CN111675762A - 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用 - Google Patents

一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111675762A
CN111675762A CN201911235374.0A CN201911235374A CN111675762A CN 111675762 A CN111675762 A CN 111675762A CN 201911235374 A CN201911235374 A CN 201911235374A CN 111675762 A CN111675762 A CN 111675762A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
site
amino acid
constant region
heavy chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911235374.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111675762B (zh
Inventor
谢珍慧
刘礼乐
张莹
刘敬贤
盛其然
陈先涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xdcexplorer Shanghai Co ltd
Original Assignee
Xdcexplorer Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xdcexplorer Shanghai Co ltd filed Critical Xdcexplorer Shanghai Co ltd
Priority to CN202311656470.9A priority Critical patent/CN117843795A/zh
Publication of CN111675762A publication Critical patent/CN111675762A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111675762B publication Critical patent/CN111675762B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用。该抗体的重链恒定区为人源γ1链，其轻链恒定区为人源κ链，其A位点和/或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸。该抗体亲和力高，可与药物进行定点偶联，所得产物的均一性高、化药可计量、可重复性高。

Description

一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
技术领域
本发明提供了一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用。
背景技术
传统的随机偶联的抗体-药物偶联物(ADC)是由小分子抗肿瘤药物和抗体中的天然氨基酸连接偶联而成，药物和抗体偶联的位置和数目无法控制，产物结构不均一、批次可重复性差、治疗指数低等。近年来，基于Thiomab、非天然氨基酸、转移酶等进行的定点偶联技术有效克服了上述缺点，这些技术可以有效控制药物结合的位置，获得药抗比均一的偶联物，使得位点专一的抗体-药物偶联物成为ADC研究新趋势。
TDC与传统ADC药物相比有着不可取代的优点。传统ADC药物中随机还原抗体的二硫键，并由共价键的连接将药物模块附着至抗体一般会产生不均一的分子混合物，此混合物通常含有0-8个药物模块附着的抗体，且药物模块附着于抗体上的不同位点。此混合物含有不同的药物/抗体摩尔比和连接位点不同，且每种具有不同的药代动力学、抗癌功效和安全性。现有的分析和制备方法不足以分离和表征由随机偶联反应产生的不均一混合物中ADC分子。抗体是较大的、复杂的生物分子，常常带有许多官能团。它们与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于诸如pH、浓度、盐浓度和溶剂等因素，多步骤高度可重复性的偶联过程很难在ADC的生产过程中被控制。所以，位点专一性单一药抗比的TDC药物就能解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的可与药物形成偶联物的抗体结构较为单一等缺陷，因此，本发明提供了一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用。该抗体亲和力高，可与药物进行定点偶联，所得产物的均一性高、化药可计量、可重复性高。
本发明提供了一种抗体，其包括重链和轻链，其重链恒定区为人源γ1链(替换前)，其轻链恒定区为人源κ链(替换前)，其特征在于，其A位点和/或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；其中，
(1)所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、161、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点中的一个或多个；
(2)所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、152、153、169和191位点中的一个或多个；
当所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114或235位点时，所述的抗体的重链恒定区(替换前)为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链；
所述位点根据kabat编号系统编号。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的抗体中，所述的抗体由所述的重链和所述的轻链组成。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基可替换为半胱氨酸。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的抗体中，所述的抗体的重链的数目为两条。
在所述的抗体中，所述的A位点成对出现在两条重链中。例如，“所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第115位点”是指两条重链中的第115位点的氨基酸残基均为半胱氨酸。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的(1)中的“多个”例如2个、3个、4个、5个或6个，又例如2个或3个，还例如2个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的A位点可为所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点中的一个或多个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的A位点可为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338和396位点中的一个或多个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的A位点可为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160和235位点中的一个或多个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换前，所述的A位点的氨基酸残基为丙氨酸或谷氨酰胺。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时(包括但不限于“A位点和B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸”的情形，全文同此)，所述的A位点的数量为一个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的抗体中，所述的抗体的轻链的数目为两条。
在所述的抗体中，所述的B位点成对出现在两条轻链中。例如，“所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第145位点”是指两条轻链中的第145位点的氨基酸残基均为半胱氨酸。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的(2)中的“多个”例如2个、3个、4个、5个或6个，又例如2个或3个，还例如2个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
当所述的B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的B位点可为所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、153和191位点中的一个或多个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
当所述的B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的B位点可为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换前，所述的B位点的氨基酸残基为缬氨酸。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
当所述的B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时(包括但不限于“A位点和B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸”的情形，全文同此)，所述的B位点的数量为一个。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160或235位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的A位点的氨基酸残基为丙氨酸或谷氨酰胺，所述的B位点的氨基酸残基为缬氨酸。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160或235位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的A位点的氨基酸残基为丙氨酸或谷氨酰胺，所述的B位点的氨基酸残基为缬氨酸。
在所述的抗体中，在所述的替换前，所述的抗体的重链可为本领域常规的人源IgG1的重链，例如与人TPBG(human Trophoblast Glycoprotein，人滋养层特异性糖蛋白)结合的人源IgG1的重链，又例如如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链。
在所述的抗体中，在所述的替换前，所述的抗体的轻链可为本领域常规的人源IgG1的轻链，例如与人TPBG结合的人源IgG1的轻链，又例如如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链。
在所述的抗体中，所述的抗体的可变区可为本领域常规的人源IgG1的可变区，例如与人TPBG结合的人源IgG1的可变区。
在所述的抗体中，所述的抗体的重链可变区可为本领域常规的人源IgG1的重链可变区，例如与人TPBG结合的人源IgG1的重链可变区，又例如如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的可变区。
在所述的抗体中，所述的抗体的轻链可变区可为本领域常规的人源IgG1的轻链可变区，例如与人TPBG结合的人源IgG1的轻链可变区，又例如如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的可变区。
在所述的抗体中，在所述的替换前，所述的抗体的恒定区可为本领域常规的人源IgG1的恒定区。
在所述的抗体中，在所述的替换前，所述的人源γ1链(重链恒定区)可为本领域常规的人源γ1链，例如野生型人源γ1链或突变型人源γ1链，又例如如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换前，所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、161、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点中的一个或多个的氨基酸残基不为半胱氨酸残基。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换前，所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、161、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点的氨基酸残基均不为半胱氨酸残基。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的抗体的重链恒定区中，被替代的A位点的氨基酸残基(即替换前的氨基酸残基)不为半胱氨酸残基。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换后，所述的人源γ1链可为如序列表SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的人源γ1链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的抗体中，在所述的替换前，所述的人源κ链可为本领域常规的人源κ链，例如野生型人源κ链或突变型人源κ链，又例如如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换前，所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、152、153、169和191位点中的一个或多个的氨基酸残基不为半胱氨酸残基。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换前，所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、152、153、169和191位点的氨基酸残基均不为半胱氨酸残基。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的抗体的轻链恒定区中，被替代的B位点的氨基酸残基(即替换前的氨基酸残基)不为半胱氨酸残基。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换后，所述的人源κ链可为如序列表SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
采用所述的抗体制得的抗体药物定点偶联物(Thiomab drug conjugates)的DAR(药物交联率)可为1.5～2.0，所述的DAR通过HPLC-HIC或LC-MS测定。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
采用所述的抗体制得的抗体药物定点偶联物(Thiomab drug conjugates)的单体百分比可大于90％，还可大于95％。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的人源γ1链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链，和/或，所述的人源κ链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160或235位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的人源γ1链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链，和/或，所述的人源κ链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换后，所述的人源γ1链可为如序列表SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的人源γ1链，所述的人源κ链可为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换后，所述的人源γ1链可为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链，所述的人源κ链可为如序列表SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
所述的抗体的重链可变区为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的可变区，和/或，所述的抗体的轻链可变区为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的可变区。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160或235位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
所述的抗体的重链可变区为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的可变区，和/或，所述的抗体的轻链可变区为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的可变区。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的抗体的重链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链，和/或，所述的抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160或235位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的抗体的重链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链，和/或，所述的抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的抗体的重链恒定区的第160位点或轻链恒定区的第191位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；
在所述的替换前，所述的抗体的重链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链，和/或，所述的抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的抗体的重链可变区为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的可变区；所述的抗体的轻链可变区为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的可变区；
在所述的替换后，所述的人源γ1链可为如序列表SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的人源γ1链，所述的人源κ链可为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
所述的抗体的重链可变区为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的可变区；所述的抗体的轻链可变区为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的可变区；
在所述的替换后，所述的人源γ1链可为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链，所述的人源κ链可为如序列表SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的人源κ链。
在某一方案中，所述的抗体中的某些参数可如下所述(本方案未描述的参数如上任一方案所述)：
在所述的替换前，当所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114和/或235位点时，所述的抗体的重链恒定区为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链。
本发明还提供了一种抗体片段，其为上述抗体的Fc段、Fab或F(ab’)2。
本发明还提供了一种核酸，其编码上述的抗体或抗体片段。
所述的核酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸。
所述核酸可按照本领域常规的方法制备，例如基因克隆技术、或、人工全序列合成。
本发明还提供了一种核酸，其编码上述的抗体的重链或抗体片段的重链。
所述的核酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸。
所述的抗体的重链或抗体片段的重链中包含“经上述替换形成的半胱氨酸残基”。
所述核酸可按照本领域常规的方法制备，例如基因克隆技术、或、人工全序列合成。
本发明还提供了一种核酸，其编码上述的抗体的重链恒定区或抗体片段的重链恒定区。
所述的核酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸。
所述的抗体的重链恒定区或抗体片段的重链恒定区中包含“经上述替换形成的半胱氨酸残基”。
所述核酸可按照本领域常规的方法制备，例如基因克隆技术、或、人工全序列合成。
本发明还提供了一种核酸，其编码上述的抗体的轻链或抗体片段的轻链。
所述的抗体的轻链或抗体片段的轻链中包含“经上述替换形成的半胱氨酸残基”。
所述的核酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸。
所述核酸可按照本领域常规的方法制备，例如基因克隆技术、或、人工全序列合成。
本发明还提供了一种核酸，其编码上述的抗体的轻链恒定区或抗体片段的轻链恒定区。
所述的抗体的轻链恒定区或抗体片段的轻链恒定区中包含“经上述替换形成的半胱氨酸残基”。
所述的核酸可为核糖核酸或脱氧核糖核酸。
所述核酸可按照本领域常规的方法制备，例如基因克隆技术、或、人工全序列合成。
本发明还提供一种重组表达载体，其包含上述的核酸。
所述的重组表达载体可按照本领域常规的方法制备，例如：将上述的核酸连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的载体，只要其能够容载前述核酸即可。所述载体包括但不限于：质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
本发明还提供一种重组表达转化体，其包含上述的重组表达载体。
所述的重组表达转化体可按照本领域常规的方法制备，例如：将上述的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。例如，所述宿主细胞为E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)、CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)或293细胞(例如Freestyle 293-F细胞)。其中，所述的转化方法为本领域常规的转化方法，例如化学转化法、热激法或电转法。
本发明还提供了一种细胞或细胞系，其包含上述的重组表达载体。所述的细胞可为哺乳动物或人细胞，又可为CHO细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、CV-l细胞或COS细胞。
本发明还提供了一种上述的抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体、上述的细胞、或者、上述的细胞系，获得抗体即可。
本发明还提供了一种上述的抗体或上述的抗体片段在制备药物中的应用。
本发明还提供了一种上述的抗体或上述的抗体片段在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤可为本领域常规的肿瘤，例如过表达人TPBG的肿瘤。
所述的肿瘤可为癌症。
所述的肿瘤可为鳞状/腺瘤性肺癌(非小细胞肺癌)、浸润性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、浸润性子宫内膜腺癌、浸润性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌、绒毛膜癌、支气管癌、乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌或精囊癌。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的抗体和药用辅料。
所述的药用辅料为本领域常规的药用辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述的抗体和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更佳地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用，即经鼻施用；或者，鞘内、髓内或心室内施用。更佳地，所述的药物组合物还可以透皮、经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
对于本发明的所述药物组合物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估为本领域技术人员已知。
本发明还提供一种检测过表达人TPBG的细胞的方法，其包括如下的步骤：将上述的抗体与待测样品混合即可；所述的抗体的重链可变区为与人TPBG结合的重链可变区；所述的抗体的轻链可变区为与人TPBG结合的轻链可变区。
本发明还提供了一种上述的抗体或上述的抗体片段在制备抗体药物偶联物中的应用。
本发明还提供了一种抗体药物偶联物Ab-(L-D)n；
其中，所述的Ab为上述的抗体，所述的L为连接子，所述的D为细胞毒剂，所述的n为0～2.0，但不为0；
所述的Ab中“经所述的替换形成的半胱氨酸残基”，通过所述的L与所述的D连接。
所述的连接子可为本领域常规的连接子，例如活性酯、碳酸盐类、氨基甲酸酯类、亚胺磷酸酯、肟类、腙类、缩醛类、原酸酯类、氨基类、小肽段或核苷酸片段，又例如马来酰亚胺基己酰(maleimidocaproyl，MC，其马来酰端与所述的Ab连接，其己酰端与所述的细胞毒剂连接)、马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇(MC-VC-PAB，其左端与所述的Ab连接，其右端与所述的细胞毒剂连接)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
所述的细胞毒剂可为本领域常规的细胞毒剂，例如细胞毒素、化学治疗剂、放射性同位素、治疗性核酸、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖促凋亡剂或细胞溶解酶。所述细胞毒素可为本领域常规的细胞毒素，一般指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的活性剂，例如甲基奥瑞他汀E(MMAE)、甲基奥瑞他汀F(MMAF)或N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基-美登素(DM1)。
所述的n可为整数或非整数。
所述的n例如1.5～2.0。
所述的n可通过HPLC-HIC或LC-MS测定。
所述的抗体药物偶联物可为抗体药物定点偶联物(Thiomab drug conjugates，简称TDC)，其采用Thiomab技术制备。
所述的抗体药物偶联物可为下述任一抗体药物偶联物：
表A
Figure BDA0002304741760000121
Figure BDA0002304741760000131
所述的表A中，马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇(MC-VC-PAB)的左端与所述的Ab连接，其右端与所述的细胞毒剂连接，所述的n通过HPLC-HIC测定；
表B
抗体 连接子 细胞毒剂 n
h28D4-HC-A114C MC-VC-PAB MMAE 1.71
h28D4-HC-T160C MC-VC-PAB MMAE 1.74
h28D4-HC-S235C MC-VC-PAB MMAE 1.78
h28D4-HC-K322C MC-VC-PAB MMAE 1.64
h28D4-HC-N380C MC-VC-PAB MMAE 1.37
h28D4-HC-N204C MC-VC-PAB MMAE 0.99
所述的表B中，马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇(MC-VC-PAB)的左端与所述的Ab连接，其右端与所述的细胞毒剂连接，所述的n通过LC-MS测定；
表C
抗体 连接子 细胞毒剂 n
h28D4-HC-A114C MC MMAF 1.76
h28D4-HC-S235C MC MMAF 1.78
h28D4-HC-T160C MC MMAF 1.94
h28D4-HC-K322C MC MMAF 1.74
所述的表C中，马来酰亚胺基己酰(MC)的马来酰端与所述的Ab连接，其己酰端与所述的细胞毒剂连接，所述的n通过LC-MS测定。
本发明还提供一种上述的抗体药物偶联物在制备药物中的应用。
本发明还提供一种上述的抗体药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤可为本领域常规的肿瘤，例如过表达人TPBG的肿瘤。
所述的肿瘤可为癌症。
所述的肿瘤可为鳞状/腺瘤性肺癌(非小细胞肺癌)、浸润性乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、浸润性子宫内膜腺癌、浸润性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌、绒毛膜癌、支气管癌、乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌或精囊癌。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的抗体药物偶联物和药用辅料。
所述的药用辅料为本领域常规的药用辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述的抗体药物偶联物和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更佳地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用，即经鼻施用；或者，鞘内、髓内或心室内施用。更佳地，所述的药物组合物还可以透皮、经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
对于本发明的所述药物组合物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估为本领域技术人员已知。
本发明中，术语“kabat编号系统”的编号方法是：重链恒定区的第1个氨基酸Ala为kabat编号系统的第114位，之后依次类推；轻链恒定区的第1个氨基酸Arg为kabat编号系统的第108位，之后依次类推。
本发明中，如无特别说明，被替换的氨基酸残基不为半胱氨酸残基，也即：在所述的替换前，“所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、161、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点，以及，所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、152、153、169和191位点”中可以没有半胱氨酸残基，也可以有一个或多个半胱氨酸残基；当其中有一个或多个半胱氨酸残基时，所述的为半胱氨酸残基的位点不进行所述的替换。
本发明中，如无特别说明，TPBG是指人源TPBG，即hTPBG。
本发明中，抗TPBG抗体(或h28D4、亲代抗体)是指下述序列的抗体：
抗TPBG抗体重链分子量为49271.67，由450个氨基酸残基组成(其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示)，等电点为8.35，恒定区为人IgG1野生型(SEQ ID NO:5)，可变区为1-120位氨基酸(SEQ ID NO:3)。重链3个CDR序列分别为NYVMS(CDRH1)、EISTGGSHTYYSDTVTG(CDRH2)、FYYGSSYSMDY(CDRH3)。
抗TPBG抗体轻链分子量约为23567.24，由214个氨基酸残基构成(其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示)，等电点为7.78，恒定区序列为人κ型(SEQ ID NO:6)，可变区为1-107位氨基酸(SEQ ID NO:4)。轻链3个CDR序列分别为RASQDIRNYLN(CDRL1)、HTSRLHS(CDRL2)、QQGDTLPLT(CDRL3)。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的抗体亲和力高，可与药物进行定点偶联，所得产物的均一性高、化药可计量、可重复性高。
附图说明
图1为实施例2的部分突变抗体与hTPBG结合力的测试图。
图2为抗TPBG抗体偶联MMAE TDC与ADC在NCI-H1568细胞中的体外活性评价。
图3为抗TPBG抗体偶联MMAE TDC与ADC在NCI-H1975细胞中的体外活性评价。
图4为抗TPBG抗体偶联MMAE TDC与ADC在MDA-MB-468细胞中的体外活性评价。
图5为抗TPBG抗体偶联MMAF TDC与ADC在NCI-H1568细胞中的体外活性评价。
图6为抗TPBG抗体偶联MMAF TDC与ADC在NCI-H1975细胞中的体外活性评价。
图7为抗TPBG抗体偶联MMAF TDC与ADC在MDA-MB-468细胞中的体外活性评价。
图8为HC-T160C位点MMAE TDC的大鼠PK。
图9为LC-V191C位点MMAE TDC的大鼠PK。
图10为HC-A114C位点MMAE TDC的大鼠PK。
图11为HC-S235C位点MMAE TDC的大鼠PK。
图12为抗TPBG抗体传统随机偶联MMAE ADC的大鼠PK。
图13为10mg/kg抗TPBG抗体MMAE TDC与ADC在NCI-H1975小鼠异种移植瘤模型中的药效评价。
图14为3mg/kg抗TPBG抗体偶联MMAE TDC与ADC在NCI-H1975小鼠异种移植瘤模型中的药效评价。
图15为10mg/kg抗TPBG抗体偶联MMAE TDC与ADC在NCI-H1975小鼠异种移植瘤模型的药效评价实验中的动物体重变化。
图16为3mg/kg抗TPBG抗体偶联MMAE TDC与ADC在NCI-H1975小鼠异种移植瘤模型的药效评价实验中的动物体重变化。
图17为实施例2的部分突变抗体与hTPBG结合力的测试图。
图18为实施例2的部分突变抗体与hTPBG结合力的测试图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中的“2×Q5高保真酶PCR混合物”为
Figure BDA0002304741760000162
High-Fidelity 2×MasterMix(NEB,货号M0492S)
下述实施例中的“10x cut smart缓冲液”为NEB，货号B7204S的缓冲液。
下述实施例中的“重组酶II”为Vazyme，货号229051的重组酶。
下述实施例中的“5x重组II缓冲液”为Vazyme，货号310141的重组酶缓冲液。
实施例1突变载体的制备
表G引物表
Figure BDA0002304741760000161
Figure BDA0002304741760000171
1点突变法
以野生型重链质粒(h28D4-VH.1b质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)或野生型轻链质粒(h28D4-VK.1质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)为模板，用Muta-directTMsite-directed mutagenesis试剂盒(SBS Genetech,SDM-15)和突变引物(上下游引物分别为引物1和引物2，具体见表G)进行PCR扩增反应，诱导目的基因进行点突变。
PCR反应完毕后，用Mutazyme酶将质粒模板降解，将PCR产物转化到商业化的感受态DH5α细胞。挑克隆做菌落PCR鉴定和测序。挑取上步骤中测序正确的克隆摇菌，用
Figure BDA0002304741760000172
Xtra Maxi Plus protocol(MACHEREY-NAGEL，cat.740416.50)试剂盒法提取质粒，Nanodrop测试质粒浓度，测序。
2 Overlap PCR法
2.1第一轮PCR:
第一轮PCR包括以上述的野生型重链质粒(h28D4-VH.1b质粒，其核苷酸序列如SEQID NO:7所示)或野生型轻链质粒(h28D4-VK.1质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)为模板，分别以pEF1a上游引物(5’to 3‘,SEQ ID NO:59)与引物2(具体见表G)、引物1(具体见表G)与pSV40下游引物(5’to 3‘,SEQ ID NO:60)为引物对，使用下列反应体系扩增获得PCR产物A和B。以上所有引物使用前稀释至25μM待用，在50μl反应体系中加入1μl引物，说明所述引物在反应体系中的终浓度为500nM。
产物A的PCR反应体系：
Figure BDA0002304741760000181
产物B的PCR反应体系：
Figure BDA0002304741760000182
PCR产物A和B通过1％琼脂糖电泳，从而回收目的DNA片段a和b。
2.2第2轮PCR:(两种大片段之间摩尔比为1:1)
Figure BDA0002304741760000183
通过1％琼脂糖电泳回收目的DNA片段。
2.3 KpnI and NotII双酶切:
Figure BDA0002304741760000191
所述的h28D4-VH.1b质粒核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，h28D4-VK.1质粒核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，混均后37度孵育过夜，切胶回收6.5kb DNA大片段。
2.4同源重组:
Figure BDA0002304741760000192
2.5转化
Figure BDA0002304741760000193
实施例2突变抗体的表达和纯化
质粒转染：
取5mL培养基和100μg质粒(重链质粒40μg,轻链质粒60μg)混匀，取5mL培养基和PEI混匀(PEI用量是质粒质量的2倍)，静置5分钟后混匀，静置15-20分钟(培养基体积应该随体系增大而以对应比例增大)，缓缓加入100mL Freestyle 293-F细胞中，细胞密度控制在1-1.5*106/ml范围，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入37度摇床培养，130RPM，8％CO2；第二天加入终浓度0.5％的蛋白胨；6-7天后，2500rpm离心30分钟收集上清，活细胞百分比必须在60％以上。
重力柱纯化：
离心后的细胞悬液用0.22μm滤器过滤。将含Protein A填料的亲和层析柱用5倍柱体积0.5M NaOH冲洗，5倍柱体积的PBS进行平衡，将过滤好的细胞上清流过柱子，必要时收集上清。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M的pH 3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用1/10体积的pH8.5的1M Tris-HCl中和。将抗体注入透析袋中，在1×PBS中透析4度透析过夜。第2天将抗体吸出，0.22μm滤器过滤，Nanodrop测定浓度，SEC测定抗体纯度。
基于上述方法，制得了：重链发生如A114C,S115C,S132C,G134C,K143C,T151C,A158C,T160C,S161C,S172C,G190C,T191C,N204C,S235C,K322C,Q338C,N380C或S396C点突变；或，轻链发生如T109C,K145C,N152C,A153C,K169C或V191C点突变的、抗TPBG抗体的突变抗体(其位点根据kabat编号系统编号)。
效果实施例1 ELISA法鉴定突变抗体与抗原亲和力
在96孔透明平底板里，每孔加入75μL的1μg/mL hTPBG-Fc fusion protein抗原包被,4℃过夜。第2天，加入135μL 2％BSA in PBST封闭,37℃孵育1hr,PBST洗板三次。将样品从4μg/ml开始以5倍梯度稀释成6个浓度，稀释板每孔体积不小于120μL。将75μL样品液转移到反应板中，37℃孵育1hr,PBST洗板三次。每孔加75μL(1:5000稀释)anti-human IgG FabHRP(goat)，37℃孵育1hr，PBST洗板三次。每孔加75μL TMB显色液(A：B＝1:1)，反应10min后，加75μL 1M HCl终止反应。酶标仪(BMI-B22-01)上测450nm吸收波长。此实验独立重复六次，六次结果取平均值，并计算SD值。
ELISA结果(图1、图17、图18和表D～F)显示：上述实施例2制得的重链发生如A114C，S115C,S132C,G134C,K143C，T151C,T160C,S172C,G190C,T191C,N204C,S235C,K322C,Q338C,N380C或S396C点突变改造后的抗体跟亲代抗体相比与hTPBG-Fc抗原的结合力变化不大，OD450曲线无明显差别，EC50值相比无统计学差异，空白组和阴性对照组无抗原结合信号；上述实施例2制得的轻链发生如T109C,K145C,N152C或V191C点突变改造后抗体跟亲代抗体相比与hTPBG-Fc抗原的结合力变化不大，OD450曲线无明显差别，EC50值相比无统计学差异，空白组和阴性对照组无抗原结合信号。表D～F中的数据为OD450。
表D与hTPBG蛋白结合力的平均值
Figure BDA0002304741760000201
Figure BDA0002304741760000211
表E与hTPBG蛋白结合力的平均值
Figure BDA0002304741760000212
表F与hTPBG蛋白结合力的平均值
Figure BDA0002304741760000213
Figure BDA0002304741760000221
实施例3 Cys突变抗体的偶联
按照下述方法(偶联方法还可参见US7723485B2)，将上述的实施例2制得的突变抗体用于制备与MC-VC-PAB-MMAE(以下省略连接子，简称MMAE)或MC-MMAF(以下省略连接子，简称MMAF)的偶联物。
Cys突变改造型抗体(即上述的实施例2制得的突变抗体)经过pH 6.5～8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP，购自Sigmal-Aldrich)，其中TCEP与纯化的抗TPBG抗体的摩尔比比率为20-50，室温下还原2小时，得反应液A。将反应液A经过Thermalzebra spin 7K column(购自Thermo Fisher)对抗体进行脱盐去除多余的TCEP，并使用含0.3M NaCl的PBS洗脱抗体，得反应液B。向反应液B中加入脱氢抗坏血酸(pH 7～8)(购自Sigmal-Aldrich)，其中脱氢抗坏血酸与纯化的半胱氨酸突变改造型抗体的摩尔比比率为30-50，室温下氧化2h得反应液C。将反应液C经过Thermal zebra spin 7K column进行脱盐处理去除多余的脱氢抗坏血素酸。并使用含1mM DTPA的PBS溶液(pH7.4)洗脱抗体，得反应液D。反应液D在充氮保护的状态下，加入MC-VC-PAB-MMAE(购自凯惠科技)，其中MC-VC-PAB-MMAE与纯化的半胱氨酸突变改造型抗体的摩尔比比率为5-10，室温下反应2h。再加入半胱氨酸用以中和多余的MC-VC-PAB-MMAE，并通过G25柱脱盐除去多余的小分子。得到纯化的抗TPBG抗体药物定点偶联物(Thiomab drug conjugates，简称TDC)，其结构如式I所示。
Figure BDA0002304741760000231
其中，mAb即上述的Cys突变改造型抗体，其通过突变Cys与“连接子+药物(细胞毒素)”连接，n为每个Cys突变改造型抗体连接的“连接子+药物(细胞毒素)”的数量。
Cys突变改造型抗体(即上述的实施例2制得的突变抗体)与MC-MMAF的偶联操作同上，反应液D在充氮保护的状态下，加入MC-MMAF(购自凯惠科技)，其中MC-MMAF与纯化的半胱氨酸突变改造型抗体的摩尔比比率为5-10，室温下反应2h。再加入半胱氨酸用以中和多余的MC-MMAF，并通过G25柱脱盐除去多余的小分子。得到纯化的抗TPBG抗体药物定点偶联物，其结构如式II所示。
Figure BDA0002304741760000232
其中，mAb即上述的Cys突变改造型抗体，其通过突变Cys与“连接子+药物(细胞毒素)”连接；m为5；n为每个Cys突变改造型抗体连接的“连接子+药物(细胞毒素)”的数量。
效果实施例2通过HPLC-HIC或LC-MS分析偶联物的交联率、通过HPLC-SEC分析偶联物的纯度等参数
HPLC-HIC,HPL-SEC和LC/MS的检测抗体药物偶联物的色谱条件与偶联物的分析
A.HPLC-HIC条件
色谱柱：Thermol MabPac,HIC-Butyl
HPLC：E2695,Waters
流动相A：1.5M硫酸铵，0.025M磷酸钠水溶液，pH＝6.95
流动相B：0.025M磷酸钠水溶液，25％(v/v)异丙醇水溶液
流速：0.5ml/min
梯度：0～2min:80％流动相A+20％流动相B
2～15min:80％～60％流动相A+20％～40％流动相B
15～18min:60％～30％流动相A+40％～70％流动相B
18～20min:70％流动相B+30％流动相A
B.HPLC-SEC条件
色谱柱：TSKgel 3000SWxl
HPLC:FTN-R,Waters
流动相A：1×PBS缓冲液+10％异丙醇
流速：0.5ml/min
梯度：0～20min:100％流动相A
C.LC/MS条件
色谱柱：Acquity UPLC BEH200,SEC 1.7μm,4.6×300mm
HPLC:Acquity UPLC H-Class Bio,Waters
MS:Triple TOF 5600,TOF 5600,AB Sciex
流动相A：0.1％甲酸，25％乙腈水溶液。
流速：0.2ml/min
梯度：0～25min:流动相A
通过HPLC-HIC或LC-MS分析上述实施例3制得的抗TPBG抗体药物定点偶联物和按照CN201611206936.5的实施例四制备的h28D4-MMAE的交联率，通过HPLC-SEC分析上述的实施例2制得的突变抗体、上述实施例3制得的抗TPBG抗体药物定点偶联物和按照CN201611206936.5的实施例四制备的h28D4-MMAE的纯度等参数。
抗TPBG抗体药物定点偶联物的药物交联率(DAR)为0-2.0之间不等，抗TPBG抗体药物定点偶联物单体的比例在0％-100％之间不等，测得的数据见表1。其中，DAR(drugantibody ratio)指抗体偶联后一个抗体分子上携带的小分子药物的平均数量。
表1
Figure BDA0002304741760000241
Figure BDA0002304741760000251
上表中的“裸抗单体百分比”表示偶联之前抗体的未聚集百分比。
上表中的“裸抗聚集百分比”表示偶联之前抗体的聚集百分比。
上表中的“偶联物单体百分比”表示偶联之后偶联物(例如抗TPBG抗体药物定点偶联物)的未聚集百分比。
上表中的“偶联物聚集百分比”表示偶联之后偶联物(例如抗TPBG抗体药物定点偶联物)的聚集百分比。
与实施例3一样，上表中的“样品名称”省略了连接子，举例说明：h28D4-HC-A114C-MMAE的全称为h28D4-HC-A114C-mc-vc-PAB-MMAE，其中h28D4表示亲代抗体，HC-A114C为半胱氨酸突变位点，mc-vc-PAB为连接子(样品名称中省略)，MMAE为细胞毒素(药物)。如无特别说明，本发明全文同此。
其中，HC-A114C、HC-A158C、HC-T160C、HC-S235C、LC-V191C位点Cys改造型的抗TPBG抗体药物定点偶联物的HIC-DAR平均值在1.5-2.0之间，且抗TPBG抗体药物定点偶联物单体纯度大于95％，为理想的偶联位点。而其它HC-Q338C、HC-N204C、HC-K322C、HC-S396C位点虽然HIC-DAR平均值在1.5-2.0之间，但抗体偶联MC-VC-PAB-MMAE后发生了一定的聚集，抗TPBG抗体药物定点偶联物单体纯度略有降低，为候选位点。
HC-A114C、HC-T160C、HC-S235C、LC-V191C位点Cys改造型的抗TPBG抗体药物定点偶联物的HIC-DAR具体分布如表2所示。h28D4-MMAE的具体HIC-DAR分布如表3所示。
表2
样品名称 DAR 0(％) DAR 1(％) DAR 2(％) 平均HIC-DAR
h28D4-HC-A114C-MMAE 0.35 14.86 84.79 1.84
h28D4-HC-T160C-MMAE 1.7 6.59 91.71 1.90
h28D4-HC-S235C-MMAE 0.68 17.52 81.8 1.81
h28D4-LC-V191C-MMAE 2.48 9.51 88.02 1.86
表3
Figure BDA0002304741760000261
如表2和3所示，h28D4-MMAE(ADC样品)由偶联不同数量药物的多个组分组成，通常由DAR0、DAR2、DAR4、DAR6、DAR8组成，样品均一性较差。与h28D4-MMAE(ADC样品)相比，TDC样品的均一性较好，主要组分为DAR 2的偶联物，占90％以上，没有偶联的裸抗(DAR 0)和偶联1个药(DAR 1)的组分的总和小于10％，若后期经过偶联工艺优化，可将DAR 2组分所占比例提到到95％以上，因此在样品均一性方面显示出显著的优越性，为后期工艺开发及样品鉴定提供了方便。
效果实施例3通过LC-MS分析药物的交联率
按照效果实施例2的LC-MS条件分析上述实施例3制得的抗TPBG抗体药物定点偶联物和按照CN201611206936.5的实施例四制备的h28D4-MMAE、h28D4-MMAF的交联率，结果如下：
表4
Figure BDA0002304741760000271
LC-MS分析结果显示，HC-T160C和HC-K322C型改造抗体偶联MC-VC-PAB-MMAE后MS-DAR分别为1.74和1.64，能达到与阳性对照HC-A114C和HC-S235C位点的MS-DAR结果1.71和1.78类似的效果。
LC-MS分析结果显示，HC-T160C改造抗体偶联MC-MMAF后MS-DAR为1.94，与阳性对照HC-A114C位点偶联MC-MMAF的MS-DAR结果1.76相比，有较大的优势。
抗TPBG抗体通过Cys随机偶联MC-VC-PAB-MMAE或MC-MMAF的MS-DAR值均在3.0-4.0范围内。
效果实施例4抗TPBG抗体MMAE、MMAF定点偶联物在不同细胞系中的体外活性检测
将上述实施例3制得的纯化的抗TPBG抗体药物定点偶联物、按照CN201611206936.5的实施例四制备的h28D4-MMAE、h28D4-MMAF分别用完全培养基进行梯度稀释，96孔细胞培养板以2000细胞/孔加入100微升TPBG阳性的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1568(购自ATCC，货号#CRL5876)细胞悬液过夜培养后，每孔分别加入10微升不同浓度的纯化的抗TPBG抗体药物定点偶联物的稀释液，继续培养5天后，用Cell Titer-Glo试剂盒(购自Promega，使用方法参照产品说明书)检测细胞活力。
同时选用TPBG弱表达的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975(购自ATCC，货号#CRL-5908)和乳腺癌细胞系MDA-MB-468(购自ATCC，货号#HTB-132)进行细胞杀伤活性检测，方法同上。
结果见表5～6和图2～7。
表5抗TPBG抗体MMAE偶联物TDCs与ADC对TPBG阳性细胞的杀伤作用
Figure BDA0002304741760000281
表6抗TPBG抗体MMAF偶联物TDCs与ADC对TPBG阳性细胞的杀伤作用
Figure BDA0002304741760000282
总体上看，在体外细胞杀伤实验中，纯化的抗TPBG抗体药物定点偶联物对具有不同TPBG表达水平的细胞(MDA-MB-468>NCI-H1568>NCI-H1975)有不同程度的杀伤作用，且偶联不同的小分子毒素MMAE或MMAF的抗TPBG抗体药物定点偶联物对同一株TPBG阳性细胞的细胞杀伤能力也不同。
抗TPBG抗体药物定点偶联MMAE对MDA-MB-468细胞的杀伤效果较为明显，实验组HC-T160C、HC-K322C和阳性对照组HC-A114C、HC-S235C相比，对MDA-MB-468细胞杀伤作用类似(结果如图4和表5所示)。
抗TPBG抗体药物定点偶联MMAF对H1568和MDA-MB-468细胞的杀伤作用较为明显。在H1568细胞中，定点偶联的实验组HC-T160C、HC-K322C和阳性组HC-A114C、HC-S235C的作用差别不大(结果如图5和表6所示)。在MDA-MB-468细胞中，定点偶联杀伤作用排序为HC-S235C>HC-K322C>HC-A114C>HC-T160C(结果如图7和表6所示)。
另外，所有的MMAE和MMAF定点偶联物对细胞的杀伤作用稍逊于MMAE和MMAF随机偶联组，原因可能是由于随机偶联组每个抗体偶联药物的个数在3.0-4.0之间，而定点偶联组每个抗体偶联药物在1.7-2.0之间，前者DAR是后者的2倍，所以对细胞的杀伤力略强，这与理论预期相符。
效果实施例5大鼠中抗TPBG抗体MMAE定点偶联物(TDC)与随机偶联物(ADC)的药物代谢动力学测试
通过单个静脉内推注射入Sprague-Dawley大鼠后，测量抗体药物偶联物的血清浓度，分析人源化抗TPBG抗体药物偶联物的体内部署。携带至少一个细胞毒性药物的抗体药物偶联物的浓度用ELISA进行检测，使用抗MMAE抗体进行捕捉并使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠Fc抗体进行检测。血清中总的人源化抗TPBG抗体及Thio抗TPBG抗体浓度用ELISA进行检测，使用抗人Fc抗体进行捕捉并使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠Fc抗体进行检测。血清样品最低稀释度为20倍，血清中总抗体(Total antibody，Tab)和抗体药物偶联物(ADC或TDC)检测的定量下限均为62.5ng/ml。最低稀释度1:10。使用具有IV推注输入、一阶消除和宏观速率常数的两隔室模型(Model 8，WinNonlinear Pro v.5.0.1,Pharsight Corporation,Mountain View,CA)分析了来自每只动物的不同采样时间点下的血清中的总抗体和偶联物的浓度数据。
在大鼠中进行的28天药动学分析的结果显示如图8～12。按3mg/kg标准给大鼠尾静脉注射上述实施例3制得的纯化的抗TPBG抗体药物定点偶联物h28D4-HC-T160C-MMAE(图8)、h28D4-LC-V191C-MMAE(图9)，阳性对照药物h28D4-HC-A114C-MMAE(图10)、h28D4-HC-S235C-MMAE(图11)、按照CN201611206936.5的实施例四制备的非定点偶联ADC药物h28D4-MMAE(图12)。在给药前、注射后10分钟、1小时、4小时、8小时及1、2、4、7、14、21和28天收集大鼠血清，并检测血清中相应Tab、TDC和ADC的浓度。结果如表7所示。
表7定点偶联物(TDCs)与传统偶联物(ADCs)的大鼠PK参数比较
Figure BDA0002304741760000291
Figure BDA0002304741760000301
CL：总清除率，值越高代表代谢或清除越快
Vss：稳态下的表观分布容积，值越高组织分布越广泛
V1：中央室的分布容积，该值应与实验动物每公斤体积的血清体积接近
Alpha t1/2:分布相半衰期，与分布速率相关
Beta t1/2：消除相半衰期，与消除速度相关
AUC:药时曲线下面积(area under concentration-time curve)，代表受试物在血清中的暴露量,一般时间下暴露量和药效直接相关
从结果来看，TDC(即述实施例3制得的纯化的抗TPBG抗体药物定点偶联物)在血清中的暴露量均高于ADC(即按照CN201611206936.5的实施例四制备的h28D4-MMAE)，TDC/ADC和Tab的AUC的比值从0.33至0.78不等，其中ADC的比值最低(0.33)，轻链定点偶联的TDC比值最高(0.78)，重链定点联抗TDC的比值介于前两者之间。总体而言，TPBG TDC药物与ADC药物相比(图8～12)，显示出较低的体内清除速度。实验组h28D4-HC-T160C-MMAE TDC组(图8)有类似于阳性对照的稳定性，而h28D4-LC-V191C-MMAE TDC组(图9)在大鼠体内的稳定性优于阳性对照。此对于改善治疗恶性肿瘤或其它病症的过程中对治疗剂的暴露，同时降低细胞毒性药物经由快速清除途径(包括代^t)清除的潜在有害效应可能是有利的。
效果实施例6抗TPBG抗体MMAE定点偶联物(TDC)与随机偶联物(ADC)的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975的小鼠异种移植瘤模型中的药效评价
将NCI-H1975(非小细胞肺癌细胞株，ATCC，CRL-5908)(2×106个)200μl接种于Balb/c nude小鼠右肋皮下，待7-10天肿瘤长至200mm3后，去除体重、肿瘤过大和过小的，按肿瘤体积将小鼠随机分为几组，每组7只。分组如表8，为不同剂量的上述实施例3制得的h28D4-HC-T160C-MMAE、h28D4-LC-V191C-MMAE，对照定点偶联物h28D4-HC-S235C-MMAE和按照CN201611206936.5的实施例四制备的随机偶联物h28D4-MMAE的治疗分组，药物剂量分别为10mg/kg(图13)和3mg/kg(图14)。D1开始尾静脉注射抗体，单次给药后，每周测2次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2；其中a、b分别表示长、宽。
表8不同剂量的人源化抗TPBG抗体药物偶联物在NCI-H1975小鼠异种移植瘤模型中的体内药效实验
Figure BDA0002304741760000311
如图13所示，定点偶联TDC h28D4-HC-T160C-MMAE、h28D4-LC-V191C-MMAE、h28D4-HC-S235C-MMAE和随机偶联ADC h28D4-MMAE的10mg/kg单次给药治疗组的肿瘤体积在给药后的25天中肿瘤基本消退。
如表9所示，肿瘤生长抑制率(Tumor growth inhibition，TGI)从给药后的第7天开始直至第25天观察结束TGI均大于90％，表现出了非常好的治疗效果。通常，TGI>90％说明处理组药物非常有效，TGI>58％说明处理组药物有效。
表9人源化抗TPBG抗体药物偶联物给药10mg/kg后NCI-H1975小鼠异种移植瘤模型中肿瘤生长抑制情况
Figure BDA0002304741760000321
图14和表10中，定点偶联TDC h28D4-HC-T160C-MMAE、h28D4-LC-V191C-MMAE、h28D4-HC-S235C-MMAE和随机偶联ADC h28D4-MMAE的3mg/kg单次给药治疗组的肿瘤体积在给药后的25天中不同的TDC显著出不同程度的抑制肿瘤生长效果，其中随机偶联ADCh28D4-MMAE和h28D4-HC-S235C-MMAE的TGI均大于90％说明处理组药物非常有效，但h28D4-HC-T160C-MMAE在第11天时TGI>58％说明处理组药物有效，h28D4-LC-V191C-MMAE在第18天时TGI>90％，随后续肿瘤有恢复生长趋势，但截止到最终观察点第25天时TGI仍大于58％。因此，所有偶联物均显示出了较好的疗效，虽然定点偶联TDC h28D4-HC-T160C-MMAE、h28D4-LC-V191C-MMAE及h28D4-HC-S235C-MMAE的载药量(DAR)只有随机偶联ADC h28D4-MMAE的一半(TDC和ADC的DAR值分别为～2和～4)，但TDC和ADC均对肿瘤生长均具有相当的抑制作用，且在10mg/kg处理组中甚至使肿瘤消退。虽然在低剂量治疗组后续持续观察中各处理组的肿瘤开始不同程度地缓慢恢复生长，但后续可通过调整给药方案，如给药频率和给药剂量等从而达到最佳疗效。
表10人源化抗TPBG抗体药物偶联物给药3mg/kg后NCI-H1975小鼠异种移植瘤模型中肿瘤生长抑制情况
Figure BDA0002304741760000322
Figure BDA0002304741760000331
图15和图16分别为10mg/kg和3mg/kg定点偶联TDC h28D4-HC-T160C-MMAE、h28D4-LC-V191C-MMAE、h28D4-HC-S235C-MMAE和随机偶联ADC h28D4-MMAE治疗后动物体重。结果显示，几种TDC和ADC可以很好的抑制肿瘤NCI-H1975的生长，而且对小鼠的体重没有显著的影响。
SEQUENCE LISTING
<110> 凯惠科技发展（上海）有限公司
<120> 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
<130> P19014778CF
<150> 201910181977.0
<151> 2019-03-11
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG抗体重链氨基酸序列
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Met Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG抗体轻链氨基酸序列
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG抗体重链可变区氨基酸序列
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Thr Gly Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Met Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG抗体轻链可变区氨基酸序列
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG抗体重链恒定区氨基酸序列
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG抗体轻链恒定区氨基酸序列
<400> 6
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 7
<211> 7914
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-VH.1b 质粒核苷酸序列
<400> 7
agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 60
gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 120
ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 180
tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 240
ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 300
gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360
aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420
tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480
tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540
ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600
ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660
gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720
tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780
gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840
aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900
ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960
gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020
ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080
cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140
gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gaagatctct 1200
agaagctggg taccgcccgg cgccaccatg gagtttgggc tgagctggct ttttcttgtc 1260
gcgattctta agggtgtcca gtgcgaggtg cagctggtgg aatcaggagg aggactggtg 1320
aagccaggcg gatctctgag actgtcttgc gccgccagcg gctttacatt cagcaactac 1380
gtgatgtctt ggatccggca ggcaccagga aagggactcg agtgggtggc agaaatcagc 1440
accggaggca gccacaccta ctacagcgac accgtgaccg gaaggttcac catcagccgg 1500
gacaacgcca agaagagcct gtacctgcag atgaacagcc tgagagccga ggacaccgcc 1560
gtgtactatt gcatcatgtt ctactacggc agcagctaca gcatggacta ttggggccag 1620
ggaaccaccg tgacagtgtc ttctgcttcg accaagggcc catcggtctt ccccctggca 1680
ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 1740
ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 1800
ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 1860
tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 1920
aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1980
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 2040
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 2100
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 2160
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2220
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 2280
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2340
accctgcccc catcccgcga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 2400
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2460
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2520
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2580
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagcg 2640
gccgctcgag gccggcaagg ccggatccag acatgataag atacattgat gagtttggac 2700
aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 2760
ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 2820
ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 2880
aatgtggtat ggctgattat gatccggctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa 2940
cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag 3000
cagacaagcc cgtcaggcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaggtc 3060
gactctagag gatcgatgcc ccgccccgga cgaactaaac ctgactacga catctctgcc 3120
ccttcttcgc ggggcagtgc atgtaatccc ttcagttggt tggtacaact tgccaactgg 3180
gccctgttcc acatgtgaca cgggggggga ccaaacacaa aggggttctc tgactgtagt 3240
tgacatcctt ataaatggat gtgcacattt gccaacactg agtggctttc atcctggagc 3300
agactttgca gtctgtggac tgcaacacaa cattgccttt atgtgtaact cttggctgaa 3360
gctcttacac caatgctggg ggacatgtac ctcccagggg cccaggaaga ctacgggagg 3420
ctacaccaac gtcaatcaga ggggcctgtg tagctaccga taagcggacc ctcaagaggg 3480
cattagcaat agtgtttata aggccccctt gttaacccta aacgggtagc atatgcttcc 3540
cgggtagtag tatatactat ccagactaac cctaattcaa tagcatatgt tacccaacgg 3600
gaagcatatg ctatcgaatt agggttagta aaagggtcct aaggaacagc gatatctccc 3660
accccatgag ctgtcacggt tttatttaca tggggtcagg attccacgag ggtagtgaac 3720
cattttagtc acaagggcag tggctgaaga tcaaggagcg ggcagtgaac tctcctgaat 3780
cttcgcctgc ttcttcattc tccttcgttt agctaataga ataactgctg agttgtgaac 3840
agtaaggtgt atgtgaggtg ctcgaaaaca aggtttcagg tgacgccccc agaataaaat 3900
ttggacgggg ggttcagtgg tggcattgtg ctatgacacc aatataaccc tcacaaaccc 3960
cttgggcaat aaatactagt gtaggaatga aacattctga atatctttaa caatagaaat 4020
ccatggggtg gggacaagcc gtaaagactg gatgtccatc tcacacgaat ttatggctat 4080
gggcaacaca taatcctagt gcaatatgat actggggtta ttaagatgtg tcccaggcag 4140
ggaccaagac aggtgaacca tgttgttaca ctctatttgt aacaagggga aagagagtgg 4200
acgccgacag cagcggactc cactggttgt ctctaacacc cccgaaaatt aaacggggct 4260
ccacgccaat ggggcccata aacaaagaca agtggccact cttttttttg aaattgtgga 4320
gtgggggcac gcgtcagccc ccacacgccg ccctgcggtt ttggactgta aaataagggt 4380
gtaataactt ggctgattgt aaccccgcta accactgcgg tcaaaccact tgcccacaaa 4440
accactaatg gcaccccggg gaatacctgc ataagtaggt gggcgggcca agataggggc 4500
gcgattgctg cgatctggag gacaaattac acacacttgc gcctgagcgc caagcacagg 4560
gttgttggtc ctcatattca cgaggtcgct gagagcacgg tgggctaatg ttgccatggg 4620
tagcatatac tacccaaata tctggatagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagc 4680
ataggctatc ctaatctata tctgggtagc atatgctatc ctaatctata tctgggtagt 4740
atatgctatc ctaatttata tctgggtagc ataggctatc ctaatctata tctgggtagc 4800
atatgctatc ctaatctata tctgggtagt atatgctatc ctaatctgta tccgggtagc 4860
atatgctatc ctaatagaga ttagggtagt atatgctatc ctaatttata tctgggtagc 4920
atatactacc caaatatctg gatagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat 4980
gctatcctaa tctatatctg ggtagcatag gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat 5040
gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat gctatcctaa tttatatctg ggtagcatag 5100
gctatcctaa tctatatctg ggtagcatat gctatcctaa tctatatctg ggtagtatat 5160
gctatcctaa tctgtatccg ggtagcatat gctatcctca tgcatataca gtcagcatat 5220
gatacccagt agtagagtgg gagtgctatc ctttgcatat gccgccacct cccaaggggg 5280
cgtgaatttt cgctgcttgt ccttttcctg ctgcttatcg atgataagct gtcaaacatg 5340
agaattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 5400
taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 5460
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 5520
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 5580
ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 5640
aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 5700
acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 5760
ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg 5820
gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 5880
atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 5940
acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 6000
tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 6060
ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgcagc aatggcaaca acgttgcgca 6120
aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 6180
aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 6240
ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 6300
atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 6360
aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 6420
accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 6480
tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 6540
tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 6600
tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 6660
cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 6720
caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 6780
cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 6840
cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 6900
gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 6960
acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 7020
atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 7080
cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 7140
gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 7200
tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgaagctgtc cctgatggtc gtcatctacc 7260
tgcctggaca gcatggcctg caacgcgggc atcccgatgc cgccggaagc gagaagaatc 7320
ataatgggga aggccatcca gcctcgcgtc gcgaacgcca gcaagacgta gcccagcgcg 7380
tcggccccga gatgcgccgc gtgcggctgc tggagatggc ggacgcgatg gatatgttct 7440
gccaagggtt ggtttgcgca ttcacagttc tccgcaagaa ttgattggct ccaattcttg 7500
gagtggtgaa tccgttagcg aggtgccgcc ctgcttcatc cccgtggccc gttgctcgcg 7560
tttgctggcg gtgtcactgg ccccgtgggt tagggacggg gtcccccatg gggaatggtt 7620
tatggttcgt gggggttatt attttgggcg ttgcgtgggg tcaggtccac gactggactg 7680
agcagacaga cccatggttt ttggatggcc tgggcatgga ccgcatgtac tggcgcgaca 7740
cgaacaccgg gcgtctgtgg ctgccaaaca cccccgaccc ccaaaaacca ccgcgcggat 7800
ttctggcgtg ccaagctagt cgaccaattc tcatgtttga cagcttatca tcgcagatcc 7860
gggcaacgtt gttgccattg ctgcaggcgc agaactggta ggtatggaag atct 7914
<210> 8
<211> 7216
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-VK.1 质粒核苷酸序列
<400> 8
agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 60
gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 120
ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 180
tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 240
ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 300
gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg 360
aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 420
tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 480
tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 540
ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 600
ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 660
gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 720
tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 780
gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 840
aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 900
ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 960
gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 1020
ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 1080
cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 1140
gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gaagatctct 1200
agaagctggg taccgcccgg gcgccaccat ggacatgcgc gtgcccgccc agctgctggg 1260
cctgctgctg ctgtggttcc ccggctcgcg atgcgacatc cagatgaccc agagccctag 1320
cagcctgagc gccagcgtgg gagatagagt gaccatcacc tgtagagcca gccaggacat 1380
ccggaactac ctgaattggt atcagcagaa gcccggcaag gcccctaagc tgctgatcta 1440
ccacaccagc agactgcaca gcggagtgcc ttctagattc agcggcagcg gaagcggcac 1500
agatttcacc ttcaccatca gcagcctgca gcccgaggac atcgccacct actattgcca 1560
gcagggcgac acactgcctc tgacctttgg acagggaacc aggctggaga tcaagcgtac 1620
ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac 1680
tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa 1740
ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa 1800
ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca 1860
caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt 1920
caacagggga gagtgttgag cggccgctcg aggccggcaa ggccggatcc agacatgata 1980
agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 2040
tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 2100
aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 2160
taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggctgatt atgatccggc tgcctcgcgc 2220
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 2280
gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggc gtcagcgggt gttggcgggt 2340
gtcggggcgc agccatgagg tcgactctag aggatcgatg ccccgccccg gacgaactaa 2400
acctgactac gacatctctg ccccttcttc gcggggcagt gcatgtaatc ccttcagttg 2460
gttggtacaa cttgccaact gggccctgtt ccacatgtga cacggggggg gaccaaacac 2520
aaaggggttc tctgactgta gttgacatcc ttataaatgg atgtgcacat ttgccaacac 2580
tgagtggctt tcatcctgga gcagactttg cagtctgtgg actgcaacac aacattgcct 2640
ttatgtgtaa ctcttggctg aagctcttac accaatgctg ggggacatgt acctcccagg 2700
ggcccaggaa gactacggga ggctacacca acgtcaatca gaggggcctg tgtagctacc 2760
gataagcgga ccctcaagag ggcattagca atagtgttta taaggccccc ttgttaaccc 2820
taaacgggta gcatatgctt cccgggtagt agtatatact atccagacta accctaattc 2880
aatagcatat gttacccaac gggaagcata tgctatcgaa ttagggttag taaaagggtc 2940
ctaaggaaca gcgatatctc ccaccccatg agctgtcacg gttttattta catggggtca 3000
ggattccacg agggtagtga accattttag tcacaagggc agtggctgaa gatcaaggag 3060
cgggcagtga actctcctga atcttcgcct gcttcttcat tctccttcgt ttagctaata 3120
gaataactgc tgagttgtga acagtaaggt gtatgtgagg tgctcgaaaa caaggtttca 3180
ggtgacgccc ccagaataaa atttggacgg ggggttcagt ggtggcattg tgctatgaca 3240
ccaatataac cctcacaaac cccttgggca ataaatacta gtgtaggaat gaaacattct 3300
gaatatcttt aacaatagaa atccatgggg tggggacaag ccgtaaagac tggatgtcca 3360
tctcacacga atttatggct atgggcaaca cataatccta gtgcaatatg atactggggt 3420
tattaagatg tgtcccaggc agggaccaag acaggtgaac catgttgtta cactctattt 3480
gtaacaaggg gaaagagagt ggacgccgac agcagcggac tccactggtt gtctctaaca 3540
cccccgaaaa ttaaacgggg ctccacgcca atggggccca taaacaaaga caagtggcca 3600
ctcttttttt tgaaattgtg gagtgggggc acgcgtcagc ccccacacgc cgccctgcgg 3660
ttttggactg taaaataagg gtgtaataac ttggctgatt gtaaccccgc taaccactgc 3720
ggtcaaacca cttgcccaca aaaccactaa tggcaccccg gggaatacct gcataagtag 3780
gtgggcgggc caagataggg gcgcgattgc tgcgatctgg aggacaaatt acacacactt 3840
gcgcctgagc gccaagcaca gggttgttgg tcctcatatt cacgaggtcg ctgagagcac 3900
ggtgggctaa tgttgccatg ggtagcatat actacccaaa tatctggata gcatatgcta 3960
tcctaatcta tatctgggta gcataggcta tcctaatcta tatctgggta gcatatgcta 4020
tcctaatcta tatctgggta gtatatgcta tcctaattta tatctgggta gcataggcta 4080
tcctaatcta tatctgggta gcatatgcta tcctaatcta tatctgggta gtatatgcta 4140
tcctaatctg tatccgggta gcatatgcta tcctaataga gattagggta gtatatgcta 4200
tcctaattta tatctgggta gcatatacta cccaaatatc tggatagcat atgctatcct 4260
aatctatatc tgggtagcat atgctatcct aatctatatc tgggtagcat aggctatcct 4320
aatctatatc tgggtagcat atgctatcct aatctatatc tgggtagtat atgctatcct 4380
aatttatatc tgggtagcat aggctatcct aatctatatc tgggtagcat atgctatcct 4440
aatctatatc tgggtagtat atgctatcct aatctgtatc cgggtagcat atgctatcct 4500
catgcatata cagtcagcat atgataccca gtagtagagt gggagtgcta tcctttgcat 4560
atgccgccac ctcccaaggg ggcgtgaatt ttcgctgctt gtccttttcc tgctgcttat 4620
cgatgataag ctgtcaaaca tgagaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta 4680
tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 4740
ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 4800
ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 4860
attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 4920
gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 4980
ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 5040
cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt 5100
gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 5160
tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 5220
gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 5280
ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 5340
tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgca 5400
gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 5460
caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 5520
cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 5580
atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 5640
gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 5700
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 5760
cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 5820
atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 5880
tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 5940
ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 6000
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 6060
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 6120
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 6180
gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 6240
acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 6300
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 6360
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 6420
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 6480
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgaagctg 6540
tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat 6600
gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc 6660
cagcaagacg tagcccagcg cgtcggcccc gagatgcgcc gcgtgcggct gctggagatg 6720
gcggacgcga tggatatgtt ctgccaaggg ttggtttgcg cattcacagt tctccgcaag 6780
aattgattgg ctccaattct tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ccctgcttca 6840
tccccgtggc ccgttgctcg cgtttgctgg cggtgtcact ggccccgtgg gttagggacg 6900
gggtccccca tggggaatgg tttatggttc gtgggggtta ttattttggg cgttgcgtgg 6960
ggtcaggtcc acgactggac tgagcagaca gacccatggt ttttggatgg cctgggcatg 7020
gaccgcatgt actggcgcga cacgaacacc gggcgtctgt ggctgccaaa cacccccgac 7080
ccccaaaaac caccgcgcgg atttctggcg tgccaagcta gtcgaccaat tctcatgttt 7140
gacagcttat catcgcagat ccgggcaacg ttgttgccat tgctgcaggc gcagaactgg 7200
taggtatgga agatct 7216
<210> 9
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG突变抗体重链恒定区氨基酸序列
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Cys Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗TPBG突变抗体轻链恒定区氨基酸序列
<400> 10
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Cys Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-A114C引物1的核苷酸序列
<400> 11
ccaccgtgac agtgtcttct tgctcgacca agggcccatc ggt 43
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-A114C引物2的核苷酸序列
<400> 12
accgatgggc ccttggtcga gcaagaagac actgtcacgg tgg 43
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S115C引物1的核苷酸序列
<400> 13
acagtgtcca gcgcttgcac caagggccca tcg 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S115C引物2的核苷酸序列
<400> 14
cgatgggccc ttggtgcaag cgctggacac tgt 33
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S132C引物1的核苷酸序列
<400> 15
caccctcctc caagagcacc tgtgggggca cagcggccct ggg 43
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S132C引物2的核苷酸序列
<400> 16
cccagggccg ctgtgccccc acaggtgctc ttggaggagg gtg 43
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-G134C引物1的核苷酸序列
<400> 17
aagagcacct ctgggtgcac agcggccctg ggc 33
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-G134C引物2的核苷酸序列
<400> 18
gcccagggcc gctgtgcacc cagaggtgct ctt 33
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-K143C引物1的核苷酸序列
<400> 19
cggccctggg ctgcctggtc tgcgactact tccccgaacc ggt 43
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-K143C引物2的核苷酸序列
<400> 20
accggttcgg ggaagtagtc gcagaccagg cagcccaggg ccg 43
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-T151C引物1的核苷酸序列
<400> 21
actacttccc cgaaccggtg tgcgtgtcgt ggaactcagg cgc 43
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-T151C引物2的核苷酸序列
<400> 22
gcgcctgagt tccacgacac gcacaccggt tcggggaagt agt 43
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-A158C引物1的核苷酸序列
<400> 23
cggtgtcgtg gaactcaggc tgcctgacca gcggcgtgca cac 43
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-A158C引物2的核苷酸序列
<400> 24
gtgtgcacgc cgctggtcag gcagcctgag ttccacgaca ccg 43
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-T160C引物1的核苷酸序列
<400> 25
aactcaggcg ccctgtgcag cggcgtgcac acc 33
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-T160C引物2的核苷酸序列
<400> 26
ggtgtgcacg ccgctgcaca gggcgcctga gtt 33
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S161C引物1的核苷酸序列
<400> 27
ggaactcagg cgccctgacc tgcggcgtgc acaccttccc ggc 43
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S161C引物2的核苷酸序列
<400> 28
gccgggaagg tgtgcacgcc gcaggtcagg gcgcctgagt tcc 43
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S172C引物1的核苷酸序列
<400> 29
ccggctgtcc tacagtgctc aggactctac tcc 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S172C引物2的核苷酸序列
<400> 30
ggagtagagt cctgagcact gtaggacagc cgg 33
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-G190C引物1的核苷酸序列
<400> 31
ccctccagca gcttgtgcac ccagacctac atc 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-G190C引物2的核苷酸序列
<400> 32
gatgtaggtc tgggtgcaca agctgctgga ggg 33
<210> 33
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-T191C引物1的核苷酸序列
<400> 33
tgccctccag cagcttgggc tgccagacct acatctgcaa cgtg 44
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-T191C引物2的核苷酸序列
<400> 34
cacgttgcag atgtaggtct ggcagcccaa gctgctggag ggca 44
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-N204C引物1的核苷酸序列
<400> 35
aatcacaagc ccagctgcac caaggtggac aag 33
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-N204C引物2的核苷酸序列
<400> 36
cttgtccacc ttggtgcagc tgggcttgtg att 33
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S235C引物1的核苷酸序列
<400> 37
ctgaactcct ggggggaccg tgtgtcttcc tcttcccccc aaa 43
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S235C引物2的核苷酸序列
<400> 38
tttgggggga agaggaagac acacggtccc cccaggagtt cag 43
<210> 39
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-K322C引物1的核苷酸序列
<400> 39
acaagtgcaa ggtctccaac tgcgccctcc cagcccccat cga 43
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-K322C引物2的核苷酸序列
<400> 40
tcgatggggg ctgggagggc gcagttggag accttgcact tgt 43
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-Q338C引物1的核苷酸序列
<400> 41
ccatctccaa agccaaaggg tgcccccgag aaccacaggt gta 43
<210> 42
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-Q338C引物2的核苷酸序列
<400> 42
tacacctgtg gttctcgggg gcaccctttg gctttggaga tgg 43
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-N380C引物1的核苷酸序列
<400> 43
tcgccgtgga gtgggagagc tgcgggcagc cggagaacaa cta 43
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-N380C引物2的核苷酸序列
<400> 44
tagttgttct ccggctgccc gcagctctcc cactccacgg cga 43
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S396C引物1的核苷酸序列
<400> 45
cctcccgtgc tggactgcga cggctccttc ttc 33
<210> 46
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-HC-S396C引物2的核苷酸序列
<400> 46
gaagaaggag ccgtcgcagt ccagcacggg agg 33
<210> 47
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-T109C引物1的核苷酸序列
<400> 47
ccaggctgga gatcaagcgt tgcgtggctg caccatctgt cttc 44
<210> 48
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-T109C引物2的核苷酸序列
<400> 48
gaagacagat ggtgcagcca cgcaacgctt gatctccagc ctgg 44
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-K145C引物1的核苷酸序列
<400> 49
acttctatcc cagagaggcc tgcgtacagt ggaaggtgga taac 44
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-K145C引物2的核苷酸序列
<400> 50
gttatccacc ttccactgta cgcaggcctc tctgggatag aagt 44
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-N152C引物1的核苷酸序列
<400> 51
aagtacagtg gaaggtggat tgcgccctcc aatcgggtaa ctc 43
<210> 52
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-N152C引物2的核苷酸序列
<400> 52
gagttacccg attggagggc gcaatccacc ttccactgta ctt 43
<210> 53
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-A153C引物1的核苷酸序列
<400> 53
tacagtggaa ggtggataac tgcctccaat cgggtaactc cc 42
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-A153C引物2的核苷酸序列
<400> 54
gggagttacc cgattggagg cagttatcca ccttccactg ta 42
<210> 55
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC- K169C引物1的核苷酸序列
<400> 55
gtgtcacaga gcaggacagc tgcgacagca cctacagcct cag 43
<210> 56
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC- K169C引物2的核苷酸序列
<400> 56
ctgaggctgt aggtgctgtc gcagctgtcc tgctctgtga cac 43
<210> 57
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-V191C引物1的核苷酸序列
<400> 57
cagactacga gaaacacaaa tgctacgcct gcgaagtcac cc 42
<210> 58
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h28D4-LC-V191C引物2的核苷酸序列
<400> 58
gggtgacttc gcaggcgtag catttgtgtt tctcgtagtc tg 42
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEF1a的核苷酸序列
<400> 59
gccctttttg agtttgga 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSV40的核苷酸序列
<400> 60
cactgcattc tagttgtg 18

Claims (36)

1.一种抗体，其包括重链和轻链，其重链恒定区为人源γ1链，其轻链恒定区为人源κ链，其特征在于，其A位点和/或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；其中，
(1)所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、161、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点中的一个或多个；
(2)所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、152、153、169和191位点中的一个或多个；
当所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114或235位点时，所述的抗体的重链恒定区为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链；
所述位点根据kabat编号系统编号。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的重链的数目为两条；
和/或，所述的(1)中的“多个”为2个、3个、4个、5个或6个；
和/或，在所述的替换前，所述的A位点的氨基酸残基为丙氨酸或谷氨酰胺；
和/或，所述的抗体的轻链的数目为两条；
和/或，所述的(2)中的“多个”为2个、3个、4个、5个或6个；
和/或，在所述的替换前，所述的B位点的氨基酸残基为缬氨酸；
和/或，所述的抗体的重链可变区为与人TPBG结合的人源IgG1的重链可变区；
和/或，所述的抗体的轻链可变区为与人TPBG结合的人源IgG1的轻链可变区；
和/或，在所述的替换前，所述的人源γ1链为野生型人源γ1链或突变型人源γ1链；
和/或，在所述的替换前，所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、161、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点中的一个或多个的氨基酸残基不为半胱氨酸残基；
和/或，在所述的替换前，所述的人源κ链为野生型人源κ链或突变型人源κ链；
和/或，在所述的替换前，所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、152、153、169和191位点中的一个或多个的氨基酸残基不为半胱氨酸残基；
和/或，采用所述的抗体制得的抗体药物定点偶联物的DAR为1.5～2.0，所述的DAR通过HPLC-HIC或LC-MS测定；
和/或，采用所述的抗体制得的抗体药物定点偶联物的单体百分比大于90％。
3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述的(1)中的“多个”为2个或3个；
和/或，所述的(2)中的“多个”为2个或3个；
和/或，所述的抗体的重链可变区为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的可变区；
和/或，所述的抗体的轻链可变区为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的可变区；
和/或，所述的抗体的重链恒定区中，被替代的A位点的氨基酸残基不为半胱氨酸残基；
和/或，所述的抗体的轻链恒定区中，被替代的B位点的氨基酸残基不为半胱氨酸残基；
和/或，采用所述的抗体制得的抗体药物定点偶联物的DAR为1.8～2.0，所述的DAR通过HPLC-HIC或LC-MS测定；
和/或，采用所述的抗体制得的抗体药物定点偶联物的单体百分比大于95％。
4.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，在所述的替换前，所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、161、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点的氨基酸残基均不为半胱氨酸残基；
和/或，在所述的替换前，所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、152、153、169和191位点的氨基酸残基均不为半胱氨酸残基。
5.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，在所述的替换前，所述的人源γ1链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链；
和/或，在所述的替换前，所述的人源κ链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链。
6.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述的(1)中的“多个”为2个；
和/或，所述的(2)中的“多个”为2个；
和/或，在所述的替换后，所述的人源γ1链为如序列表SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的人源γ1链；
和/或，在所述的替换后，所述的人源κ链为如序列表SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的人源κ链。
7.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，在所述的替换前，所述的抗体的重链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链；
和/或，在所述的替换前，所述的抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链。
8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；
和/或，当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、115、132、134、143、151、158、160、172、190、191、204、235、322、338、380和396位点中的一个或多个；
和/或，当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的A位点的数量为一个；
和/或，当所述的B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第109、145、153和191位点中的一个或多个；
和/或，当所述的B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的B位点的数量为一个。
9.如权利要求8所述的抗体，其特征在于，当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338和396位点中的一个或多个；
和/或，当所述的B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点。
10.如权利要求9所述的抗体，其特征在于，当所述的A位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸时，所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160和235位点中的一个或多个。
11.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点。
12.如权利要求11所述的抗体，其特征在于，其参数如下任一方案所述：
(1)所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160或235位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
(2)所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的A位点的氨基酸残基为丙氨酸或谷氨酰胺，所述的B位点的氨基酸残基为缬氨酸；
(3)所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的人源γ1链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链，和/或，所述的人源κ链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链；
(4)所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
所述的抗体的重链可变区为如序列表SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的可变区，和/或，所述的抗体的轻链可变区为如序列表SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的可变区。
13.如权利要求12所述的抗体，其特征在于，其参数如下任一方案所述：
(5)在所述的替换后，所述的人源γ1链为如序列表SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的人源γ1链，所述的人源κ链为如序列表SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的人源κ链；
(6)在所述的替换后，所述的人源γ1链为如序列表SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的人源γ1链，所述的人源κ链为如序列表SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的人源κ链。
14.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的抗体的重链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链，和/或，所述的抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链。
15.如权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述的A位点或B位点的氨基酸残基替换为半胱氨酸；所述的A位点为所述的抗体的重链恒定区的第114、158、160、204、235、322、338或396位点，所述的B位点为所述的抗体的轻链恒定区的第191位点；
在所述的替换前，所述的抗体的重链为如序列表SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链，所述的抗体的轻链为如序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链。
16.一种抗体片段，其为如权利要求1～15中任一项所述的抗体的Fc段、Fab或F(ab’)2。
17.一种核酸，其编码如权利要求1～15中任一项所述的抗体或如权利要求16所述的抗体片段。
18.一种核酸，其编码如权利要求1～15中任一项所述的抗体的重链或如权利要求16所述的抗体片段的重链。
19.一种核酸，其编码如权利要求1～15中任一项所述的抗体的重链恒定区或如权利要求16所述的抗体片段的重链恒定区。
20.一种核酸，其编码如权利要求1～15中任一项所述的抗体的轻链或如权利要求16所述的抗体片段的轻链。
21.一种核酸，其编码如权利要求1～15中任一项所述的抗体的轻链恒定区或如权利要求16所述的抗体片段的轻链恒定区。
22.一种重组表达载体，其包含如权利要求17～21中任一项所述的核酸。
23.一种重组表达转化体，其包含如权利要求22所述的重组表达载体。
24.一种细胞或细胞系，其包含如权利要求22所述的重组表达载体。
25.一种如权利要求1～15中任一项所述的抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求23所述的重组表达转化体、如权利要求24所述的细胞或细胞系，获得抗体即可。
26.一种如权利要求1～15中任一项所述的抗体或权利要求16所述的抗体片段在制备药物中的应用。
27.如权利要求25所述的应用，所述的药物为抗肿瘤药物。
28.一种药物组合物，其包括如权利要求1～15中任一项所述的抗体和药用辅料。
29.一种检测过表达人TPBG的细胞的方法，其包括如下的步骤：将如权利要求1～15中任一项所述的抗体与待测样品混合即可；所述的抗体的重链可变区为与人TPBG结合的重链可变区；所述的抗体的轻链可变区为与人TPBG结合的轻链可变区。
30.一种如权利要求1～15中任一项所述的抗体或权利要求16所述的抗体片段在制备抗体药物偶联物中的应用。
31.一种抗体药物偶联物Ab-(L-D)n；
其中，所述的Ab为如权利要求1～15中任一项所述的抗体，所述的L为连接子，所述的D为细胞毒剂，所述的n为0～2.0，但不为0；
所述的Ab中“经所述的替换形成的半胱氨酸残基”，通过所述的L与所述的D连接。
32.如权利要求31所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的连接子为马来酰亚胺基己酰、马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；
和/或，所述的细胞毒剂为甲基奥瑞他汀E、甲基奥瑞他汀F或N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基-美登素；
和/或，所述的抗体药物偶联物为抗体药物定点偶联物；
和/或，所述的n为1.5～2.0。
33.如权利要求32所述的抗体药物偶联物，其特征在于，其为下述任一抗体药物偶联物：
表A
Figure FDA0002304741750000051
Figure FDA0002304741750000061
所述的表A中，马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇的左端与所述的Ab连接，其右端与所述的细胞毒剂连接，所述的n通过HPLC-HIC测定；
表B
抗体 连接子 细胞毒剂 n h28D4-HC-A114C MC-VC-PAB MMAE 1.71 h28D4-HC-T160C MC-VC-PAB MMAE 1.74 h28D4-HC-S235C MC-VC-PAB MMAE 1.78 h28D4-HC-K322C MC-VC-PAB MMAE 1.64 h28D4-HC-N380C MC-VC-PAB MMAE 1.37 h28D4-HC-N204C MC-VC-PAB MMAE 0.99
所述的表B中，马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇的左端与所述的Ab连接，其右端与所述的细胞毒剂连接，所述的n通过LC-MS测定；
表C
抗体 连接子 细胞毒剂 n h28D4-HC-A114C MC MMAF 1.76 h28D4-HC-S235C MC MMAF 1.78 h28D4-HC-T160C MC MMAF 1.94 h28D4-HC-K322C MC MMAF 1.74
所述的表C中，马来酰亚胺基己酰的马来酰端与所述的Ab连接，其己酰端与所述的细胞毒剂连接，所述的n通过LC-MS测定。
34.一种如权利要求31～33中任一项所述的抗体药物偶联物在制备药物中的应用。
35.如权利要求34所述的应用，所述的药物为抗肿瘤药物。
36.一种药物组合物，其包括如权利要求31～33中任一项所述的抗体药物偶联物和药用辅料。
CN201911235374.0A 2019-03-11 2019-12-05 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用 Active CN111675762B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311656470.9A CN117843795A (zh) 2019-03-11 2019-12-05 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910181977 2019-03-11
CN2019101819770 2019-03-11

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311656470.9A Division CN117843795A (zh) 2019-03-11 2019-12-05 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111675762A true CN111675762A (zh) 2020-09-18
CN111675762B CN111675762B (zh) 2023-12-01

Family

ID=72427199

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911235374.0A Active CN111675762B (zh) 2019-03-11 2019-12-05 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
CN202311656470.9A Pending CN117843795A (zh) 2019-03-11 2019-12-05 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311656470.9A Pending CN117843795A (zh) 2019-03-11 2019-12-05 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (2) CN111675762B (zh)
WO (1) WO2020181846A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115850449A (zh) * 2022-09-29 2023-03-28 苏州智核生物医药科技有限公司 抗体和缀合物

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3234604A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Shelley Erin ACKERMAN Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2864872A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Alteogen Inc. Modified antibody in which motif comprising cysteine residue is bound
WO2014137931A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to 5t4
CN105143271A (zh) * 2013-02-08 2015-12-09 Irm责任有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
US20160008485A1 (en) * 2011-12-23 2016-01-14 Pfizer Inc. Engineered Antibody Constant Regions for Site-Specific Conjugation and Methods and Uses Therefor
US20160130358A1 (en) * 2014-09-12 2016-05-12 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20170021033A1 (en) * 2014-03-12 2017-01-26 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
CN106456794A (zh) * 2014-05-22 2017-02-22 斯索恩生物制药有限公司 接头药物与抗体的位点特异性缀合以及所得adc
CN106916227A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN107335062A (zh) * 2010-06-08 2017-11-10 基因泰克公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
CN108348608A (zh) * 2015-11-24 2018-07-31 斯索恩生物制药有限公司 抗5t4抗体和抗体-药物缀合物
CN108690136A (zh) * 2017-04-05 2018-10-23 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种人源化抗tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN108727499A (zh) * 2018-04-24 2018-11-02 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
CN108743966A (zh) * 2018-04-24 2018-11-06 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090068178A1 (en) * 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
BRPI0516284A (pt) * 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
GB0920324D0 (en) * 2009-11-19 2010-01-06 Ucb Pharma Sa Antibodies
PL2968494T3 (pl) * 2013-03-13 2019-04-30 Seattle Genetics Inc Filtracja z węglem aktywnym do oczyszczania benzodiazepinowych ADC

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107335062A (zh) * 2010-06-08 2017-11-10 基因泰克公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
US20160008485A1 (en) * 2011-12-23 2016-01-14 Pfizer Inc. Engineered Antibody Constant Regions for Site-Specific Conjugation and Methods and Uses Therefor
CA2864872A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Alteogen Inc. Modified antibody in which motif comprising cysteine residue is bound
WO2013125891A1 (ko) * 2012-02-24 2013-08-29 (주)알테오젠 시스테인 잔기를 포함하는 모티프가 결합된 변형항체, 상기 변형항체를 포함하는 변형항체-약물 접합체 및 그 제조방법
CN105143271A (zh) * 2013-02-08 2015-12-09 Irm责任有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
WO2014137931A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to 5t4
US20170021033A1 (en) * 2014-03-12 2017-01-26 Novartis Ag Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates
CN106659800A (zh) * 2014-03-12 2017-05-10 诺华股份有限公司 用于修饰抗体以制备免疫缀合物的特定位点
CN106456794A (zh) * 2014-05-22 2017-02-22 斯索恩生物制药有限公司 接头药物与抗体的位点特异性缀合以及所得adc
US20160130358A1 (en) * 2014-09-12 2016-05-12 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN108348608A (zh) * 2015-11-24 2018-07-31 斯索恩生物制药有限公司 抗5t4抗体和抗体-药物缀合物
CN106916227A (zh) * 2015-12-24 2017-07-04 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN108690136A (zh) * 2017-04-05 2018-10-23 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种人源化抗tpbg抗体及其制备方法、其偶联物和应用
CN108727499A (zh) * 2018-04-24 2018-11-02 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
CN108743966A (zh) * 2018-04-24 2018-11-06 四川百利药业有限责任公司 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HILSCHMANN,N.等: "RecName: Full=Immunoglobulin kappa constant; AltName: Full=Ig kappa chain C region; AltName: Full=Ig kappa chain C region AG; AltName: Full=Ig kappa chain C region CUM; AltName: Full=Ig kappa chain C region EU; AltName: Full=Ig kappa chain C region OU; AltName...", 《GENBANK DATABASE》 *
L. NATHAN TUMEY: "Site Selection: a Case Study in the Identification of Optimal Cysteine Engineered Antibody Drug Conjugates", 《THE AAPS JOURNAL 》 *
于传飞等: "一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物的药物看他偶联比测定", 《中国新药杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115850449A (zh) * 2022-09-29 2023-03-28 苏州智核生物医药科技有限公司 抗体和缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020181846A1 (zh) 2020-09-17
CN117843795A (zh) 2024-04-09
CN111675762B (zh) 2023-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111675762B (zh) 一种含半胱氨酸的抗体、药物偶联物及其应用
US5955073A (en) Selective RNase cytotoxic reagents
DK2628746T3 (en) A method for the concentration of a polypeptide
AU2018345303A1 (en) Fusion proteins comprising enzyme replacement therapy enzymes
MX2014001238A (es) Anticuerpos contra poliubiquitina y métodos de uso.
JP2019507103A (ja) 抗呼吸器合胞体ウイルスの完全ヒト抗体
WO2017092375A1 (zh) 一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用
TW200817436A (en) Antigen binding molecules that bind EGRF, vectors encoding same, and uses thereof
CN107787329B (zh) 以高亲和力、亲和性及特异性结合转化生长因子-β1的经修饰的IgG抗体
CN108623692B (zh) 一种融合蛋白及其制备方法和其应用
CN112074264A (zh) 源自包括编码靶蛋白的多核苷酸的重组微生物的细胞外囊泡以及其用途
KR20220003000A (ko) 인플루엔자 a형 감염 치료용 항체 및 방법
CN110028584A (zh) 针对egfr蛋白和met蛋白的双特异性抗体
KR101981943B1 (ko) 항-cd43 항체 및 이의 암 치료 용도
WO2008141449A1 (en) Single-domain antibodies and heavy chain antibody against egfr and uses thereof
KR20140004632A (ko) DCC의 제 5 피브로넥틴 유형 III 도메인의 재조합 Fc-융합 단백질
CN101410408A (zh) 用于浓缩多肽的方法
DK2538968T3 (en) PROCEDURE FOR THE PREPARATION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT LYSOSOMAL ALFA MANNOSIDASE
CA2969220A1 (en) Methods and compositions related to functional polypeptides embedded in heterologous protein scaffolds
KR102510154B1 (ko) 비만유래 2형 당뇨 예방 및 치료를 위한 내장지방 대식세포 표적 비바이러스성 유전자／전달체 복합체
CN111440774A (zh) 稳定表达敲入egfp的ifngr2基因黑色素瘤b-16细胞系的构建方法
CN113272320A (zh) 自杀基因
WO2016033168A1 (en) Polypeptides and their use for treating influenza
US20030199073A1 (en) Production of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase
US11332546B2 (en) Protease inhibitory antibodies and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant