KR20220003000A - 인플루엔자 a형 감염 치료용 항체 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 감염을 중화시키는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 이를 암호화하는 핵산 및 영구증식된 B 세포 및 이러한 항체를 생산하는 배양된 혈장 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 A형 감염의 예방 및 치료시 본 발명의 항체의 용도를 제공한다.

Description

인플루엔자 A형 감염 치료용 항체 및 방법
본 발명은 인플루엔자 A형 감염을 강력하게 감소시키는 항체 및 이러한 항체의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인플루엔자 A형 감염의 예방 및 치료에 관한 것이다.
인플루엔자는 매년 발생하여 세계적으로 확산됨으로써 매년 약 3백만 내지 5백만 경우의 심각한 질병 및 약 290,000 내지 650,000명의 호흡기 사망(WHO,Influenza (Seasonal) Fact sheet, 2018년 11월 6일)을 야기한다. 가장 일반적인 증상은: 열의 급속한 발병, 기침(일반적으로 마른), 두통, 근육 및 관절 통증, 심각한 불쾌감(malaise)(편치않은 느낌(feeling unwell)), 인후염(sore throat) 및 콧물(runny nose)을 포함한다. 일반적으로 증상이 바이러스에 노출 후 약 2일째에 시작하지만, 잠복기(incubation period)는 1 내지 4일 사이에서 변한다. 인플루엔자의 합병증은 폐렴(pneumonia), 부비동 감염(sinus infection), 및 이전 건강 문제의 악화, 예를 들면, 천식(asthma) 또는 심 부전(heart failure), 패혈증(sepsis) 또는 만성 기저 질환(chronic underling disease)의 악화를 포함할 수 있다.
인플루엔자는 음성-센스(negative-sense), 단일-가닥의, 분절화된(segmented) RNA 게놈을 함유하는 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 과(family)의 바이러스의 항원적으로 및 유전적으로 다양한 그룹인, 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된다. 인플루엔자 바이러스의 4개의 유형(A, B, C 및 D) 중에서, 3개의 유형(A, B 및 C)은 사람에게 영향을 미친다. 인플루엔자 A형 바이러스는 가장 악성의(virulent) 사람 병원체이며 가장 심각한 질환을 유발한다. 인플루엔자 A형 바이러스는 존재하는 주요 표면 단백질의 상이한 아형(subtype)을 기반으로 분류될 수 있다: 헤마글루티닌(Hemagglutinin)(HA) 및 뉴라미니다제(Neuraminidase)(NA). 이의 헤마글루티닌("HA") 단백질에 의해 정의된 적어도 18개의 인플루엔자 A형 아형이 존재한다. HA는 2개의 그룹으로 분류될 수 있다. 그룹 1은 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 및 H17 아형을 포함하고, 그룹 2는 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15 아형을 포함한다. 모든 아형이 조류 속에 존재하지만, 대부분의 H1, H2 및 H3 아형은 사람에서 질환을 유발한다. H5, H7 및 H9 아형은 사람에서 산발적인 심각한 감염을 유발하며 새로운 유행병을 생성할 수 있다. 인플루엔자 A형 바이러스는 지속적으로 발달하여, 항원 변이(antigenic drift)로 불리는 현상인, 새로운 변이체를 생성한다. 그 결과, 과거의 바이러스에 대한 반응시 생산된 항체는 새로이 변이된 바이러스에 대해 불량하거나 비-보호성이다. 결과는 새로운 백신이, 매우 비용이 들 뿐 아니라 항상 효율적이지 않은 공정인, 나타날 것으로 예측된 H1 및 H3 바이러스에 대해 새로운 백신을 매년 생산하여야 한다는 것이다. 동일한 것이 H5 인플루엔자 백신의 생산에 적용된다.
HA는 인플루엔자 A형의 주요 표면 단백질이며, 이는 감염 또는 예방접종에 의해 유도된 중화 항체의 주요 표적이다. HA는 막 위에 시알산을 지닌 세포, 예를 들면, 상기도 또는 적혈구 속의 세포에 바이러스가 결합하는데 관여한다. 또한, HA는 pH가 감소된 후, 엔도솜(endosome) 막을 지닌 바이러스 엔벨로프의 융합을 매개한다. HA 삼량체(trimer)는 각각 2개의 이황화물 브릿지에 의해 연결된 HA1 및 HA2 영역을 지닌 완전한 HAO 단일 폴리펩타이드 새로 이루어진, 3개의 동일한 단량체로 구성된다. 각각의 HA2 영역은 나선 코일된 코일 구조을 채택하고 있으며 HA의 "줄기(stem)" 또는 "스택(stalk)" 영역을 주로 형성하지만, HA1 영역은 α/β 구조(HA의 "헤드(head)" 영역)의 혼합물을 함유하는 작은 구형 도메인이다. 구형 HA 헤드 영역은 시알산 수용체에 대한 결합을 매개하지만, HA 줄기는 낮은 pH에 의해 엔도솜 내에서 개시되는 바이러스와 세포 막 사이의 후속적인 융합을 매개한다. 면역우세(immunodominant)-HA 구형 헤드 도메인은 명백한 항원 부위와 높은 가소성을 가져서 불변 항원 변이(constant antigenic drift)를 겪지만, HA 줄기 영역은 아형 중에서 비교적 보존되어 있다. 현재의 인플루엔자 백신은 면역우세 및 가변성 HA 헤드 영역에 대한 면역 반응을 주로 유도하며, 이는 HA의 줄기 영역보다 더 빠르게 진화한다(Kirkpatrick E, Qiu X, Wilson PC, Bahl J, Krammer F. The influenza virus hemagglutinin head evolves faster than the stalk domain. Sci Rep. 2018 Jul 11;8(1):10432). 따라서, 특수한 인플루엔자 백신은 일반적으로 몇년 동안 보호를 부여하며 인플루엔자 백신의 매년 재-개발이 요구된다.
이러한 문제를 극복하기 위하여, HA 줄기에서 보존된 부위를 표적화하는 새로운 부류의 인플루엔자-중화 항체가 인플루엔자 바이러스 치료요법으로서 개발되었다. HA의 줄기 영역을 표적화하는 이러한 항체는 일반적으로 HA의 헤드 영역을 표적화하는 항체와 비교하여 보다 광범위하게 중화시킨다. 인플루엔자 A형 항체를 광범위하게 중화시키는 것의 개관은 문헌: Corti D. and Lanzavecchia A., Broadly neutralizing antiviral antibodies. Annu. Rev. Immunol. 2013;31:705-742에 제공되어 있다. 오쿠노(Okuno) 등은 마우스를 인플루엔자 바이러스 A/Okuda/57(H2N2)로 면역화시키고 HA2내 보존된 구조적 에피토프에 결합하여 동물 모델에서 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 그룹 1 H2, H1 및 H5 아형 인플루엔자 A형 바이러스를 중화시키는 단리된 모노클로날 항체(C179)를 분리하였다(Okuno et al.,1993; Smirnov et al., 1999; Smirnov et al., 2000). 항체를 표적화하는 HA-줄기 영역의 추가의 예는 CR6261(Throsby M, van den Brink E, Jongeneelen M, Poon LLM, Alard P, Cornelissen L, et al. (2008) Heterosubtypic Neutralizing Monoclonal Antibodies Cross-Protective against H5N1 and H1N1 Recovered from Human IgM+ Memory B Cells. PLoS ONE 3(12): e3942. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003942; Friesen RHE, Koudstaal W, Koldijk MH, Weverling GJ, Brakenhoff JPJ, Lenting PJ, et al. (2010) New Class of Monoclonal Antibodies against Severe Influenza: Prophylactic and Therapeutic Efficacy in Ferrets. PLoS ONE 5(2): e9106. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009106), F10(Sui J, Hwang WC, Perez S, Wei G, Aird D, Chen LM, Santelli E, Stec B, Cadwell G, Ali M, Wan H, Murakami A, Yammanuru A, Han T, Cox NJ, Bankston LA, Donis RO, Liddington RC, Marasco WA (March 2009). "Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses". Nature Structural & Molecular Biology. 16 (3): 265-73. doi:10.1038/nsmb.1566), CR8020(Ekiert DC, Friesen RHE, Bhabha G, Kwaks T, Jongeneelen M, et al. 2011. A highly conserved neutralizing epitope on group 2 influenza A viruses. Science 333(6044):843-50), FI6(Corti D, Voss J, Gamblin SJ, Codoni G, Macagno A, et al. 2011. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins. Science 333(6044):850-56), 및 CR9114(Dreyfus C, Laursen NS, Kwaks T, Zuijdgeest D, Khayat R, et al. 2012. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science 337(6100):1343-48)를 포함한다.
그러나, 그룹 1 및 2 아형 둘 다의 HA 줄기 영역과 반응할 수 있는 항체는 매우 드물고 일반적으로 모든 아형의 완전한 커버(complete coverage)를 나타내지 않는다. 최근에, 항체 MEDI8852가 기술되었으며, 이는 >80년의 항원 발달에 걸쳐 대표적인 바이러스의 다양한 패널을 중화시킬 수 있다(Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza A Subtypes. Cell. 2016;166(3):596-608; Paules, C. I. et al. The Hemagglutinin A Stem Antibody MEDI8852 Prevents and Controls Disease and Limits Transmission of Pandemic Influenza Viruses. J Infect Dis 216, 356-365, https://doi.org/10.1093/infdis/jix292 (2017)). MEDI8852는 다른 구조적으로 특성화된 줄기-반응성 중화 항체와는 현저히 상이한 고도로 보존된 에피토프에 결합하는 것으로 밝혀졌다(Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza A Subtypes. Cell. 2016;166(3):596-608).
상기 측면에서, 본 발명의 목적은 매우 낮은 용량에서 투여되는 경우에도, 인플루엔자 A형 바이러스를 광범위하고 효율적으로 중화시키는, 신규 항체를 제공하는 것이다.
이러한 목적은 하기 및 첨부된 청구범위에 나타낸 주제로 달성된다.
본 발명이 하기 상세히 기술되어 있지만, 본 발명은 변할 수 있으므로, 이는 본원에 기술된 특수한 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 첨부된 청구범위에 의해 한정될 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
다음에서, 본 발명의 성분이 기술될 것이다. 이러한 성분은 구체적인 구현예와 함께 나타나 있지만, 이는 추가의 구현예를 생성하는 임의의 방식 및 임의의 수와 조합시킬 수 있음이 이해될 수 있다. 다양하게 기술된 실시예 및 구현예는 본 발명을 명쾨하게 기술된 구현예에 만 한정되는 것으로 고려되지 않아야 한다. 이러한 설명은 명쾌하게 기술된 구현예와 임의의 수의 개시된 성분을 조합하는 구현예를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 또한, 본원에서 모든 기술된 성분의 임의의 순열 및 조합은 내용이 달리 나타내지 않는 한, 본원의 설명에 의해 개시된 것으로 고려될 수 있다.
이후의 본 명세서 및 청구범위 전체에서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)", 및 변화, 예를 들면, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 기술된 구성원, 정수 또는 단계를 포함하지만 임의의 다른 기술되지 않은 구성원, 정수 또는 단계를 배제하지 않음을 내포하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "로 이루어진"은 용어 "포함하자"의 특수한 구현예이고, 여기서 임의의 다른 기술되지 않은 구성원, 정수 또는 단계는 배제된다. 본원의 내용에서, 용어 "포함하다"는 용어 "로 이루어진"을 포함한다. 따라서, 용어 "포함하는"은 "포괄하는(including)" 뿐만 아니라 "이루어진"을 포함하는데, 예컨대, X를 "포함하는" 조성물은 독점적으로 X로 이루어질 수 있거나 추가의 것, 예컨대, X+Y를 포함할 수 있다.
본 발명을 기술하는 내용(특히 청구범위의 내용)에 사용된 단수 용어("a" 및 "an" 및 "the") 및 유사한 참고문헌은 본원에서 달리 나타내거나 내용이 명확하게 부정하지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 망라하는 것으로 고려되어야 한다. 본원의 값의 범위의 인용은 단지 이러한 범위내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 인용하는 단축 방법으로서 제공되기 위해 의도된다. 본원에서 달리 나타내지 않는 한, 각각의 개개의 값은 이것이 개별적으로 본원에 인용된 경우와 같이 명세서내로 포함된다. 명세서 내 언어는 본 발명의 실시에 대해 필수적인 임의의 청구되지 않은 성분을 나타내는 것으로 고려되지 않을 수 있다.
단어 "실질적으로(substantially)"는 "완전한"을 배제하지 않는데, 예컨대, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y를 완전히 포함하지 않을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 빠질 수 있다.
수치 x와 관련하여 용어 "약"은 x ± 10%, 예를 들면, x ± 5%, 또는 x ± 7%, 또는 x ± 10%, 또는 x ± 12%, 또는 x ± 15%, 또는 x ± 20%를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "질환"은, 정상 기능화가 손상되고 전형적으로 구별가능한 신호에 의해 나타나며, 사람 또는 동물이 감소된 수명 또는 삶의 질을 갖도록 하는 모두 사람 또는 동물 신체 또는 이의 부분 중 하나의 비정상적인 상태를 반영한다는 점에서 용어 "장애" 및 "상태(의학 조건에서와 같음)와 일반적으로 동의어이고, 이와 상호교환적으로 사용되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체 또는 환자의 "치료"에 대한 참고는 방지, 예방, 약화, 개선 및 치료요법을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "대상체" 또는 "환자"는 사람을 포함하는 모든 동물을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 대상체의 예는 사람, 소, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 돼지, 및 토끼를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 사람이다.
용량은 흔히 체중과 관련하여 나타낸다. 따라서, [g, mg, 또는 다른 단위]/kg(또는 g, mg 등)으로 나타낸 용량은 "용어 "체중"이 명확하게 언급되지 않는 경우에도, "체중 kg(또는 g, mg 등) 당" [g, mg, 또는 다른 단위]를 지칭한다.
용어 "특이적으로 결합하는(specifically binding)" 및 유사한 참고는 비-특이적인 부착(sticking)을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 본 발명에 따른 특징적인 특성이 유지되는 한, 전체 항체, 항체 단편, 사람 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, 재조합 항체 및 유전적으로 가공된 항체(변이체 또는 돌연변이체 항체)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 형태의 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 사람 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)이다. 예를 들면, 항체는 사람 모노클로날 항체이다.
사람 항체는 당해 분야의 상태에서 잘 공지되어 있다(van Dijk, M. A., 및 van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 사람 항체는 또한 면역화시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에서 사람 항체의 완전한 레퍼토리를 생산하거나 선택할 수 있는 유전자이식 동물(예컨대, 마우스)에서 생산될 수 있다. 이러한 배-선(germ-line) 돌연변이체 마우스에서 사람 사람 배-선 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 챌린지시 사람 항체의 생산을 야기한다(참고: 예컨대, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340). Human antibodies can also be produced in phage display libraries (Hoogenboom, H. R., 및 Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). 콜(Cole) 등 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술은 또한 사람 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 일부 구현예에서, 사람 모노클로날 항체는 문헌: Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5에 기술된 바와 같이 증진된 EBV-B 세포 영구증식(immortalization)을 사용하여 제조한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "가변 영역"(경쇄(VL)의 가변 영역, 중쇄(VH)의 가변 영역)은 항원에 항체를 결합시키는데 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 쌍 각각을 나타낸다.
본 발명의 항체는 임의의 동형(예컨대, IgA, IgG, IgM, 즉, α, γ 또는 μ 중쇄)일 수 있다. 예를 들면, 항체는 IgG 유형이다. IgG 동형 내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아부류, 예를 들면 IgG1일 수 있다. 본 발명의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 유형이고 κ 경쇄를 갖는다.
본 발명에 따른 항체는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 항체는 다른 폴리펩타이드를 실질적으로 포함하지 않는 조성물 속에 존재할 것인데, 예컨대, 조성물의 90% 미만(중량 단위), 일반적으로 60% 미만 및 보다 일반적으로 50% 미만은 다른 폴리펩타이드로 제조된다.
본 발명에 따른 항체는 사람 및/또는 비-사람(또는 이종) 숙주, 예컨대, 마우스 내에서 면역원성일 수 있다. 예를 들면, 항체는 비-사람 숙주에서 면역원성이지만, 사람 숙주에서는 그렇지 않은 유전형(idiotope)을 가질 수 있다. 사람 용의 본 발명의 항체는 마우스, 염소, 토끼, 랫트, 비-영장류 동물 등과 같은 숙주로부터 용이하게 단리될 수 없고, 일반적으로 사람화 또는 제노-마우스(xeno-mouse)로부터 수득될 수 없다.
본원에 사용된 바와 같은, "중화 항체"는 숙주 내에서 감염을 개시 및/또는 영구화하는 병원체의 능력을 중화, 즉, 방지, 억제, 감소, 지연 또는 방해할 수 있는 것이다. 용어 "중화 항체" 및 "중화시키는 항체(an antibody that neutralizes또는 antibodies that neutralize)"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 항체는 적절한 제형시, 활성 예방접종과 관련하여, 단독으로, 또는 예방제 또는 치료제로서, 진단 도구로서, 또는 본원에 기술된 바와 같은 생산 도구로서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "돌연변이"는 참고 서열, 예컨대, 상응하는 게놈 서열과 비교하여 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열 내 변화에 관한 것이다. 예컨대, 게놈 서열과 비교시 돌연변이는 예를 들면, (천연적으로 존재하는) 체세포 돌연변이, 자발적인 돌연변이, 예컨대, 효소, 화학물질 또는 방사선에 의해 유도된 돌연변이, 또는 부위-지시된 돌연변이유발(핵산 서열내 및/또는 아미노산 서열 내 특이적인 및 의도된 변화를 제조하기 위한 분자 생물학 방법)에 의해 수득된 돌연변이일 수 있다. 따라서, 용어 "돌연변이" 또는 "돌연변이시키는"은 또한 예컨대, 핵산 서열 또는 아미노산 서열 내 돌연변이를 물리적으로 제조함을 포함한다. 돌연변인는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 치환, 결실 및 삽입 뿐만 아니라 수개의 성공적인 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 역위를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴크렐오타이드 또는 아미노산의 치환, 결실 및 삽입 뿐만 아니라 수개의 연속적인 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 역위를 포함한다. 아미노산 서열내 돌연변이를 달성하기 위하여, 돌련변이를 상기 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열내로 도입시킴으로써 (재조합) 돌연변이된 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 돌연변이는 예컨대, 부위-지시된 돌연변이유발, 상이한 아미노산을 암호화하는 코돈을 생성하기 위한 하나의 아미노산을 암호화하는 핵산 분자의 코돈에 의해, 예컨대, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 인식함에 의해 및 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오타이드에 대한 요구없이 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자의 합성을 설계함으로써 달성할 수 있다.
수개의 문서가 본 명세서의 내용 전체에서 인용된다. 본원에 인용된 문서(모든 특허, 특허원, 과학 공보, 제조업자 명세, 설명서 등) 각각은, 상기 또는 하기에서, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본원에 어느 것도 본 발명이 이러한 개시내용을 선행 발명으로써 예상되는 것으로 자격이 주어짐을 허용하는 것으로 고려되지 않는다.
본 발명은 본원에 기술된 특수한 방법론, 프로토콜 및 시약이 변할 수 있으므로 이들이 본 발명에 기술된 것에 한정되지 않음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 특수한 구현예 만을 기술할 목적을 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
항체
본 발명은 다른 발견들 중에서 매우 낮은 용량에서 투여되는 경우에서조차 인플루엔자 A형 감염을 잠재적으로 감소시키는 항체의 확인을 기반으로 한다. 또한, 본 발명의 항체는 증가된 반감기를 나타낸다. 어떠한 이론에 얽메이지 않고, 본 발명자는 본 발명의 항체의 증가된 효능이 증가된 반감기와는 독립적임을 보증한다. 예를 들면, 비교 항체와 비교시, 본 발명의 항체는 항체의 유사한 혈장 농도에도 불구하고 증가된 잠재능을 나타내었다. 더욱이, 본 발명의 항체는 중쇄 불변 영역내 돌연변이 M428L 및 N434S 없이 모 항체와 비교하여 감소된 면역원성을 나타낸다.
제1 양태에서 본 발명은 각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하는 (단리된) 항체를 제공한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 항체는 전형적으로 중쇄 상에 (적어도) 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 경쇄 상에 (적어도) 3개의 CDR을 포함한다. 일반적으로, 상보성 결정 영역(CDR)은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 내에 존재하는 초가변 영역이다. 전형적으로, 항체의 중쇄 및 연결된 경쇄의 CDR은 함께 항원 수용체를 형성한다. 일반적으로, 3개의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 가변 도메인 내에서 비-연속적으로 정렬된다. 항원 수용체는 전형적으로 2개의 가변 도메인(2개의 상이한 폴리펩타이드 쇄, 즉, 중쇄 및 경쇄 상에)으로 구성되고, 각각의 항원 수용체(중쇄: CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3; 경쇄: CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)에 대해 6개의 CDR이 존재한다. 단일 항체 분자는 일반적으로 2개의 항원 수용체를 가지므로 12개의 CDR을 함유한다. 중쇄 및/또는 경쇄 상의 CDR은 골격 영역에 의해 분리될 수 있으며, 이에 의해, 골격 영역(FR)은 CDR보다 거의 "가변성"이 아닌 가변 도메인 내 영역이다. 예를 들면, 쇄(또는 각각 각각의 쇄)는 3개의 CDR로 분리된, 4개의 골격 영역으로 구성될 수 있다.
중쇄 상에 3개의 상이한 CDR 및 경쇄 상의 3개의 상이한 CDR을 포함하는, 본 발명의 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄의 서열이 측정되었다. CDR 아미노산의 위치는 IMGT 번호매김 시스템(IMGT: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) 핵산s Res. 37, D1006-D1012)에 따라 정의된다.
전형적으로, 본 발명의 항체는 인플루엔자 A형 바이러스의 헤마글루티닌에 결합한다. 이에 의해, 본 발명의 항체는 인플루엔자 A형 바이러스의 감염을 중화시킬 수 있다. 상기 정의된 바와 같은 6개의 CDR 서열로 인하여, 본 발명에 따른 항체는 인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌(IAV HA) 줄기 영역의 MEDI8852와의 동일한 에피토프에 결합하며(Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure 및 Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza A Subtypes. Cell. 2016;166(3):596-608), 이에 의해 모든 인플루엔자 A형의 아형의 다양한 인플루엔자 A형 혈청형에 대해 동일한 광범위한 보호를 제공한다.
또한, 본 발명의 항체는 중쇄의 불변 영역 내(CH3 영역 내) 2개의 돌연변이: M428L 및 N434S를 포함한다. 이와 관련하여, 아미노산 위치는 당해 분야에 공지된 EU 번호매김 시스템(numbering system)에 따라 번호매김되었다. 카밧(Kabat) 또는 EU 번호매김에서와 같은 EU 색인 또는 EU 색인은 EU 항체의 번호매김을 지칭한다(Edelman GM, Cunningham BA, Gall WE, Gottlieb PD, Rutishauser U, Waxdal MJ. The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969;63(1):78-85; Kabat E.A., National Institutes of Health (U.S.) Office of the Director, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edition, Bethesda, MD : U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, 1991, 본원에 전체적으로 참고로 포함됨).
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서 상기 항체와는 상이한, 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형의 중화하는데 요구되는 용량의 1/2을 초과하지 않는, 용량에서 인플루엔자 A형 감염을 중화시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/3을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/4를 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/5를 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/6을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/7을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/8을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/9을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용하여 인플루엔자 A형을 중화시키는데 요구된 용량의 1/10을 초과하지 않는다. 이러한 비교 시험(유사한 시험 검정, 시험 조건 등)을 위해 중화 검정을 사용하는 것이 이해된다. 이러한 비교 시험을 위해, 비교가능한 중화 검정(유사한 시험 검정, 시험 조건 등)을 사용하는 것이 이해된다. 예를 들면, 동일한 시험(시험할 항체에서만 상이함)을 사용하여 본 발명의 항체가 인플루엔자 A형을 중화시키는 용량을 측정하고 비교 항체가 인플루엔자 A형을 중하시키는 용량을 측정할 수 있다.
실험실에서 바이러스 감염성(또는 "중화")를 연구하고 정량화하기 위해, 당해 분야의 기술자는 다양한 표준 "중화 검정"을 알고 있다. 중화 검정을 위해 동물 바이러스를 전형적으로 세포 및/또는 세포주 내에서 증식시킨다. 예를 들면, 중화 검정에서 배양된 세포를 고정된 양의 인플루엔자 A형 바이러스(IAV)와 함께 시험한 항체의 존재(또는 부재) 하에서 항온처리할 수 있다. 판독물로서, 예를 들면, 유동 세포분석법을 사용할 수 있다. 대안적으로, 또한 다른 판독물이 가능할 수 있다.
특정의 구현예에서, 항체는 H3N2 헤마글루티닌(H3HA)의 다형 HA1 P11S, HA2 D46N, 및/또는 HA2 N49T; 및/또는 H1N1 헤마글루티닌(H1 HA)의 다형 N146D를 암호화하는 바이러스를 중화시킨다. 예를 들면, 항체는 H3HA의 HA1 P11S, HA2 D46N 또는 HA2 N49T의 1개 또는 2개의 다형을 중화시킬 수 있다. 특히, 항체는 H3 HA의 모든 3개의 다형 HA1 P11S, HA2 D46N, 및 HA2 N49T를 중화시킬 수 있다. 더욱이, 항체는 H1 HA의 다형 N146D를 중화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 H3 HA의 다형 HA1 P11S, HA2 D46N, 및 HA2 N49T; 및 H1 HA의 다형 N146D를 중화시킨다. 상기 다형의 경우, H1N1에 대한 참고는 A/California/07/2009이고 H3N2에 대한 참고는 A/Perth/16/2009이다.
특정의 예에서, 항체는 H3 HA의 다형 HA1 P11S, HA2 D46N, 및/또는 HA2 N49T; 및/또는 H1 HA의 다형 N146D를 야생형 바이러스의 HA와 비교하여, 특히 야생형 바이러스와 나란히 비교하여, <2의 IC50 배수 변화로 중화시킨다. 예를 들면, 항체는 H3 HA의 HA1 P11S, HA2 D46N 또는 HA2 N49T의 1개 또는 2개의 다형을 야생형의 HA에 대해, 특히 야생형 바이러스와 나란히 비교하여 < 2의 IC50 배수 변화로 중화시킬 수 있다. 특히, 항체는 H3 HA의 모든 3개의 다형 HA1 P11S, HA2 D46N, 및 HA2 N49T를 야생형 바이러스의 HA에 대해, 특히 야생형 바이러스와 나란히 비교하여 <2의 IC50 배수 변화를 중화시킬 수 있다. 더욱이, 항체는 H1 HA의 다형 N146D를 야생형 바이러스의 HA, 특히 야생형 바이러스와 비교하여 나란히 <2의 IC50 배수 변화를 중화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 H3 HA의 다형 HA1 P11S, HA2 D46N, 및 HA2 N49T; 및 H1 HA의 다형 N146D를 중화시키며, 각각은 야생형 바이러스의 HA에 대해, 특히 야생형 바이러스와 나란히 비교하여 <2의 IC50 배수 변화를 중화시킨다.
일부 구현예에서, 항체는 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와는 상이한 비교 항체와 비교하여 감소된 항-약물 항체(ADA)를 유발한다. 특히, 항체는 중쇄의 불변 영역 내에 특정의 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와는 상이한 비교 항체와 비교하여 면역원성을 거의 나타내지 않을 수 있다. 본 출원의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 놀랍게도 감소된 항-약물 항체(ADA) 반응을 유발하므로, M428L/N434S 돌연변이가 없는 항체와 비교하여 면역원성을 거의 유발하지 않는다. 항-약물 항체(ADA) 반응/면역원성을 평가하기 위하여, 기술자는 적절한 시험을 인식하고 있다. 임의의 이러한 시험은 본 발명의 항체 및 M428L/N434S 돌연변이가 없는 비교 항체를 나란히 시험하여 직접적인 비교가 가능하도록 하는 한 선택할 수 있다. 예시된 시험은 본 명세서의 실시예 9 및 10에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 사람 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 사람 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 임의의 동형(예컨대, IgA, IgG, IgM, 즉, α, γ 또는 μ 중쇄)일 수 있다. 예를 들면, 항체는 IgG 유형이다. IgG 동형 내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아부류, 예를 들면 IgG1일 수 있다. 본 발명의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 카파(κ) 경쇄를 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG1 유형이고 κ 경쇄를 갖는다.
일부 구현예에서, 항체는 사람 IgG1 유형이다. 항체는 임의의 동종이인자형(allotype)일 수 있다. 용어 "동종이인자형"은 IgG 아부류 중에서 발견된 대립형질 변이이다. 예를 들면, 항체는 G1m1(또는 G1m(a)) 동종이인자형, G1m2(또는 G1m(x)) 동종이인자형, G1m3(또는 G1m(f)) 동종이인자형, 및/또는 G1m17(또는 Gm(z)) 동종이인자형일 수 있다. G1m3 및 G1m17 동종이인자형은 CH1 도메인내 동일한 위치(EU 번호매김에 따른 214번 위치)에 위치한다. G1m3은 R214(EU)에 상응하지만, G1m17은 K214(EU)에 상응한다. G1m1 동종이인자형은 CH3 도메인(356 및 358번 위치(EU))에 위치하고 대체 E356D 및 M358L을 지칭한다. G1m2 동종이인자형은 431번 위치(EU)에서 알라닌의 글리신으로의 대체를 지칭한다. G1m1 동종이인자형은 예를 들면 G1m3 또는 G1m17 동종이인자형과 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 G1m1(G1m3,-1)DL DJQTSMS 동종이인자형 G1m3이다. 일부 구현예에서, 항체는 G1m17,1 동종이인자형이다. 일부 구현예에서, 항체는 G1m3,1 동종이인자형이다. 일부 구현예에서, 항체는 G1m1(G1m17,-1)이 없는 동종이인자형 G1m17이다. 임의로, 이러한 동종이인자형은 G1m2, G1m27 또는 G1m28 동종이인자형과 조합될 수 있다. 예를 들면, 항체는 G1m17,1,2 동종이인자형일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 7에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열(각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 나타낸 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6에 나타낸 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열)이 유지된다.
서열 동일성(Sequence identity)은 일반적으로 참고 서열(출원에 인용된 서열)의 전체 길이와 관련하여 계산된다. 본원에 지칭된 바와 같은 서열 동일성은 예를 들면, BLAST를 사용하여 NCBI(국립 생물공학 정보센터(the National Center for Biotechnology Information); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 명시된 디폴트 매개변수(default parameter)[Blosum 62 매트릭스; 갭 오픈 패널티(gap open penalty)=11 및 갭 연장 패널티(gap extension penalty)=1]를 사용하여 측정할 수 있다.
"서열 변이체(sequence variant)"는 참고 서열내 아미노산 서열 중 하나 이상이 결실 또는 치환되고/되거나 하나 이상의 아미노산이 참고 아미노산 서열의 서열 내로 삽입된 변경된 서열을 갖는다. 변경의 결과로서, 아미노산 서열 변이체는 참고 서열에 대해 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 적어도 70% 동일한 변이체 서열은 30개 이하의 변경, 즉, 참고 서열의 100개 아미노산 당 결실, 삽입 또는 치환의 임의의 조합을 갖는다.
일반적으로, 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 것이 가능하지만, 치환은 일반적으로 보존적 아미노산 치환이고, 여기서 치환된 아미노산은 참고 서열 내에 상응하는 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는다. 예로서, 보존적 아미노산 치환은 하나의 지방족 또는 소수성 아미노산, 예컨대, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신의 다른 것으로의 치환; 하나의 하이드록실-함유 아미노산, 예컨대, 세린 및 트레오닌의 다른 것으로의 치환; 하나의 산성 잔기, 예컨대, 글루탐산 또는 아스파르트산의 다른 것으로의 치환; 하나의 아미드-함유 잔기, 예컨대, 아스파라긴 및 글루탐산의 다른 것으로의 대체; 하나의 방향족 잔기, 예컨대, 페닐알라닌 및 타이로신의 다른 것으로의 대체; 하나의 염기성 잔기, 예컨ㄷ, 라이신, 아르긴 및 히스티딘의 다른 것으로의 대체; 및 하나의 작은 아미노산, 예컨대, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 및 글리신의 다른 것으로의 대체를 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기로부터 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 범위의 아미드- 및/또는 카복실-말단 융합체, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 리포터 분자 또는 효소에 대한 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 7에 대해 75% 이상(즉, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열은 유지된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 7에 대해 80% 이상(즉, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열은 유지된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 7에 대해 85% 이상(즉, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열은 유지된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 8에 대해 90% 이상(즉, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열은 유지된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 7에 대해 95% 이상(즉, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열은 유지된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 7에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열은 유지된다.
일반적으로, 본 발명의 항체가 Fc 영역(예컨대, CH2 또는 CH3 영역) 내에 하나 이상의 추가의 돌연변이(M428L 및 N434S 외에)를 포함하는 것이 가능하다. 그러나, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 이의 CH3 영역 내에 M428L 및 N434S 외에 임의의 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다(각각의 야생형 CH3 영역과 비교하여). 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 이의 Fc 영역내에 M428L 및 N434S 외에 임의의 추가의 돌연변이를 포함하지 않는다(각각의 야생형 Fc 영역과 비교하여). 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "야생형"은 예를 들면, 천연적으로 나타나는 바와 같은, 참고 서열을 지칭한다. 구체적인 예로서, 용어 "야생형"은 천연에서 발생하는 가장 높은 출현율(prevalence)을 지닌 서열을 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 서열 번호: 9에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호: 10에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 가질 수 있다.
본 발명의 항체는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체로부터 6개의 CDR 및 동일하거나 상이한 에피토프 또는 항원에 대한 다른 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 하이브리드 항체 분자를 또한 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 하이브리드 항체는 본 발명의 항체로부터의 6개의 CDR 및 상이한 에피토프 또는 항원에 대한 다른 항체로부터의 6개의 CDR을 포함한다.
변이체 항체가 또한 본 발명의 영역 내에 포함된다. 따라서, 본 출원에 인용된 서열의 변이체는 또한 본 발명의 영역 내에 포함된다. 이러한 변이체는 면역 반응 동안 생체내에서 또는 영구증식된 B 세포 클론의 배양시 시험관내에서 체세포 돌연변이에 의해 생성된 천연 변이체를 포함한다. 대안적으로, 변이체는 유전 코드의 축퇴(degeneracy)로 인하여 발생할 수 있거나 전사 또는 해독에서의 오류로 인하여 생산될 수 있다.
본 발명의 항체는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 항체는 다른 폴리펩타이드를 실질적으로 포함하지 않는 조성물 속에 존재할 것인데, 예컨대, 조성물의 90% 미만(중량 기준), 일반적으로 60% 미만 및 보다 일반적으로 50% 미만은 다른 폴리펩타이드로 제조된다.
본 발명의 항체는 비-사람(또는 이종) 숙주, 예컨대, 마우스 내에서 면역원성일 수 있다. 특히, 항체는 비-사람 숙주, 그러나, 사람 숙주 내에서 면역원성인 유전형(idiotope)를 가질 수 있다. 특히, 사람용의 본 발명의 항체는 마우스, 염소, 토끼, 랫트, 비-영장류 포유동물 등으로부터 용이하게 단리될 수 없고, 일반적으로 제노-마우스에 의해 수득될 수 없는 것을 포함한다.
핵산
다른 양태에서, 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
특정의 구현예에서, 핵산 분자는
(i) 서열 번호: 12에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 12에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로, 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이며; 및
(ii) 서열 번호: 13에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 13에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로, 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는
(i) 서열 번호: 14에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 14에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로, 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열 및 불변 영역 내에 M428L 및 N434S 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
(ii) 서열 번호: 15에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 15에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오ㅗ타이드로, 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열 및 불변 영역 내에 M428L 및 N434S 돌연변이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
핵산 분자 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 예는 예컨대, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 올리고뉴클레오타이드, RNA 분자, 예를 들면, rRNA, mRNA, miRNA, siRNA, 또는 tRNA, 또는 DNA 분자, 예를 들면, cDNA를 포함한다. 핵산은 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화할 수 있다. 다시 말해서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 동일한 핵산 분자(예컨대, 바이시스트로닉 방식(bicistronic manner))에 의해 암호화될 수 있다. 대안적으로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 별개의 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다.
유전 코드의 중복성(redundancy)으로 인하여, 본 발명은 또한 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 서열 변이체를 포함한다. 항체(또는 완전한 핵산 분자)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 항체의 발현을 위해 최적화할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열의 코돈 최적화를 사용하여 항체의 생산을 위한 발현 시스템에서 해독 효능을 증진시킬 수 있다. 서열 번호 12, 13, 14 및 15에 따른 예시된 핵산 서열은 예시된 항체 FluAB_MLNS의 발현을 위해 코돈-최적화된 서열이다. 더욱이, 핵산 분자는 항체(의 중쇄 또는 경쇄)에 대한 암호화 서열로서 이종 성분(즉, 동일한 핵산 분자 상에 천연적으로 존재하지 않는 성분)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 이종 프로모터, 이종 인핸서, 이종 UTR(예컨대, 최적의 해독/발현을 위해), 이종 폴리-A-테일 등들 포함할 수 있다.
핵산 분자는 핵산 구성성분을 포함하는 분자이다. 용어 핵산 분자는 일반적으로 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 이는 용어 "폴리뉴클레오타이드"와 동일어로 사용될 수 있는데, 즉, 핵산 분자는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 외에 추가의 성분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 핵산 분자는 당/포스페이트-골격의 포스포디에스테르-결합에 의해 각각 서로 공유결합으로 연결된 뉴클레오타이드 단량체를 포함하거나 이로 이루어진 중합체이다. 용어 "핵산 분자"는 또한 변형된 핵산 분자, 예를 들면, 염기-변형된, 당-변형된 또는 골격-변형된 등의 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다.
일반적으로, 핵산 분자는 특정의 핵산 서열을 삽입, 결실 또는 변경시키기 위해 조작될 수 있따. 이러한 조작으로부터의 변화는 제한 부위를 도입하여 코돈 사용빈도(codon usage)를 변경시키거나, 전사 및/또는 해독 조절 서열을 가하거나 최적화하는 것 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 핵산을 변화시켜 암호화된 아미노산을 변경시키는 것이 또한 가능하다. 예를 들면, 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 등)의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 항체의 아미노산 서열 내로 도입시키는 것이 유리할 수 있다. 이러한 점 돌연변이는 효과기 기능을 변형시킬 수 있으며, 항원-결합 친화성, 해독 후 변형, 면역원성 등은 공유결합성 그룹(예컨대, 표지)의 부착을 위해 아미노산을 도입시킬 수 있거나 태그(예컨대, 정제 목적을 위해)를 도입할 수 있다. 대안적으로, 핵산 서열내 돌연변이는 "사일런트(silent)"일 수 있는데, 즉, 유전 코드의 중복성으로 인하여 아미노산 서열 내에 반영되지 않는다. 일반적으로, 돌연변이는 특정 부위 내로 도입시킬 수 있거나 무작위로 도입한 다음 선택(예컨대, 분자 진화)할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 (예시적인) 항체의 임의의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산은 무작위로 또는 직접 돌연변이되어 암호화된 아미노산 내에 상이한 특성을 도입시킬 수 있다. 이러한 변화는 반복 공정의 결과일 수 있으며 여기서 초기 변화는 보유되고 다른 뉴클레오타이드 위치에서 새로운 변화가 도입된다. 또한, 독립된 단계에서 달성된 변화가 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편(또는 (완전한) 핵산 분자)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈-최적화될 수 있다. 기술자는 코돈 최적화를 위한 다양한 도구, 예를 들면, 문헌: Ju Xin Chin, Bevan Kai-Sheng Chung, Dong-Yup Lee, Codon Optimization OnLine (COOL): a web-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design, Bioinformatics, Volume 30, Issue 15, 1 August 2014, Pages 2210-2212; 또는 in: Grote A, Hiller K, Scheer M, Munch R, Nortemann B, Hempel DC, Jahn D, JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1;33(Web Server issue):W526-31; 또는, 예를 들면, Genscript's OptimumGeneTM algorithm(제US 2011/0081708 A1호에 기술된 바와 같음)에 기술된 것을 인식하고 있다.
본 발명은 또한 제1 및 제2의 핵산 분자의 조합을 제공하고, 여기서 제1의 핵산 분자는 본 발명의 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 제2의 핵산 분자는 동일한 항체의 상응하는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자의 (일반적인) 특징에 관한 상기 설명은 조합의 제1 및 제2의 핵산 분자에 따라 적용된다. 예를 들면, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다는 코돈-최적화될 수 있다.
특정의 구현예에서, 핵산 분자의 조합은
(i) 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1의 핵산 분자로서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 12에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 12에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열을 암호화하는 제1의 핵산 분자; 및
(ii) 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2의 핵산 분자로서, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 13에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 13에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열을 암호화하는, 제2의 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자의 조합은
(i) 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1의 핵산 분자로서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 14에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 14에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열 및 불변 영역 내에 M428L 및 N434S 돌연변이를 암호화하는 제1의 핵산 분자; 및
(ii) 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2의 핵산 분자로서, 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 15에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 15에 대해 70% 이상(즉, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 서열은 상기 정의된 바와 같은 CDR 서열 및 불변 영역 내에 M428L 및 N434S 돌연변이를 암호화하는, 제2의 핵산 분자를 포함한다.
벡터
본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 핵산 분자의 조합(예컨대, 비스트로닉 방식으로)을 포함하는, 벡터, 예를 들면, 발현 벡터가 본 발명의 영역 내에 추가로 포함된다. 일반적으로, 벡터는 상술한 바와 같은 핵산 분자 또는 상술한 바와 같은 핵산 분자의 조합(예컨대, 비스스트로닉 방식)을 포함한다.
본 발명은 또한 제1 및 제2 벡터의 조합을 제공하고, 여기서 제1 벡터는 상술한 바와 같은 제1의 핵산 분자(핵산 분자의 조합의 경우)를 포함하고 제2의 벡터는 상술한 바와 같은 제2의 핵산 분자(핵산 분자의 조합의 경우)를 포함한다.
벡터는 일반적으로 재조합 핵산 분자, 즉, 천연에서 존재하지 않는 핵산 분자이다. 따라서, 벡터는 이종 성분(즉, 천연에서 상이한 기원의 서열 성분)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 벡터는 다중 클로닝 부위, 이종 프로모터, 이종 인핸서, 이종 선택 마커(상기 벡터를 포함하지 않는 벡터와 비교하여 상기 벡터를 포함하는 세포를 확인하기 위함) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 내용에서 벡터는 목적한 핵산 서열을 혼입시키거나 지니는데 적합하다. 이러한 벡터는 저장 벡터, 발현 벡터, 클로닝 벡터, 전달 벡터 등일 수 있다. 저장 벡터는 핵산 분자의 편리한 저장을 허용하는 벡터이다. 따라서, 벡터는 예컨대, 본 발명에 따른 목적한 항체(의 중쇄 및/또는 경쇄)에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 발현 생성물, 예를 들면, RNA, 예컨대, mRNA, 또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 벡터의 서열 스트레치(stretch)의 전사에 필요한 서열, 예를 들면, (이종) 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 부위를 함유하는 벡터이며, 이를 사용하여 핵산 서열을 벡터 내로 혼입시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 예컨대, 플라스미드 벡터 또는 박테리오파아지 벡터일 수 있다. 전달 벡터는 핵산 분자를 세포 또는 유기체내로 전달하기에 적합한 벡터, 예를 들면 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 내용에서 벡터는 예컨대, RNA 또는 DNA 벡터일 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 의미에서 벡터는 클로닝 부위, 선택 마커, 예를 들면, 항생제 내성 인자, 및 벡터의 증폭에 적합한 서열, 예를 들면, 복제 오리진을 포함한다. 본 출원의 내용에서 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있다.
세포
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 발현시키고/시키거나 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
이러한 세포의 예는 진핵 세포, 예컨대, 효모 세포, 동물 세포 또는 식물 세포 또는 원핵 세포, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, 포유동물 세포주이다. 예는 사람 세포, CHO 세포, HEK293T 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, 사람 간 세포, 골수종 세포 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
세포는 본 발명에 따른 벡터, 예를 들면, 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 용어 "형질감염(transfection)"은 핵산, 분자, 예를 들면, DNA 또는 RNA(예컨대 mRNA) 분자의 세포 내로의 도입을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "형질감염"은 핵산 분자를 세포, 예를 들면, 포유동물 세포 내로 도입시키기 위한 기술자에게 공지된 임의의 방법을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들면, 전기천공(electroporation), 예컨대, 양이온성 지질 및/또는 리포좀을 기반으로 한, 지질감염, 인산칼슘 침전, 나노입자 기반 형질감염, 바이러스 기반 형질감염, 또는 양이온성 중합체, 예를 들면, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등을 기반으로 한 형질감염을 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 비-바이러스성이다.
더욱이, 본 발명의 세포는 예컨대, 본 발명에 따른 항체를 발현시키기 위해, 본 발명에 따른 벡터로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 본 발명에 따른 벡터로 안정하게 형질감염된다. 다른 구현예에서, 세포는 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 본 발명에 따른 벡터로 일시적으로 형질감염된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이종으로 발현하는, 재조합 숙주 세포를 제공한다. 예를 들면, 세포는 항체 이외의 다른 종(예컨대, 사람 항체를 발현하는 CHO 세포)일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 세포형은 천연적으로 (이러한) 항체를 발현하지 않는다. 더욱이, 숙주 세포는 이의 천연 상태에서 존재하지 않는 항체 상에서 해독 후 변형(PTM; 예컨대, 글리코실화)를 부여할 수 있다. 이러한 PTM은 기능적 차이(예컨대, 감소된 면역원성)을 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 해복후 변형을 가질 수 있고, 이는 천연적으로 생산된 항체(예컨대, 사람에서 면역 반응의 항체)와는 구별된다.
항체의 생산
본 발명에 따른 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 하이브리도마 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 제조하는 일반적인 방법이 잘 공지되어 있다(Kohler, G. 및 Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983). 일부 구현예에서, 제WO2004/076677호에 기술된 대안의 EBV 무한증식 방법이 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 참고로 포함된 제WO 2004/076677호에 기술된 방법이 사용된다. 당해 방법 B에서 본 발명의 항체를 생산하는 세포는 EBV 및 폴리클로날 B 세포 활성인자로 형질전환된다. 세포 성장 및 분화의 추가의 자극인자를 형질전환 단계 동안 임의로 가하여 효능을 추가로 향상시킬 수 있다. 이러한 자극인자는 사이토킨, 예를 들면, IL-2 및 IL-15일 수 있다. 일 양태에서, IL-2를 영구증식 단계 동안에 가하여 영구증식의 효능을 증진시키지만, 이의 사용은 필수적이지 않다. 이러한 방법을 사용하여 생산된 영구증식된 B 세포를 이후 당해 분야에 공지된 방법 및 이로부터 단리된 항체를 사용하여 배양할 수 있다.
다른 예시적인 방법은 제WO 2010/046775호에 기술되어 있다. 이러한 방법에서 혈장 세포는 제한된 수로, 또는 단일 혈장 세포로서 다중웰 배양 플레이트 속에서 배양한다. 항체는 혈장 세포 배양물로부터 단리될 수 있다. 또한, 혈장 세포 배양물로부터, RNA를 추출하고 PCR을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 항체의 VH 및 VL 영역은 RT-PCR(역전사 효소(reverse transcriptase) PCR)로 증폭시키고, 서열분석하고 발현 벡터내로 클로닝한 다음 HEK293T 세포 또는 다른 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 발현 벡터 속에서 핵산의 클로닝, 숙주 세포의 형질감염, 형질감염된 숙주 세포의 배양 및 생산된 항체의 단리는 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
항체는 경우에 따라, 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법, 예를 들면, HPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 항체, 예컨대, 모노클로날 항체의 정제 기술, 예를 들어, 약제학적 등급의 항체를 생산하는 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 목적한 DNA 서열은 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 부위-지시된 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 적절하게 사용할 수 있다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용할 수 있다. 진핵세포, 예컨대, 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템을 항체 분자, 예를 들면, 완전한 항체 분자의 생산을 위해 사용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구현예에서, 사용될 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA 서열의 발현은 원핵 세포, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 이. 콜라이 내에서 발현시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 암호화하는 벡터를 포함하는 (이종) 숙주 세포를 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA로부터 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 항체 분자의 생산 공정을 제공한다.
중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는 항체의 생산을 위해, 세포주를 2개의 벡터, 즉, 경쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제1의 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 제2의 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 대안적으로, 단일 벡터를 사용할 수 있고, 이러한 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 (i) 숙주 세포 내에서 본 발명에 따른 핵산 서열을 발현시키는 단계, 및 (ii) 발현된 항체 생성물을 단리하는 단계에 의해 생산될 수 있다. 추가로, 이러한 방법은 (iii) 단리된 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환된 B 세포 및 배양된 혈장 세포는 목적한 특이성 또는 기능의 항체를 생산하는 것에 대해 스크리닝할 수 있다.
스크리닝 단계는 임의의 면역검정, 예컨대, ELISA에 의해, 조직 또는 세포(형질감염된 세포 포함)의 염색에 의해, 중화 검정에 의해 또는 목적한 특이성 또는 기능을 확인하기 위한 당해 분야에 공지된 다수의 다른 방법 중 하나에 의해 수행할 수 있다. 검정은 하나 이상의 항원의 단순힌 인식을 기반으로 선택할 수 있거나, 목적한 기능을 추가의 기반으로, 예컨대, 항원-결합 항체보다는 중화 항체를 선택하기 위해, 표적화된 세포의 특성, 예를 들면, 이의 신호전달 캐스케이드(signaling cascade), 이의 유형, 이의 성장 속도, 다른 세포에 영향을 미치는 이의 능력, 다른 세포 또는 다른 시약에 의한 또는 상태에서의 변화, 이의 분화 상태 등에 의한 영향에 대한 이의 반응을 변화시킬 수 있는 항체를 선택하기 위해, 선택할 수 있다.
개개의 형질전환된 B 세포 클론을 이후 양성의 형질전환된 B 세포 배양물로부터 생산할 수 있다. 양성 세포의 혼합물로부터 개개 클론을 분리하기 위한 클로닝 단계는 제한 희석, 미세조작, 세포 분류에 의한 단일 세포 침착 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
배양된 혈장 세포로부터의 핵산은 HEK293T 세포 또는 다른 공지된 숙주 세포 내에서 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 단리, 클로닝 및 발현시킬 수 있다.
본 발명의 영구증식된 B 세포 클론 또는 형질감염된 숙주 세포를 다양한 방식, 예컨대, 모노클로날 항체의 공급원으로서, 목적한 모노클로날 항체를 암호화하는 핵산(DNA 또는 mRNA)의 공급원으로서, 연구 등을 위해 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 생산하는 영구증식된 B 기억 세포 또는 형질감염된 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 영구증식된 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포를 또한 후속적인 재조합 발현을 위한 항체 유전자의 클로닝을 위한 핵산 공급원으로서 사용할 수 있다. 재조합 공급원으로부터의 발현은 예컨대, 안정성, 재생산성, 배양 용이성 등의 이유로, B 세포 또는 하이브리도마로부터의 발현보다는 약제 목적에 보다 일반적일 수 있다.
따라서, 본 발명은: (i) 목적한 항체를 암호화하는 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 하나 이상의 핵산(예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄 mRNA)를 수득하는 단계; (ii) 핵산을 발현 벡터 내로 삽입하는 단계 및 (iii) 벡터를 (이종) 숙주 세포 내로 형질감염시켜 이러한 숙주 세포 내에서 목적한 항체의 발현을 허용하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
유사하게, 본 발명은 (i) 목적한 항체를 암호화하는 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 핵산(들)을 서열분석하는 단계; 및 (ii) 단계 (i)로부터의 서열 정보를 사용하여 숙주 세포 내로 삽입하기 위한 핵산(들)을 제조함으로서 목적한 항체가 이러한 숙주 세포 내에서 발현하도록 하는 단계를 포함하는, 재조합 세포의 제조 방법을 제공한다. 핵산은 단계 (i)과 (ii) 사이에서 조작하여 제한 부위를 도입하고/하거나, 코돈 사용빈도(codon usage)를 변화시키고/시키거나 전사 및/또는 해독 조절 서열을 최적화할 수 있지만, 요구되지는 않는다.
또한, 본 발명은 또한 목적한 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는, 형질감염된 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 핵산은 본 발명의 영구증식된 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 유래된다. 따라서, 핵산(들)을 우선 제조한 다음 이를 이용하여 숙주 세포를 형질감염시키는 과정은 상이한 횟수로 상이한 사람들에 의해 상이한 장소(예컨대, 상이한 국가)에서 수행될 수 있다.
본 발명의 이러한 재조합 세포는 발현 및 배양 목적에 사용될 수 있다. 이는 대-규모 약제 생산을 위한 항체의 발현에 특히 유용하다. 이는 또한 약제학적 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 임의의 적합한 배양 기술, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 정적 배양(static culture), 롤러 병 배양(roller bottle culture), 복수액, 중공-섬유형 생물반응기 카트릿지(hollow-fiber type bioreactor cartridge), 모듈러 미니발효기(modular minifermenter), 교반된 탱크(stirred tank), 마이크로캐리어 배양(microcarrier culture), 세라믹 코어 관류(ceramic core perfusion) 등을 사용할 수 있다.
B 세포 또는 혈장 세포로부터 면역글로불린 유전자를 수득 및 서열분석하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다(예컨대, 문헌: Chapter 4 of Kuby Immunology, 4th edition, 2000 참고).
형질전환된 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 효모 및 동물 세포, 특히 포유동물 세포(예컨대, CHO 세포, NS0 세포, 사람 세포, 예를 들면, PER.C6 또는 HKB-11 세포, 골수종 세포, 또는 사람 간 세포), 뿐만 아니라 식물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 형질전환된 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들면, 이. 콜라이일 수 있다. 일부 구현예에서, 형질감염된 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, 사람 세포이다. 일부 구현예에서, 발현 숙주는 본 발명의 항체를 특히 자체적으로 사람 내에서 면역원성이 아닌 탄수화물 구조로 글리코실화할 수 있다. 일부 구현예에서 형질감염된 숙주 세포는 혈청이 없는 배지 속에서 성장시킬 수 있다. 추가의 구현예에서, 형질감염된 숙주 세포는 동물-유래된 생성물의 부재하에서 배양물 속에서 성장시킬 수 있다. 형질전환된 숙주 세포를 또한 배양하여 세포주를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한
(i) 영구증식된 B 세포 클론을 제조하거나 본 발명에 따른 혈장 세포를 배양하는 단계; (ii) B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 목적한 항체를 암호화하는 핵산을 수득하는 단계를 포함하는, 목적한 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(예컨대, 중쇄 및 경쇄 유전자)를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 (i) 영구증식된 B 세포 클론을 제조하거나 본 발명에 따른 혈장 세포를 배양하는 단계; (ii) B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 목적한 항체를 암호화하는 핵산을 서열분석하는 단계를 포함하는, 목적한 항체를 암호화하는 핵산 서열을 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 형질전환된 B 세포 클론 또는 본 발명의 배양된 혈장 세포로부터 수득된 핵산을 수득하는 단계를 포함하는, 목적한 항체를 암호화하는 핵산 분자(들)을 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포를 우선 수득한 다음, B 세포 클론 또는 배양된 혈잘 세포로부터 핵산(들)을 수득하기 위한 과정은 상이한 시간에 상이한 사람에 의해 상이한 장소(예컨대, 상이한 국가)에서 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 목적한 항체를 발현하는 선택된 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 하나 이상의 핵산(예컨대, 중쇄 및 경쇄 유전자)를 수득 및/또는 서열분석하는 단계; (ii) 핵산(들)을 핵산(들) 서열(들) 내로 또는 이를 사용하여 삽입함으로써 발현 벡터를 제조하는 단계; (iii) 목적한 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; (iv) 형질감염된 숙주 세포를 목적한 항체가 발현되는 조건 하에서 배양 또는 아-배양하는 단계; 및 임의로, (v) 목적한 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체(예컨대, 약제학적 용도를 위해)를 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 형질감염된 숙주 세포 집단, 예컨대, 안정하게 형질감염된 숙주 세포 집단을 목적한 항체가 발현되는 조건 하에서 배양 또는 아배양하는 단계 및, 임의로 목적한 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 목적한 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기서 상기 형질감염된 숙주 세포 집단은 (i) B 세포 클론 또는 상술한 바와 같이 제조된 배양된 혈장 세포에 의해 생산된 선택된 목적한 항체를 암호화하는 핵산(들)을 제공하는 단계, (ii) 핵산(들)을 발현 벡터 내로 삽입하는 단계, (iii) 벡터를 목적한 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포 내에서 형질전환시키는 단계, 및 (iv) 삽입된 핵산을 포함하는 형질감염된 숙주 세포를 배양 또는 아-배양함으로써 목적한 항체를 생산하는 단계에 의해 제조되었다. 따라서, 재조합 숙주 세포를 우선 제조한 다음 이를 배양하여 항체를 발현하는 과정은 매우 상이한 시간에 상이한 사람들에 의해 상이한 장소(예컨대, 상이한 국가)에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6에 나타낸 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체의 면역원성을 감소시키는 방법을 제공하며; 이러한 방법은 돌연변이 M428L 및 N434S를 항체의 중쇄의 불변 영역에 도입시키는 단계를 포함한다. 돌연변이는 상술한 바와 같이 달성할 수 있다. 본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체는 놀랍게도 매우 낮은 면역원성만, 특히 M428L/N434S 돌연변이가 없는 항체와 비교하여 거의 없는 면역원성을 나타낸다. 따라서, 이러한 돌연변이를 항체 내로 도입하는 것은 항체의 면역원성을 감소시킨다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한:
(i) 본 발명에 따른 항체;
(ii) 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 핵산;
(iii) 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터; 및/또는
(iv) 본 발명에 따른 항체를 발현시키거나 본 발명에 다른 벡터를 포함하는 세포 중 하나 이상
및, 임의로 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다시 말해서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 임의로 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 함유할 수 있다. 담체 또는 희석체가 투여를 촉진시킬 수 있지만, 이는 자체적으로 조성물을 제공받은 개체에게 유해한 항체의 생산을 유도하지 않아야 한다. 이는 독성이 아니어야 한다. 적합한 담체는 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 크고, 서서히 대사되는 거대분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 속에서 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제는 인플루엔자 A형 감염과 관련하여 활성 구성성분이 아니다.
약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 광산 염(mineral acid salt), 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기 산의 염, 예를 들면, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트를 사용할 수 있다.
약제학적 조성물 속의 약제학적으로 허용되는 담체는 액체, 예를 들면, 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물 속에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약제학적 조성물을 대상체가 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의정제(dragee), 캡슐제, 액체, 겔제, 시럽제, 슬러리제 및 현탁제로 제형화될 수 있도록 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 액체 액제 도는 현탁제로서, 주사가능하게 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 속의 액제, 또는 현탁제용으로 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다(예컨대, 방부제를 함유하는 멸균 수로 재구성하기 위한 Synagis™ 및 Herceptin®와 유사한 동결건조된 조성물). 조성물은 국소 투여를 위해, 예컨대, 연고제, 크림제 또는 산제로 제조할 수 있다. 조성물은 경구 투여용으로, 예컨대, 정제 또는 캡슐제로서, 스프레이제로서, 또는 시럽제(임의로 풍미된)로서 제조할 수 있다. 조성물은 폐 투여용으로, 예컨대, 흡입제로서, 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여 제조할 수 있다. 조성물은 비강, 귀 또는 눈 투여용, 예컨대, 점적제로서 제조할 수 있다. 조성물은 조합된 조성물이 대상체에게 투여되기 직전에 재구성되도록 설계된, 키트 형태(kit form)일 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 항체를 멸균수 또는 멸균 완충제와 함께 키트 형으로 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물 속의 (유일한) 활성 성분은 본 발명에 따른 항체이다. 따라서, 이는 위장 관 속에서의 분해에 대해 민감성일 수 있다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용한 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하지만 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출하는 제제를 함유할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체의 완벽한 논의는 문헌: Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472에서 입수가능하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 5.5 내지 8.5의 pH를 갖고, 일부 구현예에서 이는 6 내지 8, 예를 들면 약 7일 수 있다. pH는 완충제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 조성물은 멸균성이고/이거나 발열질이 없을 수 있다. 조성물은 사람과 관련하여 등장성일 수 있따. 일부 구현예에서 본 발명의 약제학적 조성물은 밀폐되어 밀봉된 용기(hermetically-sealed container)로 공급될 수 있다.
수개의 투여형으로 존재하는 조성물이 본 발명의 범위 내에 있고; 형태는 예컨대, 주사 또는 주입, 예를 들면, 거환 주사 또는 연속 주입에 의해, 비경구 투여용으로 적합한 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 이는 현탁제, 액제 또는 오일성 또는 수성 비히클 속의 유제의 형태를 취할 수 있고 이는 제형화제, 예를 들면, 현탁화제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적절한 멸균 액체와 함께 재구성하기 위한, 무수 형태일 수 있다.
비히클은 전형적으로 화합물, 예를 들면, 약제학적으로 활성인 화합물, 특히 본 발명에 다른 항체를 저장, 운반, 및/또는 투여하기에 적합한 물질인 것으로 이해된다. 예를 들면, 비히클은 생리학적으로 허용되는 액체일 수 있고, 이는 약제학적으로 활성인 화합물, 특히 본 발명에 따른 항체의 저장, 운반, 및/또는 투여에 적합하다. 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 일부 구현예에서 조성물은 포유동물, 예컨대, 사람 대상체에게 투여하기 위해 조정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 수의 경로, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 복강내, 수막내, 심실내, 경피(transdermal), 경피하(transcutaneous), 국소, 피하, 비강내, 장, 설하(sublingual), 질내 또는 직장 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(hypospray)를 또한 사용하여 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다. 임의로, 약제학적 조성물은 경구 투여용으로, 예컨대, 국소 투여용 정제, 캡슐제 등으로, 또는 주사가능하게, 예컨대, 액체 액제 또는 현탁제로서 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사가능하다. 주사 전에 액체 비히클 속의 액제, 또는 현탁제용으로 적합한 고체 형태가 또한 고려되는데, 예를 들면 약제학적 조성물은 동결건조된 형태일 수 있다.
주사용, 예컨대, 정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위에서의 주사용으로, 활성 성분은 발열질이 없고(pyrogen-free) 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 예를 들면, 등장성 비히클, 예를 들면, 염화나트륨 수사액, 링거 주사액(Ringer's Injection), 락테이트화된 링거 주사액(Lactated Ringer's Injection)을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요한 경우 포함될 수 있다. 이것이 항체, 펩타이드, 핵산 분자, 또는 개체에게 제공될 본 발명에 따른 다른 약제학적으로 유용한 화합물인지의 여부에 상관없이, 투여는 일반적으로 "예방학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"(존재할 수 있는 경우)이고, 이는 개체에게 이점을 나타내기에 충분하다. 투여된 실제 양, 및 투여 속도 및 투겨 과정은 치료되는 것의 특성 및 중증도에 의존할 것이다. 주사를 위해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 예를 들면, 예비-충전된 주사기 속에 제공될 수 있다.
상기 정의된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁제 또는 액제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 경구적으로 허용되는 투여량 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에, 일반적으로 사용된 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활화제, 예를 들면, 스테아르산마그네슘을 또한 전형적으로 가한다. 캡슐제 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 무수 옥수수전분을 포함한다. 수성 현탁제가 경구 사용을 위해 요구되는 경우, 활성 성분, 즉, 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 운반인자 카고 접합체 분자(transporter cargo conjugate molecule)를 유하제 및 현탁화제와 조합한다. 바람직한 경우, 특정의 감미제, 풍미제 또는 착색제를 또한 가할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 특히 치료 표적이 예컨대, 접근가능한 상피 조직을 포함하는, 국소 적용에 의해 용이하게 접근가능한 부위 또는 기관을 포함하는 경우, 국소적으로 투여할 수 있다. 적합한 국소 제형은 이러한 부위 또는 기관 각각에 대해 용이하게 제조된다. 국소 적용을 위해, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 담체 속에 현탁되거나 용해된, 본 발명의 약제학적 조성물, 특히 상기 정의된 바와 같은 이의 구성성분을 함유하는 적합한 연고제로 제형화될 수 있다. 국소 투여용 담체는 광 오일, 액체 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 적합한 로션제 또는 크림제로 제형화될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 적합한 담체는 광 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
투여량 치료는 단일 용량 스케쥴 또는 다중 용량 스케쥴일 수 있다. 특히, 약제학적 조성물은 단일 용량 생성물로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 특히 단일 용량 생성물로 제공되는 경우 약제학적 조성물 속의 항체의 양은 200 mg을 초과하지 않는데, 예를 들면, 이는 100 mg 또는 50 mg을 초과하지 않는다.
예를 들면, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 매일, 예컨대, 1일 당 1회 또는 수회, 예컨대, 1일 당 1, 2, 3회 또는 4회로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 이상 동안, 예컨대, 매일 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 동안 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 매주, 예컨대, 주당 1 또는 2회, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21주 이상 동안, 예컨대, 매주 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 동안 또는 매주 2, 3, 4, 또는 5년 동안 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 매달, 예컨대, 1개월당 1회 또는 격달로 1, 2, 3, 4, 또는 5년 이상 투여될 수 있다. 투여는 또한 생애 동안 지속될 수 있다. 일부 구현예에서, 특히 특정의 처방, 예컨대, 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방을 위해 1회의 단일 투여 만이 예상된다. 예를 들면, 단일 투여(단일 용량)가 투여되고 추가의 용량은, 항체의 역가가 불충분하거나 보호용으로 불충분한 것으로 추정되는 경우, 1회 이상 이후 시점에서 투여될 수 있다.
단일 용량, 예컨대, 매일, 매주 또는 매달 투여를 위해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 내 항체의 양은 1 g 또는 500 mg을 초과하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 용량의 경우, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 속의 항체의 양은 200 mg, 또는 100 mg을 초과하지 않을 수 있다. 예를 들면, 단일 용량의 경우, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 속의 항체의 양은 50 mg을 초과하지 않을 수 있다.
약제학적 조성물은 전형적으로 본 발명의 하나 이상의 항체의 "유효"량, 즉, 목적한 질환 또는 상태를 치료, 개선, 약화, 감소 또는 방지하거나, 검출가능한 치료학적 효과를 나타내기에 충분한 양을 포함한다. 치료학적 효과는 또한 병원성 효능 또는 물리적 증상에서의 감소 또는 약화를 포함한다. 임의의 특수한 대상체에 대해 정밀한 유효량은 이의 체격, 체중, 및 건장, 상태의 특성 및 정도, 및 투여용으로 선택된 치료제 또는 치료제의 조합에 의존할 것이다. 주어진 상황에 대한 유효량은 통상의 실험으로 측정되며 임상의의 판단 내에 있다. 본 발명의 목적을 위해, 유효 용량은 일반적으로 약 0.005 내지약 100 mg/kg, 예를 들면, 약 0.0075 내지 약 50 mg/kg 또는 약 0.01 내지 약 10 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, 유효 용량은 이것이 투여된 개체의 체중(예컨대, kg)과 관련하여 본 발명의 항체의 약 0.02 내지 약 5 mg/kg(예컨대, 약제학적 조성물 속의 항체의 양)일 것이다.
더욱이, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 추가의 활성 구성성분을 포함할 수 있고, 이는 또한 항체 또는 항체가 아닌 구성성분일 수 있다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 하나 이상의 항바이러스제(항체가 아닌)를 포함할 수 있다. 더욱이, 약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 항체(본 발명에 따르지 않는), 예를 들면, 다른 인플루엔자 바이러스 항원(헤마글루티닌 이외의)에 대한 항체 또는 다른 인플루엔자 바이러스에 대한(예컨대, 인플루엔자 B형 바이러스에 대한 또는 인플루엔자 C형 바이러스에 대한) 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 활성 구성성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 동일한 약제학적 조성물 속에 추가의 활성 구성성분으로서 존재할 수 있거나, 대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 제1의 약제학적 조성물에 포함되며 추가의 활성 구성성분은 제1의 약제학적 조성물과는 상이한 제2의 약제학적 조성물에 포함된다. 따라서, 하나 이상의 추가의 활성 구성성분이 고려된 경우, 각각의 추가의 활성 구성성분 및 본 발명에 따른 항체는 상이한 약제학적 조성물 속에 포함될 수 있다. 이러한 상이한 약제학적 조성물은 조합하여/동시에 또는 수회로 또는 별개의 위치(예컨대, 신체의 별개의 부분)에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 및 추가의 활성 구성성분은 추가의 치료학적 효과, 예를 들면, 상승적 치료 효과를 제공할 수 있다. 용어 "상승작용(synergy)"은 각각의 개개 활성제의 개개 효과의 합보다 더 큰 2개 이상의 활성제의 조합 효과를 기술하는데 사용된다. 따라서, 2개 이상의 제제의 조합된 효과가 활성 또는 공정의 "상승적 억제(synergistic inhibition)"를 생성하는 경우, 활성 또는 공정의 억제는 각각의 개개 활성제의 억제 효과의 합보다 더 큰 것으로 의도된다. 용어 "상승적 치료 효과(synergistic therapeutic effect)"는 2개 이상의 치료요법의 조합으로 관찰된 치료 효과를 지칭하며 여기서 치료 효과(임의의 다수의 매개변수에 의해 측정된 것으로서)는 각각의 개개 치료요법으로 관찰된 개개 치료학적 효과의 합보다 더 크다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 항체를 포함할 수 있고, 여기서 항체는 조성물의 총 단백질의 적어도 50 중량%(예컨대, 60 중량%, 70 중량%, 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 99 중량% 이상)을 구성한다. 본 발명의 조성물에서, 항체는 정제된 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 본 발명의 항체를 제조하는 단계; 및 (ii) 정제된 항체와 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물을 제조하는 방법은 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 형질전환된 B 세포 또는 배양된 혈장 세포로부터 수득된 모노클로날 항체이다.
치료학적 목적을 위한 항체 또는 B 세포를 전달하기 위한 대안으로서, B 세포 또는 배양된 모노클로날 항체를 암호화하는 핵산(전형적으로 DNA)를 대상체에게 전달함으로써, 핵산이 대상체 내에서 동일계내(in situ) 발현되어 목적한 치료학적 효과를 제공할 수 있는 것이 가능하다. 적합한 유전자 치료요법 및 핵산 전달 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다.
약제학적 조성물은 특히 다중 용량 양식으로 패키징되는 경우, 항미생물제를 포함할 수 있다. 이는 세제, 예컨대, 트윈(폴리소르베이트), 예를 들면, 트윈 80을 포함할 수 있다. 세제는 일반적으로 저 수준, 예컨대, 0.01% 미만으로 존재한다. 조성물은 또한 나트륨 염(예컨대, 염화나트륨)을 포함함으로써 강직성을 제공할 수 있다. 예를 들면, 10±2mg/ml 농도의 NaCl이 대표적이다.
또한, 약제학적 조성물은, 이들이 특히 동결건조되어야 하거나 이들이 동결건조된 물질로부터 재구성된 물질을 포함하는 경우, 당 알코올(예컨대, 만니톨) 또는 이당류(예컨대, 슈크로스 또는 트레할로스), 예컨대, 대략 15 내지 30 mg/ml(예컨대, 25 mg/ml)를 포함할 수 있다. 동결건조용 조성물의 pH는 동결건조 전에 5 내지 8, 또는 5.5 내지 7, 또는 대략 6.1로 조절될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역조절제는 보조제를 포함한다.
의학적 치료 및 용도
추가의 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료시; 또는 (ii) 인플루엔자 A형 바이러스로의 감염의 진단시 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 인플루엔자 A형 바이러스 감염을 감소시키거나, 인플루엔자 A형 바이러스 감염을 저하시키는 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방, 치료 또는 약화용 의약의 제조시 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
진단 방법은 항체를 샘플과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 대상체, 예를 들면, 비강 통과액, 부비강, 타액선, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌, 피부 또는 혈액, 예를 들면, 태반 또는 혈청으로부터 취한, 예를 들면, 단리된 조직 샘플로부터 단리될 수 있다. 진단 방법은 또한 특히 항체와 샘플의 접촉 후, 항원/항체 복합체의 검출을 포함할 수 있다. 이러한 검출 단계는 전형적으로 벤치(bench)에서, 즉, 사람 또는 동물 신체에 대한 임의의 접촉없이 수행된다. 검출 방법의 예는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있고, 예컨대, ELISA(효소-연결된 면역흡착성 검정)를 포함한다.
인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염의 예방은 특히 예방학적 설정을 지칭하고 여기서 대상체는 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염으로 진단되지 않았고/않았거나(진단이 수행되지 않았거나 진단 결과가 음성이었다) 대상체가 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염의 증상을 나타내지 않는다. 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염의 예방은 감염된 경우 심각한 질환 또는 합병증의 보다 큰 위험에 있는 대상체, 예를 들면, 임신한 여성, 어린이(59개월 이하의 어린이), 노인, 만성 의학적 상태(예를 들면, 만성 심장, 폐, 신장, 대사, 신경발달, 간 또는 혈액학적 질환)를 지닌 개체 및 면역억제 상태(예를 들면, HIV/ADIS, 화학치료요법 또는 스테로이드를 제공받는, 또는 악성 종양)을 지닌 개체에서 특히 유용하다. 더욱이, 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염의 예방은 예컨대, 증가된 노출로 인하여 인플루엔자 A형 바이러스 감염될 위험이 보다 큰 대상체, 예를 들면, 공공 구역에서 일하거나 머무는 대상체, 특히 보건 작업자에서 특히 유용하다.
치료학적 설정에서, 대조적으로, 대상체는 전형적으로 인플루엔자 A형 바이러스로 감염되고/되거나, 인플루엔자 A형 바이러스 감염으로 진단되고/되거나 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 증상을 나타낸다. 물론, 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 용어 "치료" 및 "치료요법"/"치료제"는 (완전한) 치유 뿐만 아니라 인플루엔자 A형 바이러스 감염 및/또는 관련 증상의 약화/감소를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 바이러스 감염된 것으로 진단된 대상체 또는 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 증상을 나타내는 개체에서 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 무증상 대상체에서 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 대상체는 인플루엔자 A형 바이러스 감염으로 진단되거나 진단되지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 치료될 대상체(예컨대, 상술한 바와 같은 예방학적 또는 치료학적 설정에서)는 자가면역 질환 또는 알레르기를 앓고 있거나; 자가면역 질환 또는 알레르기로 진행될 위험이 있다. 자가면역 질환 또는 알레르기로 진행될 위험이 있는 대상체는 자가면역 질환 및/또는 알레르기를 지닌 가족 구성원을 가진 대상체, 및/ 알레르기원에 (일정하게) 노출된 대상체를 포함한다. 본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같은 본 발명의 항체는 놀랍게도 M428L/N434S 돌연변이가 없는 항체와 비교하여 단지 매우 낮은 면역원성을 나타내거나, 특히 면역원성을 거의 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명의 항체는 강력한 면역 반응의 위험에 있는 대상체에서 특히 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용되며, 여기서 항체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 바이러스 감염 전 3개월까지(가능하게는), 예를 들면, (가능한) 인플루엔자 A형 바이러스 감염 전 2주까지 또는 (가능한) 인플루엔자 A형 바이러스 감염 전 1주까지 투여된다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용되며, 여기서 항체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 (가능한) 인플루엔자 A형 바이러스 감염 전 1일까지 투여된다. 이러한 치료 스케쥴은 특히 예방학적 설정으로 지칭된다.
더욱이, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있고, 여기서 항체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 감염의 제1 증상 전 3개월 까지 또는 인플루엔자 A형 감염의 제1 증상이 발생하기 전 3개월 까지 또는 인플루엔자 A형 감염의 제1 증상이 발생하기 전 1개월 까지, 예를 들면, 인플루엔자 A형 감염의 제1 증상이 발생하기 전 2주 까지 또는 인플루엔자 A형 감염의 제1 증상이 발생하기 전 1주 까지 투여된다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용되며, 여기서 항체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물은 인플루엔자 A형 감염의 제1 증상이 발생하기 전 3일 또는 2일까지 투여된다.
일반적으로 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제1 투여 후, 1회 이상의 후속적인 투여가 이어질 수 있는데, 예를 들면 1일당 또는 격일당 1회 용량으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 이어질 수 있다. 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제1 투여 후, 1회 이상의 후속적인 투여, 예를 들면, 주당 1회 또는 2회의 단일 용량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21주 동안 이어질 수 있다. 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제1 투여 후, 1회 이상의 후속적인 투여, 예를 들면, 2주마다 또는 4주마다 1회 용량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21주 동안 이어질 수 있다. 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제1 투여 후 1회 이상의 후속적인 투여, 예를 들면, 격달마다 또는 4개월마다 1회 투여량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 1, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개월 동안 이어질 수 있다. 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제1 투여 후, 1회 이상의 후속적인 투여, 예를 들면, 1년당 1회 또는 2회의 단일 용량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 동안 이어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 0.005 내지 100 mg/kg의 체중 또는 0.0075 내지 50 mg/kg의 체중의 (단일) 용량에서, 예를 들면, 0.01 내지 10 mg/kg의 체중의 (단일) 용량에서 또는 0.05 내지 5 mg/kg의 체중의 단일 용량에서 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 0.1 내지 1 mg/kg의 체중의 (단일) 용량에서 투여된다.
본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 임의의 수의 경로, 예를 들면, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 복강내, 수막내, 심실내, 경피, 경피하, 국소, 피하, 비강내, 장, 설하, 질내 또는 직장 경로로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 예방학적으로, 즉, 인플루엔자 A형 감염이 진단되기 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형 감염의 예방 또는 치료를 위해 필요한 용량의 1/2을 초과하지 않으며, 이는 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형 감염의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/2을 초과하지 않는 용량에서 투여되고, 이는 중쇄를 불변 영역 내에서 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와 상이하다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 용량은 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형 감염의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8 또는 1/9을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 인플루엔자 A형 감염의 예방 또는 치료에 요구된 용량의 1/10을 초과하지 않으며 이는 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서 상기 항체와는 상이하다. 본 출원의 실시예 5는 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하는 본 발명의 항체가 비교 항체와 비교하여 훨씬 더 낮은 용량에서 효과적이며, 이는 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만, 본 발명의 항체와 상이하다. 실시예 5는 또한 본 발명의 항체가 순환하는 항체 수준과는 독립적임을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 항체는 인플루엔자 A형 감염의 즉각적인 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 인플루엔자 A형 감염의 즉각적인 위험은 전형적으로 인플루엔자 A형 유행 동안 발생한다. 인플루엔자 A형 바이러스는 질환의 계절적 유행을 순환 및 유발시키는 것으로 알려져 있다(WHO, Influenza (Seasonal) Fact sheet, November 6, 2018). 온대 기후에서, 계절성 유행병은 주로 겨울에 발생하지만, 열대 지방에서, 인플루엔자는 년중 발생하여 보다더 불규칙적인 유행을 유발할 수 있다. 예를 들면, 북반구에서, 인플루엔자 A형 유행 위험은 11, 12, 1, 2 및 3월 동안 높지만, 남반구에서 인플루엔자 A형 유행 위험은 5, 6, 7, 8 및 9월에 높다.
조합 치료요법
본 발명에 따른 방법 및 용도에서 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여는 단독으로 또는 보조제(co-agent)(또한 본원에서 "추가의 활성 구성성분"으로 지칭됨)와 함께 수행되며, 이는 인플루엔자 감염의 방지 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여를 포함하고, 여기서 이는 대상체에게 보조제 또는 인플루엔자를 치료 및/또는 방지하는데 유용한 다른 치료학적 요법 전에, 이와 동시에 또는 이후에 투여된다. 상기 보조제와 함께 투여되는 상기 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물은 동일하거나 상이한 조성물(들)로 및 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은, "조합 치료요법", "조합된 투여", "함께 투여" 등과 같은 표현은 약물(이는 "와 함께" 투여되어야 한다)의 조합된 작용을 지칭하는 것으로 의도된다. 이를 위해, 조합된 약물은 일반적으로 동일한 시간 및/또는 오버랩핑 시간 윈도우(overlapping time window)에 존재한다. 약물 중 하나에 의해 개시된 효과가 여전히 진행중이지만(약물 자체가 더 이상 존재하지 않는 경우에도) 다른 약물이 투여됨으로써 약물 둘 다의 효과가 상호작용할 수 있도록 하는 것도 또한 가능할 수 있다. 그러나, 다른 약물 전에 오랫동안(예컨대, 2, 3, 3개월 이상 또는 1년 동안) 투여됨으로써 다른 약물이 투여된 때 이것이 더 이상 존재하지 않는(또는 이의 효과가 진행중이지 않는) 약물인 전형적으로 "함께 투여된 것으로 고려되지 않는다. 예를 들면, 명백한 인플루엔자 계절에 투여된 인플루엔자 의약은 일반적으로 "함께" 투여되지 않는다.
상기 다른 치료학적 요법 또는 보조제는 예를 들면, 항바이러스제일 수 있다. 항바이러스제(또는 "항바이러스제" 또는 "항바이러스 약물")는 바이러스 감염을 치료하기 위해 구체적으로 사용된 의약의 부류를 지칭한다. 세균용 항생제와 같이, 항바이러스는 다양한 바이러스에 대해 유용한 광범위한 스펙트럼의 항바이러스제 또는 특정 바이러스에 대해 사용된 특정 항바이러스제일 수 있다. 대부분의 항생제와는 달리, 항바이러스 약물은 이의 표적 병원체를 파괴시키지 않고; 대신에 이들은 전형적으로 이의 발달을 억제한다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 (의약적) 사용을 위한 항바이러스제와 함께(전에, 동시에 또는 후에) 투여된다.
일반적으로, 항바이러스제는 광범위한 스펙트럼의 항바이러스제(이는 인플루엔자 바이러스 또는 다른 바이러스에 대해 유용하다) 또는 인플루엔자 바이러스-특이적인 항바이러스제일 수 있다. 일부 구현예에서, 항바이러스제는 항체가 아니다. 예를 들면, 항바이러스제는 작은 분자 약물일 수 있다. 인플루엔자의 예방 및/또는 치료에 유용한 작은 분자의 예는 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술되어 있다. 문헌: Wu et al., 2017에 기술된 바와 같이, 기술자는 인플루엔자의 예방 및/또는 치료에 유용한 다양한 항바이러스제에 친숙하다. 인플루엔자에 유용한 추가의 항바이러스제는 문헌: Davidson S. Treating Influenza Infection, From Now and Into the Future. Front Immunol. 2018;9:1946; 및 in: Koszalka P, Tilmanis D, Hurt AC. Influenza antivirals currently in late-phase clinical trial. Influenza Other Respir Viruses. 2017;11(3):240-246에 기술되어 있다.
인플루엔자의 예방 및/또는 치료에 유용한 항바이러스제는 (i) 인플루엔자 바이러스 자체의 기능성 단백질을 표적화하는 제제 및 (ii) 숙주 세포, 예컨대, 상피를 표적화하는 제제를 포함한다.
숙주 세포 표적화제는 광범위한 스펙트럼의 항바이러스제의 티아졸리드 부류, 시알리다제 융합 단백질, 제III형 인터페론, Bcl-2(B 세포 림프종 2) 억제제, 프로테아제 억제제, V-ATPase 억제제 및 항산화제를 포함한다. 광범위한 스펙트럼의 항바이러스의 티아졸리드 부류의 예는 혈액 속에서 활성 대사 형인 티족사니드(TIZ)로 신속하게 탈아세틸화되는, 니타족사니드(NTZ), 및 RM5061과 같이, nTZ와 구조적으로 관련된, 제2 세대 티아졸리드 화합물을 포함한다. 플루다제(DAS181)는 시알리다제 융합 단백질의 예이다. 제III형 IFN은 예를 들면, IFN을 포함한다. Bcl-2 억제제의 비-제한적 예는 ABT-737, ABT-263, ABT-199, WEHI-539 및 A-1331852(Davidson S. Treating Influenza Infection, From Now and Into the Future. Front Immunol. 2018;9:1946)를 포함한다. 프로테아제 억제제의 예는 나파모스타트, 류펩틴, 엡실론-아미노카프론산, 카모스타트 및 아프로티닌을 포함한다. V-ATPase 억제제는 NorakinR, ParkopanR, AntiparkinR 및 AkinetonR을 포함한다. 항산하제의 예는 알파-토코페롤을 포함한다.
일부 구현예에서, 항바이러스제는 인플루엔자 바이러스 자체의 기능성 단백질을 표적화하는 제제이다. 예를 들면, 항바이러스제는 헤마글루티닌이 아닌, 인플루엔자 바이러스의 기능성 단백질을 표적화할 수 있다. 일반적으로, 인플루엔자 바이러스의 기능성 단백질을 표적화하는 항바이러스제는 도입 억제제(entry inhibitor), 헤마글루티닌 억제제, 뉴라미나제 억제제, 인플루엔자 폴리머라제 억제제(RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RdRp) 억제제), 뉴클레오캡시드 단백질 억제제, M2 이온 채널 억제제 및 아르비돌 하이드로클로라이드를 포함한다. 도입 억제제의 비-제한적 예는 트리테르페노이드 유도체, 예를 들면, 글리시리즈산(글리시리진) 및 글리시르헤틴산; 사포닌; 우랄사포닌스 M-Y(예를 들면, 우랄사포닌스 M); 덱스트란 설페이트(DS); 실리마린; 쿠르쿠민; 및 리소솜 향성 제제(lysosomotropic agent), 예를 들면, 콘카나마이신 A, 바필로마이신 A1, 및 클로로퀸을 포함한다. 헤마글루티닌 억제제의 비-제한적 예는 BMY-27709; 스타키플린; 천연 생성물, 예를 들면, 고씨폴(Gossypol), 루틴(Rutin), 퀴르세틴(Quercetin), 크실로핀(Xylopine), 및 테아플라빈; 3가 글리코펩타이드 모사체, 예를 들면, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 화합물 1; 포도카프르산 유도체, 예를 들면, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 화합물 2; 천연 생성물 펜타사이클릭 트리테르페노이드, 예를 들면, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 화합물 3; 및 프레닐화된 인돌 디케토피페라진 알칼로이드, 예를 들면, 네오에키눌린 B을 포함한다. 뉴클레오캡시드 단백질 억제제의 비-제한적 예는 뉴클레오진, 사이클로헥스이미드, 나프록센 및 인가비린을 포함한다. M2 이온 채널 억제제의 비-제한적 예는 승인된 M2 억제제 아다만틴 및 리만타딘 및 이의 유도체; 뿐만 아니라 비-아다만탄 유도체, 예를 들면, 스페르민, 스페르미딘, 스피로피페리딘 및 피난아민 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항바이러스제는 뉴라미니다제(NA) 억제제 및 인플루엔자 폴리머라제 억제제(RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RdRp) 억제제)를 포함한다. 뉴라미니다제(NA) 억제제의 비-제한적 예는 자나미비르(zanamivir); 오셀타미비르(oseltamivir); 페라미비르(peramivir); 라니나미비르(laninamivir); 이의 유도체, 예를 들면, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 화합물 4-10, 및 이량체성 자나미비르 접합체(예컨대, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 바와 같음); 벤조산 유도체(예컨대, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 바와 같은; 예를 들면, 화합물 11-14); 피롤리딘 유도체(예컨대, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 바와 같음; 예를 들면, 화합물 15-18); 징크제틴-시알산 접합체; 플라바논 및 플라보노이드 이소스쿠텔라레인 및 이의 유도체(예컨대, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 바와 같음); AV5080; 및 N-치환된 오셀타미비르 유사체(예컨대, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 바와 같음)를 포함한다. 인플루엔자 폴리머라제 억제제(RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRp) 억제제)의 비-제한적 예는 RdRp 파괴 화합물, 예를 들면, 문헌: Wu X, Wu X, Sun Q, et al. Progress of small molecular inhibitors in the development of anti-influenza virus agents. Theranostics. 2017;7(4):826-845에 기술된 것; PB2 캡(cap)-결합 억제제, 예를 들면, JNJ63623872(VX-787); 캡-의존성 엔도뉴클레아제 억제제, 예를 들면, 발록사비르 마르복실(S-033188); PA 엔도뉴클레아제 억제제, 예를 들면, AL-794, EGCG 및 이의 지방족 유사체, N-하이드록삼산 및 N-하이드록시이미드, 플루티미드 및 이의 방향족 유사체, 테트람산 유도체, L-742,001, ANA-0, 폴리페놀산 카테친, 펜에틸-페닐프탈이미드 유사체, 마크로사이클릭 비스비벤질, 피리미딘올, 풀러렌, 하이드록시피리디논, 하이드록시피리다지논, 트리하이드록시-페닐-생성 화합물, 2-하이드록시-벤즈아미드, 하이드록시-피리미디논, β-디케토산 및 이의 생물등량 화합물(bioisosteric compound), 티오세미카르바존, 비스디하이드록시인돌-카복스아미드, 및 피리도-피페라진디온(엔도-1); 및 뉴클레오시드 및 핵염기 유사체 억제제, 예를 들면, 리바비린, 파비피라비르(T-705), 2'-데옥시-2'-플루오로구아노신(2'-FdG), 2'-치환된 카르바-뉴클레오시드 유사체, 6-메틸-7-치환된-7-데아자 푸린 뉴클레오시드 유사체, 및 2'-데옥시-2'-플루오로사이티딘(2'-FdC)을 포함한다. 예를 들면, 항바이러스제는 자나미비르, 오셀타미비르 또는 발록사비르일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 추가의 활성 구성성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 동일한 약제학적 조성물 속에 추가의 활성 구성성분(보조제)로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체 및 추가의 활성 구성성분(보조제)는 별도의 약제학적 조성물(예컨대, 동일한 조성물 속이 아닌) 속에 존재할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 추가의 활성 구성성분(보조제)가 고려되는 경우, 본 발명에 따른 각각의 추가의 활성 구성성분(보조제) 및 항체, 또는 항원 결합 단편은 상이한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 상이한 약제학적 조성물은 함께/동시에 또는 별도의 시간에 및/또는 별개의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 및 추가의 활성 구성성분(보조제)은 부가적인 또는 상승적인 치료학적 효과를 제공할 수 있다. 용어 "상승작용"은 각각의 개개 활성제의 개개 효과의 합보다 더 큰 2개 이상의 활성제의 조합된 효과를 기술하기 위해 사용된다. 따라서, 2개 이상의 제제의 조합된 효과가 활성 또는 공정의 "상승적 억제"를 생성하는 경우, 활성 또는 공정의 억제는 각각의 개개 활성제의 억제 효과의 합보다 더 큰 것으로 의도된다. 용어 "상승적 치료학적 효과"는 2개 이상의 치료요법의 조합으로 관찰된 치료학적 효과를 지칭하고 여기서 치료학적 효과(임의의 다수의 매개변수에 의해 측정됨)는 각각 개개 치료요법으로 관찰된 개개 치료학적 효과의 합보다 더 크다.
따라서, 본 발명은 또한 (i) 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체, 및 (ii) 상술한 바와 같은 항바이러스제의 조합을 제공한다.
다음에서 첨부된 도면의 간단한 설명이 제공될 것이다. 도면은 본 발명을 보다 상세히 나타내기 위함이다. 그러나, 이는 본 발명의 주제를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1은 실시예 2에 대해 56일까지 ELISA를 통해 마카퀴(macaque) 혈장 샘플에서 사람 항체 FluAB_MLNS(빈 사각형) 및 FluAB_wt(비교 항체; 채워진 사각형)의 혈장 농도를 나타낸다.
도 2는 실시예 3에 대해 총 사람 mAb를 정량하기 위해 항-CH2 항체 ELISA를 사용하거나 mAb의 기능성을 측정하기 위해 HA 항원-결합 ELISA를 사용하여 측정한 FluAB_MLNS(동물 C90142, C90190)의 혈장 농도를 나타낸다. 그래프는 선택된 시점(1, 21, 56, 86, 및 113일)에서 총 사람 mAb 정량화와 개개 동물에 대한 HA 결합 사이의 선형 회귀를 나타낸다.
도 3은 실시예 4에 대해 (A) ELISA를 사용하여 측정하고 우레아 함량에 대해 표준화한 것으로서 비강 채취면봉(swab) 내 사람 항체 FluAB_MLNS 및 FluAB_wt의 농도; 및 (B) 혈장 농도에 걸쳐 비강 채취면봉내 우레아-표준화된 농도의 %로 나타낸, 사람 항체 FluAB_MLNS 및 FluAB_wt의 생분포를 나타낸다. 개개 동물 ID 및 접정된 사람 항체 변이체(FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt)를 하기 나타낸다.
도 4는 실시예 5에 대해 FluAB_wt(패널 B, D, 원형), FluAB_MLNS(패널 C, E, 사각형)을 1 mg/kg(패널 B, C, 회색기호) 및 0.3 mg/kg(패널 D, E, 연회색 기호)로 처리하거나 처리하지 않고 둔(패널 A, 삼강형) Tg32 ㅁ우스에서 시간에 따른 누적된 체중 변화를 나타내고; 모든 마우스는 PR8 바이로스로 감염시켰다. 개개 동물을 나타낸다; 두꺼운 검정 선은 BW±SD의 평균 경향성을 나타낸다. 그룹 당 개체의 수가 나타나 있다. *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001 대 대조군 단독(A), °p< 0.05, °°p< 0.01, 모두 대 MEDI8852의 상대적인 시점, 본페로니 다중 시험 교정(Bonferroni's multiple test correction)을 사용한 2원 아노바(2-way ANOVA).
도 5는 실시예 5의 경우에 아무것도 처리하지 않은(사선), FluAB_wt, 또는 FluAB_MLNS로 처리한 감염된 Tg32 수컷 마우스에서 1 mg/kg 용량(좌측 패널)과 0.3 mg/kg 용량(우측 패널) 사이에 생존 비교 %를 나타낸다. **p<0.01 대 처리하지 않은 마우스(CTR) 및 FluAB_MLNS 0.3 mg/kg; °°°p<0.001 대 FluAB_wt, 로그-순위 분석(log-rank analysis), 만텔-콕스 방법(Mantel-Cox method).
도 6은 실시예 5의 경우 주사된 항체의 순환 수준을 나타낸다. 감염 직전(0일째) 및 감염 후 6일째에, 마우스의 혈청 속에서 측정된 순환하는 FluAB_wt(원형) 및 FluAB_MLNS(사각형)의 개개 수준(μg/ml)을 나타낸다. 바아는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 7은 실시예 6의 경우 시험관내 중화 검정에서 사용된 플레이트 개략도를 나타낸다.
도 8은 실시예 6의 경우 H1N1(A, C) 및 H3N2(B, D) 바이러스 감염에서 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르(Oseltamivir) 단독의 중화 활성을 나타낸다.
도 9는 실시예 6의 경우 H1(A) 및 H3(B) 바이러스 감염에서 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합된 중화 활성을 나타낸다. 데이타는 MDCK 세포의 H1N1(A) 및 H3N2(B) 바이러스 감염 둘 다에서 FluAB_MLNS 단독 및 오셀타미비르와 헤테로몰 농도의 오셀타미비르의 조합에 의한 억제된 비율(fraction)을 나타낸다. 데이타는 3개의 값의 평균 ± SD로 나타내고, 각각의 중복물은 3개의 독립된 배양 플레이트에서 수득하였다.
도 10은 실시예 6의 경우 조합된 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 중간 효과 플롯을 나타낸다. 2개의 화합물을 나타낸 성분 비에서 일련 희석시키고 H1(A) 및 H3(B) 바이러스 균주로 감염된 MDCK 세포에 가하였다. 비-고정 비(non-constant ratio)(NCR)에서 선택된 조합으로부터 수득한 값을 또한 나타낸다.
도 11은 실시예 6의 경우 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합 지수(combination index)를 나타낸다. 점(dot)은 측면에 나타낸 누적된 약물-약물 농도와 함께 나타낸 고정 비에서 실제 실험 점을 나타낸다. 점으로 된 곡선은 완전한 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 나타낸다.
도 12는 실시에 6의 경우 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합된 지수를 나타낸다. 데이타는 측면에 나타낸 누적된 약물-약물 농도와 함게 나타낸 고정 비에서 실제 실험 점을 나타낸다. 점으로 된 곡선은 완전한 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 나타낸다.
도 13은 실시예 6의 경우 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합의 이소볼로그램(isobologram)을 나타낸다. 데이타는 상이한 일정 비의 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합에서 IC50, IC75 및 IC90 값을 나타낸다.
도 14는 실시예 6의 경우 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합의 이소볼로그램을 나타낸다. 데이타는 상이한 고정 비의 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합에서 IC50, IC75 및 IC90 값을 나타낸다. 각각의 실험 점에서, 누적된 농도가 나타나 있다.
도 15는 실시예 6의 경우 H1N1(A, C) 및 H3N2(B, D) 바이러스 감염에서 FluAB_MLNS 및 자나미비르(Zanamivir) 단독의 중화 활성을 나타낸다.
도 16은 실시예 6의 경우 H1(A) 및 H3(B) 바이러스 감염에서 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합된 중화 활성을 나타낸다. 데이타는 MDCK 세포의 H1N1(A) 및 H3N2(B) 바이러스 감염 둘 다에서 FluAB_MLNS 단독 및 헤테로몰 농도의 자나미비르와의 조합에 의한 억제된 비율을 나타낸다. 데이타는 3개의 값의 평균±SD로 나타내고, 각각의 중복물은 3개의 독립된 배양 플레이트에서 수득하였다.
도 17은 실시예 6의 경우 조합된 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 중간 효과 플롯을 나타낸다. 2개의 화합물을 나타낸 고정 비에서 일련 희석하고 H1(A) 및 H3(B) 바이러스 균주로 감염된 MDCK 세포에 가하였다. 비-고정 비(NCR)에서 선택된 조합으로부터 수득된 값을 또한 나타낸다.
도 18은 실시예 6의 경우 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합 지수를 나타낸다. 점은 측면에 나타낸 누적된 약물-약물 농도와 함께 나타낸 고정 비에서 실제 실험 점을 나타낸다. 점으로 된 곡선은 완전한 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 나타낸다.
도 19는 실시예 6의 경우 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합 지수를 나타낸다. 점은 측면에 나타낸 누적된 약물-약물 농도와 함께 나타낸 일정 비에서 실제 실험 점을 나타낸다. 점으로 된 곡선은 완전한 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 나타낸다.
도 20은 실시예 6의 경우 H1N1 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-자나미비르 조합의 이소볼로그램을 나타낸다. 데이타는 상이한 함량비의 FluAB_MLNS-자나미비르 조합에서 IC50, IC75 및 IC90 값을 나타낸다. 각각의 실험 점에서, 누적된 농도가 나타나 있다.
도 21은 실시예 6의 경우 H3N2 바이러스 감염에 대한 FluAB_MLNS-자나미비르 조합의 이소볼로그램을 나타낸다. 데이타는 상이한 함량비의 FluAB_MLNS-자나미비르 조합에서 IC50, IC75 및 IC90 값을 나타낸다. 각각의 실험 점에서, 누적된 농도가 나타나 있다.
도 22는 실시예 6의 경우 H1N1(A, C) 및 H3N2(B, D) 바이러스 감염에서 FluAB_MLNS 및 발록사비르(Baloxavir) 단독의 중화 활성을 나타낸다,
도 23은 실시예 6의 경우 H1(A) 및 H3(B) 바이러스 감염에서 FluAB_MLNS 및 발록사비르의 조합된 중화 활성을 나타낸다. 데이타는 MDCK 세포의 H1N1(A) 및 H3N2(B) 바이러스 감염에서 FluAB_MLNS 단독 및 헤테로몰 농도의 발록사비르와 조합된 것 둘 다에 의해 억제된 비율을 나타낸다. 데이타는 3개 값의 평균±SD를 나타내고, 각각의 반복물은 3개의 독립된 배양 플레이트에서 수득하였다.
도 24는 실시예 6의 경우, 조합된 FluAB_MLNS 및 발록사비르의 중간 효과 플롯을 나타낸다. 2개의 화합물을 나탄내 고정 비에서 일련 희석시키고 H1(A) 및 H3(B) 바이러스 균주로 감염시킨 MDCK 세포에 가하였다. 비-고정 비(NCR)에서 선택된 조합으로부터 수득한 값을 또한 플롯팅한다.
도 25는 실시예 6의 경우 FluAB_MLNS 및 발록사비르의 조합 지수를 나타낸다. 점은 측면에 나타낸 누적된 약물-약물 농도와 함께 나타낸 고정 비에서 실제 실험 점을 나타낸다. 점으로 된 곡선은 완전한 효과 범위에 걸쳐 예측된 조합 지수를 나타낸다.
도 26은 실시에 6의 경우 FluAB_MLNS-발록사비르 조합의 이소볼로그램을 나타낸다. 점은 상이한 일정 비의 FluAB_MLNS-발록사비르 조합에서 IC50, IC75 및 IC90 값을 나타낸다. 각각의 실험 점에서, 누적된 농도가 나타나 있다.
도 27은 실시예 7의 경우 pH=6.0(A) 또는 pH=7.4(B)에서 Octet에 의해 측정된 것으로서 고정된 FluAB_MLNS(회색 선) 또는 FluAB_wt(검정색 선)에 대한 용액 중 사람 FcRn의 결합을 나타낸다. 시점 0초는 기본선 완충제로부터 사람 FcRn을 함유하는 완충제까지의 스위치(switch)를 나타낸다. 시점 420초(회색 점 처리된 수직선)는 상응하는 pH에서 블랭크 완충제에 대한 스위치를 나타낸다. 연합 및 해리 프로파일은 Octet RED96(ForteBio)을 사용하여 실시간으로 측정하였다.
도 28은 실시예 9의 경우 마우스 항-약물 IgG를 검출하기 위해 ELISA로 측정한 ADA 반응의 수준을 나타낸다(A; 바아는 처리 그룹의 평균±SD; 및 정맥내 주사 후 14일째에 측정한 순환하는 사람 IgG의 수준(X 축)과 동일한 시점에서 나타난 ADA의 신호(Y 축) 사이의 상관 분석(B)를 나타낸다. 비-매개변수 스피어맨 상관 계수(non-parametric Spearman's correlation coefficient)를 유의적인 값에 대해 나타낸다.
도 29는 실시예 10의 경우 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt의 피하(s.c.) 주사 후 ADA 반응의 수준을 나타낸다. 데이타는 피하 주사(n=5마리/그룹)하고, PBS 1:25 속에서 예비-희석한 다음 5배 추가로 일련 희석시킨 후 3주째에 수득한 각각의 개체 혈청 속에서 검출된 ADA 신호(OD 450 nm)의 값으로 나타낸다.
실시예
다음에서, 본 발명의 다양한 구현예 및 양태를 나타내는 특수한 실시예를 나타낸다. 그러나, 본 발명은 본원에 기술된 구체적인 구현예에 의한 영역 내에서 한정되지 않아야 한다. 다음의 제조 및 실시에는 당해 분야의 기술자가 본 발명을 보다 명확하게 이해하여 실시하기 위하 제공된다. 그러나, 본 발명은 예시된 구현예에 의한 여역 내에 한정되지 않으며, 이러한 구현예는본 발명의 단일 양태 만을 나타내기 위함이고, 기능적으로 등가인 이의 방법은 본 발명의 영역 내에 있다. 또한, 본원에 기술된 것 외에, 본 발명의 다양한 변형이 앞서의 설명, 첨부된 도면 및 하기 실시예로부터 당해 분야의 기술자에게 매우 명백하게 될 것이다. 모든 이러한 변형은 첨구된 청구범위의 영역 내에 속한다.
실시예 1: 시노몰구스 마카퀴(cynomolgus macaque)에서 본 발명에 따른 항체의 안전성 및 내성
(i) 서열 번호: 1 내지 6에 나타낸 CDR 서열 및 (ii) 중쇄 불변 영역 내에 2개의 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하는, 본 발명에 따른 항체를 설계하고 생산하였다. 보다 구체적으로, 항체는 (i) 서열 번호: 7에 나타낸 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 8에 나타낸 경쇄 가변 영역(VL) 서열; 및 (ii) 중쇄 불변 영역내 2개의 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함한다. 심지어 보다 구체적으로, 항체는 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 당해 항체는 본원에서 "FluAB_MLNS"로 지칭된다.
비교를 위해, 항체 "FluAB_wt"를 사용하였고, 이는 중쇄 불변 영역 내에 2개의 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 항체 "FluAB_MLNS"와 상이하다. 따라서, 비교 항체 "FluAB_wt"는 서열 번호: 11에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호: 10에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
2.5 ml/kg 용적으로 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt의 5 mg/kg의 단일 정맥내 주입을 시험 그룹 당 3마리의 암컷 시노몰구스 마카퀴(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)에 60분 정맥내 주입으로 제공하였다. 임상 화학 및 혈액학적 분석을 위해 혈액 또는 뇨를 투여 전 및 투여 후 7일 및 21일째에 수집하였다.
5 mg/kg에서 60분 정맥내 주입으로 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt의 투여 후, 암컷 시노몰구스 마카퀴를 건강 및 체중에 대해 밀접하게 모니터링하고 혈액 및 뇨에 대해 규칙적으로 샘플링하였다. 동물 중 일부에서 24시간 째에 브러싱 및 접종 부위에 투여 후 3일째 홍피증(erythroderma) 이외의 부작용은 항체의 정맥내 접종 후 관찰되지 않았다. 모든 동물은 일반적으로 건강하였고, 정상적인 사료 섭취를 나타내었으며 연구 전체에서 전반적으로 긍정적인 체중 증가를 가졌다. 임상 화학, 혈액학, 및 뇨분석 매개변수는 투여 전 샘플과 비교하여, 투여 후 7 또는 21일째에 정상이었다.
요약하면, 시노몰구스 마카퀴내로 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt의 단일 정맥내 투여는 부작용을 유도하지 않았고 일반적으로 잘 견뎠다.
실시예 2: 혈장 농도 및 약동학의 측정
이러한 실험은 농도를 측정하고, 반감기를 확립하며, 단일 정맥내 주사 후 혈장 속에서 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS의 약동학을 비교 항체 FluAB_wt와 비교하는 것을 목표로 하였다.
투여 전에, 동물을 도트 면역결합 검정(dot immunobinding assay)을 사용하여 인플루엔자-특이적인 항체에 대해 음성인지를 시험하였다. 기존의 면역성이 당해 시험을 방해할 수 있으므로 혈청양성 동물은 연구에서 배제시켰다. 또한, 항-약물 항체(ADA) 반응이 진행되는 동물도 배제시켰다.
2.5 ml/kg의 용적으로 5 mg/kg의 FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt의 단일 정맥내 주입을 60분 정맥내 주입으로 시험 그룹당 3마리의 암컷 마카퀴에 제공하였다. 혈액을 투여 전 K2EDTA를 함유하는 튜브 속에 수집하고 투여 후 대략 1, 6, 24, 96, 168, 504, 840, 및 1344 시간(h)째에 약동학적 시험을 위해 할장에 대해 가공하였다.
항체의 혈장 농도를 시험관내에서 ELISA 검정을 사용하여 측정하였다. 요약하면, IAV-HA 항원(인플루엔자 A형 바이러스 H1N1 A/California/07/2009 헤마글루티닌 단백질 항원(His 태그(Tag)를 지님); Sino Biologicals)을 PBS 속에서 2 μg/ml로 희석시키고 25 μl를 96-웰 평편 바닥 ½-부위 ELISA 플레이트에 4℃에서 밤새 코팅하기 위해 가하였다. 코팅 후, 플레이트를 0.05% 트윈20(세척 용액)이 보충된 0.5x PBS로 자동화된 ELISA 세척기를 사용하여 2회 세척하였다. 이후에, 플레이트를 1% BSA(차단 용액)가 보충된 PBS 100 μl/웰로 1시간 동안 실온(RT)에서 차단시킨 다음 2회 세척하였다. 혈장 샘플을 10,000g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고 96-웰 세포 배양 플레이트 속에서 차단 용액 속에서 최종 1:300 희석을 위해 희석하였다(1:10 및 이후에 1:30). 정량화를 위해 사용된 마카퀴 혈장의 최소 희석액을(1:300) 시험하고 매트릭스 효과가 무시할 정도가 되도록 설정하였다. 이후에 샘플을 단계식으로 총 12개의 희석물에 대해 3개씩 1:2로 희석하였다. 시험할 각각의 항체에 대한 표준물을 모든 시험 동물로부터의 접종전 혈장의 혼주물 속에서 항체 1:300을 1 μg/ml로 희석시키고, 시험 샘플의 매트릭스를 모사(mimicking)함을 통해 유사하게 제조하였다. 이후에, 표준물을 단계식으로 차단 용액 속에 총 12개의 희석물에 대해 3개씩 1:3으로 희석하였다. 25 μl의 제조된 샘플 또는 표준물을 헤마글루티닌(ha)-코팅된 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 4회 세척 후, 차단 용액 속에서 1:5'000(최종 농도 0.16 μg/ml)으로 희석시킨 25 μl의 염소 항 사람-IgG HRP 접합체(Fcγ 단편-특이적인, AffiniPure F(ab')₂단편; Jackson ImmunoResearch)를 검출을 위해 웰 당 가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 4회 세척 후, 플레이트를 웰 당 40 μl의 SureBlue TMB 기질(Bioconcept)을 가하여 진행시켰다. 실온에서 7 내지 20분 항온처리 후, 색상 반응이 정체기(plateau)(max OD 3.8)에 도달하면, 40 μl의 1% HCl를 웰 당 가하여 반응을 정지시키고 흡광도를 450 nm에서 분광기를 사용하여 측정하였다.
시노몰구스 혈장 속에서 항체의 농도를 측정하기 위해, ELISA 데이타로부터의 OD 값을 Gen5 소프트웨어(BioTek) 속에서 농도에 대해 플롯팅하였다. 비-선형 곡선 피트(non-linear curve fit)를 다양한 기울기 모델, 4개의 매개변수 및 방정식: Y=(A-D) / (1+ (X/C)^B) +D)를 사용하여 적용하였다. 곡선의 상부, 중간 또는 하부 범위내에서 대조군 샘플 품질에 의한 설정 심험에서 특정된 바와 같은 표준 곡선의 예측가능한 검정 범위 내에 속하는 샘플 희석물의 OD 값을 이후 샘플의 최종 희석을 고려하여 측정하였다. 샘플 희석물의 하나 이상의 값이 표준 곡선의 선형 범위 내에 속하는 경우, 이러한 값의 평균을 사용하였다. 약동학(PK) 데이타는 WINNONLIN NONCOMPARTMENTAL ANALYSIS PROGRAM(8.1.0.3530 코어 버젼(Core Version), Phoenix software, Certara)을 다음의 설정을 사용하여 분석하였다: 혈장 데이타, 고정 주입 투여; 잃지 않은 관찰의 수: 8; 정체 상 간격 Tau: 1.00; 투여 시간: 0.00; 투여량: 5.00 mg/kg; 주입 기간: 0.04일; 계산 방법: 선형 보간법을 사용한 선형 사다리꼴; lambda_z 계산을 위한 칭량: 균일한 칭량; Lambda_z 방법: lambda_z를 위해 가장 우수한 피트를 찾음, 로그 회귀(Log regression). 그래프 및 통계적 분석(선형 회귀 또는 아웃라이어 분석(outlier analysis))을 Prism 7.0 소프트웨어(GraphPad, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 수행하였다. 아웃라이어 분석은 ROUT 방법(Q=1%)과, 방향에서 임의의 아웃라이어의 수를 찾기위한 가능성으로 수행하였다.
결과는 도 1에 나타낸다. 접종 후 56일째에 채혈한 시노몰구스 혈장 샘플의 분석은 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS가 비교 항체 FluAB_wt와 비교하여 연장된 생체내 반감기를 가졌음을 입증하였다(도 1). WinNonLin을 사용한 비구획 분석을 사용하여, T1/2은 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS의 경우 19.5일이지만, T1/2은 비교 항체 FluAB_wt의 경우 11.6일로 평가되었다. 정량화의 하한치는 300 ng/ml이었다.
요약하면, 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS는 비교 항체 FluAB_wt와 비교하여 접종 후 적어도 56일까지 연장된 생체내 반감기를 가졌다.
실시예 3: 생체내에서의 장기간 안전성
시간에 걸쳐 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS의 항원 결합의 생체내 안정성 및 기능성을 시험하기 위하여, 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS를 제공받은 그룹의 약동학적 측정(실시예 2에 기술된 바와 같음)을 접종 후 86일 및 113일까지 연장시켰다. 접종 후 1, 21, 56, 86, 113일 째에, 기능성 FluAB_MLNS를 실시예 2에 기술된 바와 같이 헤마글루티닌(HA) 결합 ELISA를 사용하여 정량화하였다.
또한, 마카퀴 혈장 속에서 총 사람 항체를 특이적인 항-CH2 ELISA를 사용하여, 사람의 CH2 영역에 특이적으로 결합하지만 원숭이 Ab에는 결합하지 않는 포획 mAb를 사용하여 정량화하였다. 총 사람 IgG를 측정하고 따라서 시노몰구스 혈장 속의 총 접종된 사람 항체를 정량화하기 위해, 사람 IgG에 대해 특이적인 마우스 항-CH2 도메인(클론 R10Z8E9; Thermo Scientific)를 포획하는 ELISA를 사용하였다. 이러한 mAb는 원숭이 IgG와 교차반응하지 않음이 입증되었다. 96-웰 평편 바닥 ½-부위 ELISA 플레이트의 코팅을 위해, 마우스 항-사람 IgG CH2를 PBS 속에서 0.5 μg/ml로 가하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 이후에, 플레이트를 세척하고 5% BSA가 들어있는 100 μl/웰의 차단 용액을 1시간 동안 실온에서 가하였다. 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS의 표준물은 FluAB_MLNS를 차단 용액 속에서 1 ng/ml로 희석하여 제조하였다. 표준물을 이후에 단계식으로 차단 완충액 속에서 총 12개의 희석물에 대해 2개씩 1:1.5로 희석시켰다. 시노몰구스 혈장 샘플을 10,000 g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고 최종 1:1,000, 1:5,000 또는 1:15,000 까지 차단 용액 속에서 단계식으로 희석시켰다. 플레이트를 희석시킨 후, 25 μl의 샘플 또는 표준물을 ELISA 플레이트에 가하고 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 3회 세척 후, 25 μl의 염소 항 사람-IgG HRP(Fcγ 단편-특이적인, AffiniPure F(ab')₂ 단편; Jackson ImmunoResearch)를 0.04 μg/ml에서 검출을 위해 1% BSA가 들어있는 차단 용액 속에 가하고 실온에서 45분 동안 항온처리하였다. 3회 세척 후, 플레이트를 웰당 40 μl의 SureBlue TMB 기질(Bioconcept)을 가하여 전개시켰다. 실온에서 20분 항온처리 후, 40 μl의 1% HCl을 가하여 반응을 정지시키고, 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
결과는 도 2에 나타낸다. 정량화 둘 다는 시노몰구스 혈장 속에서 유사한 사람 항체 농도를 생성하였다(도 2). 선형 회귀를 통한 추가의 분석은 HA 결합을 통한 정량화와 총 항-CH2 정량화 사이의 관계가 모든 선택된 시점에 대한 선형 패터(linear patter)를 따름을 입증하였다. 결과적으로, 혈장 속에 존재하는 FluAB_MLNS의 총 양은 또한 생체내에서 86일 및 113일 후, 인플루엔자 A형 바이러스(IAV)의 헤마글루티닌(HA) 줄기 영역에 대한 결합에서 기능성이었다.
요약하면, 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS는 기능적인 항원 결합 및 따라서 연구 연장 동안 접종 후 113일까지 양호한 장기간 안정성을 입증하였다.
실시예 4: 비강 채취면봉(nasal swab)에서 항체 농도 및 생물분포
혈장과 관련하여 비강 점막 사이의 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS 및 비교 항체 FluAB_wt의 생물분포를 측정하기 위하여, 항체의 농도를 비강 채취면봉에서 측정하였다. 이를 위해, 실시예 2에 기술된 마카퀴(macaque)의 비강 채취면봉을 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS 또는 비교 항체 FluAB_wt의 투여 후 24, 504, 및 1344 시간 째에 수집하였다. 비강 채취면봉에서 항체 FluAB_MLNS 및 FluAB_wt의 농도는 다음의 약간의 변형으로 혈장 속에서 측정하기 위해 실시예 2에 기술된 바와 같이 필수적으로 측정하였다: (a) ELISA 플레이트를 실온에서 2시간 차단하였다; (b) 비강 채취면봉 샘플은 PBS 소에서 1% BSA를 사용하여 1:2에서 출발하여 희석시킨 다음 단계 식으로 총 8개의 희석 점에 대해 1:2로 일련 희석하였다; (c) 비강 채취면봉 매질(RT MINI 바이러스 운반 매질(Viral Transport Medium); Copan)을 검정 매트릭스 대조군으로서 사용하였다.
채취 과정 동안 및 각각의 동물 및 상이한 시점(1, 21, 및 56일째)에 존재한 비강 분비물의 양에서의 차이를 제거하기 위하여, 비강 채취면봉으로부터의 결과를 우레아 함량에 대해 표준화하였다. 우레아는 혈액 사이에서 자유로이 확산하여, 이의 혈장 또는 채취면복 샘플을 가로질러 유사한 양으로 존재한다(Lim et al., 2017, Antimicrob Agents Chemother 61(8):e00279-17). 이를 위해, 우레아 질소(BUN)를 "우레아 질소(BUN) 비색 검출 키트(Colorimetric Detection Kit)" (Invitrogen)를 제조업자의 과정에 따라 사용하여 정량적으로 측정하였다. 요약하면, 샘플을 PBS 속에서 1;3으로 희석시키고 키트 시약 A 및 B와 혼합하고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 산화환원 반응(redox reaction)의 색상을 띈 생성물을 450 nm에서 96웰 미세플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 정량하는 샘플을 키트와 함께 제공되고 균등하게 처리된 BUN 표준에 대해 비교함을 통하여 수행하였다.
결과는 도 3에 나타낸다. 비강 채취면봉에서 표준화된 항체의 양은 시간에 걸쳐 감소하였다(도 3 A). 혈장 농도에 대해 비강을 비교함을 통한 생물분포의 측정은 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS와 비교 항체 FluAB_wt 사이에 차이가 없음을 나타내었고(도 3 B), 이는 MLNS-Fc 돌연변이가 혈장 속에서 FluAB_MLNS의 반감기를 연장시키지만, 비강 점막내로 항체의 생물-분포를 향상시키지 않았음을 시사한다.
요약하면, 비강 채취면봉 샘플은 3개의 mAb 변이체 중에서 비강 점막과 혈장 사이에 생물분포에 있어서 어떠한 유의적인 차이도 나타내지 않았다.
실시예 5: PR8-감염된 Tg32 마우스에서 항체 FluAB_MLNS의 예방 효과
다음에, 항체 FluAB_wt와 비교하여 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS의 예방 효과를 치사량의 인플루엔자 A형 감염의 H1N1 쥐(murine) 모델에서 측정하였다.
예방 효능을 평가하기 위하여, 9- 내지 14-주령의 FcRn-/- hFcRn 계통 32 Tg 마우스(C57B6 배경)에게 5 ml/kg의 본 발명에 따른 항체 FluAB_MLNS 또는 비교 항체 FluAB_wt를 함유하는 용액을 0.3 내지 1 mg/kg의 투여량에서 정맥내(i.v.) 주사하였다. 정맥내 주사 후 24시간 째에, 마우스를 꼬리 정맥으로부터 출혈시켜 감염 전 혈청 항체 수준을 측정하였다. 출혈을 또한 감염 후(p.i.) 6일 및 13일째에 반복하였다. 항체-주사된 및 비처리된 마우스 둘다를 마취(이소플루란, O2 중 4%, 0.3 L/min)시키고 50 μl(25 μl/각각)의 5마리 마우스의 치사 용량의 50%(5개의 MLD50, 1200 TCID50/마우스와 등가)의 인플루엔자 A형 바이러스(H1N1, A/Puerto Rico/8/34, 문헌: Cottey, R., Rowe, C.A., and Bender, B.S. (2001). Influenza virus. Curr Protoc Immunol Chapter 19, Unit19.11-19.11.32에 기술된 바와 같음)를 양 콧구멍으로 서서히 흡입시켜 비강내(i.n.)로 챌린지하였다. 각각의 마우스를 약 1분 동안 이의 머리를 뒤로 약간 젖혀 수직으로 유지시킴으로써 콧구멍으로부터 접종물이 흐르는 경향성을 감소시켰다. 과정 후 및 바른 반사 작용 후, 동물을 우리(cage)에 복귀시켰다. 마우스를 체중 감소 및 질환 증상에 대해 p.i. 14까지 모니터링하고 이들이 이의 초기 체중의 20% 이상을 상실하거나(이에 의해 0%가 감염일에 설정된다) 4의 이환율 점수에 도달한 경우 희생시켰다. 표 1은 적용된 이환율 점수를 상세히 나타낸다:
[표 1]
Figure pct00001
궁극적으로는 모든 동물을 희생시켜 혈청 및 폐를 수집하였다.
혈청 제조:
대략 0.05 ml의 혈액을 겔-함유 튜브내로 수집하고 실온에서 30분 동안 두었다. 튜브를 5분 동안 5500 rpm(3200 x g)에서 회전시키고, 혈청을 새로운 튜브로 이전시키고 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
2개의 독립된 실험을 다음의 설계에 따라 수행하였다:
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
순환하는 mAb의 ELISA 정량화:
혈청을 0 및 6일째에 순환하는 항체의 수준에 대해 평가하였다. 요약하면, ELISA 플레이트의 1/2을 밤새 4℃에서 H1N1 균주 A/California/07/09로부터의 재조합 헤마글루티닌(HA)(PBS 중 2 g/ml, 25 l/웰)으로 코팅하였다. 차단(PBS/1% BSA, 100 l/웰, 1 hr RT) 및 ELISA 세척 용액(PBST)으로 2회 세척(220 l/웰) 후, 혈청의 희석물(1 mg/kg의 경우 초기 희석 1:150, 0.3 mg/kg의 경우 1:50) 및 항체 표준물(FluAB_MLNS 및 FluAB_wt, 0.1 g/ml)을 2개씩 가하고(25 l/well) 일련 희석하였다(혈청 희석을 위해 10점까지 1:2, 항체 표준물의 경우 8점까지 1:3). 1.5시간 실온에서 항온처리 후, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 1.5 시간 동안 실온에서 HRP-표지된 항-사람 제2 항체(0.16 g/ml, 25 l/웰)와 함께 추가로 항온처리하였다. PBST로 4회 세척 후, 플레이트를 기질 용액(25 l/웰)으로 분배하고, 14분 동안 전개시키고 1% HCl(v/v, 25 l/웰)로 차단하였다. 플레이트를 신호 정량화를 위해 분광광도기로 450 nm에서 판독하였다. 농도 값은 log(효능제) 대 반응의 비-선형 회귀 모델(가변 기울기 모델, 4개의 매개변수, GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다.
데이타 분석:
데이타를 플롯팅하고 Macintosh(GraphPad 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재, www.graphpad.com))의 경우 GraphPad Prism 소프트웨어 버젼 8.0을 사용하여 분석하였다. 연속적인 변수를 통계적으로 유의적인 차이(p<0.05, 95% 신뢰 구간)를 위해 본페로니 다중 비교 시험을 사용하여 교정한 통상의 2원-ANOVA를 사용하여 평가하였다. 생존 데이타를 만텔-콕스 방법(Mantel-Cox method)으로 로그-순위 분석을 사용함으로써 비교하였다(p<0.05는 통계적으로 유의적인 것으로 고려하였다. 상술한 2개의 별개의 실험으로부터의 데이타를 혼주하였다.
결과:
예방학적 활성을 비강내 감염을 통한 H1N1 PR8 바이러스 챌린지 1일 전에 Tg32 마우스에서 FluAB_MLNS 및 FluAB_MLNS(1 및 0.3 mg/kg)의 정맥내 투여시 시험하였다. 결과는 도 4 내지 6에 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 1 mg/kg(패널 D) 또는 0.3 mg/kg(패널 E)의 FluAB_MLNS로 처리한 마우스는 비처리된(패널 A) 및 FluAB_wt-주사된(패널 B 및 C) 마우스와 비교하여, 보다 낮은 체중 감소를 나타내었다.
FluAB_wt와 비교하여 FluAB_MLNS의 보다 우수한 보호 효과는 도 5에 나타낸 생존 분석에서 입증되었다.
FluAB_MLNS와 FluAB_wt에서 효능의 차이는 항체의 정맥내 투여 후 1일 및 7일째에 측정된 것으로서, 혈청 속의 순환하는 항체의 상이한 수준과 관련되지 않았다(도 6). 특히, 검출가능하지 않은 수준의 순환하는 항체가 주사 후 14일째에 측정되었다(나타내지 않음).
요약하면, FluAB_MLNS는 Tg32 마우스에서, 비교 항체 FluAB_wt 보다 H1N1 PR8 비강내 바이러스 챌린지에 대해 보다 우수한 보호능을 입증하였다. 효능은 순환하는 항체 수준과는 별개이다. 이러한 데이타는 FluAB_MLNS와 Tg32 마우스에 의해 발현된 hFcRn의 상호작용이 보호 활성과 관련하여 증가된 효능과 같이, 연장된 항체 반감기와 관련되지 않은 생체내 효과를 매개함을 시사한다.
실시예 6: 항체 FluAB_MLNS와 다양한 항바이러스제의 조합
약물 조합은 내성을 선택할 가능성을 감소시키면서 효능을 향상시킬 명확한 기회를 제공한다. 더욱이, 추정되는 부가 또는 상승 효과는 용량-절약 접근법(dose-sparing approach)으로 종료될 수 있다. FDA에 의해 현재 승인된 인플루엔자 의약은 누라미니다제 억제제인 오셀타미비르 및 자나미비르 뿐만 아니라, 엔도뉴클레아제 억제제 부류에 속하는, 최근에 승인된 발록사비르 마르복실을 포함한다.
H1N1 및 H3N2 대표적인 바이러스 균주에서 본 발명의 항체 FluAB_MLNS와 항바이러스제 오셀타미비르, 자나미비르 또는 발록사비르 마르복실의 조합 활성을 평가하기 위하여, 시험관내 중화를 수행하여 수득되는 억제 효과를 평가하였다. 조합 효과의 분석은 중간-효과 플롯 및 조합 지수(combination index)(CI)의 계산을 사용하여 수행하였다.
요약하면, MDCK(마딘-바비 개 신장(Madin-Darby canine kidney)) 세포를 30,000개의 세포/웰에서 96-웰 플레이트(평평 바닥, 검정색)에 씨딩(seeding)하였다. 세포를 37℃ 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 24시간 후, 60 μl의 감염 배지(MEM (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 M0644) + Glutamax (Invitrogen, 41090-028) + 1 g/ml TPCK-처리된 트립신(Worthington Biochemical #LS003750) + 10 g/ml 가나마이신) 중 4x 항체 및 항바이러스(오셀타미비르, 자나미비르 또는 발록사비르 마르복실) 희석물을 FluAB_MLNS(최종 166.7 nM에서 출발, 9개의 수평 점) 및 상이한 항바이러스제(오셀타미비르, 자나미비르 또는 발록사비르 마르복실)의 열십자(crisscross) 1:2 일련 희석물을 사용하여, 125(자나미비르의 경우 250) nM로부터 출발하여 7개의 수직 점에 의해, 도 7에 나타낸 플레이트 개략도에 따라 제조하였다.
각각의 조합에 대해, 3개의 별개의 플레이트를 제조하여, 각각의 약물-약물 조합 비 3개를 갖도록 하였다. 단일 화합물 적정(즉, FluAB_MLNS의 경우, 9점 및 각각의 항바이러스제의 경우, 8점)을 각각의 플레이트에 포함시켰다. 바이러스 용액을 60 μl 중 120x the TCID50이 농도에서 제조하고, MEM 속에서 1:1로 추가로 희석시키거나 FluAB_MLNS 희석물과 1:1로 혼합하고 1시간 동안 33℃에서 항온처리하였다. 세포를 보충물이 들어있지 않은 200 μl/웰의 MEM을 사용하여 2회 세척한 다음, 100 μl의 바이러스 단독 또는 100 μl의 FluAB_MLNS/바이러스 혼합물(100x TCID50/웰)을 가하고 4시간 동안 33℃ 5% CO2에서 항온처리하였다. 100 μl/웰의 감염 배지를 가한 후, 세포를 72시간 동안 33℃, 5% CO2 속에서 추가로 항온처리하였다. 감염 후 3일째에, 20 μM의 MuNANA(4-MUNANA (2_-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산 나트륨 염 수화물(Sigma-Aldrich) #69587) 용액을 MuNANA 완충제(MES 32.5 mM/CaCl2 4mM, pH 6.5) 속에서 제조하고 50 μl/웰을 검정색 96-웰 플레이트 내로 분배하였다. 50 μl의 중화 또는 바이러스-단독 적정 상층액을 플레이트로 이전시키고 60분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 이후에, 반응을 100 μl/웰의 0.2 M 글리신/50% EtOH, pH 10.7로 정지시켰다. 형광성을 460 nm에서 형광계(fluorimeter)(Bio-Tek)를 사용하여 정량화하였다.
바이러스 중화의 비율(fraction)을 하기 수학식에 따라 계산하였다:
Figure pct00004
여기서 fx는 샘플 형광성 신호(세포 + 바이러스 + FluAB_MLNS + 항바이러스제)이고; fmin는 최소의 형광성 신호(세포 단독, 바이러스 없음)이고; fmax는 최대 형광성 신호(세포 + 바이러스 단독)이다.
중화 비율 데이타를 사용하여 초우 및 탈라레이 방법(Chou and Talalay method)(Chou TC, Talalay P: Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 1984, 22:27-55)에 따라 약물-약물 조합에 대한 용량-효과 관계의 정량적 분석을 계산하였다. 조합 지수, 영향받은 비율(fraction affected)(Fa), 및 이소볼로그램을 CompuSyn 소프트웨어(ComboSyn Inc., 미국 뉴저지 주 마라무스 소재)(Chou T-C: Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies. Pharmacological Reviews 2006, 58:621-681)를 사용하여 수득하였다.
결과를 도 8 내지 26에 나타내고 하기 기술한다.
FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합
인플루엔자 A형 바이러스를 중화시키는 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 상대적인 효능을 H3N2 및 H1N1 균주 둘 다에 대해 대표적인 2개의 바이러스 혈청형에서 시험관내 비교하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 별개로 시험한, 화합물 둘 다는 H3N3 및 H1N1 바이러스와 함께 독립적으로 ㄴ출되는 경우 세포 감염을 용량-의존적으로 충분히 억제할 수 있었다(도 8 A,B). 데이타 로그 선형화(문헌: Chou TC, Talalay P: Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 1984, 22:27-55)에 기술된 바와 같이) 후, 중간-효과 플롯으로부터 계산한 것으로서, IC50 값(도 8C,D)은 또한 FluAB_MLNS(H3 및 H1 균주 각각에 대해 17.9 및 15.6 nM) 및 오셀타미비르(H3 및 H1 균주 각각에 대해 7 및 9.1) 둘다에 대해 나노몰 범위이내이다. 전반적으로, H3와 H1 바이러스 감염 사이에 FluAB_MLNS에 의한 억제 반응의 측면에서 실질적인 차이는 측정되지 않았지만, H1N1 바이러스는 오셀타미비르의 억제 효과에 대해 미미하게 보다 민감하였다.
H3 및 H1 바이러스에 의한 MODK 세포의 감염을 중화시키는데 있어서 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 조합의 효과를 시험하기 위하여, 화합물 둘 다를 상술한 바와 같이 상이한 비율에서 일련 희석시키고, 상이한 약물 농도의 존재하에서 뉴라미니나제의 효소 활성(NA; 배양물 속의 바이러스 함량의 판독물로서)에 대해 평가하고 단일 약물 효과와 비교하였다. FluAB_MLNS로 측정된 중화 효과는 헤테로몰 농도의 제2 화합물의 동시 존재에 의해 크게 향상되며, 따라서, H3 및 H1 바이러스 감염 둘 다에서, 부가적인 효과보다는 상승적인 효과를 시사한다(도 9). 오셀타미비르의 억제 활성에 대한 H1 및 H3 바이러스의 약간 상이한 민감성이 검출되었다.
다양한 약물 조합 비의 추정된 상승효과를 정밀하게 정량화하기 위하여, 중화 데이타를 중간-효과 원리에 따라 추가로 변환시키고 상술한 바와 같은 CompuSyn 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 수개의 상이한 FluAB_MLNS-오셀타미비르 조합 고정 비의 효과를 도 10에 나타낸 바와 같이 중간-효과 플롯에서 플롯팅하였다.
CompuSyn 소프트웨어를 실험 데이타에 대한 중간-효과 방정식의 대수 변환을 적용시키고 다양한 약물 조합의 효능(IC50) 및 소위 조합 지수(CI) 둘 다를 계산하였다. CI는 질량-작용 법칙의 물리-화학적 특성을 고려하는 초우-탈라레이(Chou-Talalay)(중간-효과) 방정식-유도된 매개변수이고 동일한 효과를 달성하기 위해 단일 약물 1 및 2의 용량으로 나눈, 특정 효과를 달성하기 위해 약물 2와 조합된 약물 1의 용량의 부위 사이의 2개의 비의 합으로부터 생성된다. 이러한 수학적 알고리즘에 따라서, CI = 1은 부가 효과를 나타내고, CI < 1은 상승작용을 나타내고 CI > 1은 길항작용을 나타낸다.
도 11 및 12에 나타낸 바와 같이, 시험한 모든 조합 비의 경우 및 H1(도 11) 및 H3 바이러스(도 12) 둘 다의 경우, 억제된 비율 범위를 거쳐 예측된 CI 값은 모든 약물 조합 비에 대해 1 이하인 곡선을 기술하였고 상이한 조합 농도의 실제 실험 점은 또한 거의 모든 조합에 대해 1 이하의 범위이었다. 이와 함께, 데이타는 조합된 경우 FluAB_MLNS 및 오셀타미비르의 간단한 상승 효과를 나타낸다.
동일한 데이타가 등농도 농도의 단일 및 조합된 약물 둘 다를 비교하는 이소볼로그램 프롯을 사용하여 교호적으로 기술될 수 있다. 도 13 및 14에 나타낸 바와 같이, 3개의 상이한 조합 비에 대한 IC50, IC75, 및 IC90 값의 분포는 H1(도 13) 및 H3(도 14) 둘 다의 경우, 시험한 단일 약물의 각각의 IC50, IC75, 및 IC90를 연결하는 이소볼 라인(isobole line)보다 휠씬 낮으며, 이는 일관된 상승작용을 나타낸다(그러나 부가적 및 길항작용은 단일-약물 이소볼 상에 또는 위에 각각 위치한 등농도 점을 생성할 수 있다).
FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합
인플루엔자 A형 바이러스를 중화시키는 FluAB_MLNS 및 자나미비르이 상대적인 효능을 또한 H3N2 및 H1N1 균주 둘 다에 대해 대표적인 2개의 바이러스 혈청형에서 시험관내 비교하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 별도로 시험한, 화합물 둘 다는 H3N3 및 H1N1 바이러스와 함께 독립적으로 노출되는 경우, 용량 의존적으로 세포 감염을 충분히 억제할 수 있었다. 상대적인 계산된 IC50 값은 FluAB_MLNS의 경우 23.1 내지 24.4 nM이었고 자나미비르의 경우 10.7 내지 13.7 nM이었다.
FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합 효과에 대해, 도 16은, 오셀타미비르와 유사하게, 자나미비르는 H1 및 H3 바이러스 둘 다에 대해 FluAB_MLNS의 억제능을 크게 향상시킴을 나타낸다.
상승 효과의 정량화는 CompuSyn 및 상술한 바와 같은 중간 효과 원리로 유사하게 계산하였다. FluAB_MLNS 및 자나미비르의 조합된 효과에 대한 중간 효과 플롯은 도 17에 나타낸다. FluAB_MLNS 및 자나미비르에 대한 계산된 CI는 도 18 및 19에 나타내고 이는 시험한 모든 실험 점에 대해 1 미만의 값에 의해 나타나는 바와 같이, H1(도 18) 및 H3(도 19) 바이러스 둘 다를 사용하여, 2개 약물 사이의 상승 효과를 명확하게 나타낸다. 바이러스 균주 둘 다와 일치하에, 이소볼로그램은 IC50, IC75, 및 IC90 값에 걸쳐 강력한 상승 효과를 나타내고(도 20 및 21에 나타냄), 이는 단일 약물을 사용한 IC 값보다 모두 유의적으로 낮다.
FluAB_MLNS 및 발록사비르 마르복실의 조합
최근 승인된 엔도뉴클레아제 억제제 발록사비르 마르복실을 오셀타미비르 및 자나미비르에 대해 상술한 바와 유사하게, H1 및 H3 균주 둘 다에서 FluAB_MLNS 단독과 초기에 비교하였다. 상대적으로 계산된 IC50 값은 FluAB_MLNS의 경우 20.1 내지 15.4 nM이었고 발록사비르 마르복실의 경우 4.9 내지 2.3 nM이었다.
발록사비르가 NA 억제제와 비교하여 바이러스 복제를 억제하는데 있어서 상이한 작용 메카니즘을 가지지만, 약물은 FluAB_MLNS의 억제능을 여전히 강력하게 상승시킬 수 있으며, 이는 상승 효과를 나타낸다(도 23). 상이한 조합 비로 수득된 억제 데이타를 사용하여 CompuSyn 소프트웨어로 중간 효과를 계산하고 플롯팅하였고 상술한 바와 같이 약물-약물 상호작용의 유형을 계산하였다(도 24). FluAB_MLNS 및 발록사비르 마르복실에 대해 계산된 CI(도 25)는 시험한 실험 점의 대부분에 대해 1 미만의 값으로 나타낸 바와 같이, H1 및 H3 바이러스 둘다로, 2개 약물 사잉에서 상승효과를 명확하게 나타낸다. 이소볼로그램은 IC50, IC75, 및 IC90 값에 걸쳐 풍부하고 완전한 상승 효과를 나타낸다(도 26).
요약하면, H1 및 H3 균주 둘 다에 대한 FluAB_MLNS의 중화능은 상이한 항바이러스제, 즉, NA 억제제인 오셀타미비르 및 자나미비르 뿐만 아니라 엔도뉴클레아제 억제제 발록사비르-마르복실에 의해 상승적으로 향상된다.
실시예 7: 상이한 pH에서 사람 FcRn에 대한 결합
FluAB_wt 및 FluAB_MLNS를 바이오층 간섭계(biolayer interferometry)(BLI)를 사용하여 신생 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 이의 능력에 대해 나란히 비교하였다.
이를 위해, 사람 FcRn에 대한 FluAB_wt 및 FluAB_MLNS의 결합을 Octet RED96 장치(biolayer interferometry, BLI, ForteBio)에서 측정하였다. 항-사람 Fab-CH1로 코팅된 바이오센서를 역학 완충제 속에서 10분 동안 실온에서 예비-수화시켰다. 이후에, 사람 mAb(FluAB_wt 또는 FluAB_MLNS)를 역학 완충액 속에서 pH 7.4에서 30분 동안 1 μg/ml에서 바이오센서 위로 로딩시켰다. 기본선을 역학 완충제(멸균 여과된 0.01% 내독소가 없는 소 혈청 알부민, 0.002% 트윈-20(폴리소르베이트 20), PBS 중 0.005% NaN3) 속에서 pH=7.4 또는 pH=6.0에서 4분 동안 측정하였다. 이후에, 사람 mAb-로딩된 센서를 7분 동안 사람 FcRn 용액에 역학 완충제 중 1 μg/ml에서 pH=7.4 또는 pH=6.0에서 노출시켜 상이한 환경에서 FcRn-mAb의 결합을 측정하였다(온 속도(on rate)). 이후에 해리는 역학 완충제 속에서 동일한 pH에서 추가로 5분 동안 측정하였다(오프 속도(off rate)). 모든 단계는 1000 rpm에서 30℃에서 교반하면서 수행하였다. 결합 및 해리 프로파일을 간섭 패턴에서의 변화로서 실시간으로 측정하였다.
도 27에 나타낸 바와 같이, FluAB_MLNS는 FluAB_wt과 비교하여 산성 pH(pH 6.0)에서 보다 높은 친화성으로 결합된 사람 FcRn에 결합하였지만, FluAB_MLNS 또는 FluAB_wt 중 어느 것도 중성 pH(pH 7.4)에서 FcRn에 결합하지 않았다.
실시예 8: 항체의 연장된 에피토프에서 확인된 다형의 특성화
연장된 에피토프 속에서 과거의(Historical) 다형을 A/Puerto Rico/8/34(PR8) 배경에서 H1 HA 또는 H3 HA을 사용하여 역 유전학으로 생성시킨 바이러스를 사용하여 FluAB_MLNS의 중화 활성에 있어서의 이의 영향에 대해 평가하였다.
단일 뉴클레오타이드 다형을 PR8 H1 HA 또는 A/Aichi/2/68 (Aichi) HA pHW2000 플라스미드 내에 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 생성시켰다. 재조합체 인플루엔자 A형 바이러스를 표준 방법(예컨대, 문헌: Erich Hoffmann, Gabriele Neumann, Yoshihiro Kawaoka, Gerd Hobom, Robert G. Webster, 2000, A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proceedings of the National Academy of Sciences May 2000, 97 (11): 6108-6113; doi: 10.1073/pnas.100133697)을 사용하여 PR8 배경에서 결합된 H1 또는 H3 HA를 사용하여 구조하였다.
중화 활성을 MDCK 세포에서 표준 방법을 사용하여 평가하였다. 예를 들면, 중화 활성은 MDCK 세포에서, 예컨대, 96 웰 플레이트에서 평가할 수 있다. 이를 위해, MCDK 세포를 30,000개의 세포/웰에서 감염 24시간 전에 씨딩(seeding)하였다. 항체 FluAB_MLNS를 바이러스와 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후 MDCK 세포를 가하였다. 이를 위해, FluAB_MLNS의 1:2.5 9-점 일련 희석을 감염 배지 속에서 생성시킬 수 있으며 각각의 희석을 3회(예컨대, 50 μg/mL - 0.03 μg/mL의 최종 농도) 시험할 수 있고 120 TCID50의 바이러스와 1시간 동안 37℃에서 항온처리할 수 있다. MDCK 세포를 PBS로 2회 세척하고, 100 μl/웰의 바이러스:항체 용액을 가할 수 있으며, 세포를 4시간 동안 37℃에서 항온처리할 수 있다. 4시간 후, 추가의 100 μl/웰의 감염 배지를 세포에 가하였다. 37℃에서 72시간 항온처리 후, 바이러스 RNA를 추출하고 qRT-PCR에 의해, 예컨대 WHO 프라이머(World Health Organization. CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A H1N1. April 28, 2009)를 사용하여 측정할 수 있다. IC50은 바이러스 복제의 50%를 감소시키는 항체 농도로서 μg/mL로 나타내며 대조군 웰(바이러스가 없는 및 바이러스 단독)에 대해 표준화된 데이타의 비-선형 4-매개변수 로지스틱 적합 곡선(non-linear 4-parameter logistic fit curve)을 사용하여 계산하였다.
연장된 에피토프 내에서 H1 및 H3 HA 다형에 대한 FluAB_MLNS의 중화 활성은 하기 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00005
H3 HA를 암호화하는 바이러스의 경우, FluAB_MLNS는 돌연변이 HA1 P11S, HA2 D46N, 또는 HA2 N49T를 지닌 바이러스를 야생형 바이러스와 유사한 IC50 값으로 중화시켰다(야생형 바이러스에 대해 IC50에 있어서 < 2배수 변화). H1 HA를 암호화하는 바이러스의 경우, FluAB_MLNS는 HA2 N146D를 암호화하는 바이러스를 야생형 바이러스와 유사한 IC50 값으로 중화시켰다(야생형 바이러스에 대해 IC50에 있어서 < 2배수 변화). 또한, 사용된 PR8 야생형 균주는 HA2 다형 L38Q 및 D46N를 암호화하였고 FluAB_MLNS에 의해 4.7 μg/mL의 IC50 값으로 중화되었다. 전반적으로, 평가된 모든 다형은 FluAB_MLNS에 대해 야생형 바이러스에 대해 <2배의 IC50 배수 변화를 생성하였다. 요약하면, FluAB_MLNS는 연장된 에피토프(H3 HA: HA1 P11S, HA2 D46N, 또는 HA2 N49T; H1 HA: N146D)에서 모든 평가된 과거의 다형을 효율적으로 중화시켰다.
실시예 9: Tg32 마우스에서 항-약물 항체 반응
M428L/N434S 돌연변이와 관련하여, 최근의 관심은 상기 돌연변이가 이러한 돌연변이를 포함하는 항체의 면역원성을 증가시키는 것에 집중되었다(Brian C. Mackness, Julie A. Jaworski, Ekaterina Boudanova, Anna Park, Delphine Valente, Christine Mauriac, Olivier Pasquier, Thorsten Schmidt, Mostafa Kabiri, Abdullah Kandira, Katarina
Figure pct00006
Huawei Qiu (2019) Antibody Fc engineering for enhanced neonatal Fc receptor binding and prolonged circulation half-life, mAbs, 11:7, 1276-1288; Maeda A, Iwayanagi Y, Haraya K, et al. Identification of human IgG1 variant with enhanced FcRn binding and without increased binding to rheumatoid factor autoantibody. MAbs. 2017;9(5):844-853).
면역원성, 특히 이의 모 항체 FluAB_wt와 비교하여 항체 FluAB_MLNS의 항-약물 반응(항-약물 항체; ADA)를 평가하기 위하여, TG32 마우스(사람 FcRn에 대해 유전자이식성)의 2개의 별개의 그룹(n=5)에게 5 mg/kg의 FluAB-MLNS 또는 FluAB_wt 모노클로날 항체를 정맥내 주사하였다. 주사된 mAb의 순환 수준을 평가하기 위하여, 혈액 샘플을 이후에 상이한 시점에서 수득하였다. 주사 후 14일 및 21일째 취한 샘플을 사용하여 주사된 사람 모노클로날 항체에 대한 항-약물 항체(ADA)를 특이적인 ELISA로 평가하였다.
요약하면, 정제된 FluAB_wt 및 FluAB_MLNS 모노클로날 항체를 96-웰 플레이트 상에서 2 μg/ml에서 코팅하였다. 차단 후, 처리된 동물로부터의 혈청을 주사 후 14일 및 21일째에 수득하고, 1:180로 희석시키고 1.5 시간 동안 실온(RT)에서 항온처리하였다. 세척 후, 퍼옥시다제-표지된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2 단편(0.16 μg/ml)을 플레이트에 가하고 1.5시간 동안 실온에서 항온처리하였다. ADA IgG(주사된 항체 FluAB_wt 및 FluAB_MLNS에 대한 쥐 항체)는 이후에 적절한 기질과 함께 나타내었고 분광광도계로 판독하였다. 나타낸 데이타는 항체를 정맥내 주사한 후 14 및 21일째에 수집한 각각의 개개 혈청(n=5/그룹)에서 수득한 OD 값(450 nm)이다. 나이브(naive) Tg32 마우스(대조군(ctrl))로부터의 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다.
결과는 도 28에 나타낸다. 놀랍게도, FluAB-MLNS 항체에 대해 반응하는 쥐 혈청 IgG의 신호는 매우 낮았고 대조군의 주사받지 않은 동물에서 검출된 신호에 상응하였지만, 대신에 FluAB_wt를 주사한 마우스의 혈청에서 측정된 ADA 반응은 정맥내 주사 후 14 및 21일 둘 다에서 유의적으로 높았다(도 28 A). 또한, 주사 후 14일째에 측정한 ADA의 수준은 순환하는 FluAB_wt이 수준과 유의적으로 및 역으로 관련되었지만(혈청 FluAB_wt 수준은 FluAB_wt에 대한 쥐 항체로 인하여 감소하였다), 동일한 시점에서 측정된 순환하는 FluAB-MLNS의 수준은 또한 훨씬 더 높고 균질하였다(도 28 B).
요약하면, 이러한 데이타는 놀랍게도 항-약물 반응(항-약물 항체; ADA), 및 따라서, FluAB_MLNS의 면역원성이 FluAB_wt와 비교하여 감소되었음을 나타낸다.
실시예 10: 피하 투여 후 항-약물 항체 반응 및 면역원성
보다 면역원성인 설정에서 이러한 놀라운 반응을 추가로 확인하기 위하여, TG32 마우스의 별개의 그룹(n=5)에게 일반적으로 투여의 보다 면역원성인 경로로 고려되는, FluAB-MLNS 또는 FluAB_wt(5 mg/kg)를 피하(s.c.) 주사하였다. 피하 주사한지 3주 후, 항-약물 항체의 수준을 FluAB_wt 또는 FLuAB_MLNS로 피하 주사받은 마우스의 혈청 속에서 마우스 항-약물 ELISA(실시예 9에서 상술한 바와 같음)에 의해 혈청 속에서 측정하였다. 음성 대조군으로서, 나이브의, 비처리된 동물로부터의 10개 혈청의 혼주물(pool)을 사용하였다.
결과는 도 29에 나타낸다. 보다 면역원성인 설정에도 불구하고, FluAB-MLNS로 피하 처리한 동물은 주사받지 않은 대조군 동물의 혈청 속에서 검출된 것과 오버랩핑된 항-hIgG 항체의 혈청 역가에 의해 확인된 바와 같이, 체액성 면역원성 반응을 여전히 시작하지 않았다. 역으로, FluAB_wt로 처리한 동물에서 ADA 역가는 명확하게 양성이고 모든 처리된 동물에서 측정가능하였다. 주사된 항체의 순환하는 수준과 항-hIgG 내인성 반응 사이의 역 상관관계는 FluAB_wt 만을 주사받은 동물의 혈청 속에서 검출되었다(나타내지 않음).
이러한 데이타는 놀랍게도 항체 FluAB_MLNS가 이의 모 항체 FluAB_wt와 비교하여 면역원성을 거의 나타내지 않음을 나타낸다.
서열 및 서열 번호(서열 목록)의 표:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
SEQUENCE LISTING <110> Humabs Biomed SA <120> ANTIBODIES AND METHODS FOR TREATMENT OF INFLUENZA A INFECTION <130> HB01P039WO1 <150> PCT/EP2019/061134 <151> 2019-04-30 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 1 Ser Tyr Asn Ala Val Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 2 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Gly Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Glu Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 3 Ser Gly His Ile Thr Val Phe Gly Val Asn Val Asp Ala Phe Asp Met 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 4 Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser Ser Tyr Thr His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 5 Ala Ala Ser Ser Arg Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 6 Gln Gln Ser Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 128 <212> PRT 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Cys Leu Val Lys Asp Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 170 175 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 195 200 205 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 210 215 220 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 10 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Thr Phe Gly Gln 85 90 95 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280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 12 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluAB_MLNS VH nuc <400> 12 caagttcagc tgcagcagag cggccccggt ctggtgaagc ctagccagac tctgtcttta 60 acttgcgcca tctccggcga cagcgtgagc agctacaacg ccgtctggaa ctggattcgt 120 cagagcccta gcagaggttt agagtggctg ggtcgtactt actatcgttc cggctggtac 180 aacgactacg ccgagagcgt gaagtctcgt atcactatca accccgatac tagcaagaac 240 cagttctctt tacagctgaa cagcgtgact cccgaagaca ctgccgtgta ctactgcgct 300 cgtagcggcc acatcactgt gttcggcgtg aatgtggacg ccttcgacat gtggggccaa 360 ggtactatgg tcactgtgag cagc 384 <210> 13 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluAB_MLNS VL nuc <400> 13 gacatccaga tgactcagag cccttcctct ttaagcgcta gcgtgggcga tagggtcact 60 atcacttgtc gtactagcca gtctttaagc tcctacactc actggtacca gcagaagccc 120 ggtaaggccc ctaagctgct gatctacgct gccagcagca gaggcagcgg agtgcctagc 180 agatttagcg gcagcggtag cggcactgac ttcactctga caatcagctc tttacagccc 240 gaagacttcg ccacttacta ctgccagcag tctcgtactt tcggccaagg tactaaggtg 300 gagatcaag 309 <210> 14 <211> 1374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FluAB_MLNS heavy chain nuc <400> 14 caagttcagc tgcagcagag cggccccggt ctggtgaagc ctagccagac tctgtcttta 60 acttgcgcca tctccggcga cagcgtgagc agctacaacg ccgtctggaa ctggattcgt 120 cagagcccta gcagaggttt agagtggctg ggtcgtactt actatcgttc cggctggtac 180 aacgactacg ccgagagcgt gaagtctcgt atcactatca accccgatac tagcaagaac 240 cagttctctt tacagctgaa cagcgtgact cccgaagaca ctgccgtgta ctactgcgct 300 cgtagcggcc acatcactgt gttcggcgtg aatgtggacg ccttcgacat gtggggccaa 360 ggtactatgg tcactgtgag cagcgctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 420 ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 480 ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 540 ttcccggccg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 600 tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc 660 aaggtggaca agcgggttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720 ccagcacctg aactcctggc gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900 aagccgcggg 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300 gagatcaagc gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 420 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 480 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 540 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 600 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 630

Claims (68)

  1. 각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 및 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 인플루엔자 A형 바이러스의 헤마글루티닌에 결합하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염을 중화시키는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 항체가 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와 상이한, 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 중화에 요구되는 용량의 1/2을 초과하지 않는, 용량에서 인플루엔자 A형 감염을 중화시키는, 항체.
  5. 제4항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 중화에 요구되는 용량의 1/3을 초과하지 않는, 항체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 중화에 요구되는 용량의 1/5을 초과하지 않는, 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 H3 HA의 다형(polymorphism) HA1 P11S, HA2 D46N, 및/또는 HA2 N49T; 및/또는 H1 HA의 다형 N146D를 중화시키는 항체.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 H3 HA의 다형 HA1 P11S, HA2 D46N, 및/또는 HA2 N49T; 및/또는 H1 HA의 다형 N146D를 야생형 바이러스의 HA에 대하여 <2의 IC50 배수 변화(fold change)로 중화시키는 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와 상이한 비교 항체와 비교하여 감소된 항-약물 항체 반응을 유발시키는, 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와 상이한 비교 항체와 비교하여 면역원성을 덜 나타내는, 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 사람 항체인, 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인, 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG 유형의 것인, 항체.
  14. 제13항에 있어서, 항체가 IgG1 유형의 것인, 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄가 카파 경쇄인, 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 7에 대해 적어도 70% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 제1항에 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지되어 있는, 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 7에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 제1항에 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지되어 있는, 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 7에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 제1항에 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지되어 있는, 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 7에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 제1항에 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지되어 있는, 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 7에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 제1항에 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지되어 있는, 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 7에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 제1항에 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지되어 있는, 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 7에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 8에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 제1항에 정의된 바와 같은 CDR 서열이 유지되어 있는, 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 CH3 영역이 M428L 및 N434S 이외에 임의의 추가의 돌연변이를 포함하지 않는, 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 Fc 영역이 M428L 및 N434S 이외에 임의의 추가의 변형을 포함하지 않는 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호: 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호: 10에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 항체.
  27. 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 항체.
  28. 제27항에 있어서, 항체가 예방학적으로 투여되는, 사용하기 위한 항체.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 항체가 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와 상이한, 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/2을 초과하지 않는 용량에서 투여되는, 사용하기 위한 항체.
  30. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/3을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  31. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/4을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  32. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/5을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  33. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/6을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  34. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/7을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  35. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/8을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  36. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/9을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  37. 제29항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/10을 초과하지 않는, 사용하기 위한 항체.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 대상체가 인플루엔자 A형 감염의 즉각적인 위험에 있는, 사용하기 위한 항체.
  39. 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 대상체가 자가면역 질환(autoimmune disease) 또는 알레르기(allergy)를 앓고 있거나; 자가면역 질환 또는 알레르기로 진행될 위험이 있는, 사용하기 위한 항체.
  40. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자.
  41. 제40항에 있어서, 핵산 분자가
    (i) 서열 번호: 12에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 12에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열를 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (ii) 서열 번호: 13에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 13에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 분자.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 핵산 분자가
    (i) 서열 번호: 14에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 14에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    (ii) 서열 번호: 15에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 15에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 분자.
  43. 제1 및 제2의 핵산 분자의 조합으로서, 여기서 제1의 핵산 분자가 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 제2의 핵산 분자가 동일한 항체의 상응하는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 제1 및 제2의 핵산 분자의 조합.
  44. 제43항에 있어서,
    (i) 제1의 핵산 분자가 서열 번호: 12에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드; 또는 서열 번호: 12에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고;
    (ii) 제2의 핵산 분자가 서열 번호: 13에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 13에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 제1 및 제2의 핵산 분자의 조합.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서,
    (i) 제1의 핵산 분자가 서열 번호: 14에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 14에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고;
    (ii) 제2의 핵산 분자가 서열 번호: 15에 나타낸 바와 같은 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호: 15에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 제1 및 제2의 핵산 분자의 조합.
  46. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  47. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 조합을 포함하는 벡터.
  48. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체를 발현하거나, 제46항 또는 제47항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  49. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 조합, 제46항 또는 제47항에 따른 벡터, 또는 제48항에 따른 세포, 및 임의로, 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  50. 인플루엔자 A형 바이러스의 감염의 예방, 치료 또는 약화용 의약의 제조시의, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 조합, 제46항 또는 제47항에 따른 벡터, 또는 제48항에 따른 세포의 용도.
  51. 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료시 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 조합, 제46항 또는 제47항에 따른 벡터, 제48항에 따른 세포 또는 제49항에 따른 약제학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물이 예방학적으로 투여되는, 사용하기 위한 항체, 핵산, 핵산의 조합, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물.
  53. 제51항 또는 52항에 있어서, 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물이 항바이러스제(antiviral)와 함께 투여되는, 사용하기 위한, 항체, 핵산, 핵산의 조합, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 항바이러스제가 뉴라미니다제 억제제 및 인플루엔자 폴리머라제 억제제로부터 선택된, 사용하기 위한 항체, 핵산, 핵산의 조합, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 항바이러스제가 오셀타미비르, 자나미비르 및 발록사비르로부터 선택된, 사용하기 위한 항체, 핵산, 핵산의 조합, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 대상체가 자가면역 질환 또는 알레르기를 앓고 있거나; 자가면역 질환 또는 알레르기로 진전될 위험이 있는, 사용하기 위한 항체, 핵산, 핵산의 조합, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물.
  57. (i) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및
    (ii) 항바이러스제의 조합.
  58. 제57항에 있어서, 항바이러스제가 뉴라미니다제 억제제 및 인플루엔자 폴리머라제 억제제로부터 선택된 조합.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 항바이러스제가 오셀타미비르, 자나미비르 및 발록사비르로부터 선택된 조합.
  60. 인플루엔자 A형 바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료시 사용하기 위한 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항의 조합.
  61. 이를 필요로 하는 대상체에게, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스 감염을 감소시키거나, 인플루엔자 A형 바이러스 감염의 위험을 저하시키는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 항체가 예방학적으로 투여되는 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 항체가 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 함유하지 않는다는 점에서만 상기 항체와 상이한, 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/2을 초과하지 않는 용량으로 투여되는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/3을 초과하지 않는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 용량이 상기 비교 항체를 사용한 인플루엔자 A형의 예방 또는 치료에 요구되는 용량의 1/5을 초과하지 않는 방법.
  66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인플루엔자 A형 감염의 즉각적인 위험에 있는 방법.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항바이러스제와 함께 투여되는 방법.
  68. 항체의 중쇄의 불변 영역 내에 돌연변이 M428L 및 N434S를 도입시키는 단계를 포함하여, 각각 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 및 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열; 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 및 서열 번호: 6에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체의 면역원성을 감소시키는 방법.
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