JP2022531556A - Ａ型インフルエンザ感染の抗体及び治療法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染を中和する抗体を提供する。本発明はまた、係る抗体をコードする核酸、及び係る抗体を産生する不死化Ｂ細胞及び培養プラズマ細胞を提供する。更に、本発明は、Ａ型インフルエンザ感染の予防及び治療における本発明の抗体の使用を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、Ａ型インフルエンザ感染を強力に低減させる抗体及び係る抗体の使用に関する。特に、本発明は、Ａ型インフルエンザ感染の予防及び治療に関する。
インフルエンザは感染症であり、毎年流行して世界中に広がり、１年当たり約３００万～５００万の重症化例と、約２９万～６５万の呼吸器関連死に至っている（非特許文献１）。最も一般的な症状としては、突然の発熱、咳（通常、乾性）、頭痛、筋肉及び関節の痛み、重度の倦怠感（体調不良）、喉の痛み、及び鼻水が挙げられる。潜伏期間は１日間～４日間の間で様々であるが、通常、症状は、ウイルス曝露から約２日後に始まる。インフルエンザの合併症としては、肺炎、副鼻腔感染症、喘息又は心不全、敗血症、慢性基礎疾患の悪化などの過去の健康問題の悪化を含むことがある。
インフルエンザは、ネガティブセンスの一本鎖のセグメント化されたＲＮＡゲノムを含む、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の抗原的及び遺伝的に多様なウイルス群であるインフルエンザウイルスによって引き起こされる。４種類のインフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）のうち、３種類（Ａ、Ｂ、及びＣ）がヒトに感染する。Ａ型インフルエンザウイルスは最も毒性の強いヒト病原体であり、最も深刻な疾患を引き起こす。Ａ型インフルエンザウイルスは、存在する主要表面タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の様々なサブタイプに基づいて分類することができる。ヘマグルチニン（「ＨＡ」）タンパク質によって定められるＡ型インフルエンザサブタイプは、少なくとも１８種類存在する。ＨＡは、２つのグループに分類できる。グループ１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、及びＨ１７サブタイプを含み、グループ２は、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５サブタイプを含む。全てのサブタイプがトリに存在するが、殆どの場合、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３サブタイプは、ヒトに疾患を引き起こす。Ｈ５、Ｈ７、及びＨ９サブタイプは、ヒトに散発的な重度の感染症を引き起こしており、新たなパンデミックを引き起こす可能性がある。Ａ型インフルエンザウイルスは絶えず進化し、新たな変異体を発生させる（抗原連続変異と呼ばれる現象）。結果として、過去のウイルスに応答して生成された抗体は、新たなドリフトウイルス（ｄｒｉｆｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ）に対して不十分又は非防御的である。その結果、出現が予測されるＨ１及びＨ３ウイルスに対して毎年新たなワクチンを製造する必要があり、これは、非常にコストがかかるだけでなく、常に効率的であるとは限らないプロセスである。同様のことが、Ｈ５インフルエンザワクチンの製造にも当てはまる。
ＨＡは、Ａ型インフルエンザウイルスの主要表面タンパク質であり、感染又はワクチン接種によって誘導される中和抗体の主な標的である。ＨＡは、上気道の細胞又は赤血球など、膜上にシアル酸を有する細胞にウイルスを結合させる役割を担う。更に、ＨＡは、ｐＨが低下した後、ウイルスエンベロープのエンドソーム膜との融合を仲介する。ＨＡは、ホモ三量体の内在性膜糖タンパク質である。ＨＡ三量体は、３つの同一モノマーから構成され、各モノマーは、２つのジスルフィド架橋によって結合されたＨＡ１及びＨＡ２領域を有するインタクトなＨＡ０単一ポリペプチド鎖から形成される。各ＨＡ２領域は、アルファヘリックスコイルドコイル構造を採用し、主に、ＨＡの「ステム」又は「ストーク（ｓｔａｌｋ）」領域を形成する。一方、ＨＡ１領域は、α／β構造のミックスを含む小さい球状ドメインである（ＨＡの「ヘッド」領域）。球状のＨＡヘッド領域は、シアル酸受容体への結合を仲介し、一方、ＨＡステムは、その後、低ｐＨによってエンドソーム中で引き起こされるウイルス膜と細胞膜との間の融合を仲介する。免疫優勢のＨＡ球状ヘッドドメインは高い可塑性を有し、異なる抗原部位が一定の抗原連続変異を受けるが、ＨＡステム領域は、サブタイプ間で比較的保存されている。現在のインフルエンザワクチンは、主に、ＨＡのステム領域よりも速く進化する免疫優勢で可変のＨＡヘッド領域に対する免疫応答を誘導する（非特許文献２）。したがって、特定のインフルエンザワクチンは、通常、数年以内の防御しか与えず、インフルエンザワクチンの毎年の再開発が必要とされる。
これらの問題点を克服するために、最近、ＨＡステムの保存部位を標的とする新たなクラスのインフルエンザ中和抗体が、インフルエンザウイルス治療薬として開発された。ＨＡのステム領域を標的とするこれらの抗体は、通常、ＨＡのヘッド領域を標的とする抗体と比較してより広い中和作用を示す。広く中和するＡ型インフルエンザ抗体に関する概要は、非特許文献３に記載されている。Ｏｋｕｎｏらは、インフルエンザウイルスＡ／Ｏｋｕｄａ／５７（Ｈ２Ｎ２）でマウスを免疫し、ＨＡ２の保存された配座エピトープに結合し、グループ１のＨ２、Ｈ１、及びＨ５サブタイプＡ型インフルエンザウイルスを、動物モデルにおいてインビトロとインビボで中和するモノクローナル抗体（Ｃ１７９）を単離した（非特許文献４～６）。抗体を標的とするＨＡステム領域の更なる例としては、ＣＲ６２６１（非特許文献７及び非特許文献８）、Ｆ１０（非特許文献９）、ＣＲ８０２０（非特許文献１０）、ＦＩ６（非特許文献１１）、及びＣＲ９１１４（非特許文献１２）が挙げられる。
しかし、グループ１とグループ２の両サブタイプのＨＡステム領域と反応できる抗体は非常に稀であり、通常は、全サブタイプを完全にカバーしている訳ではない。最近、抗体ＭＥＤＩ８８５２が報告され、これは、グループ１及びグループ２のＡ型インフルエンザウイルスを前例のない幅で強力に中和し、８０年を超える抗原進化の代表的なウイルスの多様なパネル（ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌ）を中和することができる（非特許文献１３及び非特許文献１４）。ＭＥＤＩ８８５２は、他の構造的に特徴付けられたステム反応性中和抗体とは著しく異なり、高度に保存されたエピトープに結合することが示された（非特許文献１３）。
ＷＨＯ， Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ （Ｓｅａｓｏｎａｌ） Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ６， ２０１８ Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ Ｅ， Ｑｉｕ Ｘ， Ｗｉｌｓｏｎ ＰＣ， Ｂａｈｌ Ｊ， Ｋｒａｍｍｅｒ Ｆ． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｈｅａｄ ｅｖｏｌｖｅｓ ｆａｓｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｓｔａｌｋ ｄｏｍａｉｎ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１８ Ｊｕｌ １１；８（１）：１０４３２ Ｃｏｒｔｉ Ｄ． ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ．， Ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３；３１：７０５－７４２ Ｏｋｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｓｍｉｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｔｈｒｏｓｂｙ Ｍ， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ Ｅ， Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌｅｎ Ｍ， Ｐｏｏｎ ＬＬＭ， Ａｌａｒｄ Ｐ， Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ Ｌ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｃｒｏｓｓ－Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｈ５Ｎ１ ａｎｄ Ｈ１Ｎ１ Ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ＋ Ｍｅｍｏｒｙ Ｂ Ｃｅｌｌｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（１２）： ｅ３９４２． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３９４２ Ｆｒｉｅｓｅｎ ＲＨＥ， Ｋｏｕｄｓｔａａｌ Ｗ， Ｋｏｌｄｉｊｋ ＭＨ， Ｗｅｖｅｒｌｉｎｇ ＧＪ， Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ ＪＰＪ， Ｌｅｎｔｉｎｇ ＰＪ， ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｅｖｅｒｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ： Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ Ｆｅｒｒｅｔｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（２）： ｅ９１０６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００９１０６ Ｓｕｉ Ｊ， Ｈｗａｎｇ ＷＣ， Ｐｅｒｅｚ Ｓ， Ｗｅｉ Ｇ， Ａｉｒｄ Ｄ， Ｃｈｅｎ ＬＭ， Ｓａｎｔｅｌｌｉ Ｅ， Ｓｔｅｃ Ｂ， Ｃａｄｗｅｌｌ Ｇ， Ａｌｉ Ｍ， Ｗａｎ Ｈ， Ｍｕｒａｋａｍｉ Ａ， Ｙａｍｍａｎｕｒｕ Ａ， Ｈａｎ Ｔ， Ｃｏｘ ＮＪ， Ｂａｎｋｓｔｏｎ ＬＡ， Ｄｏｎｉｓ ＲＯ， Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ ＲＣ， Ｍａｒａｓｃｏ ＷＡ （Ｍａｒｃｈ ２００９）． "Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂａｓｅｓ ｆｏｒ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ"． Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １６ （３）： ２６５－７３． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．１５６６ Ｅｋｉｅｒｔ ＤＣ， Ｆｒｉｅｓｅｎ ＲＨＥ， Ｂｈａｂｈａ Ｇ， Ｋｗａｋｓ Ｔ， Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌｅｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ２０１１． Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｇｒｏｕｐ ２ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４４）：８４３－５０ Ｃｏｒｔｉ Ｄ， Ｖｏｓｓ Ｊ， Ｇａｍｂｌｉｎ ＳＪ， Ｃｏｄｏｎｉ Ｇ， Ｍａｃａｇｎｏ Ａ， ｅｔ ａｌ． ２０１１． Ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｇｒｏｕｐ １ ａｎｄ ｇｒｏｕｐ ２ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３（６０４４）：８５０－５６ Ｄｒｅｙｆｕｓ Ｃ， Ｌａｕｒｓｅｎ ＮＳ， Ｋｗａｋｓ Ｔ， Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ Ｄ， Ｋｈａｙａｔ Ｒ， ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６１００）：１３４３－４８ Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ＮＬ， Ｃｏｒｔｉ Ｄ， Ｃｏｌｌｉｎｓ ＰＪ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｃｅｌｌ． ２０１６；１６６（３）：５９６－６０８ Ｐａｕｌｅｓ， Ｃ． Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ａ Ｓｔｅｍ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＭＥＤＩ８８５２ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔｓ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１６， ３５６－３６５， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｉｎｆｄｉｓ／ｊｉｘ２９２ （２０１７）
前記を考慮して、本発明の目的は、非常に低用量で投与された場合であっても、Ａ型インフルエンザウイルスを広く効率的に中和する新規な抗体を提供することである。
この目的は、以下及び添付の特許請求の範囲に示す主題によって達成される。
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数を組み合わせて更なる実施形態を生み出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態に限定することを意図するものではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された要素と組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願における全ての記載された要素の任意の入れ換え及び組合せが本願の記載によって開示されるとみなすべきである。
本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む」並びに「含み」及び「含んでいる」などの変形は、指定されている部材、整数、又は工程を含むが、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程を除外するものではないことを意味すると理解される。用語「からなる」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む」の具体的な実施形態である。本発明において、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。
数値ｘに関連する用語「約」は、ｘ±１０％、例えば、ｘ±５％、又はｘ±７％、又はｘ±１０％、又はｘ±１２％、又はｘ±１５％、又はｘ±２０％を意味する。
用語「疾患」は、本明細書で使用するとき、ヒト若しくは動物の身体又は正常な機能が損なわれているその部分のうちの１つの異常な状態を全て反映し、典型的には、識別可能な徴候及び症状によって顕在化し、且つヒト又は動物の寿命又は生活の質を低減するという点で、用語「疾病」及び（健康状態のような）「状態」と略同義であることを意図し、互換的に使用される。
本明細書で使用するとき、対象又は患者の「治療」に対する言及は、防止、予防、軽減、寛解、及び療法を含むことを意図する。用語「対象」又は「患者」は、本明細書では互換的に使用されて、ヒトを含む全ての哺乳動物を意味する。対象の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、及びウサギが挙げられる。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。
用量は、多くの場合、体重に関連して表される。したがって、［ｇ、ｍｇ、又は他の単位］／ｋｇ（又はｇ、ｍｇなど）として表される用量は、たとえ用語「体重」が明示的に言及されていないとしても、通常「体重１ｋｇ（又はｇ、ｍｇなど）当たりの」［ｇ、ｍｇ、又は他の単位］を意味する。
用語「特異的結合」及び同様の用語は、通常、非特異的な付着を含まない。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、本発明に係る特徴的な性質が保持されている限り、抗体全体、抗体断片、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体、及び遺伝子操作された抗体（変異体又は変異体抗体）を含むがこれらに限定されない様々な形態の抗体を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。例えば、抗体は、ヒトのモノクローナル抗体である。
ヒト抗体は、現在の技術水準において周知である（ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８－３７４）。ヒト抗体は、免疫時に、内因性免疫グロブリンが産生されていなくてもヒト抗体の完全レパートリー又はセレクションを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においても産生され得る。係る生殖系列変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移植すると、抗原接種時にヒト抗体が産生される（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１－２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５－２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３４０を参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリでも産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１－３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１－５９７）。Ｃｏｌｅなど及びＢｏｅｒｎｅｒなどの技術も、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；及びＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６－９５）。いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、Ｔｒａｇｇｉａｉ Ｅ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｓ，Ｓｕｂｂａｒａｏ Ｋ，Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ Ｌ，Ｕｅｍａｔｓｕ Ｙ，Ｇｉｓｍｏｎｄｏ ＭＲ，Ｍｕｒｐｈｙ ＢＲ，Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ．（２００４）：Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ：ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．１０（８）：８７１－５に記載の通り、改善されたＥＢＶ－Ｂ細胞の不死化を使用することによって調製される。本明細書で使用するとき、用語「可変領域」（軽鎖（ＶＬ）の可変領域、重鎖（ＶＨ）の可変領域）は、抗体の抗原に対する結合に直接関与する軽鎖及び重鎖の各対を意味する。
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、即ち、α、γ、又はμ重鎖）であってよい。例えば、抗体は、ＩｇＧタイプである。ＩｇＧアイソタイプの中でも、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のサブクラスであってよく、例えば、ＩｇＧ１であってよい。本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖を有していてよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１タイプであり、κ軽鎖を有する。
本発明に係る抗体は、精製形態で提供されてもよい。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物、例えば、前記組成物の９０（重量）％未満、通常６０％未満、より通常は５０％未満が他のポリペプチドで構成される組成物中に存在する。
本発明に係る抗体は、ヒト及び／又は非ヒト（又は異種）宿主、例えば、マウスにおいて免疫原性であり得る。例えば、前記抗体は、非ヒト宿主では免疫原性であるが、ヒト宿主では免疫原性でないイディオトープを有し得る。ヒトで使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳動物などの宿主から容易には単離することができず、且つ一般にヒト化によって又はゼノマウスから入手することができないものを含む。
本明細書で使用するとき、「中和抗体」は、宿主において感染を開始及び／又永続化させる病原体の能力を中和する、即ち、予防、阻害、低減、妨害、又は干渉することができるものである。用語「中和抗体」及び「中和する抗体」は、本明細書では互換的に使用される。これら抗体は、単独で使用してもよく、適切な製剤化に際して予防剤又は治療剤として、能動的ワクチン接種に関連して、診断ツールとして、又は本明細書に記載される生産ツールとして組み合わせて使用してもよい。
本明細書で使用するとき、用語「変異」は、レファレンス配列、例えば、対応するゲノム配列と比較した、核酸配列及び／又はアミノ酸配列の変化に関する。例えばゲノム配列と比較した変異は、（自然界に存在する）体細胞変異、自然変異、例えば、酵素、化学物質、若しくは放射線によって誘導される誘導変異、又は部位特異的変異誘発（核酸配列及び／又はアミノ酸配列を特異的且つ故意に変化させるための分子生物学的方法）によって得られる変異であってよい。したがって、用語「変異」又は「変異する」とは、例えば、核酸配列及び／又はアミノ酸配列において変異を物理的に作製することも含むと理解されるものとする。変異は、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、及び挿入に加えて、いくつかの連続するヌクレオチド又はアミノ酸の逆位も含む。アミノ酸配列に変異を生じさせるため、（組み換え）変異型ポリペプチドを発現させるために、前記アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列に変異を導入してよい。変異は、例えば、あるアミノ酸をコードしている核酸分子のコドンを、例えば部位特異的変異誘発によって、変化させて異なるアミノ酸をコードしているコドンを生じさせることにより、又は核酸分子の１以上のヌクレオチドを変異させる必要無しに、ポリペプチドをコードしている核酸分子のヌクレオチド配列を理解し、ポリペプチドの変異体をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子の合成を設計することによって、配列変異体を合成することにより行ってよい。
本明細書の本文中には、いくつかの文献が引用されている。本明細書中に引用した各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の明細書、指示書などを含む）は、上掲又は下記のいずれかにかかわらず、参照によりその全体を本明細書に援用する。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行する発明によってそのような開示よりも先行する資格がないと認めるものとして解釈されるものではない。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ用いられるのであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
抗体
本発明は、他の知見の中でも特に、非常に低用量で投与された場合であっても、Ａ型インフルエンザ感染を強力に低減させる抗体の同定に基づいている。更に、本発明の抗体は、半減期の延長を示す。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者らは、本発明の抗体の効果の上昇は、半減期の延長と無関係であると考える。例えば、比較抗体と比較して、本発明の抗体は、抗体血漿濃度が同様であるにもかかわらず、上昇した効果を示した。更に、本発明の抗体は、驚くべきことに、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有さない親抗体と比較して、免疫原性の低下を示す。
第１の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列；配列番号４、配列番号５、及び配列番号６でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列；並びに重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む（単離された）抗体を提供する。
一般に、本発明に係る抗体は、典型的には、重鎖上の（少なくとも）３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖上の（少なくとも）３つのＣＤＲを含む。一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに存在する超可変領域である。典型的には、抗体の重鎖と、結合された軽鎖とのＣＤＲが一緒になって抗原受容体を形成する。通常、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、可変ドメインに非連続的に配置される。抗原受容体は通常、２つの可変ドメイン（２つの異なるポリペプチド鎖、即ち重鎖と軽鎖）で構成されているため、抗原受容体ごとに６つのＣＤＲが存在する（重鎖：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；軽鎖：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）。単一抗体分子は通常、２つの抗原受容体を有するので、１２個のＣＤＲを含む。重鎖及び／又は軽鎖上のＣＤＲは、フレームワーク領域によって分離されることができる。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲよりも「可変性」が低い可変ドメイン内の領域である。例えば、鎖（又は各鎖）は、３つのＣＤＲで分離された４つのフレームワーク領域で構成されることができる。
重鎖上の３つの異なるＣＤＲ及び軽鎖上の３つの異なるＣＤＲを含む、本発明の例示的な抗体の重鎖及び軽鎖の配列を決定した。ＣＤＲアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴナンバリングシステム（ＩＭＧＴ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／； ｃｆ． Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．－Ｐ． ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３７， Ｄ１００６－Ｄ１０１２）にしたがって定義される。
典型的には、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合する。これにより、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染を中和することができる。前記定義した６個のＣＤＲ配列によって、本発明に係る抗体は、ＭＥＤＩ８８５２と同一の、Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＩＡＶ ＨＡ）ステム領域のエピトープに結合する（Ｋａｌｌｅｗａａｒｄ ＮＬ， Ｃｏｒｔｉ Ｄ， Ｃｏｌｌｉｎｓ ＰＪ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｃｅｌｌ． ２０１６；１６６（３）：５９６－６０８）。これにより、あらゆるＡ型インフルエンザサブタイプの様々なＡ型インフルエンザ血清型に対して同一の広い防御を提供する。
更に、本発明の抗体は、重鎖の定常領域内（ＣＨ３領域内）に２つの変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む。この文脈において、アミノ酸の位置は、当技術分野で認められているＥＵナンバリングシステムにしたがってナンバリングされている。ＥＵインデックス又はＫａｂａｔ若しくはＥＵナンバリングにおけるＥＵインデックスは、ＥＵ抗体のナンバリングを意味する（Ｅｄｅｌｍａｎ ＧＭ， Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＡ， Ｇａｌｌ ＷＥ， Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ＰＤ， Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ Ｕ， Ｗａｘｄａｌ ＭＪ． Ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ ｇａｍｍａＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９６９；６３（１）：７８－８５； Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （Ｕ．Ｓ．） Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ： Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， １９９１、この全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の半分を超えない用量で、Ａ型インフルエンザ感染を中和する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の３分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の４分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の５分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の６分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の７分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の８分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の９分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の１０分の１を超えない。係る比較試験には、同等の中和アッセイが使用されることが理解される（同様の試験アッセイ、試験条件など）。例えば、同一の試験（試験対象の抗体のみが異なる）を使用して、Ａ型インフルエンザの中和のための本発明の抗体の用量を決定すると共に、Ａ型インフルエンザの中和のための比較抗体の用量を決定することができる。
実験室でウイルス感染性（又は「中和」）を試験及び定量するために、当業者は、様々な標準的な「中和アッセイ」を認識している。中和アッセイの場合、動物ウイルスは通常、細胞及び／又は細胞株で増殖させる。例えば、中和アッセイにおいて、培養細胞を、試験対象の抗体の存在下（又は非存在下）で、一定量のＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）と共にインキュベートすることができる。読み取りとして、例えば、フローサイトメトリーを使用することができる。或いは、他の読み取りも考えられる。
特定の実施形態では、抗体は、Ｈ３Ｎ２ヘマグルチニン（Ｈ３ ＨＡ）の多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及び／又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔ及び／又はＨ１Ｎ１ヘマグルチニン（Ｈ１ ＨＡ）の多型Ｎ１４６Ｄをコードするウイルスを中和する。例えば、抗体は、Ｈ３ ＨＡのＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔの１つ又は２つの多型を中和し得る。特に、抗体は、Ｈ３ ＨＡの３つの多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及びＨＡ２ Ｎ４９Ｔをいずれも中和し得る。更に、抗体は、Ｈ１ ＨＡの多型Ｎ１４６Ｄを中和し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ３ ＨＡの多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及びＨＡ２ Ｎ４９Ｔ、並びにＨ１ ＨＡの多型Ｎ１４６Ｄを中和する。前記多型について、Ｈ１Ｎ１への言及は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９であり、Ｈ３Ｎ２への言及は、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９である。
特定の例では、抗体は、Ｈ３ ＨＡの多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及び／又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔ、及び／又はＨ１ ＨＡの多型Ｎ１４６Ｄを、野生型ウイルスのＨＡに対して、特に、野生型ウイルスとの対照比較（ｓｉｄｅ－ｂｙ－ｓｉｄｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）において、２未満のＩＣ５０倍率変化（ＩＣ５０ ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅｓ）で中和する。例えば、抗体は、Ｈ３ ＨＡのＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔの１つ又は２つの多型を、野生型ウイルスのＨＡに対して、特に、野生型ウイルスとの対照比較において、２未満のＩＣ５０倍率変化で中和し得る。特に、抗体は、Ｈ３ ＨＡの３つの多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及びＨＡ２ Ｎ４９Ｔのいずれをも、野生型ウイルスのＨＡに対して、特に、野生型ウイルスとの対照比較において、２未満のＩＣ５０倍率変化で中和し得る。更に、抗体は、Ｈ１ ＨＡの多型Ｎ１４６Ｄを、野生型ウイルスのＨＡに対して、特に、野生型ウイルスとの対照比較において、２未満のＩＣ５０倍率変化で中和し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｈ３ ＨＡの多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及びＨＡ２ Ｎ４９Ｔ、並びにＨ１ ＨＡの多型Ｎ１４６Ｄを、それぞれ、野生型ウイルスのＨＡに対して、特に、野生型ウイルスとの対照比較において、２未満のＩＣ５０倍率変化で中和する。
いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体と比較して、減少した抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を誘発する。特に、抗体は、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体と比較して、より低い免疫原性を示すことができる。本明細書の実施例に示されるように、本発明の抗体は、驚くべきことに、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答の低下を誘発するので、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異を有しない抗体と比較して免疫原性が低い。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答／免疫原性を評価するために、当業者は適切な試験について認識している。本発明の抗体及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異を有しない比較抗体が、直接比較を可能にするため対照試験される限り、係る試験の任意のものを選択することができる。例示された試験は、本明細書の実施例９及び１０に記載される。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。例えば、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、即ち、α、γ、又はμ重鎖）であることができる。例えば、抗体は、ＩｇＧ型である。ＩｇＧアイソタイプにおいて、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラス、例えば、ＩｇＧ１であり得る。本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、カッパ（κ）軽鎖を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１型であり、κ軽鎖を有する。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１型である。抗体は、任意のアロタイプであり得る。用語「アロタイプ」は、ＩｇＧサブクラスに見られる対立遺伝子変異を意味する。例えば、抗体は、Ｇ１ｍ１（又はＧ１ｍ（ａ））アロタイプ、Ｇ１ｍ２（又はＧ１ｍ（ｘ））アロタイプ、Ｇ１ｍ３（又はＧ１ｍ（ｆ））アロタイプ、及び／又はＧ１ｍ１７（又はＧｍ（ｚ））アロタイプであり得る。Ｇ１ｍ３及びＧ１ｍ１７アロタイプは、ＣＨ１ドメインの同一位置に位置する（ＥＵナンバリングによれば２１４位）。Ｇ１ｍ３は、Ｒ２１４（ＥＵ）に対応し、Ｇ１ｍ１７は、Ｋ２１４（ＥＵ）に対応する。Ｇ１ｍ１アロタイプは、ＣＨ３ドメイン（３５６位及び３５８位（ＥＵ））に位置し、置換Ｅ３５６Ｄ及びＭ３５８Ｌを意味する。Ｇ１ｍ２アロタイプは、４３１位（ＥＵ）のアラニンのグリシンによる置換を意味する。Ｇ１ｍ１アロタイプは、例えば、Ｇ１ｍ３又はＧ１ｍ１７アロタイプと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｇ１ｍ１を有しないアロタイプＧ１ｍ３（Ｇ１ｍ３，－１）である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｇ１ｍ１７，１アロタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｇ１ｍ３，１アロタイプである。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｇ１ｍ１を有しないアロタイプＧ１ｍ１７である（Ｇ１ｍ１７，－１）。任意に、これらのアロタイプは、Ｇ１ｍ２、Ｇ１ｍ２７、又はＧ１ｍ２８アロタイプと組み合わせる（又は組み合わせない）ことができる。例えば、抗体は、Ｇ１ｍ１７，１，２アロタイプであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記定義されたＣＤＲ配列（配列番号１、配列番号２、及び配列番号３でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列）が維持される。
配列同一性は、通常、レファレンス配列（即ち、本願に列挙される配列）の完全長に対して計算される。本明細書において言及するとき、同一性パーセントは、例えば、ＮＣＢＩ（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定されたデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクス；ギャップオープンペナルティ＝１１、及びギャップエクステンションペナルティ＝１］を用いるＢＬＡＳＴを使用して決定することができる。
「配列変異体」は、レファレンスアミノ酸におけるアミノ酸のうちの１以上が欠失、置換、及び／又は１以上のアミノ酸がレファレンスアミノ酸配列の配列に挿入されている、変化した配列を有する。変化の結果、アミノ酸配列変異体は、レファレンス配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有する。少なくとも７０％同一の変異体配列は、レファレンス配列の１００アミノ酸当たり３０以下の変化、即ち、欠失、挿入、又は置換の任意の組合せを有する。
一般に、非保存的アミノ酸置換を有することが可能であるが、前記置換は、通常、置換するアミノ酸が、レファレンス配列中の対応する置換されたアミノ酸と類似の構造的又は化学的性質を有する保存的アミノ酸置換である。一例として、保存的アミノ酸置換は、ある脂肪族又は疎水性のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、及びイソロイシン）の別の脂肪族又は疎水性のアミノ酸による置換；あるヒドロキシ含有アミノ酸（例えば、セリン及びトレオニン）の別のヒドロキシル含有アミノ酸による置換；ある酸性残基（例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸）の別の酸性残基による置換；あるアミド含有残基（例えば、アスパラギン及びグルタミン）の別のアミド含有残基による置換；ある芳香族残基（例えば、フェニルアラニン及びチロシン）の別の芳香族残基による置換；ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）の別の塩基性残基による置換；並びにある小アミノ酸（例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、及びグリシン）の別の小アミノ酸による置換を含む。
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、アミノ酸配列のＮ又はＣ末端のレポーター分子又は酵素への融合が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７と７５％以上（即ち、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記定義されたＣＤＲ配列が維持される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７と８０％以上（即ち、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記定義されたＣＤＲ配列が維持される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７と８５％以上（即ち、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記定義されたＣＤＲ配列が維持される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７と９０％以上（即ち、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記定義されたＣＤＲ配列が維持される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７と９５％以上（即ち、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記定義されたＣＤＲ配列が維持される。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、前記定義されたＣＤＲ配列が維持される。
一般に、本発明の抗体は、Ｆｃ領域（例えば、ＣＨ２又はＣＨ３領域）に（Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓに加えて）１以上の更なる変異を含むことがある。しかし、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、そのＣＨ３領域に、（それぞれの野生型ＣＨ３領域と比較して）Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓのほかに、更なる変異を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、そのＦｃ領域に、（それぞれの野生型Ｆｃ領域と比較して）Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓのほかに、更なる変異を含まない。本明細書において、用語「野生型」は、例えば、自然界で生じるものとしてのレファレンス配列を意味する。具体例として、用語「野生型」は、自然界で最もよくみられる配列を意味し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。本発明の抗体は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有し得る。
本発明の抗体はまた、前記定義された本発明の抗体の６個のＣＤＲと、同一又は異なるエピトープ又は抗原に対する別の抗体の１以上のＣＤＲとを含むハイブリッド抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、係るハイブリッド抗体は、本発明の抗体の６個のＣＤＲと、異なるエピトープ又は抗原に対する別の抗体の６個のＣＤＲとを含む。
変異体抗体も本発明の範囲内に包含される。したがって、本願に記載される配列の変異体もまた、本発明の範囲内に包含される。このような変異体としては、免疫応答中のインビボ又は不死化Ｂ細胞クローンの培養時のインビトロでの体細胞変異によって生成される天然変異体が挙げられる。或いは、変異体は、遺伝暗号の縮退により生じ得る、又は転写若しくは翻訳のエラーにより生じ得る。
本発明の抗体は、精製形態で提供され得る。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、例えば、組成物の９０（重量）％未満、通常は６０％未満、より通常は５０％未満が他のポリペプチドで構成される。
本発明の抗体は、非ヒト（又は異種）宿主、例えば、マウスにおいて免疫原性であり得る。特に、抗体は、非ヒト宿主において免疫原性であるが、ヒト宿主においては免疫原性でないイディオトープを有し得る。特に、ヒトで使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳動物などの宿主から容易に単離することができず、且つ一般にヒト化によってもゼノマウスからも得ることができないものが挙げられる。
核酸
別の態様では、本発明はまた、前記した本発明に係る抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
特定の実施形態では、核酸分子は、
（ｉ）配列番号１２で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１２と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有し、前記定義されたＣＤＲ配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）配列番号１３で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１３と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有し、前記定義されたＣＤＲ配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子は、
（ｉ）配列番号１４で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有し、前記定義されたＣＤＲ配列をコードし、定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｉｉ）配列番号１５で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有し、前記定義されたＣＤＲ配列をコードし、定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。
核酸分子及び／又はポリヌクレオチドの例としては、例えば、組換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｔＲＮＡなどのＲＮＡ分子、又はｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子が挙げられる。核酸は、本発明の抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードすることができる。換言すれば、抗体の軽鎖及び重鎖は、同一の核酸分子によって（例えば、バイシストロン性の様式で）コードされ得る。或いは、抗体の軽鎖及び重鎖は、別々の核酸分子によってコードされ得る。
遺伝暗号の重複性のために、本発明はまた、同じアミノ酸配列をコードする核酸配列の配列変異体も含む。抗体（又は完全な核酸分子）をコードするポリヌクレオチドは、抗体の発現のために最適化することができる。例えば、ヌクレオチド配列のコドン最適化を使用して、抗体産生のための発現系における翻訳効率を改善することができる。配列番号１２、１３、１４、及び１５に係る例示核酸配列は、例示抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの発現のためのコドン最適化配列である。更に、核酸分子は、異種要素（即ち、抗体（の重鎖又は軽鎖）のコード配列と同一の核酸分子上に天然には存在しない要素）を含むことができる。例えば、核酸分子は、異種プロモーター、異種エンハンサー、異種ＵＴＲ（例えば、最適な翻訳／発現のための）、異種ポリ－Ａ－テールなどを含むことができる。
核酸分子は、核酸成分を含む分子である。核酸分子という用語は、通常、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。それは、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に使用することができ、即ち、核酸分子は、抗体をコードするポリヌクレオチドからなることができる。或いは、核酸分子はまた、抗体をコードするポリヌクレオチドのほかに、更なる要素を含むことができる。典型的には、核酸分子は、糖／リン酸－主鎖のホスホジエステル結合によって互いに共有結合したヌクレオチドモノマーを含む又はからなるポリマーである。用語「核酸分子」はまた、塩基修飾、糖修飾、又は骨格修飾などの修飾核酸分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を包含する。
一般に、核酸分子は、特定の核酸配列を挿入、欠失、又は変更するように操作することができる。係る操作による変更としては、限定するものではないが、制限部位を導入するための変更、コドン使用を変えるための変更、転写及び／又は翻訳調節配列を追加又は最適化するための変更などが挙げられる。また、核酸を変更して、被コードアミノ酸を変えることもできる。例えば、１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を抗体のアミノ酸配列に導入することが有用であり得る。係る点変異は、エフェクタ機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性などを改変することができ、共有結合基（例えば、標識）の結合のためのアミノ酸を導入することができる、又は（例えば、精製目的のための）タグを導入することができる。或いは、核酸配列の変異は、「サイレント」、即ち、遺伝暗号の重複性のためにアミノ酸配列に反映されないことがある。一般に、変異は特定部位に導入することができ、又はランダムに導入してから選択（分子進化など）することもできる。例えば、本発明の（例示的な）抗体の軽鎖又は重鎖のいずれかをコードする１以上の核酸を、ランダムに又は定方向に（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ）変異させて、被コードアミノ酸に各種性質を導入することができる。係る変化は、初期の変化が保持され、他のヌクレオチド位置に新たな変化が導入される反復プロセスの結果であり得る。更に、独立した各工程で達成された変化を組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメント（若しくは（完全な）核酸分子）をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。当業者は、コドン最適化のための各種ツールを認識しており、例えば、Ｊｕ Ｘｉｎ Ｃｈｉｎ， Ｂｅｖａｎ Ｋａｉ－Ｓｈｅｎｇ Ｃｈｕｎｇ， Ｄｏｎｇ－Ｙｕｐ Ｌｅｅ， Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＯｎＬｉｎｅ （ＣＯＯＬ）： ａ ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉ－ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎ， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ３０， Ｉｓｓｕｅ １５， １ Ａｕｇｕｓｔ ２０１４， Ｐａｇｅｓ ２２１０－２２１２；又はＧｒｏｔｅ Ａ， Ｈｉｌｌｅｒ Ｋ， Ｓｃｈｅｅｒ Ｍ， Ｍｕｎｃｈ Ｒ， Ｎｏｒｔｅｍａｎｎ Ｂ， Ｈｅｍｐｅｌ ＤＣ， Ｊａｈｎ Ｄ， ＪＣａｔ： ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ａｄａｐｔ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｔｏ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｏｓｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００５ Ｊｕｌ １；３３（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５２６－３１；又は、例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ’ｓ ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅＴＭ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（米国特許出願公開第２０１１／００８１７０８ Ａ１号明細書に記載）に記載されているツールが挙げられる。
本発明はまた、第１及び第２の核酸分子の組合せを提供し、第１の核酸分子が、本発明の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２の核酸分子が、同一抗体の対応する軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸分子の（一般的な）特徴に関する前記記載は、適宜、組合せの第１及び第２の核酸分子に適用される。例えば、抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードするポリヌクレオチドの一方又は両方、又はその抗原結合断片は、コドン最適化され得る。
特定の実施形態では、核酸分子の組合せは、
（ｉ）抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第１の核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１２と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、前記定義されたＣＤＲ配列をコードする第１の核酸分子；及び
（ｉｉ）抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２の核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１３と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、前記定義されたＣＤＲ配列をコードする第２の核酸分子を含む。
いくつかの実施形態では、核酸分子の組合せは、
（ｉ）抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第１の核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１４で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、前記定義されたＣＤＲ配列をコードし、定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有する第１の核酸分子；及び
（ｉｉ）抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２の核酸分子であって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１５で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号１５と７０％以上（即ち、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、前記定義されたＣＤＲ配列をコードし、定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有する第２の核酸分子を含む。
ベクター
本発明の範囲には、本発明に係る核酸分子又は本発明に係る核酸分子の組合せ（例えば、バイシストロン性で）を含むベクター、例えば、発現ベクターが更に含まれる。通常、ベクターは、前記核酸分子又は前記核酸分子の組合せ（例えば、バイシストロン性で）を含む。
本発明はまた、第１及び第２のベクターの組合せを提供し、第１のベクターは、（核酸分子の組合せについて）前記した第１の核酸分子を含み、第２のベクターは、（核酸分子の組合せについて）前記した第２の核酸分子を含む。
ベクターは通常、組換え核酸分子、即ち、天然には存在しない核酸分子である。したがって、ベクターは、異種要素（即ち、本質的に異なる起源の配列要素）を含み得る。例えば、ベクターは、マルチクローニング部位、異種プロモーター、異種エンハンサー、異種選択マーカー（前記ベクターを含まない細胞と比較して、前記ベクターを含む細胞を同定するため）などを含み得る。本発明の文脈におけるベクターは、所望の核酸配列を組み入れる又は組み込むのに好適である。係るベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクターなどであることができる。ストレージベクターは、核酸分子の便利なストレージを可能にするベクターである。したがって、ベクターは、例えば、本発明に係る所望の抗体（の重鎖及び／又は軽鎖）に対応する配列を含み得る。発現ベクターは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質などの発現産物の産生に使用することができる。例えば、発現ベクターは、（異種）プロモーター配列などの、ベクターの配列の一続きの転写に必要な配列を含み得る。クローニングベクターは、典型的には、核酸配列をベクターに組み込むために使することができるクローニング部位を含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであることができる。トランスファーベクターは、核酸分子を細胞又は生物に移入するのに好適なベクター、例えばウイルスベクターであることができる。本発明の文脈におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクター又はＤＮＡベクターであることができる。例えば、本願の意味におけるベクターは、クローニング部位、抗生物質耐性因子などの選択マーカー、及び複製起点などのベクターの増殖に好適な配列を含む。本願の文脈におけるベクターは、プラスミドベクターであることができる。
細胞
更なる態様では、本発明はまた、本発明に係る抗体を発現する、及び／又は本発明に係るベクターを含む細胞を提供する。
前記細胞の例としては、真核細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞、又は植物細胞、又は原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞株などの哺乳動物細胞である。例としては、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
細胞は、本発明に係るベクター、例えば発現ベクターでトランスフェクトすることができる。用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分子などの核酸分子の、細胞への導入、例えば、真核細胞又は原核細胞への導入を意味する。本発明の文脈において、用語「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞などの細胞に核酸分子を導入するための当業者に知られた任意の方法を包含する。係る方法は、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子ベースのトランスフェクション、ウイルスベースのトランスフェクション、又はＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクションを包含する。いくつかの実施形態では、導入は、非ウイルス性である。
更に、本発明の細胞は、例えば、本発明による抗体を発現させるために、本発明に係るベクターで安定的又は一過性にトランスフェクトすることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、本発明に係る抗体をコードする本発明に係るベクターで安定的にトランスフェクトされる。他の実施形態では、細胞は、本発明に係る抗体をコードする本発明に係るベクターで一過性にトランスフェクトされる。
したがって、本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを異種発現する組換え宿主細胞を提供する。例えば、細胞は、抗体とは別の種のものであることができる（例えば、ヒト抗体を発現するＣＨＯ細胞）。いくつかの実施形態では、細胞の細胞タイプは、天然には（係る）抗体を発現しない。更に、宿主細胞は、それらの天然状態では存在しない抗体に翻訳後修飾（ＰＴＭ；例えば、グリコシル化）を付与することができる。係るＰＴＭは、機能的な違いをもたらすことができる（例えば、免疫原性の低下）。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、天然に産生された抗体（例えば、ヒトにおける免疫応答の抗体）とは異なる翻訳後修飾を有し得る。
抗体の産生
本発明に係る抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論は、周知である（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，．１９７５；Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）。いくつかの実施形態では、国際公開第２００４／０７６６７７号に記載の代替ＥＢＶ不死化方法が用いられる。
いくつかの実施形態では、参照により本明細書に援用する国際公開第２００４／０７６６７７号に記載の方法が用いられる。この方法では、本発明の抗体を産生するＢ細胞を、ＥＢＶ及びポリクローナルＢ細胞活性化剤で形質転換する。任意で、効率を更に高めるために、細胞の成長及び分化の更なる刺激剤を形質転換工程中に添加してもよい。これら刺激剤は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５などのサイトカインであってよい。一態様では、ＩＬ－２を不死化工程中に添加して、不死化効率を更に向上させるが、その使用は必須ではない。次いで、これら方法を用いて産生された不死化Ｂ細胞を、当技術分野において公知の方法及びそれから単離された抗体を用いて培養してよい。
別の例示的な方法は、国際公開第２０１０／０４６７７５号に記載されている。この方法では、プラズマ細胞を限定数又は単一プラズマ細胞としてマイクロウェル培養皿で培養する。プラズマ細胞培養物から抗体を単離することができる。更に、プラズマ細胞培養物からＲＮＡを抽出することができ、当技術分野において公知の方法を使用してＰＣＲを実施することができる。抗体のＶＨ及びＶＬ領域をＲＴ－ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）によって増幅させ、配列を決定し、発現ベクターにクローニングし、次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は他の宿主細胞にトランスフェクトすることができる。発現ベクターへの核酸のクローニング、宿主細胞のトランスフェクション、トランスフェクトされた宿主細胞の培養、及び産生された抗体の単離は、当業者に公知の任意の方法を使用して行うことができる。
抗体は、必要に応じて、濾過、遠心分離、及び様々なクロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣ又はアフィニティクロマトグラフィーを用いて更に精製することができる。医薬品グレードの抗体を産生するための技術を含む抗体、例えば、モノクローナル抗体を精製する技術は、当技術分野において周知である。
分子生物学の標準的な技術を用いて、本発明の抗体をコードしているＤＮＡ配列を調製することができる。オリゴヌクレオチド合成技術を用いて所望のＤＮＡ配列を完全に又は部分的に合成することができる。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適宜使用してよい。
任意の好適な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードしているＤＮＡ配列を発現させるために用いることができる。完全抗体分子などの抗体分子を産生させるために、真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系を使用してよい。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫、又はハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、使用される本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現は、限定されるものではないがＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞中で発現させることができる。
また、本発明は、本発明に係る抗体分子を産生させるプロセスであって、本発明の核酸をコードしているベクターを含む（異種）宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードしているＤＮＡからタンパク質を発現させるのに好適な条件下で培養することと、前記抗体分子を単離することとを含むプロセスを提供する。
重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体を産生させる場合、第１のベクターが軽鎖ポリペプチドをコードしており、第２のベクターが重鎖ポリペプチドをコードしている２つのベクターを細胞株にトランスフェクトしてよい。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードしている配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
或いは、本発明に係る抗体は、（ｉ）例えば、本発明に係るベクターを使用することによって、宿主細胞で本発明に係る核酸配列を発現させ、（ｉｉ）発現した抗体産物を単離することによって産生され得る。更に、前記方法は、（ｉｉｉ）単離抗体を精製することを含み得る。形質転換されたＢ細胞及び培養したプラズマ細胞を、所望の特異性又は機能の抗体を産生するものについてスクリーニングしてよい。
スクリーニング工程は、任意のイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡによって、組織若しくは細胞（トランスフェクトされた細胞を含む）を染色することによって、中和アッセイによって、又は所望の特異性若しくは機能を同定するための当技術分野において公知の多数の他の方法のうちの１つによって実施してよい。アッセイでは、１以上の抗原の単純な認識に基づいて選択することもでき、更に所望の機能に基づいて選択して、例えば、単なる抗原結合抗体ではなく中和抗体を選択したり、標的細胞の特徴（例えば、そのシグナル伝達カスケード、形状、成長速度、他の細胞に影響を与える能力、他の細胞又は他の試薬又は条件の変化による影響に対する応答、分化状態など）を変化させることができる抗体を選択したりすることもできる。
次いで、陽性形質転換Ｂ細胞培養物から個々の形質転換Ｂ細胞クローンが産生され得る。陽性細胞の混合物から個々のクローンを分離するためのクローニング工程は、限界希釈、マイクロマニピュレーション、セルソーティングによる単一細胞沈着、又は当技術分野において公知の別の方法を使用して実施することができる。
当技術分野において公知の方法を用いて、培養プラズマ細胞から核酸を単離し、クローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は他の公知の宿主細胞で発現させることができる。
本発明の不死化Ｂ細胞クローン又はトランスフェクトされた宿主細胞は、例えば、モノクローナル抗体源として、対象となるモノクローナル抗体をコードしている核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）源として、研究のためなど、様々な方法で使用することができる。
また、本発明は、本発明に係る抗体を産生する不死化記憶Ｂ細胞又はトランスフェクトされた宿主細胞を含む組成物を提供する。
本発明の不死化Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞は、後で組み換え発現させるために抗体遺伝子をクローニングするための核酸源として使用することもできる。例えば、安定性、再現性、培養の容易さなどの理由から、Ｂ細胞又はハイブリドーマから発現させるよりも、組み換え源から発現させる方が医薬目的では一般的であることがある。
したがって、本発明は、また、組み換え細胞を調製する方法であって、（ｉ）対象となる抗体をコードしているＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から１以上の核酸（例えば、重鎖及び／又は軽鎖ｍＲＮＡ）を得る工程と、（ｉｉ）前記核酸を発現ベクターに挿入する工程と、（ｉｉｉ）（異種）宿主細胞において対象となる抗体を発現させるために、前記ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする工程とを含む方法を提供する。
同様に、本発明はまた、組み換え細胞を調製する方法であって、（ｉ）対象となる抗体をコードしているＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から核酸の配列を決定する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた配列情報を使用して、宿主細胞において対象となる抗体を発現させるために、前記宿主細胞に挿入するための核酸を調製する工程とを含む方法を提供する。工程（ｉ）と（ｉｉ）との間に、制限酵素部位を導入する、コドンの使用頻度を変更する、及び／又は転写及び／又は翻訳調節配列を最適化するために前記核酸を操作してもよいが、必須ではない。
更に、本発明は、また、トランスフェクトされた宿主細胞を調製する方法であって、対象となる抗体をコードしている１以上の核酸を宿主細胞にトランスフェクトする工程を含み、前記核酸が、本発明の不死化Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞に由来する核酸である方法も提供する。したがって、まず核酸を調製し、次いで、それを使用して宿主細胞をトランスフェクトする手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時点で実施することができる。
次いで、本発明のこれら組み換え細胞を発現及び培養目的のために使用することができる。前記組み換え細胞は、大規模に医薬品を生産するために抗体を発現させるのに特に有用である。また、前記組み換え細胞は、医薬組成物の活性成分として用いることもできる。静置培養、ローラーボトル培養、腹水液、中空繊維型バイオリアクタカートリッジ、モジュラーミニ発酵槽、撹拌槽、微粒子担体培養、セラミックコア灌流などが挙げられるがこれらに限定されない任意の好適な培養技術を使用することができる。
Ｂ細胞又はプラズマ細胞から免疫グロブリン遺伝子を得、配列を決定する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、２０００年の第４章）。
トランスフェクトされた宿主細胞は、酵母及び動物細胞を含む真核細胞、特に、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ヒト細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６又はＨＫＢ－１１細胞）、骨髄腫細胞、又はヒト肝細胞）に加えて、植物細胞であってよい。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、発現宿主は、特にそれ自体ヒトにおいて免疫原性ではない炭水化物構造で本発明の抗体をグリコシル化することができる。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、無血清培地において増殖することができる。更なる実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、動物由来の生成物が存在しなくても培養物中で増殖することができる。また、トランスフェクトされた宿主細胞を培養して、細胞株を得ることもできる。
また、本発明は、対象となる抗体をコードしている１以上の核酸分子（例えば、重鎖及び軽鎖遺伝子）を調製する方法であって、（ｉ）不死化Ｂ細胞クローンを調製するか又は本発明に係るプラズマ細胞を培養する工程と、（ｉｉ）対象となる抗体をコードしている核酸を、Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から得る工程とを含む方法を提供する。更に、本発明は、対象となる抗体をコードしている核酸配列を得る方法であって、（ｉ）不死化Ｂ細胞クローンを調製するか又は本発明に係るプラズマ細胞を培養する工程と、（ｉｉ）対象となる抗体をコードしているＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から得られた核酸の配列を決定する工程とを含む方法を提供する。
本発明は、更に、対象となる抗体をコードしている核酸分子を調製する方法であって、本発明の形質転換Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から得られた核酸を得る工程を含む方法を提供する。したがって、先ずＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞を得、次いで、前記Ｂ細胞クローン又は前記培養プラズマ細胞から核酸を得るための手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時点で実施することができる。
また、本発明は、本発明に係る（例えば、製薬に使用するための）抗体を調製する方法であって、（ｉ）対象となる抗体を発現する選択されたＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から１以上の核酸（例えば、重鎖及び軽鎖の遺伝子）を得る及び／又は配列を決定する工程と；（ｉｉ）前記核酸配列を発現ベクターに挿入するか又は前記核酸配列を使用して発現ベクターを調製する工程と；（ｉｉｉ）対象となる抗体を発現することができる宿主細胞にトランスフェクトする工程と；（ｉｖ）トランスフェクトされた宿主細胞を、前記対象となる抗体が発現する条件下で培養又は継代培養する工程と；任意で、（ｖ）前記対象となる抗体を精製する工程とを含む方法を含む。
また、本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞集団、例えば、安定的にトランスフェクトされた宿主細胞集団を、対象となる抗体が発現する条件下で培養又は継代培養する工程と；任意で、前記対象となる抗体を精製する工程とを含む、対象となる抗体を調製する方法であって、前記トランスフェクトされた宿主細胞集団が、（ｉ）上記の通り調製したＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞によって産生される、選択された対象となる抗体をコードしている核酸を提供し、（ｉｉ）前記核酸を発現ベクターに挿入し、（ｉｉｉ）前記対象となる抗体を発現することができる宿主細胞に前記ベクターをトランスフェクトし、（ｉｖ）挿入された核酸を含むトランスフェクトされた宿主細胞を培養又は継代培養して、前記対象となる抗体を産生させることによって調製される方法を提供する。したがって、先ず組み換え宿主細胞を調製し、次いで、それを培養して抗体を発現させるための手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時点で実施することができる。
本発明はまた、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む抗体の免疫原性を低下させる方法であって、前記抗体の重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを導入する工程を含む方法を提供する。変異は、前記したように達成することができる。本明細書の実施例に示されるように、本発明の抗体は、驚くべきことに、非常に低い免疫原性しか示さず、特に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異を有しない抗体と比較して、免疫原性が低い。したがって、これらの変異を抗体に導入することは、抗体の免疫原性を低下させる。
医薬組成物
本発明はまた、
（ｉ）本発明に係る抗体；
（ｉｉ）本発明に係る抗体をコードする核酸；
（ｉｉｉ）本発明に係る核酸を含むベクター；及び／又は
（ｉｖ）本発明に係る抗体を発現する又は本発明に係るベクターを含む細胞のうちの１以上と、
任意に、薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物を提供する。
換言すれば、本発明はまた、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、及び／又は本発明に係る細胞を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、任意に、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含有していてもよい。担体又は賦形剤は投与を容易にすることができるが、それ自体が、組成物を摂取する個体にとって有害な抗体の産生を誘導してはならない。また、毒性であってもならない。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子などの、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子であってよい。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤は、Ａ型インフルエンザウイルス感染に関する活性成分ではない。
薬学的に許容し得る塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、及び硫酸塩）又は有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩）を用いてもよい。
医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどの液体を更に含有していてもよい。更に、湿潤剤若しくは乳化剤などの補助物質、又はｐＨ緩衝物質がかかる組成物中に存在していてもよい。かかる担体によって、対象に服用させるために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤として製剤化することができるようになる。
本発明の医薬組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、前記組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射液として調製してよい。注射する前に液体ビヒクルの溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態を調製してもよい（例えば、保存剤を含有する滅菌水で再構成するための、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と同様の凍結乾燥組成物）。前記組成物は、例えば軟膏剤、クリーム剤、又は粉剤として、局所投与用に調製してもよい。前記組成物は、例えば錠剤若しくはカプセル剤として、噴霧剤として、又はシロップ剤として（任意で、風味付けされる）経口投与用に調製してもよい。前記組成物は、例えば微粉末又はスプレーを用いる吸入器として、肺内投与用に調製してもよい。前記組成物は、坐剤又は膣坐剤として調製してもよい。前記組成物は、例えば点眼剤として、鼻腔内、耳内、又は眼内投与用に調製してもよい。前記組成物は、対象に投与する直前に複合組成物が再構成されるように設計されたキット形態であってもよい。例えば、凍結乾燥した抗体を、滅菌水又は滅菌バッファと共にキット形態で提供してよい。
いくつかの実施形態では、組成物中の（唯一の）有効成分は、本発明に係る抗体である。抗体は、胃腸管における分解を受けやすい場合がある。したがって、組成物が胃腸管を使用する経路によって投与されるとき、組成物は、抗体を分解から保護するが、胃腸管から吸収されると抗体を放出する剤を含むことができる。
薬学的に許容し得る担体についての詳細な検討は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２から入手可能である。
本発明の医薬組成物は、一般に、５．５～８．５のｐＨを有し、幾つかの実施形態では、これは、６～８であり、例えば約７である。ｐＨは、バッファを使用することによって維持することができる。前記組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであってよい。前記組成物は、ヒトに対して等張であってよい。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、密封容器で提供される。
いくつかの投与形態で存在する組成物が、本発明の範囲内であり、前記形態としては、例えば、ボーラス注射又は持続点滴などの注射又は点滴による非経口投与に好適な形態が挙げられるが、これらに限定されない。製品が注射又は注入用である場合、油性又は水性のビヒクルの懸濁液、溶液、又はエマルションの形態をとってもよく、懸濁化剤、保存剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有していてもよい。或いは、抗体は、適切な無菌液体を用いて使用前に再構成するために乾燥形態であってもよい。
ビヒクルは、典型的には、薬学的活性化合物などの化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び投与するのに好適な物質であると理解される。例えば、ビヒクルは、薬学的活性化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容し得る液体であってよい。製剤化すると、本発明の組成物を対象に直接投与することができる。いくつかの実施形態では、前記組成物は、哺乳動物、例えば、ヒト対象への投与に適応する。
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮、局所、皮下、鼻腔内、経腸、舌下、膣内、又は直腸内経路が挙げられるがこれらに限定されない、任意の数の経路によって投与することができる。また、皮下噴射器を用いて、本発明の医薬組成物を投与してもよい。任意に、医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤などとして経口投与用に、局所投与用に、又は例えば液体溶液又は懸濁液などの注射剤として調製することができる。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、注射剤である。注射前に液体ビヒクルの溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態も包含され、例えば、医薬組成物は凍結乾燥形態であってもよい。
静脈内、皮膚、若しくは皮下への注射、又は罹患部位への注射などの注射については、活性成分は、パイロジェンフリーであり且つ好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液の形態であることができる。当業者は、例えば、生食注射、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などの等張ビヒクルを用いて好適な溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。個体に投与されるのが本発明に係る抗体であろうと、ペプチドであろうと、核酸分子であろうと、他の薬学的に有用な化合物であろうと、個体に対して効果を示すのに十分な「予防的に有効な量」又は「治療的に有効な量」（場合による）が、通常投与される。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間推移は、処置されるものの性質及び重篤度に依存する。注射の場合、本発明に係る医薬組成物を、例えばプレフィルドシリンジで提供してよい。
前記定義された本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容し得る剤形で経口投与してよい。経口使用するための錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的に添加される。カプセル形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁剤が必要な場合、活性成分、即ち、上に定義された本発明のトランスポータ－カーゴコンジュゲート分子を乳化剤及び懸濁化剤と合わせる。必要に応じて、特定の甘味剤、着香剤、又は着色剤を添加してもよい。
また、特に、治療の標的が、例えばアクセス可能な上皮組織を含む、局所適用によって容易にアクセス可能な領域又は器官を含むとき、本発明の医薬組成物を局所的に投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれに好適な局所製剤が容易に調製される。局所適用の場合、本発明の医薬組成物は、１以上の担体に懸濁又は溶解している本発明の医薬組成物、特に、上に定義されたその成分を含有する好適な軟膏剤に製剤化してよい。局所投与用の担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、本発明の医薬組成物は、好適なローション又はクリームに製剤化することもできる。本発明において、好適な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。
投薬治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであり得る。特に、医薬組成物は、単回用量製品として提供することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の抗体の量は、特に単回投与の製品として提供される場合、２００ｍｇを超えず、例えば、１００ｍｇ又は５０ｍｇを超えない。
例えば、本発明に係る医薬組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１日間以上、毎日（例えば、１日間当たり１回又は数回（例えば、１日間当たり１回、２回、３回、又は４回））投与することができ、例えば、１、２、３、４、５、６ヶ月間、毎日投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１週間以上、毎週（例えば、１週間に１回又は２回）投与することができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月間、毎週投与することができる、又は２、３、４、又は５年間、毎週投与することができる。更に、本発明に係る医薬組成物は、毎月投与することができ、例えば、１、２、３、４、又は５年間以上、１ヶ月間当たり１回又は２ヶ月間ごとに１回投与することができる。投与は、一生涯続くこともある。いくつかの実施形態では、特に特定の適応症について、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス感染症の予防のために、１回の単回投与のみの場合も想定される。例えば、単回投与（単回用量）が投与され、抗体の力価が不十分である又は防御に不十分であると想定される場合、１以上の後の時点で更なる用量を投与することができる。
単回投与の場合、例えば、１日に１回、１週間に１回、１月に１回などの場合、本発明に係る医薬組成物中の抗体の量は、１ｇ又は５００ｍｇを超えてはならない。いくつかの実施形態では、単回投与の場合、本発明に係る医薬組成物中の抗体の量は、２００ｍｇ又は１００ｍｇを超えてはならない。例えば、単回投与の場合、本発明に係る医薬組成物中の抗体の量は、５０ｍｇを超えてはならない。
医薬組成物は、典型的には、本発明の１以上の抗体を「有効」量、即ち、所望の疾患若しくは状態を治療、寛解、軽減、低減、若しくは予防するか、又は検出可能な治療効果を呈するのに十分な量含む。治療効果は、病原性効力又は身体症状を低減又は軽減することも含む。任意の特定の対象についての正確な有効量は、前記対象の身長、体重、及び健康、状態の性質及び程度、並びに投与のために選択された治療法又は治療法の組合せに依存する。所与の状況についての有効量は、ルーチンな実験によって決定され、臨床医の判断の範囲内である。本発明の目的のために、前記有効量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００７５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ又は約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、本発明の抗体の有効量（例えば、医薬組成物中の抗体の量）は、一般に、投与される個体の体重（例えば、ｋｇ）に関連して、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである。
更に、本発明に係る医薬組成物は、更なる抗体、又は抗体ではない成分であってもよい追加の活性成分を含むことができる。例えば、医薬組成物は、１以上の抗ウイルス剤（抗体ではない）を含むことができる。更に、医薬組成物はまた、１以上の抗体（本発明に係るものではない抗体）、例えば、他のインフルエンザウイルス抗原（ヘマグルチニン以外）に対する抗体又は別のインフルエンザウイルスに対する抗体（例えば、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する又はＣ型インフルエンザウイルスに対する抗体）を含むことができる。したがって、本発明に係る医薬組成物は、１以上の追加の活性成分を含むことができる。
本発明に係る抗体は、追加の活性成分と同じ医薬組成物中に存在していてもよく、或いは、本発明に係る抗体は、第１の医薬組成物に含まれることができ、追加の活性成分は、第１の医薬組成物とは異なる第２の医薬組成物に含まれる。したがって、１超の追加の活性成分が企図される場合、各追加の活性成分と本発明に係る抗体は、異なる医薬組成物に含まれてもよい。かかる異なる医薬組成物は、合わせて／同時に、又は別々の時点で若しくは別々の箇所（例えば、身体の別々の部分）に投与してよい。
本発明に係る抗体と追加の活性成分とは、相加的治療効果、例えば、相乗的治療効果を提供することができる。用語「相乗作用」とは、２以上の活性剤の併用効果が、各活性剤の個々の効果の合計よりも大きいことを説明するために用いられる。したがって、２以上の剤の併用効果によって活性又はプロセスの「相乗的阻害」が生じる場合、前記活性又はプロセスの阻害が、各活性剤の阻害効果の合計よりも大きいことを意図する。用語「相乗的治療効果」とは、（多数のパラメータのうちのいずれかによって測定される）治療効果が、それぞれの個々の治療で観察される個々の治療効果の合計よりも大きい、２以上の治療の組合せで観察される治療効果を意味する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本発明の抗体を含んでいてよく、前記抗体は、前記組成物中の全タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）を構成し得る。本発明の組成物では、抗体は、精製形態であることができる。
また、本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、（ｉ）本発明の抗体を調製する工程と、（ｉｉ）精製抗体を１以上の薬学的に許容し得る担体と混合する工程とを含む方法を提供する。
他の実施形態では、医薬組成物を調製する方法は、抗体を１以上の薬学的に許容し得る担体と混合する工程を含み、前記抗体は、本発明の形質転換Ｂ細胞又は培養プラズマ細胞から得られたモノクローナル抗体である。
治療目的のために抗体又はＢ細胞を送達する代りに、Ｂ細胞由来の目的のモノクローナル抗体をコードしている核酸（典型的には、ＤＮＡ）又は培養したプラズマ細胞を対象に送達することもでき、その結果、前記核酸は、対象においてインサイチュで発現して所望の治療効果を提供することができる。好適な遺伝子療法及び核酸送達ベクターは、当技術分野において公知である。
医薬組成物は、特に複数回投与フォーマットにパッケージ化されている場合、抗微生物剤を含んでいてよい。前記医薬組成物は、洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでいてよい。洗浄剤は、一般に、低濃度、例えば、０．０１％未満で存在する。また、組成物は、等張にするためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでいてもよい。例えば、１０±２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ濃度が典型的である。
更に、医薬組成物は、特に、凍結乾燥される場合又は凍結乾燥物質から再構成された物質を含む場合、例えば、約１５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ（例えば、２５ｍｇ／ｍＬ）の糖アルコール（例えば、マンニトール）又は二糖（例えば、スクロース又はトレハロース）を含んでいてよい。凍結乾燥用組成物のｐＨは、凍結乾燥前に５～８、又は５．５～７、又は約６．１に調整してよい。
本発明の組成物はまた、１以上の免疫調節剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫調節剤の１以上は、アジュバントを含む。
医学的治療及び使用
更なる態様では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスによる感染の予防及び／又は治療又は（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスによる感染の診断における、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の使用を提供する。したがって、本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染を低減する、又はＡ型インフルエンザウイルス感染のリスクを低下させる方法であって、それを必要とする対象に、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の治療的に有効な量を投与することを含む方法を提供する。更に、本発明はまた、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防、治療、又は軽減のための医薬の製造における、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の使用を提供する。
診断の方法は、抗体をサンプルと接触させることを含むことができる。係るサンプルは、対象から単離することができ、例えば、鼻腔、洞腔、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚、又は血漿や血清などの血液から採取した単離組織サンプルであることができる。診断の方法はまた、特に抗体とサンプルとの接触後の、抗原／抗体複合体の検出を含むことができる。係る検出工程は、通常、ベンチで、即ち、ヒト又は動物の体に接触することなしに行われる。検出方法の例は、当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）が挙げられる。
Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防は、特に、対象が、Ａ型インフルエンザウイルス感染と診断されなかった（診断が行われなかった又は診断結果が陰性であった）及び／又は対象が、Ａ型インフルエンザ感染の症状を示さない予防的状況を意味する。Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防は、妊婦、小児（例えば、５９か月未満の小児）、高齢者、慢性病状（例えば、慢性的な心臓、肺、腎臓、代謝、神経発達、肝臓、又は血液疾患）を有する個体、及び免疫抑制状態（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、化学療法又はステロイド投与を受けている、又は悪性腫瘍がある）を有する個体など、感染時に重篤な疾患又は合併症のリスクが高い対象に特に有用である。更に、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防はまた、例えば、公共の場で働いている又は滞在している対象、特に医療従事者など、曝露される機会の増加によってＡ型インフルエンザウイルス感染を罹患するリスクがより高い対象において特に有用である。
対照的に、治療的状況では、対象は通常、Ａ型インフルエンザウイルスに感染しており、Ａ型インフルエンザウイルス感染と診断され、及び／又はＡ型インフルエンザウイルス感染の症状を呈している。なお、Ａ型インフルエンザウイルス感染の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」／「治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」という用語は、Ａ型インフルエンザウイルス感染及び／又は関連する症状の（完全な）治癒及び軽減／低減を含む。
したがって、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染症と診断された対象又はＡ型インフルエンザウイルス感染症の症状を呈している対象におけるＡ型インフルエンザウイルス感染症の治療に使用することができる。
本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物はまた、無症候性対象におけるＡ型インフルエンザウイルス感染の予防及び／又は治療に使用することができる。これらの対象は、Ａ型インフルエンザウイルス感染症と診断されている場合と診断されていない場合がある。
いくつかの実施形態では、治療対象（例えば、前記予防的又は治療的状況において）は、自己免疫疾患又はアレルギーを罹患している、又は自己免疫疾患又はアレルギーを発症するリスクがある。自己免疫疾患又はアレルギーを発症するリスクのある対象は、自己免疫疾患及び／又はアレルギーを有する家族を有する対象、及び（定期的に）アレルゲンに曝露される対象を含む。本明細書の実施例に示されるように、本発明の抗体は、驚くべきことに、非常に低い免疫原性しか示さず、特に、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有さない抗体と比較して、免疫原性がより低い。したがって、本発明の抗体は、広範な免疫応答のリスクがある対象において特に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防及び／又は治療のために使用され、前記抗体、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物は、（起こり得る）Ａ型インフルエンザウイルス感染の最大３ヶ月間前又は（起こり得る）Ａ型インフルエンザウイルス感染の最大１ヶ月間前、例えば、（起こり得る）Ａ型インフルエンザウイルス感染の最大２週間前又は（起こり得る）Ａ型インフルエンザウイルス感染の最大１週間前に投与される。例えば、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防及び／又は治療のために使用され、前記抗体、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物は、（起こり得る）Ａ型インフルエンザウイルス感染の最大１日間前に投与される。係る治療スケジュールは、特に予防的設定を意味する。
更に、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防及び／又は治療のために使用することができ、前記抗体、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物は、Ａ型インフルエンザ感染の初期症状の発症の最大３ヶ月間前又はＡ型インフルエンザ感染の初期症状の発症の最大１ヶ月間前、例えば、Ａ型インフルエンザ感染の初期症状の発症の最大２週間前又はＡ型インフルエンザ感染の初期症状の発症の最大１週間前に投与される。例えば、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、Ａ型インフルエンザ感染の予防及び／又は治療のために使用され、前記抗体、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物は、Ａ型インフルエンザ感染の初期症状の発症の最大３日間前又は２日間前に投与される。
一般に、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の初回投与後、１回以上の投与がその後に続いて行われることがあり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１日間の間、１日間当たり又は２日間ごとに単回投与を行うことができる。本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の初回投与後、１回以上の投与がその後に続いて行われることがあり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１週間の間、１週間当たり１回又は２回の単回投与を行うことができる。本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の初回投与後、１回以上の投与がその後に続いて行われることがあり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１週間の間、２又は４週間ごとに単回投与を行うことができる。本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の初回投与後、１回以上の投与がその後に続いて行われることがあり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヶ月間の間、２ヶ月間又は４ヶ月間ごとに単回投与を行うことができる。本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の初回投与後、１回以上の投与がその後に続いて行われることがあり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０年間の間、１年間当たり１回又は２回の単回投与を行うことができる。
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、０．００５～１００ｍｇ／ｋｇ体重又は０．００７５～５０ｍｇ／ｋｇ体重の（単回）用量、例えば０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重の（単回）用量又は０．０５～５ｍｇ／ｋｇ体重の（単回）用量で投与される。例えば、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、０．１～１ｍｇ／ｋｇ体重の（単回）用量で投与される。
本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、任意の数の経路で投与することができ、例えば、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、髄腔内、脳室内、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、局所、皮下、鼻腔内、経腸、舌下、膣内、又は直腸の各経路で投与することができる。
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、予防的に、即ち、Ａ型インフルエンザ感染の診断前に投与される。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ、前記抗体と異なる比較抗体によるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療に必要な用量の半分を超えない用量で投与される。例えば、本発明の抗体の用量は、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療に必要な用量の３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、又は９分の１を超えない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ、前記抗体と異なる比較抗体によるＡ型インフルエンザ感染の予防又は治療に必要な用量の１０分の１を超えない用量で投与される。本明細書の実施例５は、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む本発明の抗体が、重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ、前記抗体と異なる比較抗体と比較して遥かに低用量で有効であることを示す。実施例５はまた、本発明の抗体の効果の上昇が、循環抗体レベルと無関係であることを示す。
したがって、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザ感染の即時のリスクを有する対象に投与することができる。Ａ型インフルエンザ感染の即時のリスクは、通常、Ａ型インフルエンザの流行中に生じる。Ａ型インフルエンザウイルスは循環し、季節性の疾患の流行を引き起こすことが知られている（ＷＨＯ， Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ （Ｓｅａｓｏｎａｌ） Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ６， ２０１８）。温暖な気候では、季節性の流行は、主に冬に生じるが、熱帯地域では、インフルエンザが年間を通して発生し、より不規則に流行を引き起こす。例えば、北半球では、１１月、１２月、１月、２月、及び３月にＡ型インフルエンザの流行リスクが高いが、南半球では、５月、６月、７月、８月、及び９月にＡ型インフルエンザの流行リスクが高い。
組合せ療法
本発明に係る方法及び使用における本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の投与は、単独で、又は助剤（ｃｏ－ａｇｅｎｔ）（本明細書では「更なる活性成分」とも呼ばれる）と組み合わせて行うことができ、インフルエンザ感染の予防及び／又は治療に有用であり得る。
本発明は、本発明に係る抗体、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の投与を包含し、インフルエンザの治療及び／又は予防に有用な助剤又は別の治療レジメンの前に、同時に、又は後に対象に投与される。前記助剤と組み合わせて投与される前記抗体、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物は、同一又は異なる組成物中で、同一又は異なる投与経路によって投与することができる。本明細書において、「組合せ療法」、「組み合わせられた投与」、「組み合わせて投与される」などの表現は、（「組み合わせて」投与される）薬物の組合せ作用を意味することが意図される。この目的のために、組み合わせられた薬物は、通常、同時に及び／又は重複する時間帯で作用部位に存在する。両方の薬物の効果が相互作用できるように、薬物の一方によって効果が引き起こされている間に（薬物それ自体は、既に存在しない場合でも）、他方の薬物が投与されることもあり得る。しかし、他の薬物よりも遥かに前（例えば、１、２、３ヶ月間又は１年間を超える間）に投与された薬物で、他の薬物を投与するときに既に存在しない（又はその効果が持続していない）場合、通常、「組み合わせて」投与されるとはみなされない。例えば、インフルエンザの季節ごとに投与されるインフルエンザ薬は、通常、「組み合わせて」投与されない。
前記他の治療レジメン又は助剤は、例えば、抗ウイルス薬であることができる。抗ウイルス薬（又は「抗ウイルス剤」又は「抗ウイルス薬物」）は、ウイルス感染症の治療に特に使用される医薬のクラスを意味する。細菌用の抗生物質と同様に、抗ウイルス薬は、様々なウイルスに対して有用な広域スペクトルの抗ウイルス薬又は特定のウイルスに使用される特定の抗ウイルス薬であることができる。大部分の抗生物質と異なり、抗ウイルス薬は通常、標的病原体を破壊するのではなく、通常、それらの発達を阻害する。
したがって、本発明の別の態様では、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、本明細書に記載の（医学的）使用のための抗ウイルス薬と組み合わせて（その前に、それと同時に、又はその後に）投与される。
一般に、抗ウイルス薬は、広域スペクトルの抗ウイルス薬（インフルエンザウイルス及び他のウイルスに対して有用である）又はインフルエンザウイルス特異的な抗ウイルス薬であることができる。いくつかの実施形態では、抗ウイルス剤は、抗体ではない。例えば、抗ウイルス薬は、低分子薬であることができる。インフルエンザの予防及び／又は治療に有用な低分子抗ウイルス薬の例は、Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載されている。Ｗｕ ｅｔ ａｌ，２０１７に記載されているように、当業者は、インフルエンザの予防及び／又は治療に有用な様々な抗ウイルス薬に精通している。インフルエンザに有用な更なる抗ウイルス薬は、Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｓ． Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， Ｆｒｏｍ Ｎｏｗ ａｎｄ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１８；９：１９４６及びＫｏｓｚａｌｋａ Ｐ， Ｔｉｌｍａｎｉｓ Ｄ， Ｈｕｒｔ ＡＣ． Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｉｎ ｌａｔｅ－ｐｈａｓｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ． Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ． ２０１７；１１（３）：２４０－２４６に記載されている。
インフルエンザの予防及び／又は治療に有用な抗ウイルス薬は、（ｉ）インフルエンザウイルスそれ自体の機能性タンパク質を標的とする剤、及び（ｉｉ）宿主細胞（例えば、上皮）を標的とする剤を含む。
宿主細胞標的剤は、広域スペクトル抗ウイルス薬のチアゾリドクラス、シアリダーゼ融合タンパク質、ＩＩＩ型インターフェロン、Ｂｃｌ－２（Ｂ細胞リンパ腫２）阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、Ｖ－ＡＴＰアーゼ阻害剤、及び抗酸化剤を含む。広域スペクトル抗ウイルス薬のチアゾリドクラスの例としては、血中で活性代謝型チゾキサニド（ＴＩＺ）に迅速に脱アセチル化されるニタゾキサニド（ＮＴＺ）及びＲＭ５０６１など、ＮＴＺに構造的に関連する第２世代チアゾリド化合物が挙げられる。フルダーゼ（ＤＡＳ１８１）は、シアリダーゼ融合タンパク質の例である。ＩＩＩ型ＩＦＮとしては、例えば、ＩＦＮλが挙げられる。Ｂｃｌ－２阻害剤の非限定的な例としては、ＡＢＴ－７３７、ＡＢＴ－２６３、ＡＢＴ－１９９、ＷＥＨＩ－５３９、及びＡ－１３３１８５２（Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｓ． Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， Ｆｒｏｍ Ｎｏｗ ａｎｄ Ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１８；９：１９４６）が挙げられる。プロテアーゼ阻害剤の例としては、ナファモスタット、ロイペプチン、イプシロン－アミノカプロン酸、カモスタット、及びアプロチニンが挙げられる。Ｖ－ＡＴＰアーゼ阻害剤としては、ＮｏｒａｋｉｎＲ、ＰａｒｋｏｐａｎＲ、ＡｎｔｉｐａｒｋｉｎＲ、及びＡｋｉｎｅｔｏｎＲが挙げられる。抗酸化剤の例は、α－トコフェロールである。
いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬は、インフルエンザウイルスそれ自体の機能性タンパク質を標的とする剤である。例えば、抗ウイルス薬は、ヘマグルチニンではないインフルエンザウイルスの機能性タンパク質を標的にすることができる。一般に、インフルエンザウイルスの機能性タンパク質を標的とする抗ウイルス薬は、侵入阻害剤、ヘマグルチニン阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、インフルエンザポリメラーゼ阻害剤（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）阻害剤）、ヌクレオカプシドタンパク質阻害剤、Ｍ２イオンチャネル阻害剤、及び塩酸アルビドールが挙げられる。侵入阻害剤の非限定的な例としては、グリチルリチン酸（グリチルリチン）及びグリチルレチン酸などのトリテルペノイド誘導体；サポニン；ウラルサポニンＭ－Ｙ（例えば、ウラルサポニンＭ）；デキストラン硫酸（ＤＳ）；シリマリン；クルクミン；コンカナマイシンＡ、バフィロマイシンＡ１、及びクロロキンなどのリソソーム作用剤が挙げられる。ヘマグルチニンの非限定的な例としては、ＢＭＹ－２７７０９；スタキフリン；ゴシポール、ルチン、ケルセチン、キシロピン、及びテアフラビンなどの天然物；Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載される化合物１などの３価糖ペプチド模倣物；Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載される化合物２などのポドカルピン酸誘導体；Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載される化合物３などの天然物５環性トリテルペノイド；及びネオエキヌリンＢなどのプレニル化インドールジケトピペラジンアルカロイドなどが挙げられる。ヌセロカプシドタンパク質阻害剤の非限定的な例としては、ヌクレオジン、シクロヘキシミド、ナプロキセン、及びインガビリンが挙げられる。Ｍ２イオンチャネル阻害剤の非限定的な例としては、承認されたＭ２阻害剤であるアマンタジンとリマンタジン及びそれらの誘導体、並びにスペルミン、スペルミジン、スピロピペリジン、及びピナンアミン誘導体などの非アダマンタン誘導体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗ウイルス薬は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害剤及びインフルエンザポリメラーゼ阻害剤（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）阻害剤）から選択される。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害剤の非限定的な例としては、ザナミビル；オセルタミビル；ペラミビル；ラニナミビル；Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載される化合物４～１０などのそれらの誘導体、及び二量体ザナミビルコンジュゲート（例えば、Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載されるもの）；安息香酸誘導体（例えば、Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載されるもの；例えば、化合物１１～１４）；ピロリジン誘導体（例えば、Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載されるもの；例えば、化合物１５～１８）；ギンゲチン－シアル酸コンジュゲート；フラバノンとフラボノイドイソスクテラレイン及びその誘導体（例えば、Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載されるもの）；ＡＶ５０８０；及びＮ－置換オセルタミビルアナログ（例えば、Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載されるもの）が挙げられる。インフルエンザポリメラーゼ阻害剤（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ））阻害剤の非限定的な例としては、Ｗｕ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｓｕｎ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｇｅｎｔｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（４）：８２６－８４５に記載されるものなどのＲｄＲｐ破壊化合物；ＪＮＪ６３６２３８７２（ＶＸ－７８７）などのＰＢ２キャップ結合阻害剤；バロキサビルマルボキシル（Ｓ－０３３１８８）などのキャップ依存性エンドヌクレアーゼ阻害剤；ＡＬ－７９４、ＥＧＣＧ、及びその脂肪族アナログ、Ｎ－ヒドロキサム酸及びＮ－ヒドロキシイミド、フルチミド及びその芳香族アナログ、テトラミン酸誘導体、Ｌ－７４２，００１、ＡＮＡ－０、ポリフェノールカテキン、フェネチル－フェニルフタルイミドアナログ、大環状ビスビベンジル、ピリミジノール、フラーレン、ヒドロキシキノリノン、ヒドロキシピリジノン、ヒドロキシピリダジノン、トリヒドロキシフェニル含有化合物、２－ヒドロキシベンズアミド、ヒドロキシピリミジノン、β－ジケト酸及びその生物学的等価性化合物、チオセミカルバゾン、ビスジヒドロキシインドール－カルボキサミド、及びピリドピペラジンジオン（Ｅｎｄｏ－１）などのＰＡエンドヌクレアーゼ阻害剤；リバビリン、ファビピラビル（Ｔ－７０５）、２’－デオキシ－２’－フルオログアノシン（２’－ＦｄＧ）、２’－置換カルバ－ヌクレオシドアナログ、６－メチル－７－置換－７－デアザプリンヌクレオシドアナログ、及び２’－デオキシ－２’－フルオロシチジン（２’－ＦｄＣ）などのヌクレオシド及び核酸塩基アナログ阻害剤が挙げられる。例えば、抗ウイルス薬は、ザナミビル、オセルタミビル、又はバロキサビルであることができる。
したがって、本発明に係る医薬組成物は、更なる活性成分の１以上を含むことができる。本発明に係る抗体は、更なる活性成分（助剤）と同一の医薬組成物中に存在することができる。或いは、本発明に係る抗体及び更なる活性成分（助剤）は、別々の医薬組成物中（例えば、同一組成物中ではない）に含有される。したがって、１超の更なる活性成分（助剤）が想定される場合、本発明に係る更なる活性成分（助剤）のそれぞれ、及び抗体又は抗原結合断片は、異なる医薬組成物に含有され得る。係る異なる医薬組成物は、組み合わせて／同時に、又は別々の時点及び／又は別々の投与経路で投与することができる。
本発明に係る抗体及び更なる活性成分（助剤）は、相加的又は相乗的な治療効果をもたらし得る。用語「相乗性」は、それぞれの活性剤の個々の効果の和よりも大きい２以上の活性剤の組合せ効果を記述するために使用される。したがって、２以上の剤の組合せ効果が、活性又はプロセスの「相乗的阻害」をもたらす場合、活性又はプロセスの阻害は、それぞれの活性剤の阻害効果の和よりも大きいことが意図される。用語「相乗的治療効果」は、２以上の治療の組合せで観察される治療効果であり、個々の治療それぞれで観察される個々の治療効果の和よりも大きい治療効果（これは、いくつかのパラメータのいずれかによって測定される）を意味する。
したがって、本発明はまた、（ｉ）本明細書に記載の本発明の抗体、及び（ｉｉ）前の抗ウイルス薬の組合せを提供する。
以下、添付図面の簡単な説明をする。図面は、本発明をより詳細に説明することが意図されている。しかし、それらは本発明の主題を何ら限定することを意図するものではない。
図１は、実施例２に関し、５６日目までＥＬＩＳＡで評価したマカク血漿サンプル中のヒト抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（白色四角形）及びＦｌｕＡＢ＿ｗｔ（比較抗体；黒色円形）の血漿濃度を示す。
図２は、実施例３に関し、総ヒトｍＡｂを定量する抗ＣＨ２抗体ＥＬＩＳＡ又はｍＡｂの機能を決定するＨＡ抗原結合ＥＬＩＳＡを使用して測定されたＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（動物Ｃ９０１４２、Ｃ９０１９０）の血漿濃度を示す。グラフは、選択された時点（１日目、２１日目、５６日目、８６日目、及び１１３日目）での個々の動物の総ヒトｍＡｂの定量とＨＡ結合との間の線形回帰を示す。
図３は、実施例４（Ａ）に関し、ＥＬＩＳＡを使用して測定され、尿素含量に対して規格化された、鼻腔スワブ中のヒト抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びＦｌｕＡＢ＿ｗｔの濃度を示す。（Ｂ）血漿濃度に対する鼻腔スワブの尿素規格化濃度（％）として表されるヒト抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びＦｌｕＡＢ＿ｗｔの生体内分布。個々の動物ＩＤ及び接種されたヒト抗体変異体（ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔ）を以下に示す。
図４は、実施例５に関し、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ（パネルＢ、Ｄ、円形）、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（パネルＣ、Ｅ、四角形）で、１ｍｇ／ｋｇ（パネルＢ、Ｃ、灰色記号）及び０．３ｍｇ／ｋｇ（パネルＤ、Ｅ、薄灰色記号）にて処理した又は未処理（パネルＡ、三角形）のＴｇ３２マウスの経時的累積体重変化を示す；マウスはいずれも、ＰＲ８ウイルスに鼻腔内感染している；個々の動物が示される；太い黒色線は、ＢＷ±ＳＤの平均傾向を表す。群当たりの個体数が示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ｖｓ対照単独（Ａ）、°ｐ＜０．０５、°°ｐ＜０．０１、全マウスｖｓＭＥＤＩ８８５２の相対時点、ボンフェローニの多重検定補正（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を使用した２元配置ＡＮＯＶＡ。
図５は、実施例５に関し、未処理の（破線）若しくはＦｌｕＡＢ＿ｗｔ、又はＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳで処理した感染Ｔｇ３２雄マウスにおける１ｍｇ／ｋｇ用量（左パネル）及び０．３ｍｇ／ｋｇ用量（右パネル）の生存率（％）の比較を示す。＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ未処理マウス（ＣＴＲ）及び０．３ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ；°°°ｐ＜０．００１ｖｓＦｌｕＡＢ＿ｗｔ、ログランク分析、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ法。
図６は、実施例５に関し、注射された抗体の循環レベルを示す。感染直前（０日目）及び感染６日後のマウスの血清中で測定された循環ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ（円形）及びＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（四角形）の個々のレベル（μｇ／ｍｌ）を示す。バーは、平均±ＳＤを表す。
図７は、実施例６に関し、インビトロ中和アッセイで使用されるプレートスキームを示す。
図８は、実施例６に関し、Ｈ１Ｎ１（Ａ，Ｃ）及びＨ３Ｎ２（Ｂ，Ｄ）ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びオセルタミビル単独の中和活性を示す。
図９は、実施例６に関し、Ｈ１（Ａ）及びＨ３（Ｂ）ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びオセルタミビルとの組合せ中和活性を示す。データは、ＭＤＣＫ細胞のＨ１Ｎ１（Ａ）及びＨ３Ｎ２（Ｂ）ウイルス感染の両方において、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ単独、及び様々なモル濃度（ｈｅｔｅｒｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）のオセルタミビルとの組合せによる阻害された割合を示す。データは、３つの独立した培養プレートで得られた３連の値の平均±ＳＤとして表される。
図１０は、実施例６に関し、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとオセルタミビルとの組合せの中央値効果プロットを示す。２種の化合物を、図示される一定比率で段階希釈し、Ｈ１（Ａ）及びＨ３（Ｂ）ウイルス株のいずれかを感染させたＭＤＣＫ細胞に添加した。非一定比率（ＮＣＲ）での、選択された組合せから得られた値も示す。
図１１は、実施例６に関し、Ｈ１Ｎ１ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとオセルタミビルとの組合せ指数を示す。ドットは、図示された一定比率での実際の実験点を表し、累積された薬物－薬物濃度を脇に示す。点線の曲線は、効果範囲全体に亘る予測された組合せ指数を示す。
図１２は、実施例６に関し、Ｈ３Ｎ２ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとオセルタミビルとの組合せ指数を示す。ドットは、図示された一定比率での実際の実験点を表し、累積された薬物－薬物濃度を脇に示す。点線の曲線は、効果範囲全体に亘る予測された組合せ指数を示す。
図１３は、実施例６に関し、Ｈ１Ｎ１ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－オセルタミビルの組合せのアイソボログラムを示す。ドットは、様々な一定比率のＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－オセルタミビルの組合せでのＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０の各値を示す。各実験点について、累積濃度を示す。
図１４は、実施例６に関し、Ｈ３Ｎ２ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－オセルタミビルの組合せのアイソボログラムを示す。ドットは、様々な一定比率のＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－オセルタミビルの組合せでのＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０の各値を示す。各実験点について、累積濃度を示す。
図１５は、実施例６に関し、Ｈ１Ｎ１（Ａ，Ｃ）及びＨ３Ｎ２（Ｂ，Ｄ）ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びザナミビル単独の中和活性を示す。
図１６は、実施例６に関し、Ｈ１（Ａ）及びＨ３（Ｂ）ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルとの組合せ中和活性を示す。データは、ＭＤＣＫ細胞のＨ１Ｎ１（Ａ）及びＨ３Ｎ２（Ｂ）ウイルス感染の両方において、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ単独、及び異なるモル濃度のザナミビルとの組合せによる阻害された割合を示す。データは、３つの独立した培養プレートで得られた３連の値の平均±ＳＤとして表される。
図１７は、実施例６に関し、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルとの組合せの中央値効果プロットを示す。２種の化合物を、図示される一定比率で段階希釈し、Ｈ１（Ａ）及びＨ３（Ｂ）ウイルス株のいずれかを感染させたＭＤＣＫ細胞に添加した。非一定比率（ＮＣＲ）での、選択された組合せから得られた値も示す。
図１８は、実施例６に関し、Ｈ１Ｎ１ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルとの組合せ指数を示す。ドットは、図示された一定比率での実際の実験点を表し、累積された薬物－薬物濃度を脇に示す。点線の曲線は、効果範囲全体に亘る予測された組合せ指数を示す。
図１９は、実施例６に関し、Ｈ３Ｎ２ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルとの組合せ指数を示す。ドットは、図示された一定比率での実際の実験点を表し、累積された薬物－薬物濃度を脇に示す。点線の曲線は、効果範囲全体に亘る予測された組合せ指数を示す。
図２０は、実施例６に関し、Ｈ１Ｎ１ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－ザナミビルの組合せのアイソボログラムを示す。ドットは、様々な一定比率のＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－ザナミビルの組合せでのＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０の各値を示す。各実験点について、累積濃度を示す。
図２１は、実施例６に関し、Ｈ３Ｎ２ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－ザナミビルの組合せのアイソボログラムを示す。ドットは、様々な一定比率のＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－ザナミビルの組合せでのＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０の各値を示す。各実験点について、累積濃度を示す。
図２２は、実施例６に関し、Ｈ１Ｎ１（Ａ，Ｃ）及びＨ３Ｎ２（Ｂ，Ｄ）ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びバロキサビル単独の中和活性を示す。
図２３は、実施例６に関し、Ｈ１（Ａ）及びＨ３（Ｂ）ウイルス感染に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとバロキサビルとの組合せ中和活性を示す。データは、ＭＤＣＫ細胞のＨ１Ｎ１（Ａ）及びＨ３Ｎ２（Ｂ）ウイルス感染の両方において、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ単独、及び異なるモル濃度のバロキサビルとの組合せによる阻害された割合を示す。データは、３つの独立した培養プレートで得られた３連の値の平均±ＳＤとして表される。
図２４は、実施例６に関し、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとバロキサビルとの組合せの中央値効果プロットを示す。２種の化合物を、図示される一定比率で段階希釈し、Ｈ１（Ａ）及びＨ３（Ｂ）ウイルス株のいずれかを感染させたＭＤＣＫ細胞に添加した。非一定比率（ＮＣＲ）での、選択された組合せから得られた値も示す。
図２５は、実施例６に関し、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとバロキサビルとの組合せ指数を示す。ドットは、図示された一定比率での実際の実験点を表し、累積された薬物－薬物濃度を脇に示す。点線の曲線は、効果範囲全体に亘る予測された組合せ指数を示す。
図２６は、実施例６に関し、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－バロキサビルの組合せのアイソボログラムを示す。ドットは、様々な一定比率のＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－バロキサビルの組合せでのＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０の各値を示す。各実験点について、累積濃度を示す。
図２７は、実施例７に関し、ｐＨ＝６．０（Ａ）又はｐＨ＝７．４（Ｂ）でＯｃｔｅｔによって測定した固定化ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（灰色の線）又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔ（黒色の線）に対するヒトＦｃＲｎ溶液の結合を示す。０秒の時点は、ベースラインバッファからヒトＦｃＲｎ含有バッファへの切り替えを表す。４２０秒の時点（灰色の垂直の点線）は、対応するｐＨでのブランクバッファへの切り替えを表す。会合及び解離プロファイルは、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してリアルタイムで測定した。
図２８は、実施例９に関し、マウス抗薬物ＩｇＧを検出するＥＬＩＳＡによって測定されたＡＤＡ応答のレベル（Ａ；バーは、処理群の平均±ＳＤを表す）；及びｉ．ｖ．注射後１４日目に測定された循環ヒトＩｇＧのレベル（Ｘ軸）と、同一時点のＡＤＡのシグナル（Ｙ軸）との間の相関分析（Ｂ）を示す。有意な値について、ノンパラメトリックなスピアマンの相関係数を示す。
図２９は、実施例１０に関し、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔのいずれかの皮下（ｓ．ｃ．）注射後のＡＤＡ応答レベルを示す。データは、ｓ．ｃ．注射（ｎ＝５／群）後３週間で得られた個々の血清で検出されたＡＤＡシグナル（ＯＤ４５０ｎｍ）の値として表され、ＰＢＳ中、１：２５で事前希釈し、次いで更に５倍で段階希釈する。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、その全体が参照によって援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
実施例１：カニクイザルにおける本発明に係る抗体の安全性及び忍容性
（ｉ）配列番号１～６で表されるＣＤＲ配列と、（ｉｉ）重鎖定常領域における２つの変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓとを含む、本発明に係る抗体を設計及び製造した。より具体的には、抗体は、（ｉ）配列番号７で表される重鎖可変領域（ＶＨ）配列及び配列番号８で表される軽鎖可変領域（ＶＬ）配列、並びに（ｉｉ）重鎖定常領域における２つの変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む。更により具体的には、抗体は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。この抗体を「ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ」と称する。
比較のために、抗体「ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ」を使用した。これは、重鎖定常領域に２つの変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ、抗体「ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ」と異なる。したがって、比較抗体「ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ」は、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。
１試験群当たり３頭の雌性カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、２．５ｍｌ／ｋｇの容量で、５ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔを、６０分間、単回静脈内注入した。臨床化学及び血液学的分析のための血液又は尿は、投与前及び投与後７日目と２１日目に採取した。
ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔを５ｍｇ／ｋｇで６０分間静脈内注入した後、雌性カニクイザルの健康状態と体重を綿密にモニタし、血液と尿を定期的に採取した。抗体の静脈内接種後、一部の動物では、接種部位の投与後２４時間のあざと投与後３日目の紅皮症を除いて、有害事象は観察されなかった。動物はいずれも、概して健康であり、正常な食物消費を示し、試験を通して全体的に正の体重増加を示した。臨床化学、血液学、及び尿検査のパラメータは、投与前のサンプルと比較して、投与後７日目又は２１日目で正常であった。
まとめると、カニクイザルへのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔのいずれかの単回静脈内注入は有害事象を誘発せず、概ねに忍容性が良好であった。
実施例２：血漿濃度及び薬物動態の決定
これらの実験は、濃度を決定すること、半減期を決定すること、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの薬物動態を単回静脈内注射後の血漿中の比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較することを目的とした。
投薬前に、ドット免疫結合アッセイを使用して、動物を、インフルエンザ特異的抗体に対して陰性であることを試験した。既存の免疫がこの試験に干渉する可能性があるので、血清陽性動物を研究から除外した。更に、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を発現している動物は、除外した。
１試験群当たり３頭の雌性マカクに、２．５ｍｌ／ｋｇ容量で、５ｍｇ／ｋｇのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔを、６０分間、単回静脈内注入した。血液は、投与前のＫ２ＥＤＴＡを含むチューブに回収し、投与後、約１、６、２４、９６、１６８、５０４、８４０、及び１３４４時間（ｈ）後に、薬物動態試験のために血漿に処理した。
抗体の血漿濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してインビトロで決定した。簡単に説明すると、ＩＡＶ－ＨＡ抗原（Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ ヘマグルチニンタンパク質抗原（Ｈｉｓタグ付き）；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌを９６ウェル平底１／２面積ＥＬＩＳＡプレートに添加し、４℃で一晩コーティングした。コーティング後、自動ＥＬＩＳＡウォッシャを使用して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄液）を添加した０．５×ＰＢＳでプレートを２回洗浄した。次に、プレートを、１％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）を添加した１００μｌ／ウェルのＰＢＳで室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングした後、２回洗浄した。血漿サンプルを１０，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した後、希釈（１：１０続いて１：３０）し、９６ウェル細胞培養プレートのブロッキング溶液中、最終的に１：３００に希釈した。定量に使用したマカク血漿の最小希釈率（１：３００）を試験し、マトリックス効果が無視できるように設定した。次いで、サンプルを３連で１：２の段階希釈をし、合計１２回希釈した。試験対象の各抗体の標準は、全ての試験動物からの接種前血漿のプール中で各抗体を１：３００～１μｇ／ｍｌに希釈し、試験サンプルのマトリックスを模倣することによって同様に調製した。次に、標準をブロッキング溶液にて３連で１：３の段階希釈をし、合計１２回希釈した。調製したサンプル又は標準の２５μｌを、ヘマグルチニン（ＨＡ）コーティングウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。４回洗浄後、ブロッキング溶液で１：５，０００（最終濃度０．１６μｇ／ｍｌ）に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃγ断片特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の２５μｌを、検出のため、１ウェル当たりに添加し、１時間ＲＴでインキュベートした。４回洗浄後、１ウェル当たり４０μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）を添加して、プレートを発色させた。ＲＴで、～７～２０分間インキュベートした後、発色反応がプラトー（最大ＯＤ～３．８）に達したときに、４０μｌの１％ＨＣｌを１ウェル当たりに添加して反応を停止し、分光光度計を使用して４５０ｎｍにて吸光度を測定した。
カニクイザル血漿中の抗体の濃度を決定するために、ＥＬＩＳＡデータからのＯＤ値を、Ｇｅｎ５ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ）の濃度に対してプロットした。非線形曲線フィットは、可変勾配モデル、４つのパラメータ、及び式Ｙ＝（Ａ－Ｄ）／（１＋（Ｘ／Ｃ）＾Ｂ）＋Ｄ）を使用して適用した。検量線の予測可能なアッセイ範囲内にあるサンプル希釈のＯＤ値（検量線の上方部分、中間部分、又は下方部分における品質管理サンプルによってセットアップ実験で決定される）を、サンプルを定量するために補間した。次いで、抗体の血漿濃度を、サンプルの最終希釈を考慮して決定した。サンプル希釈の１超の値が検量線の直線範囲内にある場合は、これらの値の平均を使用した。薬物動態（ＰＫ）データは、ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ ＮＯＮＣＯＭＰＡＲＴＭＥＮＴＡＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＯＧＲＡＭ（８．１．０．３５３０ Ｃｏｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｐｈｏｅｎｉｘ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃｅｒｔａｒａ）を使用して、次の設定で分析した：Ｍｏｄｅｌ：Ｐｌａｓｍａ Ｄａｔａ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ；Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｏｎ－ｍｉｓｓｉｎｇ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ：８；Ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ Ｔａｕ：１．００；Ｄｏｓｅ ｔｉｍｅ：０．００；Ｄｏｓｅ ａｍｏｕｎｔ：５．００ｍｇ／ｋｇ；Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ：０．０４日間；Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：Ｌｉｎｅａｒ Ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ ｗｉｔｈ Ｌｉｎｅａｒ Ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ；Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ ｆｏｒ ｌａｍｂｄａ＿ｚ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｕｎｉｆｏｒｍ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ；Ｌａｍｂｄａ＿ｚ ｍｅｔｈｏｄ：Ｆｉｎｄ ｂｅｓｔ ｆｉｔ ｆｏｒ ｌａｍｂｄａ＿ｚ，Ｌｏｇ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ。グラフ化及び統計分析（線形回帰又は外れ値分析）は、Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。外れ値分析は、ＲＯＵＴメソッド（Ｑ＝１％）を使用して行い、両方向で任意の数の外れ値が発見される可能性がある。
結果を図１に示す。接種後５６日目までに採取したカニクイザル血漿サンプルの分析から、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳが比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較して延長されたインビボ半減期を有することが示された（図１）。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎを用いた非コンパートメント分析を使用して、Ｔ１／２は、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳでは１９．５日間と推定され、比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔのＴ１／２は、１１．６日間と推定された。定量下限は、３００ｎｇ／ｍｌであった。
まとめると、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、少なくとも接種後５６日目まで、比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較して延長されたインビボ半減期を有していた。
実施例３：インビボでの長期安定性
本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの抗原結合のインビボ安定性及び機能性を経時で試験するために、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳを投与した群の薬物動態測定（実施例２に記載）を、接種後８６日目及び１１３日目に延長した。接種後１、２１、５６、８６、１１３日目に、機能的ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳを、実施例２に記載されるようにヘマグルチニン（ＨＡ）結合ＥＬＩＳＡを使用して定量した。
更に、マカク血漿中の総ヒト抗体は、サルの抗体ではなくヒトのＣＨ２領域に特異的に結合する捕捉ｍＡｂを使用する、特異的抗ＣＨ２ＥＬＩＳＡを使用して定量した。総ヒトＩｇＧを測定し、カニクイザル血漿中の接種された総ヒト抗体を定量するために、ヒトＩｇＧに特異的なマウス抗ＣＨ２ドメイン（クローンＲ１０Ｚ８Ｅ９；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるＥＬＩＳＡ捕捉を用いた。このｍＡｂは、サルＩｇＧと交差反応しないことが確認された。９６ウェル平底１／２面積ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために、マウス抗ヒトＩｇＧ ＣＨ２をＰＢＳに０．５μｇ／ｍｌで添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、５％ＢＳＡを含む１００μｌ／ウェルのブロッキング溶液をＲＴで１時間添加した。本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの標準液は、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳをブロッキング溶液中で１ｎｇ／ｍｌに希釈することによって調製した。次いで、標準液を、２連でブロッキング溶液中にて１：１．５に段階希釈し、合計１２倍に希釈した。カニクイザル血漿サンプルを１０，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、ブロッキング溶液中で最終的に１：１，０００、１：５，０００、又は１：１５，０００に段階希釈した。プレート洗浄後、２５μｌのサンプル又は標準液をＥＬＩＳＡプレートに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。３回洗浄後、０．０４μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃγ断片特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の２５μｌを、検出用に１％ＢＳＡ含有ブロッキング溶液に添加し、４５分間のＲＴでインキュベートした。３回洗浄後、１ウェル当たり４０μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）を添加して、プレートを発色させた。ＲＴで２０分間インキュベートした後、４０μｌの１％ＨＣｌを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
結果を図２に示す。いずれの定量も、カニクイザル血漿中のヒト抗体濃度は同様となった（図２）。線形回帰による更なる分析によれば、ＨＡ結合による定量と総抗ＣＨ２定量と間の関係が、選択された全ての時点で線形パターンにしたがっていることが示された。その結果、血漿中に存在するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの総量は、インビボで８６日間後及び１１３日後でも、Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）のヘマグルチニン（ＨＡ）ステム領域に結合する機能を有していた。
まとめると、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、研究延長期間中の接種後１１３日目まで、インビボにおいて、機能的な抗原結合性、即ち、良好な長期安定性を示した。
実施例４：鼻腔スワブにおける抗体濃度及び生体内分布
血漿に対する鼻粘液間の本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳと比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔとの生体内分布を決定するために、抗体の濃度を鼻腔スワブで決定した。このために、実施例２に記載のマカクの鼻腔スワブを、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又は比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔの投与後２４、５０４、及び１３４４時間で収集した。鼻腔スワブ中の抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びＦｌｕＡＢ＿ｗｔの濃度は、血漿中での測定のために以下の微調整を行って、実施例２に本質的に記載されるように測定した：（ａ）ＥＬＩＳＡプレートを２時間、ＲＴでブロッキングした；（ｂ）鼻腔スワブサンプルを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１：２から希釈し、続いて、１：２で段階希釈して、合計８個の希釈点とした；（ｃ）鼻腔スワブ培地（ＲＴ ＭＩＮＩ Ｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｃｏｐａｎ）をアッセイマトリックス対照として使用した。
スワビング中における、又は各動物に存在する鼻分泌物量における差を排除するために、異なる時点（１日目、２１日目、及び５６日目）で、鼻腔スワブの結果を尿素含量に規格化した。尿素は、血液間で自由に拡散し、これらの血漿又はスワブサンプルに同様の量で存在する（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ６１（８）：ｅ００２７９－１７）。このために、尿素窒素（ＢＵＮ）を、製造業者の手順にしたがって、「Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ （ＢＵＮ） Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量的に測定した。簡単に説明すると、サンプルをＰＢＳ中で１：３に希釈し、キット試薬Ａ及びＢと混合し、室温で３０分間インキュベートした。酸化還元反応の着色生成物を、９６ウェルマイクロプレートリーダを使用して４５０ｎｍで読み取った。定量は、、同様に処理したキット付属ＢＵＮ標準液とサンプルを比較することによって行った。
結果を図３に示す。鼻腔スワブ中の規格化された抗体の量は、経時で減少した（図３Ａ）。鼻と血漿の濃度を比較することによって生体内分布を決定することにより、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳと比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔとの間に差がないことが明らかになり（図３Ｂ）、ＭＬＮＳ－Ｆｃ変異は、血漿中のＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの半減期を延長するものの、鼻粘液への抗体の生体内分布が向上しなかったことが示唆された。
要約すると、鼻腔スワブサンプルは、３つのｍＡｂ変異体間で鼻粘液と血漿との間の生体内分布に有意な差を示さなかった。
実施例５：ＰＲ８に感染したＴｇ３２マウスにおける抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの予防活性
次に、抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較した本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの予防活性を、致死的なＡ型インフルエンザ感染のＨ１Ｎ１マウスモデルで決定した。
予防効果を評価するために、９～１４週齢のＦｃＲｎ－／－ｈＦｃＲｎ系統３２Ｔｇマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）に、本発明に係る抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ又は比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔを０．３～１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で含有する溶液５ｍｌ／ｋｇを、（尾静脈経由で）静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ｉ．ｖ．注射後２４時間で、感染前に血清抗体レベルを測定するために、マウスの尾静脈から採血した。採血は、感染後（ｐ．ｉ．）６日目と１３日目にも繰り返した。抗体を注射したマウスと、未処理のマウスの両方に麻酔をし（イソフルラン、Ｏ２中４％、０．３Ｌ／ｍｉｎ）、５頭のマウス致死量の５０％（５ ｍｏｕｓｅ ｌｅｔｈａｌ ｄｏｓｅ ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ）（５ＭＬＤ５０、１２００ＴＣＩＤ５０／マウスに相当）のＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１， Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４，Ｃｏｔｔｅｙ， Ｒ．， Ｒｏｗｅ， Ｃ．Ａ．， ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ， Ｂ．Ｓ． （２００１）．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １９， Ｕｎｉｔ１９．１１－１９．１１．３２）に記載）を含有するＰＢＳの５０μｌ（２５μｌ／各頭）を両鼻腔内にゆっくりと滴下注入することにより鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種した。各マウスを、鼻孔から接種物が滴下する可能性を低減するために、その頭部を僅かに後ろに傾け、約１分間直立させた。手順の後及び正向反射の発生時に、動物をケージに戻した。マウスは、ｐ．ｉ．１４日目まで体重減少及び疾患症状について毎日モニタし、初期体重（感染日を０％と設定する）の２０％超が減少したとき、又は罹患率スコア４に達したときに安楽死させた。表１は、適用された罹患率スコアの詳細を示す。
表１－ＰＲ８感染マウスの罹患率スコア
Figure 2022531556000001
 動物はいずれも、血清と肺を回収するために、最終的に屠殺した。
血清の調製：
約０．０５ｍｌの血液をゲル含有チューブに回収し、ＲＴで３０分間放置した。チューブを、５５００ｒｐｍ（３２００×ｇ）で５分間回転させ、血清を新たなチューブに移し、使用時まで－２０℃で保存した。
以下の設計にしたがって、２つの独立した実験を行った。
表２－研究計画実験１：
Figure 2022531556000002
 表３－研究計画実験２：
Figure 2022531556000003
循環ｍＡｂのＥＬＩＳＡ定量：
０日目と６日目に循環抗体のレベルについて、血清を評価した。簡単に説明すると、ハーフエリアＥＬＩＳＡプレートを、Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（２ ｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中、２５ ｌ／ウェル）からの組換えヘマグルチニン（ＨＡ）で４℃にて一晩コーティングした。ブロッキング（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ、１００μｌ／ウェル、１時間ＲＴ）及びＥＬＩＳＡ洗浄液（ＰＢＳＴ）による２回の洗浄（２２０ ｌ／ウェル）の後、血清の両希釈（初期希釈１：１５０（１ｍｇ／ｋｇの場合）、１：５０（０．３ｍｇ／ｋｇの場合）及び抗体標準液（ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びＦｌｕＡＢ＿ｗｔ、０．１ ｇ／ｍｌ）を２連で添加（２５ ｌ／ウェル）し、段階希釈した（血清希釈の場合、１：２×１０点、抗体標準液の場合、１：３×８点）。１．５時間のＲＴインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、更に、ＨＲＰ標識抗ヒト二次抗体（０．１６ ｇ／ ｍｌ、２５ ｌ／ウェル）と共ににＲＴで１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄後、プレートに基質溶液（２５ ｌ／ウェル）を分注し、１４分間発色させ、１％ＨＣｌ（ｖ／ｖ、２５ ｌ／ウェル）でブロッキングした。プレートを、シグナル定量のために分光光度計にて４５０ｎｍで最終的に読み取った。濃度値は、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答の非線形回帰モデル（可変勾配モデル、４つのパラメータ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して計算した。
データ分析：
データは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン８．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍを使用してプロット及び分析した。連続変数は、ボンフェローニ多重比較検定で補正した通常の２元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的有意差（ｐ＜０．０５、９５％信頼区間）について評価した。Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ法によるログランク分析を使用して生存率データを比較した（ｐ＜０．０５を、統計的有意とみなす）。前記２つの独立した実験からのデータをプールした。
結果：
予防活性は、鼻腔内感染によるＨ１Ｎ１ ＰＲ８ウイルス接種１日前のＴｇ３２マウスへのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ及びＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（１及び０．３ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｖ．投与時に試験した。結果を図４～６に示す。
図４に示すように、１ｍｇ／ｋｇ（パネルＤ）又は０．３ｍｇ／ｋｇ（パネルＥ）のＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳで処理したマウスは、未処理（パネルＡ）とＦｌｕＡＢ＿ｗｔ注射（パネルＢ及びＣ）のマウスの両方と比較して、体重減少が少なかった。
ＦｌｕＡＢ＿ｗｔに対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳのより優れた防御活性は、図５に示す生存率分析で確認された。
ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとＦｌｕＡＢ＿ｗｔと間の有効性の差は、抗体のｉ．ｖ．投与後１日目と７日目に測定されるように、血清中の循環抗体の各レベルと相関しなかった（図６）。注目すべきことに、注射後１４日目には、検出可能なレベルの循環抗体は測定されなかった（図示せず）。
まとめると、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、Ｔｇ３２マウスにおいて、比較抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔよりもＨ１Ｎ１ ＰＲ８鼻腔内ウイルス接種に対してより優れた防御能を示した。有効性は、循環抗体レベルと無関係であった。これらのデータは、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳと、Ｔｇ３２マウスによって発現されるｈＦｃＲｎとの相互作用の強化が、防御活性に関する有効性の上昇など、抗体半減期の延長と無関係のインビトロ効果も媒介することを示唆する。
実施例６：抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳと各種抗ウイルス剤との組合せ
薬物の組合せは、耐性を選択する可能性を低減しつつ、効果を高める明確な機会を提供する。更に、推定される相加効果又は相乗効果は、最終的に用量が節約されるアプローチになる可能性がある。現在ＦＤＡによって承認されているインフルエンザ治療薬としては、ノイラミニダーゼ阻害剤であるオセルタミビルとザナミビル、及びエンドヌクレアーゼ阻害剤クラスに属する最近承認されたバロキサビルマルボキシルが挙げられる。
本発明の抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳと抗ウイルス薬であるオセルタミビル、ザナミビル、又はバロキサビルマルボキシルとの組合せ活性を、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２の代表的なウイルス株の両方に対して評価するために、インビトロ中和を行って、結果として生じる阻害効果を評価した。組合せ効果の分析は、半数作用プロット（ｍｅｄｉａｎ－ｅｆｆｅｃｔ ｐｌｏｔ）と組合せ指数（ＣＩ）の計算を使用して行った。
簡単に説明すると、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）細胞を、３０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート（平底、黒色）に播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。２４時間後、６０μｌの感染培地（ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ０６４４）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４１０９０－０２８）＋１ ｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＃ＬＳ００３７５０）＋１０ ｇ／ｍｌカナマイシン）中の４×抗体及び抗ウイルス薬（オセルタミビル、ザナミビル、又はバロキサビルマルボキシル）希釈物を、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（最終１６６．７ｎＭから開始、９水平点）と、各種抗ウイルス薬（オセルタミビル、ザナミビル、又はバロキサビルマルボキシル）（１２５（ザナミビルの場合は、２５０）ｎＭから７垂直点まで）との十字交差（ｃｒｉｓｓｃｒｏｓｓ）１：２段階希釈を用いて、図７に示すプレートスキームにしたがって調製した。
各組合せについて、薬物－薬物組合せ比をそれぞれ３連とするために、３つの独立したプレートを調製した。単一化合物滴定（即ち、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ、９点及び各抗ウイルス薬、８点）を各プレートに含有させた。ウイルス溶液は、６０μｌ中、１２０×ＴＣＩＤ５０の濃度で調製し、ＭＥＭ中１：１で希釈する又はＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ希釈液と１：１で混合し、３３℃で１時間インキュベートした。添加剤を含有しない２００μｌ／ウェルＭＥＭを使用して、細胞を２回洗浄した後、１００μｌのウイルス単独又は１００μｌのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ／ウイルスミックス（１００×ＴＣＩＤ５０／ウェル）を添加し、３３℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの感染培地を添加した後、細胞を、３３℃、５％ＣＯ２で７２時間、更にインキュベートした。感染後３日目に、２０μＭのＭｕＮＡＮＡ（４－ＭＵＮＡＮＡ（２＿－（４－メチルウンベリフェリル）－α－ＤＮ－アセチルノイラミン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）＃６９５８７）溶液を、ＭｕＮＡＮＡバッファ（ＭＥＳ ３２．５ｍＭ／ＣａＣｌ２ ４ｍＭ、ｐＨ６．５）に調整し、５０μｌ／ウェルで、黒色の９６ウェルプレートに分注した。中和又はウイルス単独の滴定上清５０μｌをプレートに移し、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、１００μｌ／ウェルで０．２Ｍグリシン／５０％ＥｔＯＨ、ｐＨ１０．７で反応を停止させた。蛍光は、蛍光計（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ）にて４６０ｎｍで定量した。
ウイルス中和の割合は、以下の式にしたがって計算した。
Figure 2022531556000004
式中、ｆｘ＝サンプル蛍光シグナル（細胞＋ウイルス＋ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ＋抗ウイルス薬）；ｆｍｉｎ＝最小の蛍光シグナル（細胞単独、ウイルスなし）；ｆｍａｘ＝最大蛍光シグナル（細胞＋ウイルスのみ）。
中和された割合データを使用して、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの方法（Ｃｈｏｕ ＴＣ， Ｔａｌａｌａｙ Ｐ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ． １９８４， ２２：２７－５５）にしたがって、薬物－薬物組合せの用量作用関係の定性分析を計算した。組合せ指数、影響された割合（Ｆａ）、及びアイソボログラムを、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェア（ＣｏｍｂｏＳｙｎ Ｉｎｃ．， Ｐａｒａｍｕｓ， ＮＪ， ＵＳＡ）（Ｃｈｏｕ Ｔ－Ｃ： Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ， ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ， ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００６， ５８：６２１－６８１）を使用して得た。
結果を図８～２６に示し、以下に記載する。
ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとオセルタミビルとの組合せ
Ａ型インフルエンザウイルスを中和するためのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとオセルタミビルの相対的有効性を、Ｈ３Ｎ２株とＨ１Ｎ１株の両方の２つのウイルス血清型の代表例に対してインビトロで比較した。図８に示すように、両化合物は、別々に試験したとき、Ｈ３Ｎ３及びＨ１Ｎ１ウイルスに独立して曝露した場合、用量依存的に細胞感染を十分に阻害することができた（図８Ａ、Ｂ）。データログの線形化（Ｃｈｏｕ ＴＣ， Ｔａｌａｌａｙ Ｐ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇｓ ｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ． １９８４， ２２：２７－５５に記載）後の半数作用プロット（図８Ｃ、Ｄ）から計算されたＩＣ５０値は、確かに、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ（Ｈ３及びＨ１株でそれぞれ１７．９及び１５．６ｎＭ）及びオセルタミビル（Ｈ３及びＨ１株でそれぞれ７及び９．１ｎＭ）の両方でナノモル範囲であった。全体として、Ｈ３ウイルス感染とＨ１ウイルス感染との間で、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳによる阻害反応に関して実質的な差は測定されなかった。Ｈ１Ｎ１ウイルスは、オセルタミビルの阻害作用に対して僅かにより感受性であった。
ＭＤＣＫ細胞のＨ３及びＨ１ウイルスによる感染の中和における、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとオセルタミビルとの組合せの効果を試験するために、両化合物を前記した各種比率で段階希釈し、異なる薬物濃度の存在下における、単一薬物効果と比較してノイラミニダーゼ（ＮＡ；培養物中のウイルス含量の読み取りとして）の酵素活性を評価した。ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳで測定された中和効果は、２番目の化合物が様々な濃度で同時に存在することによって大幅に向上されるため、Ｈ３ウイルス感染及びＨ１ウイルス感染の両方に対して、習慣性（ａｄｄｉｃｔｉｖｅ）効果ではなく相乗効果が示唆される（図９）。オセルタミビルの阻害作用に対して、Ｈ１ウイルスとＨ３ウイルスの僅かに異なる感受性が検出された。
様々な薬物組合せ比の推定相乗効果を正確に定量するために、中和データを半数作用原理にしたがって更に変換し、前記したようにＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアで分析した。図１０に示すように、いくつかの異なるＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ－オセルタミビルの組合せ定数比の効果を、半数作用プロットにプロットした。
ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアは、半数作用式の対数変換を実験データに適用し、様々な薬物の組合せの効果（ＩＣ５０）と、いわゆる組合せ指数（ＣＩ）の両方を計算する。ＣＩは、質量作用の法則の物理化学的性質を考慮したＣｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ（半数作用）式から導出されたパラメータであり、同一効果を得るために単一薬物１及び２の用量で除した特定効果を達成するために薬物２と組み合わせられる薬物１の用量の部分の間の２つの比の和から得られる。この数学的アルゴリズムによれば、ＣＩ＝１は習慣性効果を示し、ＣＩ＜１は相乗作用を示し、ＣＩ＞１は拮抗作用を示す。
図１１及び図１２に示すように、試験した全ての組合せ比、及びＨ１ウイルス（図１１）とＨ３ウイルス（図１２）の両方について、阻害された割合範囲全体に亘って予測されたＣＩ値は、全ての薬物の組合せ比で１を遥かに下回る曲線を描き、各種組合せ濃度の実際の実験点も、殆ど全ての組合せで１未満の範囲であった。全体として、データは、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとオセルタミビルとを組み合わせた場合の明確な相乗効果を示している。
或いは、同一データをアイソボログラムプロットで記述することもできる。アイソボログラムプロットは、単剤と併用剤の両方の等効力濃度を比較する。図１３及び図１４に示すように、３種の異なる組合せ比のＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０値の分布は、Ｈ１（図１３）とＨ３（図１４）の両方について試験した各単剤のＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０を結ぶ等値線を遥かに下回っており、一貫した相乗効果を示す（一方、相加及び拮抗作用は、単剤アイソボール上又は上方に局在する等電位点を生成する）。
ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルとの組合せ
Ａ型インフルエンザウイルスを中和するためのＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルの相対的有効性も、Ｈ３Ｎ２株とＨ１Ｎ１株の両方の２つのウイルス血清型の代表例に対してインビトロで比較した。図１５に示すように、両化合物は、別々に試験したとき、Ｈ３Ｎ３及びＨ１Ｎ１ウイルスに独立して曝露した場合、用量依存的に細胞感染を十分に阻害することができた。相対的な計算されたＩＣ５０値は、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳで２３．１～２４．４ｎＭ、ザナミビルで１０．７～１３．７ｎＭであった。
ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルとの組合せ効果について、図１６は、オセルタミビルと同様に、ザナミビルがＨ１ウイルスとＨ３ウイルスの両方に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの阻害能を大きく向上させることを示す。
相乗効果の定量は、前記したようにＣｏｍｐｕＳｙｎと半数作用原理を使用して同様に計算した。ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルの併用効果の半数作用プロットを、図１７に示す。ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとザナミビルの計算されたＣＩを、図１８及び図１９に示す。試験した実験点がいずれも１未満の値であることから示されるように、Ｈ１ウイルス（図１８）とＨ３ウイルス（図１９）の両方で、２種の薬剤間の相乗効果を明確に示している。一貫して、両方のウイルス株で、アイソボログラムは、ＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０値（図２０及び図２１に示される）全体で強力な相乗効果を示しており、これらはいずれも、単一薬剤の各ＩＣ値を有意に下回っている。
ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとバロキサビルマルボキシルとの組合せ
最近承認されたエンドヌクレアーゼ阻害剤であるバロキサビルマルボキシルは、オセルタミビルとザナミビルについて前記したのと同様に、まず、Ｈ１株及びＨ３株の両方に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ単独と比較した。結果を図２２に示す。相対的な計算されたＩＣ５０値は、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳで２０．１～１５．４ｎＭ、バロキサビルマルボキシルで４．９～２．３ｎＭであった。
バロキサビルは、ＮＡ阻害剤と比較してウイルス複製の阻害において異なる作用機序を有するものの、この薬剤は、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの阻害能を強力に向上させることができ、相乗効果を明らかに示している（図２３）。様々な組合せ比で得られた阻害データを使用して、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアで半数作用を計算及びプロットし、前記したように薬物間相互作用のタイプを計算した（図２４）。ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳとバロキサビルマルボキシルの計算されたＣＩ（図２５）は、試験した実験点の大部分で１未満の値であることから示されるように、Ｈ１ウイルスとＨ３ウイルスの両方で、２種の薬剤間の相乗効果を明確に示している。アイソボログラムは、ＩＣ５０、ＩＣ７５、及びＩＣ９０値においてロバスト且つ完全な相乗効果を示している（図２６）。
まとめると、Ｈ１株とＨ３株の両方に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの中和能力は、各種抗ウイルス薬、即ち、ＮＡ阻害剤であるオセルタミビルとザナミビル、及びエンドヌクレアーゼ阻害剤であるバロキサビル－マルボキシルによって相乗的に向上する。
実施例７：様々なｐＨでのヒトＦｃＲｎへの結合
ＦｌｕＡＢ＿ｗｔとＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳを、生体層干渉法（ＢＬＩ）を使用して新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する能力について、対照比較した。
この目的のために、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ及びＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳのヒトＦｃＲｎへの結合を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器（生体層干渉法、ＢＬＩ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定した。抗ヒトＦａｂ－ＣＨ１でコーティングしたバイオセンサを、ＲＴで１０分間、キネティクスバッファで事前に水和した。次いで、ヒトｍＡｂ（ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ又はＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳ）を、ｐＨ７．４のキネティクスバッファ中で、１μｇ／ｍｌで３０分間、バイオセンサにロードした。ベースラインは、キネティクスバッファ（滅菌ろ過された０．０１％エンドトキシンフリーウシ血清アルブミン、０．００２％Ｔｗｅｅｎ－２０（ポリソルベート２０）、０．００５％ＮａＮ３のＰＢＳ溶液）中、ｐＨ＝７．４又はｐＨ＝６．０で４分間測定した。次いで、ヒトｍＡｂをロードしたセンサを、ｐＨ＝７．４又はｐＨ＝６．０のキネティクスバッファ中、１μｇ／ｍｌのヒトＦｃＲｎの溶液に７分間曝露し、様々な環境でＦｃＲｎ－ｍＡｂの会合を測定した（温レート）。次いで、解離を、同一ｐＨのキネティクスバッファ中で、更に５分間測定した（オフレート）。いずれの工程も、３０℃、１０００ｒｐｍで攪拌しながら行った。会合及び解離プロファイルは、干渉パターンの変化としてリアルタイムで測定した。
図２７に示すように、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）でＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較して高い親和性でヒトＦｃＲｎに結合したが、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳもＦｌｕＡＢ＿ｗｔも、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）ではＦｃＲｎに結合しない。
実施例８：抗体の拡張エピトープで同定された多型の特性評価
拡張エピトープにおけるこれまでの多型を、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）バックグラウンドでのＨ１ＨＡ又はＨ３ＨＡを使用した逆遺伝学によって生成したウイルスを使用して、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの中和活性に対する影響について評価した。
一塩基多型を、部位特異的変異誘発を使用して、ＰＲ８ Ｈ１ＨＡ又はＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ａｉｃｈｉ）ＨＡ ｐＨＷ２０００プラスミドに導入した。組換えＡ型インフルエンザウイルスは、標準的な方法を使用して、ＰＲ８バックボーン上の会合するＨ１又はＨ３ ＨＡでレスキューした（例えば、Ｅｒｉｃｈ Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｇａｂｒｉｅｌｅ Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ Ｋａｗａｏｋａ， Ｇｅｒｄ Ｈｏｂｏｍ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｇ． Ｗｅｂｓｔｅｒ， ２０００， Ａ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｅｉｇｈｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｍａｙ ２０００， ９７ （１１）： ６１０８－６１１３； ｄｏｉ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１００１３３６９７に記載されるように）。
中和活性は、標準的な方法を使用してＭＤＣＫ細胞で評価した。例えば、中和活性は、９６ウェルプレート中などのＭＤＣＫ細胞で評価することができる。この目的のために、ＭＣＤＫ細胞は、感染の２４時間前に３０，０００細胞／ウェルで播種することができる。抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、ＭＤＣＫ細胞に添加する前に、３７℃で１時間、ウイルスとインキュベートすることができる。この目的のために、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの１：２．５の９点段階希釈を感染培地で作成し、各希釈物を３連で試験し（例えば、５０μｇ／ｍＬ～０．０３μｇ／ｍＬ（最終濃度））、３７℃で１時間、ウイルスの１２０ＴＣＩＤ５０とインキュベートすることができる。ＭＤＣＫ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルのウイルス：抗体溶液を添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベートすることができる。４時間後、更に１００μｌ／ウェルの感染培地を細胞に添加することができる。３７℃で７２時間培養した後、ウイルスＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲで、例えば、ＷＨＯプライマー（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． ＣＤＣ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｈ１Ｎ１． Ａｐｒｉｌ ２８， ２００９）を使用して測定することができる。ＩＣ５０は、ウイルス複製の５０％を減少させるμｇ／ｍＬ単位の抗体濃度として表現され、対照ウェル（ウイルスなし及びウイルス単独）に対して規格化されたデータの非線形４パラメータロジスティックフィット曲線を用いて計算することができる。
拡張エピトープにおけるＨ１及びＨ３のＨＡ多型に対するＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの中和活性を、以下の表４に示す。
Figure 2022531556000005
 表４において、Ａｉｃｈｉ＝Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８；Ｇｅｏｍｅａｎ＝幾何平均；ＨＡ＝ヘマグルチニン；ＮＡ＝該当なし；ＰＲ８＝Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ Ｈ１Ｎ１；ｗｔ＝野生型。
Ｈ３ ＨＡをコードするウイルスでは、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、野生型ウイルスと同様のＩＣ５０値で、変異ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔを有するウイルスを中和した（野生型ウイルスに対してＩＣ５０が２倍未満の変化）。Ｈ１ ＨＡをコードするウイルスでは、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、野生型ウイルスと同様のＩＣ５０値で、ＨＡ２ Ｎ１４６Ｄコードするウイルスを中和した（野生型ウイルスに対してＩＣ５０が２倍未満の変化）。更に、使用したＰＲ８野生型株は、ＨＡ２多型Ｌ３８Ｑ及びＤ４６Ｎをコードし、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳによって４．７μｇ／ｍＬのＩＣ５０値で中和された。全体として、評価した多型はいずれも、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの野生型ウイルスと比較して２未満のＩＣ５０倍数変化をもたらした。まとめると、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳは、拡張エピトープ（Ｈ３ ＨＡ：ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔ；Ｈ１ ＨＡ：Ｎ１４６Ｄ）で評価された過去の多型のいずれをも効果的に中和した。
実施例９：Ｔｇ３２マウスにおける抗薬物抗体応答
Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異に関して、最近、前記変異が、この変異を含む抗体の免疫原性を高めるという懸念が提起された（Ｂｒｉａｎ Ｃ． Ｍａｃｋｎｅｓｓ， Ｊｕｌｉｅ Ａ． Ｊａｗｏｒｓｋｉ， Ｅｋａｔｅｒｉｎａ Ｂｏｕｄａｎｏｖａ， Ａｎｎａ Ｐａｒｋ， Ｄｅｌｐｈｉｎｅ Ｖａｌｅｎｔｅ， Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｍａｕｒｉａｃ， Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｐａｓｑｕｉｅｒ， Ｔｈｏｒｓｔｅｎ Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍｏｓｔａｆａ Ｋａｂｉｒｉ， Ａｂｄｕｌｌａｈ Ｋａｎｄｉｒａ， Ｋａｔａｒｉｎａ Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ ＆ Ｈｕａｗｅｉ Ｑｉｕ （２０１９） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ， ｍＡｂｓ， １１：７， １２７６－１２８８； Ｍａｅｄａ Ａ， Ｉｗａｙａｎａｇｉ Ｙ， Ｈａｒａｙａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｖａｒｉａｎｔ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＦｃＲｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ｆａｃｔｏｒ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ． ＭＡｂｓ． ２０１７；９（５）：８４４－８５３）。
親抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較した抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの免疫原性、特に抗薬物応答（抗薬物抗体；ＡＤＡ）を評価するために、ＴＧ３２マウス（ヒトＦｃＲｎについてトランスジェニックである）の２つの別々の群（ｎ＝５）に、ＦｌｕＡＢ－ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔモノクローナル抗体のいずれかを５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．注射した。次いで、注射したｍＡｂの循環レベルを評価するために、様々な時点で血液サンプルを採取した。注射後１４日目と２１日目に採取したサンプルを使用して、特異的ＥＬＩＳＡにより、注射したヒトモノクローナル抗体に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を評価した。
簡単に説明すると、精製したＦｌｕＡＢ＿ｗｔ及びＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳモノクローナル抗体を、９６ウェルプレートに２μｇ／ｍｌでコーティングした。ブロッキング後、注射後１４日目及び２１日目に得た被処理動物の血清を１：１８０に希釈したものを、室温（ＲＴ）で１．５時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（０．１６μｇ／ｍｌ）をプレートに添加し、ＲＴで１．５時間インキュベートした。次いで、ＡＤＡ ＩｇＧ（注射された抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ及びＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳに対するマウス抗体）を適切な基質で発色させ、分光光度計で読み取った。示したデータは、抗体のｉ．ｖ．投与後１４日目及び２１日目に収集した個々の血清（ｎ＝５／群）で得たＯＤ値（４５０ｎｍ）である。ナイーブなＴｇ３２マウス（対照）の血清を、陰性対照として使用した。
結果を図２８に示す。驚くべきことに、ＦｌｕＡＢ－ＭＬＮＳ抗体に対して反応するマウス血清ＩｇＧのシグナルは非常に弱く、注射をされていない対照動物で検出されたシグナルに対応していたが、一方で、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔを注射されたマウスの血清で測定されたＡＤＡ応答は、ｉ．ｖ．注射後１４日目と２１日目の両方で有意に高かった（図２８Ａ）。更に、注射後１４日目に測定されたＡＤＡのレベルは、循環ＦｌｕＡＢ＿ｗｔのレベルと有意に逆相関した（血清ＦｌｕＡＢ＿ｗｔレベルは、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔに対するマウス抗体のために減少した）が、一方で、同時に測定した循環ＦｌｕＡＢ－ＭＬＮＳのレベルは、確かに、遥かに高く、均一であった（図２８Ｂ）。
まとめると、これらのデータは、驚くべきことに、抗薬物応答（抗薬物抗体；ＡＤＡ）、即ち、ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳの免疫原性が、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較して減少したことを示す。
実施例１０：ｓ．ｃ．投与後の抗薬物抗体応答及び免疫原性
より免疫原性の高い環境でこの驚くべき知見を更に裏付けるために、ＴＧ３２マウスの別々の群（ｎ＝５）に、ＦｌｕＡＢ－ＭＬＮＳ又はＦｌｕＡＢ＿ｗｔのいずれか（５ｍｇ／ｋｇ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。ｓ．ｃ．注射は、免疫原性のより高い投与経路と一般に考えられている。ｓ．ｃ．投与後３週間で、抗薬物抗体のレベルを、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔ又はＦＬｕＡＢ＿ＭＬＮＳのいずれかをｓ．ｃ．注射したマウスの血清中のマウス抗薬物特異的ＥＬＩＳＡ（実施例９に記載したように）によって血清中で測定した。陰性対照として、ナイーブな未処理動物から得た１０種の血清のプールを使用した。
結果を図２９に示す。より免疫原性の高い環境にもかかわらず、ＦｌｕＡＢ－ＭＬＮＳをｓ．ｃ．投与された動物は、注射をされていない対照動物の血清で検出されたものと重複する抗ｈＩｇＧ抗体の血清力価で確認されるように、体液性免疫原性応答を引き起こさなかった。反対に、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔで処理した動物のＡＤＡ力価は明らかに陽性であり、処理動物の全てにおいて測定可能であった。注射された抗体の循環レベルと抗ｈＩｇＧ内因性応答との間の逆相関が、ＦｌｕＡＢ＿ｗｔのみを注射されたマウスの血清で検出された（図示せず）。
これらのデータは、驚くべきことに、抗体ＦｌｕＡＢ＿ＭＬＮＳが、その親抗体ＦｌｕＡＢ＿ｗｔと比較して免疫原性が低いことを示している。
配列及び配列番号の表（配列表）
Figure 2022531556000006
Figure 2022531556000007
Figure 2022531556000008
Figure 2022531556000009

Claims (68)

  1. 配列番号１、配列番号２、及び配列番号３でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列；配列番号４、配列番号５、及び配列番号６でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列；並びに重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含むことを特徴とする抗体。
  2. 前記抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合する請求項１に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスによる感染を中和する請求項１から２のいずれかに記載の抗体。
  4. 前記抗体が、前記重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の半分を超えない用量で、Ａ型インフルエンザ感染を中和する請求項３に記載の抗体。
  5. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の３分の１を超えない請求項４に記載の抗体。
  6. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの中和に必要な用量の５分の１を超えない請求項４から５のいずれかに記載の抗体。
  7. 前記抗体が、Ｈ３ ＨＡの多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及び／又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔ；及び／又はＨ１ ＨＡの多型Ｎ１４６Ｄを中和する請求項１から６のいずれかに記載の抗体。
  8. 前記抗体が、Ｈ３ ＨＡの多型ＨＡ１ Ｐ１１Ｓ、ＨＡ２ Ｄ４６Ｎ、及び／又はＨＡ２ Ｎ４９Ｔ；及び／又はＨ１ ＨＡの多型Ｎ１４６Ｄを、野生型ウイルスのＨＡに対して２未満のＩＣ５０倍率変化で中和する請求項７に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、前記重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体と比較して、低減された抗薬物抗体応答を誘発する請求項１から８のいずれかに記載の抗体。
  10. 前記抗体が、前記重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体と比較して、低い免疫原性を示す請求項１から９のいずれかに記載の抗体。
  11. 前記抗体が、ヒト抗体である請求項１から１０のいずれかに記載の抗体。
  12. 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１から１１のいずれかに記載の抗体。
  13. 前記抗体が、ＩｇＧ型である請求項１から１２のいずれかに記載の抗体。
  14. 前記抗体が、ＩｇＧ１型である請求項１３に記載の抗体。
  15. 前記抗体の軽鎖が、カッパ軽鎖である請求項１から１４のいずれかに記載の抗体。
  16. 前記抗体が、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、請求項１に記載の前記ＣＤＲ配列が維持される請求項１から１５のいずれかに記載の抗体。
  17. 前記抗体が、配列番号７と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、請求項１に記載の前記ＣＤＲ配列が維持される請求項１から１６のいずれかに記載の抗体。
  18. 前記抗体が、配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、請求項１に記載の前記ＣＤＲ配列が維持される請求項１から１７のいずれかに記載の抗体。
  19. 前記抗体が、配列番号７と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、請求項１に記載の前記ＣＤＲ配列が維持される請求項１から１８のいずれかに記載の抗体。
  20. 前記抗体が、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、請求項１に記載の前記ＣＤＲ配列が維持される請求項１から１９のいずれかに記載の抗体。
  21. 前記抗体が、配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、請求項１に記載の前記ＣＤＲ配列が維持される請求項１から２０のいずれかに記載の抗体。
  22. 前記抗体が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、請求項１に記載の前記ＣＤＲ配列が維持される請求項１から２１のいずれかに記載の抗体。
  23. 前記抗体のＣＨ３領域が、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓのほかに、更なる変異は含まない請求項１から２２のいずれかに記載の抗体。
  24. 前記抗体のＦｃ領域が、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓのほかに、更なる変異は含まない請求項１から２３のいずれかに記載の抗体。
  25. 前記抗体が、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む請求項１から２４のいずれかに記載の抗体。
  26. 前記抗体が、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖とを含む請求項１から２５のいずれかに記載の抗体。
  27. Ａ型インフルエンザウイルスによる感染の予防又は治療における使用のための請求項１から２６のいずれかに記載の抗体。
  28. 前記抗体が、予防的に投与される請求項２７に記載の使用のための抗体。
  29. 前記抗体が、前記重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の半分を超えない用量で投与される請求項２７から２８のいずれかに記載の使用のための抗体。
  30. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の３分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  31. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の４分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  32. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の５分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  33. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の６分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  34. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の７分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  35. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の８分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  36. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の９分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  37. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の１０分の１を超えない請求項２９に記載の使用のための抗体。
  38. 治療対象が、Ａ型インフルエンザ感染の即時のリスクを有する請求項２７から３７のいずれかに記載の使用のための抗体。
  39. 治療対象が、自己免疫疾患又はアレルギーを罹患している；又は自己免疫疾患若しくはアレルギーを発症するリスクを有する請求項２７から３８のいずれかに記載の使用のための抗体。
  40. 請求項１から２６のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。
  41. 前記核酸分子が、
    （ｉ）配列番号１２で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１２と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
    （ｉｉ）配列番号１３で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１３と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとを含む請求項４０に記載の核酸分子。
  42. 前記核酸分子が、
    （ｉ）配列番号１４で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１４と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
    （ｉｉ）配列番号１５で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１５と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとを含む請求項４０から４１のいずれかに記載の核酸分子。
  43. 第１及び第２の核酸分子の組合せであって、前記第１の核酸分子が、請求項１から２６のいずれかに記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、前記第２の核酸分子が、同一抗体の対応する軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組合せ。
  44. （ｉ）前記第１の核酸分子が、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１２と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み、
    （ｉｉ）前記第２の核酸分子が、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１３と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む請求項４３に記載の第１及び第２の核酸分子の組合せ。
  45. （ｉ）前記第１の核酸分子が、配列番号１４で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１４と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み、
    （ｉｉ）前記第２の核酸分子が、配列番号１５で表されるヌクレオチド配列又は配列番号１５と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む請求項４３から４４のいずれかに記載の第１及び第２の核酸分子の組合せ。
  46. 請求項４０から４２のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
  47. 請求項４３から４５のいずれかに記載の核酸分子の組合せを含むことを特徴とするベクター。
  48. 請求項１から２６のいずれかに記載の抗体を発現する又は請求項４６から４７のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。
  49. 請求項１から２６のいずれかに記載の抗体、請求項４０から４２のいずれかに記載の核酸、請求項４３から４５のいずれかに記載の核酸の組合せ、請求項４６から４７のいずれかに記載のベクター、又は請求項４８に記載の細胞と、任意に、薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
  50. Ａ型インフルエンザウイルス感染の予防、治療、又は軽減のための医薬の製造における、請求項１から２６のいずれかに記載の抗体、請求項４０から４２のいずれかに記載の核酸、請求項４３から４５のいずれかに記載の核酸の組合せ、請求項４６から４７のいずれかに記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、又は請求項４９に記載の医薬組成物の使用。
  51. Ａ型インフルエンザウイルスによる感染の予防又は治療における使用のための、請求項１から２６のいずれかに記載の抗体、請求項４０から４２のいずれかに記載の核酸、請求項４３から４５のいずれかに記載の核酸の組合せ、請求項４６から４７のいずれかに記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、又は請求項４９に記載の医薬組成物。
  52. 前記抗体、前記核酸、前記ベクター、前記細胞、又は前記医薬組成物が、予防的に投与される請求項５１に記載の使用のための抗体、核酸、核酸の組合せ、ベクター、細胞、又は医薬組成物。
  53. 前記抗体、前記核酸、前記ベクター、前記細胞、又は前記医薬組成物が、抗ウイルス薬と組み合わせて投与される請求項５１から５２のいずれかに記載の使用のための抗体、核酸、核酸の組合せ、ベクター、細胞、又は医薬組成物。
  54. 前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤及びインフルエンザポリメラーゼ阻害剤から選択される請求項５３に記載の使用のための抗体、核酸、核酸の組合せ、ベクター、細胞、又は医薬組成物。
  55. 前記抗ウイルス薬が、オセルタミビル、ザナミビル、及びバロキサビルから選択される請求項５３から５４のいずれかに記載の使用のための抗体、核酸、核酸の組合せ、ベクター、細胞、又は医薬組成物。
  56. 治療対象が、自己免疫疾患又はアレルギーを罹患している；又は自己免疫疾患若しくはアレルギーを発症するリスクを有する、請求項５１から５５のいずれかに記載の使用のための抗体、核酸、核酸の組合せ、ベクター、細胞、又は医薬組成物。
  57. （ｉ）請求項１から２６のいずれかに記載の抗体と、
    （ｉｉ）抗ウイルス薬との組合せ。
  58. 前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤及びインフルエンザポリメラーゼ阻害剤から選択される請求項５７に記載の組合せ。
  59. 前記抗ウイルス薬が、オセルタミビル、ザナミビル、及びバロキサビルから選択される請求項５７から５８のいずれかに記載の組合せ。
  60. Ａ型インフルエンザウイルスによる感染の予防又は治療における使用のための、請求項５７から５９のいずれかに記載の組合せ。
  61. Ａ型インフルエンザウイルス感染を低減する、又はＡ型インフルエンザウイルス感染のリスクを低下させる方法であって、それを必要とする対象に、請求項１から２６のいずれかに記載の抗体の治療的に有効な量を投与することを含むことを特徴とする方法。
  62. 前記抗体が、予防的に投与される請求項６１に記載の方法。
  63. 前記抗体が、前記重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含まないという点でのみ前記抗体と異なる比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の半分を超えない用量で投与される請求項６１から６２のいずれかに記載の方法。
  64. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の３分の１を超えない請求項６３に記載の抗体。
  65. 前記用量が、前記比較抗体によるＡ型インフルエンザの予防又は治療に必要な用量の５分の１を超えない請求項６３に記載の抗体。
  66. 前記対象が、Ａ型インフルエンザ感染の即時のリスクを有する請求項６１から６５のいずれかに記載の方法。
  67. 前記抗体が、抗ウイルス薬と組み合わせて投与される請求項６１から６６のいずれかに記載の方法。
  68. 配列番号１、配列番号２、及び配列番号３でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号４、配列番号５、及び配列番号６でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む抗体の免疫原性を低下させる方法であって、前記抗体の重鎖の定常領域に変異Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを導入する工程を含むことを特徴とする方法。
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