步X射线成像研究，以下实施例具体说明本发明的实施效果。

实施例1 APEX2蛋白的表达与纯化

pTRC99A-APEX2质粒(Addgene plasmid#72558)购自addgene。该pTRC99A-APEX2质粒的序列如SEQ ID No：1所示。

BL21-DE3大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。取50ngpTRC99A-APEX2质粒加入感受态细胞，冰上放置30min，42℃热激，加入LB培养基，37℃、150rpm培养1h，取适量菌液涂布于氨苄抗性的LB琼脂糖平板上，培养过夜。挑取单克隆，接种到1mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜。将1mL菌液接种到500mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养约5h，待菌液OD值达到0.6时加入420μM的IPTG和1mM的5-氨基乙酰丙酸，18℃、220rpm诱导培养16h。离心收集菌体并超声裂解。使用Ni-NTA(琼脂糖亲和柱纯化并洗脱APEX2蛋白。SDS-PAGE验证APEX2蛋白的分子量和纯度。

结果如图1所示，SDS-PAGE结果显示在分子量30kDa的位置有一条清晰的条带，表明该质粒成功表达了APEX2蛋白且纯度较高，可用于进一步的实验研究。

实施例2 DAB聚合物对不同金属离子络合量的研究

将DAB水溶液，相应的金属离子盐酸盐水溶液和H₂O₂分别加到pH 7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为2.1mg/mL。各金属离子终浓度为1mg/mL。H₂O₂终浓度为10mM，混匀。加入APEX2蛋白，终浓度为100nM。反应1h后将生成的DAB-金属聚合物悬液14000rpm离心10min，沉淀用MilliQ纯水洗涤三次，重悬于消解液中(70％HNO₃:30％H₂O₂体积比为7:1)，110℃消解6h，电感耦合等离子质谱(ICP-MS)测定金属离子浓度，计算每毫克DAB所络合的金属离子的质量。

结果如图2所示，DAB聚合物对不同金属离子的络合量有显著差异。DAB聚合物对Cu离子的络合量最多，每毫克DAB络合85μg Cu离子。DAB聚合物对Ba、Na、Mg、Ca和K离子络合量较低，每毫克DAB的络合金属量低于0.4μg。

实施例3金属离子浓度对DAB-金属聚合物聚合能力的影响

将DAB水溶液，相应的金属离子盐酸盐水溶液和H₂O₂分别加到pH7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为0.4mg/mL。各金属离子终浓度为0.01,2.5,5,7.5和10mg/mL。H₂O₂终浓度为10mM，混匀。加入APEX2蛋白，终浓度为100nM。反应1h,生成的DAB-金属聚合物悬液14000rpm离心20min,拍照。

结果如图3所示，金属离子浓度为0.01-2.5mg/mL时候，DAB-金属聚合物可以完全聚合，离心后DAB-金属聚合物悬液变得澄清。当金属离子浓度>2.5mg/mL时,随着金属离子浓度的增加，离心后生成的DAB-金属聚合物逐渐减少,表明DAB-金属聚合物聚合能力逐渐下降。当金属离子浓度为10mg/mL时候，DAB-金属聚合物无法聚合。因此,金属离子浓度为0.01-2.5mg/mL时,不影响DAB-金属聚合物的聚合能力。

实施例4金属离子浓度对DAB-金属聚合物同步X射线荧光成像信号的影响

将DAB水溶液，相应的金属离子盐酸盐水溶液和H₂O₂分别加到pH7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为0.4mg/mL。金属离子终浓度为0.01,0.1,1和2.5mg/mL。H₂O₂终浓度为10mM，混匀。加入APEX2蛋白，终浓度为100nM。反应1h后将生成的DAB-金属聚合物悬液以14000rpm离心10min，沉淀用MilliQ纯水重悬，滴加在聚四氟乙烯基底上。待干燥后，激光刻蚀沉淀，得到沉淀。

在上海光源BL15U1硬X射线微聚焦线站，入射光能量选取10keV，光斑尺寸选取为100μm，采集时间为5s，获得不同浓度不同元素DAB-金属聚合物样品的X射线荧光光谱。

结果如图4所示，当金属离子浓度小于0.1mg/mL时，DAB-金属聚合物荧光计数较低，为保证X射线成像图像质量，不作为优选的金属离子浓度范围。当金属离子浓度大于0.1mg/mL时，随着金属离子浓度增加，DAB金属聚合物的荧光计数逐渐增强。因此，Co、Ni、Cu、Zn金属离子浓度范围较佳地为0.1-2.5mg/mL,最佳地为2.5mg/mL。

实施例5 DAB-金属聚合物的制备和同步辐射X射线成像能量优化

将DAB水溶液，相应的金属离子盐酸盐水溶液和H₂O₂分别加到pH7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为0.4mg/mL。DAB-Co，DAB-Ni，DAB-Cu，DAB-Zn，DAB-K组中各金属离子终浓度为2.5mg/mL；H₂O₂终浓度为10mM，混匀。加入APEX2蛋白，终浓度为100nM。反应1h后将生成的DAB-金属聚合物悬液以14000rpm离心10min，沉淀用MilliQ纯水重悬，滴加在聚四氟乙烯基底上。待干燥后，激光刻蚀沉淀，得到有不同金属字样的沉淀(图5)。

DAB-金属聚合物的X射线成像能量优化实验在上海光源BL15U1硬X射线微聚焦线站进行，实验方法为X射线荧光成像。X射线经波荡器引出，经双晶单色器单色化，K-B镜聚焦后，照射在样品上，由硅漂移探测器(SDD)探测样品X射线荧光信号。本实施例中，设置7个X-ray入射光能量(8keV、10keV、12keV、14keV、16keV、18keV、20keV)。移动运动电机，完成DAB-金属聚合物成像标签的寻找、对焦，然后进行X射线荧光光谱分析，获得成像标签同一位置在不同入射能量下的X射线荧光光谱。实验时X射线光斑尺寸为100μm。

入射X光能量为10keV时，DAB-Co，DAB-Ni，DAB-Cu，DAB-Zn等聚合物所发射的荧光光谱最强，因此，我们使用10keV作为元素Co、Ni、Cu、Zn最优选的同步辐射X射线成像能量。但是，入射X光能量在8-20keV范围内，DAB-K均没有明显的荧光信号(图6)。

在入射光能量为10keV时，同步辐射X射线成像技术对DAB-Co，DAB-Ni，DAB-Cu，DAB-Zn等聚合物能进行很好的成像(图7)。因此，这几种DAB-金属聚合物可以作为同步X射线多色成像标签用于进一步的应用研究；而与DAB聚合物络合能力较低的K等金属离子不能作为同步X射线多色成像标签用于进一步的研究。

实施例6 DAB-多金属聚合物的制备及同步辐射X射线成像

将DAB水溶液，相应的金属离子盐酸盐水溶液和H₂O₂分别加到pH7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为0.4mg/mL。DAB-CoNi，DAB-CoCu，DAB-CoZn，DAB-NiCu，DAB-NiZn和DAB-CuZn组中各金属离子终浓度为1.25mg/mL；DAB-CoNiCu，DAB-CoNiZn,DAB-CoCuZn,DAB-NiCuZn组中各金属离子浓度为0.83mg/mL,DAB-CoNiCuZn组中各金属离子浓度为0.6125mg/mL。H₂O₂终浓度为10mM，混匀。加入APEX2蛋白，终浓度为100nM。反应1h后将生成的DAB-金属聚合物悬液以14000rpm离心10min，沉淀用MilliQ纯水重悬，滴加在聚四氟乙烯基底上。待干燥后，激光刻蚀沉淀，得到有不同金属字样的沉淀(图8)。

DAB-多金属聚合物的X射线成像实验在上海光源BL15U1硬X射线微聚焦线站进行，实验方法为X射线荧光成像。X射线经波荡器引出，经双晶单色器单色化，K-B镜聚焦后，照射在样品上，由硅漂移探测器(SDD)探测样品X射线荧光信号。光子能量范围3.5-22.5keV，根据样品尺寸选择合适空间分辨率。本实施例中，X-ray入射光能量均为10keV。移动运动电机，完成DAB-金属聚合物成像标签的寻找、对焦，然后进行X射线荧光成像，每个单点均有对应的X射线荧光光谱。成像分辨率均为100μm。

结果如图9所示，同步辐射X射线成像技术能对多种DAB-多金属聚合物进行很好的成像，DAB-多金属聚合物中所含各金属元素均具有独特的X射线荧光特征谱且互不干扰。因此，DAB-多金属聚合物和上述DAB-单金属聚合物可以作为同步X射线多色成像标签用于进一步的应用研究。

实施例7 APEX2，HRP，miniSOG和

700DX催化生成DAB-Ni聚合物及在同步X射线成像中的应用比较

APEX2体外催化生成DAB-Ni聚合物，方法与实施例2相同。

HRP体外催化生成DAB-Ni聚合物，方法为：HRP购自Sigma(货号：P8375)。将DAB水溶液，NiCl₂水溶液和H₂O₂分别加到pH 7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为0.4mg/mL，Ni离子终浓度为25mg/mL，H₂O₂终浓度为10mM，混匀。加入HRP，使终浓度为100nM。反应1h后，生成的DAB-Ni聚合物悬液以14000rpm离心10min，沉淀用MilliQ纯水重悬。

miniSOG体外催化生成DAB-Ni聚合物，方法为：将miniSOG的cDNA序列克隆进pBAD-Myc-His A原核表达载体骨架，构建pBAD-miniSOG质粒。pBAD-miniSOG质粒的序列如SEQ IDNo：2所示。取50ng pBAD-miniSOG质粒加入感受态细胞，冰上放置30min，42℃热激，加入LB培养基，37℃、150rpm培养1h，取适量菌液涂布于氨苄抗性的LB琼脂糖平板上，培养过夜。挑取单克隆，接种到1mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜。将1mL菌液接种到500mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃、220rpm培养约5h，待菌液OD值达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖，37℃、220rpm诱导培养16h。离心收集菌体并超声裂解。使用Ni-NTA(琼脂糖亲和柱纯化并洗脱miniSOG蛋白。

将DAB水溶液，NiCl₂水溶液和H₂O₂分别加到pH7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为0.4mg/mL，Ni离子终浓度为25mg/mL，混匀。加入miniSOG，使终浓度为50nM。缓慢地向反应体系中通O₂，使用150W的488nm荧光照射1h，生成的DAB-Ni聚合物悬液以14000rpm离心10min，使用纯水重悬沉淀。

700DX体外催化DAB分子聚合物，方法为：

700DX购自LI-COR(货号：929-70010)。将DAB水溶液加到pH7.4的PBS缓冲液中，DAB终浓度为0.4mg/mL，混匀。加入

700DX，使终浓度为50nM。使用150W的700nm荧光照射15min，生成的DAB聚合物悬液以14000rpm离心10min，沉淀用MilliQ纯水重悬。

上述各DAB聚合物的X射线成像观察方法与实施例2相同。

结果如图10A、10B、10C、10D所示，同步X射线成像结果和Ni的X射线荧光特征谱分析显示APEX2，HRP，miniSOG和

700DX均能催化生成DAB-Ni聚合物，但是酶APEX2，HRP，miniSOG的催化效果优于小分子

700DX。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种同步X射线可见的多色成像标签及其制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4925

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60

ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120

gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180

tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240

taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg cacaccacca ccaccaccac ggaaagtctt 300

acccaactgt gagtgctgat taccaggacg ccgttgagaa ggcgaagaag aagctcagag 360

gcttcatcgc tgagaagaga tgcgctcctc taatgctccg tttggcattc cactctgctg 420

gaacctttga caagggcacg aagaccggtg gacccttcgg aaccatcaag caccctgccg 480

aactggctca cagcgctaac aacggtcttg acatcgctgt taggcttttg gagccactca 540

aggcggagtt ccctattttg agctacgccg atttctacca gttggctggc gttgttgccg 600

ttgaggtcac gggtggacct aaggttccat tccaccctgg aagagaggac aagcctgagc 660

caccaccaga gggtcgcttg cccgatccca ctaagggttc tgaccatttg agagatgtgt 720

ttggcaaagc tatggggctt actgaccaag atatcgttgc tctatctggg ggtcacacta 780

ttggagctgc acacaaggag cgttctggat ttgagggtcc ctggacctct aatcctctta 840

ttttcgacaa ctcatacttc acggagttgt tgagtggtga gaaggaaggt ctccttcagc 900

taccttctga caaggctctt ttgtctgacc ctgtattccg ccctctcgtt gacaaatatg 960

cagcggacga agatgccttc tttgctgatt acgctgaggc tcaccaaaag ctttccgagc 1020

ttgggtttgc tgatgcctaa gatccgctag agtcgacctg caggcatgca agcttggctg 1080

ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 1140

tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc 1200

gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt 1260

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tttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 1560

ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc 1620

ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt 1680

gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct 1740

caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac 1800

ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact 1860

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gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga 1980

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tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga 2100

agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctaca gcaatggcaa caacgttgcg 2160

caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat 2220

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tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc 2340

agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga 2400

tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc 2460

agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag 2520

gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc 2580

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gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat 2760

accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc 2820

accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa 2880

gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg 2940

ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag 3000

atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag 3060

gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa 3120

cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt 3180

gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg 3240

gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc 3300

tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac 3360

cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ctgatgcggt attttctcct 3420

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 3480

tgccgcatag ttaagccagt atacactccg ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg 3540

ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc 3600

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 3660

tcaccgaaac gcgcgaggca gcagatcaat tcgcgcgcga aggcgaagcg gcatgcattt 3720

acgttgacac catcgaatgg tgcaaaacct ttcgcggtat ggcatgatag cgcccggaag 3780

agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg 3840

ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga 3900

aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg 3960

cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc 4020

tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca 4080

gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaagcg gcggtgcaca 4140

atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta tccgctggat gaccaggatg 4200

ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc 4260

agacacccat caacagtatt attttctccc atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc 4320

atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta agttctgtct 4380

cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga 4440

tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc 4500

tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg 4560

caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc gcgttggtgc ggatatctcg gtagtgggat 4620

acgacgatac cgaagacagc tcatgttata tcccgccgtc aaccaccatc aaacaggatt 4680

ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg 4740

tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca 4800

atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg 4860

tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gcgcgaattg 4920

atctg 4925

<210> 2

<211> 4366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60

tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120

aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180

attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240

atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300

taacaggagg aattaaccat ggagaaaagt ttcgtgataa ctgatccacg gctgccagac 360

aatcccatca tcttcgcatc cgatggcttc ctggagctga ccgagtattc cagagaggag 420

atcctgggcc gcaatggccg ctttctgcag ggaccagaga cagaccaggc cacagtgcag 480

aagattcgcg atgccattag agatcagcgc gagattaccg tgcagctgat aaactacaca 540

aaaagcggga agaaattctg gaacctcctg cacctccagc ccatgaggga ccagaagggt 600

gagctccagt atttcatcgg agtgcagctg gatggaaagc ttgggcccga acaaaaactc 660

atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttgagtttaa 720

acggtctcca gcttggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta 780

aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg 840

tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg 900

ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg 960

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 1020

aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga 1080

cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt 1140

tttgcgtttc tacaaactct tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 1200

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 1260

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 1320

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 1380

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 1440

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga 1500

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 1560

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 1620

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 1680

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 1740

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 1800

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 1860

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 1920

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 1980

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 2040

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 2100

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 2160

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 2220

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 2280

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 2340

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 2400

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 2460

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 2520

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 2580

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 2640

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 2700

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 2760

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 2820

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 2880

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 2940

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 3000

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct 3060

gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 3120

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt 3180

gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 3240

tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 3300

cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag 3360

gcgaagcggc atgcataatg tgcctgtcaa atggacgaag cagggattct gcaaacccta 3420

tgctactccg tcaagccgtc aattgtctga ttcgttacca attatgacaa cttgacggct 3480

acatcattca ctttttcttc acaaccggca cggaactcgc tcgggctggc cccggtgcat 3540

tttttaaata cccgcgagaa atagagttga tcgtcaaaac caacattgcg accgacggtg 3600

gcgataggca tccgggtggt gctcaaaagc agcttcgcct ggctgatacg ttggtcctcg 3660

cgccagctta agacgctaat ccctaactgc tggcggaaaa gatgtgacag acgcgacggc 3720

gacaagcaaa catgctgtgc gacgctggcg atatcaaaat tgctgtctgc caggtgatcg 3780

ctgatgtact gacaagcctc gcgtacccga ttatccatcg gtggatggag cgactcgtta 3840

atcgcttcca tgcgccgcag taacaattgc tcaagcagat ttatcgccag cagctccgaa 3900

tagcgccctt ccccttgccc ggcgttaatg atttgcccaa acaggtcgct gaaatgcggc 3960

tggtgcgctt catccgggcg aaagaacccc gtattggcaa atattgacgg ccagttaagc 4020

cattcatgcc agtaggcgcg cggacgaaag taaacccact ggtgatacca ttcgcgagcc 4080

tccggatgac gaccgtagtg atgaatctct cctggcggga acagcaaaat atcacccggt 4140

cggcaaacaa attctcgtcc ctgatttttc accaccccct gaccgcgaat ggtgagattg 4200

agaatataac ctttcattcc cagcggtcgg tcgataaaaa aatcgagata accgttggcc 4260

tcaatcggcg ttaaacccgc caccagatgg gcattaaacg agtatcccgg cagcagggga 4320

tcattttgcg cttcagccat acttttcata ctcccgccat tcagag 4366

Claims (2)

1.一种同步X射线可见的多色成像标签的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

1）将DAB和金属离子溶解于缓冲体系中，获得DAB-金属络合物，所述金属离子选自由：Co、Ni、Cu、Zn组成的组中的至少一种，所述缓冲体系包括磷酸盐缓冲液、二甲胂酸钠缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，所述缓冲液的pH值为7.2~7.6；

2）加入针对所述DAB具有催化活性的酶或者小分子，其为APEX2、HRP、miniSOG、IRDye^®700DX中的一种，混匀；

3）反应一段时间至DAB-金属聚合物生成，反应温度为4 ~37°C，反应时间为5 min~2 h；以及

4）将含有所述DAB-金属聚合物的悬液滴加在同步成像基底上，入射光能量选取10keV，分辨率为20 nm~300 μm，同步X射线成像观察，即得一种同步X射线可见的多色成像标签；

其中，步骤1）中的所述金属离子以硝酸盐、硫酸盐、或盐酸盐中任意一种或多种形式提供；

步骤1）中的所述金属离子的终浓度为0.1~2.5 mg/mL。

2.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的同步X射线可见的多色成像标签。

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