CN113546175A - Mal官能团修饰的纳米颗粒在靶向心脏递送中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种MAL官能团修饰的纳米颗粒在制备靶向心脏递送的药物或药物载体中的应用。将MAL官能团修饰的纳米颗粒应用于靶向心脏递送中时，能够有效地将核酸等活性物质成功递送至心脏等组织细胞中；并且该MAL官能团修饰的纳米颗粒的粒径小、包载率较高、成分简单、制备方法简单易行，具备良好的生物安全性和临床应用的可行性，便于工业化生产。MAL官能团修饰的纳米颗粒还能够应用于移植免疫中靶向心脏移植物中核酸等活性物质的递送，并且可通过使所述纳米颗粒携带相关抑制免疫排斥反应药物从而抑制受体免疫系统对正常心脏尤其是心肌组织的排斥反应，保护正常心脏尤其是心肌组织，延长移植组织的存活时间。

Description

MAL官能团修饰的纳米颗粒在靶向心脏递送中的应用
技术领域
本发明涉及一种MAL官能团修饰的纳米颗粒在靶向心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞递送中的应用，特别涉及一种MAL官能团修饰的纳米颗粒在制备靶向心脏递送的药物或药物载体中的应用。
背景技术
MAL(马来酰亚胺，maleimide)官能团通常被用于纳米颗粒表面靶向分子的连接，所起的作用是与靶向分子的巯基(-SH)形成化学键。通常带有MAL官能团的化合物如DSPE-PEG-MAL仅仅作为反应的中间物，多数用于抗体等蛋白和脂质体的偶联。多余的MAL也会被封闭处理来保证抗体的靶向功能。MAL可以和抗体上的巯基(-SH)相结合。至今未见报道将MAL官能团直接用于其他脂质体的表面性质改进方面，也未见报道直接研究MAL官能团在体内的作用。此外，MAL作为化学合成的基团，在体内是不存在的，其在体内可以和哪类细胞或者哪些活性物质反应都是未知的。
由于心脏的供血功能，血液由心脏动脉送出，再经由静脉回到心脏。而血液是由心脏强力搏动后送出的，因此靠近心脏的大动脉血流速度最快。故相比其他器官而言，到达心脏本身的血液的流速是最快的。这样的特殊性质造成了血液中的纳米载体停留或者富集在心脏组织中的难度也是较大的。现有技术中针对心脏尤其是心肌组织(例如心肌细胞)进行药物如核酸药物递送的纳米载体未见报道。
因此，急需寻求一种能够将核酸等活性物质成功递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞等组织细胞中、且成分简单、制备方法简单易行、具备临床应用可行性的载体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术中没有合适的将核酸等活性物质有效递送至心脏等的载体，提供一种MAL官能团修饰的纳米颗粒在靶向心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞递送中的应用，特别是MAL官能团修饰的纳米颗粒在制备靶向心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞递送的药物或药物载体中的应用。将本发明所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒(例如脂质体纳米颗粒或聚合物纳米颗粒)应用于靶向心脏递送中时，能够有效地将核酸等活性物质成功递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞等组织细胞中；并且该MAL官能团修饰的纳米颗粒的粒径小、包载率较高(可达60％)、成分简单、制备方法简单易行，具备良好的生物安全性和临床应用的可行性，便于工业化生产。此外，本发明所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒能够应用于移植免疫中靶向心脏移植物中核酸等活性物质的递送，并且可通过使所述纳米颗粒携带相关抑制免疫排斥反应药物从而抑制受体免疫系统对正常心脏尤其是心肌组织的排斥反应，保护正常心脏尤其是心肌组织，延长移植组织的存活时间。
目前，将核酸等活性物质递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞等组织细胞中存在诸多难题，本发明人通过大量的实验和摸索，意外发现当使用MAL官能团来修饰纳米颗粒(例如脂质体纳米颗粒(颗粒的核心组分为脂质例如阳离子脂质DOTAP)或聚合物纳米颗粒(颗粒的核心组分为聚合物如PLGA))时，均能够改变纳米颗粒的体内命运，从而实现将核酸等活性物质有效递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞中。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种MAL官能团修饰的纳米颗粒在制备靶向心脏递送的药物或药物载体中的应用。
较佳地，所述靶向心脏递送为靶向心肌组织递送，优选靶向心肌细胞递送。
较佳地，所述纳米颗粒为长循环纳米颗粒，优选为经PEG(Polyethylene glycol，聚乙二醇)或其衍生物(所述的衍生物通常为经过功能修饰的PEG，例如经烯烃、甲基、巯基、羧基等基团进行修饰后的PEG)修饰的长循环纳米颗粒；所述PEG的相对分子质量优选为2000-5000，例如为2000、3000、4000或5000。在本发明某一较佳实施例中，所述长循环纳米颗粒为经PEG2000(PEG2k)、PEG3000(PEG3k)、PEG4000(PEG4k)、PEG5000(PEG5k)或其衍生物修饰的长循环纳米颗粒。
较佳地，所述药物为治疗心脏移植的药物，优选为抑制移植心脏免疫排斥反应的药物。MAL官能团修饰的纳米颗粒能够应用于移植免疫中靶向心脏移植物中核酸等活性物质的递送，并且可通过使所述纳米颗粒携带相关抑制免疫排斥反应药物从而抑制受体免疫系统对正常心脏尤其是心肌组织的排斥反应，保护正常心脏尤其是心肌组织，延长移植组织的存活时间。
本发明中，所述长循环纳米颗粒可为本领域常规，通常可以延长纳米颗粒在血液循环中的滞留半衰期(传统纳米颗粒的半衰期仅有十几分钟至几十分钟，而长循环纳米颗粒的半衰期通常达几小时至十几小时甚至更长时间)。
本发明中，所述药物可以包含活性物质，所述活性物质按照实际应用时的需求可以为基因或者药物，也可以诊断试剂类的物质，还可以为小分子多肽等等。较佳地，所述活性物质为水溶性或者脂溶性的活性物质，所述活性物质还可以为生物类活性物质，优选核酸、多肽或蛋白质；更佳地，所述核酸为DNA和/或RNA；所述RNA优选为siRNA和/或mRNA。本发明中的核酸DNA、mRNA、siRNA等，其长度范围从20bp到几千bp不等，结构上包括双链和单链的核酸。在本发明某一较佳实施例中，所述活性物质为序列如SEQ ID NO.1所示的GFP质粒。在本发明某一较佳实施例中，所述活性物质为序列如SEQ ID NO.2所示的RFP质粒。
较佳地，所述MAL官能团修饰的纳米颗粒为MAL官能团修饰的脂质体纳米颗粒和/或MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒。
在本发明某一较佳实施例中，所述MAL官能团修饰的纳米颗粒为MAL官能团修饰的脂质体纳米颗粒。
较佳地，所述MAL官能团修饰的脂质体纳米颗粒可以为MAL官能团修饰的阳离子脂质体纳米颗粒，其一般包括阳离子脂质和第一辅助脂质，所述第一辅助脂质连接有MAL官能团。
本发明中，所述阳离子脂质可为本领域常规，通常由一种阳离子脂质和一种中性辅助脂质在适当的条件下复合而成。术语“阳离子脂质”通常包括具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定氨基头部基团(例如，烷基氨基或二烷基氨基头部基团)的那些脂质及其盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质的pKa的pH下被质子化(即，带正电荷)并且在高于pKa的pH下基本上呈中性。本发明的阳离子脂质也可被称为可滴定的阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质包括：可被质子化的叔胺(例如，pH可滴定的)头部基团；C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0至3个(例如，0、1、2或3个)双键；以及头部基团和烷基链之间的醚、酯或缩酮键。较佳地，所述阳离子脂质选自DOTAP(DOTAP为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵硫酸甲酯盐或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTMA(氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DODMA(1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷)、DOSPA(三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰胺基)乙基铵)、DTAB(溴化三甲基双十二烷氧基铵)、TTAB(溴化三甲基双十四烷氧基铵)、CTAB(溴化三甲基双十六烷氧基铵)、DDAB(溴化二甲基双十八烷氧基铵)、DORI(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油酰氧基丙基铵)、DORIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DORIE-HP(溴化二甲基-3-羟丙基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DORIE-HB(溴化二甲基-4-羟丁基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DORIE-HPc(溴化二甲基-5-羟戊基-2,3-二油烯氧基丙基铵)、DPRIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十六烷氧基丙基铵)、DSRIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十八烷氧基丙基铵)、DMRIE(溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵)、DOGS(N-(2-精胺甲酰基)-N’,N-双十八烷基甘氨酰胺)、DOSC(1,2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯)、CD-Chol(3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)]胆固醇)、LPLL(脂质多聚-L-赖氨酸)和SA(硬脂胺)中的一种或多种，优选DOTAP。
较佳地，所述第一辅助脂质选自连接了MAL官能团的磷脂酰乙醇胺(PE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和磷脂酰胆碱(PC)中的一种或多种，优选为连接了MAL官能团的DSPE，更优选为DSPE-PEG-MAL。
在本发明某一较佳实施例中，所述第一辅助脂质为DSPE-PEG2000-MAL。本发明中，所述DSPE-PEG-MAL为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethyleneglycol)]。
较佳地，所述第一辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比为1:14～1:55。在本发明某一较佳实施例中，所述第一辅助脂质的含量为134μg、100.5μg、67μg或33.5μg，所述阳离子脂质的含量为443μg。
较佳地，所述脂质体还包括第二辅助脂质，其未连接MAL官能团，所述第二辅助脂质优选自胆固醇(Chol)、DSPE(例如以DSPE-PEG、DSPE-PEG-NH2或DSPE-PEG-COOH的形式)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和磷脂酰胆碱(PC)中的一种或多种，优选胆固醇和/或DSPE；所述第二辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比优选为1:2～2:1，更优选为1:1。通常第二辅助脂质的脂质成分与所述第一脂质可以不同，也可以相同，只要能够成功靶向心脏的递送即可。
较佳地，所述阳离子脂质体还包括染料，优选脂溶性荧光染料，更优选DiD；当所述阳离子脂质体包括第二辅助脂质时，所述染料的质量占所述阳离子脂质和所述第二辅助脂质的质量之和的比例优选为0.5％～2.5％，优选1.25％。所述染料只是用于示踪所述颗粒，在递送功能性核酸等活性物质时一般不需要添加。
较佳地，若所述药物中含有活性物质，所述阳离子脂质与所述活性物质的质量比可以为443：48～443：24。在本发明某一较佳实施例中，所述阳离子脂质与所述活性物质的质量比为443μg：48μg。
较佳地，所述阳离子脂质体一般为纳米颗粒，其粒径优选为160nm～250nm，优选200nm。
较佳地，所述阳离子脂质体的Zeta电位为10mV～-25mV，优选15mV。
较佳地，所述阳离子脂质体的包载率为55～65％，优选60％。
较佳地，所述阳离子脂质体的浓度为1.5-0.5mg/ml，优选0.97mg/ml。本发明中，所述脂质体的浓度一般是为透析后的浓度，其一般与投料量以及水化的体积相关。在本发明某一较佳实施例中所述脂质体的浓度接近1mg/ml，优选为0.97mg/ml。
较佳地，所述阳离子脂质体的制备方法为薄膜分散法。
更佳地，所述薄膜分散法包括如下步骤：
(1)将混合后的所述阳离子脂质和有机溶剂蒸干形成薄膜脂层(或称为磷脂层)；
(2)将上述薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加所述第一辅助脂质，旋转混匀即可。
进一步更佳地，当所述脂质体纳米颗粒还包括第二辅助脂质时，步骤(1)为将混合后的所述阳离子脂质、所述第二辅助脂质和有机溶剂蒸干形成薄膜脂层；和/或，步骤(1)中，所述有机溶剂为CHCl3；和/或，步骤(1)中，所述蒸干为通过氮气吹干；和/或，步骤(1)中，所述蒸干的时间为40～60分钟，例如60分钟；和/或，当所述药物包含活性物质时，步骤(2)为将所得薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加所述活性物质和所述第一辅助脂质的混合物，旋转混匀即可；和/或，步骤(2)中，所述溶解为使用醋酸钠和乙醇的混合溶液溶解；和/或，步骤(2)中，所述超声水浴的时间为1-2分钟，例如1分钟；和/或，步骤(2)中，所述旋转混匀的时间为15-30分钟，例如30分钟；和/或，所述步骤(2)后还包括透析的步骤；所述透析的透析液为PBS；所述透析的透析袋优选3.5KD透析袋；所述透析的温度为室温。
在本发明某一较佳实施例中，所述脂质体由DOTAP、DSPE-PEG2000 -MAL、胆固醇和核酸(例如DNA、mRNA和/或siRNA)组成。较佳地，其中所述的DSPE-PEG2000-MAL可用DSPE-PEG2000进行部分替换，例如所述DSPE-PEG2000-MAL中的75％、50％或25％(w/w)替换为DSPE-PEG2000。
在本发明某一较佳实施例中，所述脂质体由以下原料组成：DOTAP 443μg、DSPE-PEG2000-MAL 134μg、胆固醇239μg和核酸(例如DNA、mRNA和/或siRNA)48μg。较佳地，最终所得脂质体的浓度约为0.97mg/ml。较佳地，其中所述的DSPE-PEG2000-MAL可用DSPE-PEG2000进行部分替换，例如所述DSPE-PEG2000-MAL中的75％、50％或25％(w/w)替换为DSPE-PEG2000。
在本发明某一较佳实施例中，所述MAL官能团修饰的纳米颗粒为MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒。
本发明中，所述的聚合物纳米颗粒(例如PLGA纳米颗粒)中所含聚合物属于高分子聚合物材料，与脂质体纳米颗粒不同，他们属于并列的两种不同类型纳米药物载体。较佳地，所述MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒中所含聚合物为生物可降解的高分子化合物，优选为乳酸、乙醇酸、己内酯、羟基乙酸中的一种或至少两种的共聚物。所述共聚物的分子量可以优选为7000-17000。
更佳地，所述聚合物可以为本领域常规的聚乳酸(PLA)和/或PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)，还可以为本领域常规使用的其他聚合物例如聚己内酯(PCL)、聚-3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)等等。通常PLGA是由两种单体：乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，不同的单体比例可以制备出不同类型的PLGA，例如：PLGA 75：25表示该聚合物由75％乳酸和25％羟基乙酸组成，所述PLGA可以例如由90％乳酸和10％羟基乙酸组成，也可以是由75％乳酸和25％羟基乙酸组成，还可以是由50％乳酸和50％羟基乙酸组成。这些常规使用的PLGA(例如90/10、75/25、50/50)一般都能够应用于本发明。其中，所述PLGA的分子量还可以优选为7000-17000。在本发明某一较佳实施例中，所采用的PLGA组成比为50/50，来源为Sigma-Aldrich，分子量在7000-17000范围内。本领域技术人员应当理解的是，通常对本发明所列出的物质(例如所述阳离子脂质、辅助脂质、聚合物等)进行本领域常规的修饰，这些都应当落入到本发明的保护范围内。
其中，当所述药物包含活性物质时，所述聚合物与所述活性物质的质量比可以优选为125:1-250:1。
在本发明某一较佳实施例中，所述MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒为MAL官能团修饰的PLGA聚合物纳米颗粒。
较佳地，所述MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒还包括辅助脂质，所述辅助脂质优选连接有MAL官能团，更优选自连接了MAL官能团的PE、DOPE、DSPE、DPPE、DPPC、DSPC和PC中的一种或多种，进一步优选为连接了MAL官能团的DSPE，最优选为DSPE-PEG-MAL。其中，所述聚合物与所述辅助脂质的质量比还可以优选为1:1-4:1，更优选1.6:1。
较佳地，所述聚合物纳米颗粒的制备方法为超声乳化法。
更佳地，所述超声乳化法包括如下步骤：将与有机溶剂混合后的所述聚合物超声、旋转蒸发；然后离心后收集聚合物纳米颗粒。
进一步更佳地，当聚合物纳米颗粒还包括辅助脂质和/或当所述药物包含活性物质时，所述超声乳化法包括如下步骤：将与有机溶剂混合后的所述聚合物以及所述辅助脂质和/或所述活性物质超声、旋转蒸发；
进一步更佳地，所述有机溶剂为CHCl3；和/或，所述超声的功率90w；和/或，所述超声的时间为60s，优选每隔10s停1s；和/或，所述旋转蒸发以除去所述有机溶剂。
进一步更佳地，所述离心包括第一次离心和第二次离心。其中，所述第一次离心的时间优选为5±1min；和/或，所述第一次离心的转速优选为1100±100g；和/或，所述第二次离心的时间优选为30±5min；和/或，所述第二次离心的转速优选为30000±1000g；
进一步更佳地，所述收集为经过重悬所述离心后的上清即可。其中，所述重悬优选为用水优选双蒸水重悬；和/或，所述重悬后还优选包括第三次离心再重悬的步骤，和/或，所述第三次离心的时间优选为30±5min；和/或，所述离心的转速优选为30000±1000g，和/或，所述再重悬优选为用水优选双蒸水重悬。
较佳地，所述聚合物纳米颗粒还包括染料，优选脂溶性荧光染料，更优选DiD。其中，所述染料的含量与PLGA质量比优选为0.1％～2％。
本发明中，所述纳米颗粒可以是经静脉给药后实现心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞中核酸等活性物质递送的方式。
在本发明某一较佳实施例中，所述聚合物纳米颗粒由以下原料组成：PLGA 10g、DSPE-PEG2000-MAL 6.25g，优选按照本领域常规的制备方法(例如超声乳化法)制得。
本发明某一方面还提供了一种MAL官能团修饰的纳米颗粒在靶向心脏递送中的应用。较佳地，所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒如前所述。
本发明某一方面还提供了一种将活性物质递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞中的方法，其包括将活性物质以MAL官能团修饰的纳米颗粒的形式进行递送。较佳地，所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒如前所述。
本发明某一方面还提供了一种靶向心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞递送的纳米颗粒，所述纳米颗粒为MAL官能团修饰的纳米颗粒。较佳地，所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒如前所述。
本发明某一方面还提供了一种治疗心脏相关疾病的方法，其包括使用MAL官能团修饰的纳米颗粒将治疗心脏相关的药物递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞中。较佳地，所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒如前所述。
本发明还提供了一种治疗心脏移植(免疫)排斥的方法，其包括使用MAL官能团修饰的纳米颗粒将治疗心脏相关的药物(可以是抑制免疫排斥反应的药物)递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞中。较佳地，所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒如前所述。MAL官能团修饰的纳米颗粒还能够应用于移植免疫中靶向心脏移植物中核酸等活性物质的递送，并且可通过使所述纳米颗粒携带相关抑制免疫排斥反应药物从而抑制受体免疫系统对正常心脏尤其是心肌组织的排斥反应，保护正常心脏尤其是心肌组织，延长移植组织的存活时间。
本发明中，所述“包括”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；也可以是指“由……组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：将本发明所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒(例如脂质体纳米颗粒或聚合物纳米颗粒)应用于靶向心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞递送中时，能够有效地将核酸等活性物质成功递送至心脏尤其是心肌组织优选心肌细胞等组织细胞中；并且该MAL官能团修饰的纳米颗粒的粒径小、包载率较高(可达60％)、成分简单、制备方法简单易行，具备良好的生物安全性和临床应用的可行性，便于工业化生产。此外，本发明所述的MAL官能团修饰的纳米颗粒能够应用于移植免疫中靶向心脏移植物中核酸等活性物质的递送，并且可通过使所述纳米颗粒携带相关抑制免疫排斥反应药物从而抑制受体免疫系统对正常心脏尤其是心肌组织的排斥反应，保护正常心脏尤其是心肌组织，延长移植组织的存活时间。
附图说明
图1A为不同官能团修饰的纳米颗粒表征，其包载核酸为GFP质粒。
图1B为不同官能团修饰的纳米颗粒表征，其包载核酸为siRNA。
图1C为包载了GFP质粒DNA的脂质体和游离GFP质粒DNA的电泳图，由此可计算出DNA包载率为60％。
图2为小鼠尾静脉注射DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体后C57BL/6小鼠心脏的DiD荧光强度统计结果。
图3A为小鼠尾静脉注射DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体后C57BL/6小鼠心肌切片激光共聚焦观察结果。
图3B为小鼠尾静脉注射DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体后BABL/c小鼠心肌切片激光共聚焦观察结果。
图4为DiD标记的MAL脂质体尾静脉注射后C57BL/6小鼠心脏与心脏移植物的DiD荧光强度的分布。
图5为移植3天后DiD标记的MAL修饰PEG脂质体尾静脉注射后C57BL/6小鼠心脏移植物心肌切片的激光共聚焦结果。
图6为DiD标记的MAL修饰PEG脂质体尾静脉注射后C57BL/6小鼠同种异基因心脏移植物心肌切片的激光共聚焦。
图7为使用不同浓度的MAL修饰PEG脂质体C57BL/6小鼠心肌切片激光共聚焦观察结果。
图8为MAL DSPE-PEG修饰的PLGA-MAL纳米颗粒在心脏组织中的分布情况，该纳米颗粒在心脏组织中富集。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中，所用GFP质粒的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所用RFP mRNA的序列如SEQ ID NO:2所示。所述质粒DNA通过QIANGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit质粒提取试剂盒提取，mRNA采用体外转录的方式合成，体外转录试剂购于ambion。
实施例1和对比例1-3
(一)脂质体的制备
(1)材料：
DOTAP(2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵，SIGMA) 10mg/ml的浓度，溶解于CHCl3
Cholesterol(胆固醇，SIGMA) 5mg/ml的浓度，溶解于CHCl3
DiD(Molecular Probes) 5mg/ml的浓度，溶解于DMSO
DSPE-PEG2000-MAL(实施例1)/DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3)
(均购于西安瑞禧生物技术有限公司) 均为10mg/mL的浓度，溶解于H2O
DNA/siRNA/mRNAstock solution 8μg/μL的浓度，溶解于H2O(以siRNA浓度为例)
(2)溶液：
Buffer A:200mM醋酸钠溶液；pH＝5.2
Buffer B:EtOH(乙醇):Buffer A＝9:1(v/v)
(3)实验步骤：
1)将按上述浓度溶于CHCl3的脂质DOTAP和Cholesterol、CHCl3(其用于整个脂质分子浓度的调节)、溶于DMSO的DiD这4种按照以下的比例一起加入至10ml的玻璃样品瓶内，通过氮气吹干1小时形成薄膜脂层。其中，
DOTAP 44.3μl(443μg)
Cholesterol 47.8μl(239μg)
CHCl3 67.9μl
DiD 1.7μl(8.5μg)，占DOTAP和Cholesterol总质量的1.25％(w/w)DOTAP：Cholesterol＝1：1(molar ratio)(DOTAP分子量为698.542g/mol：Cholesterol分子量为386.6535g/mol)。
2)以168μl Buffer B溶液溶解上述脂质薄层，同时超声水浴1分钟。
3)按照以下比例向步骤2中所得脂质中滴加核酸(DNA/siRNA/mRNA)和DSPE-PEG-MAL2000的混合物(用DEPC水补足)，旋转混匀30分钟。
核酸(DNA/siRNA/mRNA) 48μg
DSPE-PEG2000-MAL(实施例1)/DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3) 均为134μg(13.4μl)
DEPC(Diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)H2O add to 378μl
4)将上述样品转移至3.5KD透析袋内，以PBS室温透析2小时。透析之后所得脂质体的浓度约为0.97mg/ml。
5)经小鼠(小鼠均购置于北京维通利华，8周龄左右给药，给药时体重均在20g左右)尾静脉给药500μl每只。
以下所用脂质体均按上述制备方法制得。此外，本发明中所用的脂质体也可根据现有技术的方法来进行制备，例如CN110548007A中所公开的制备方法。
(二)MAL脂质体纳米颗粒的表征
在三个时间段检测第(一)部分所得纳米颗粒的表征，分别是：室温透析2小时后、4℃过夜保存以及4℃保存一周，结果均无差异。具体结果如图1所示，其是通过Zeta sizerNano S90测得的不同官能团修饰的纳米颗粒表征。其中，PEG组代表滴加了DSPE-PEG2000的组(对比例1)，NH2组代表滴加了DSPE-PEG2000-NH2的组(对比例2)，COOH组代表滴加了DSPE-PEG2000-COOH的组(对比例3)，MAL组代表滴加了DSPE-PEG-MAL2000的组(实施例1)。图1A中的脂质体纳米粒测定尺寸和zeta电位时，所包载核酸为GFP质粒，为4℃过夜时的样品，包载其他核酸(如siRNA)所得脂质体性质与包载GFP质粒的脂质体性质基本一致，具体如图1B所示(同样为4℃过夜时的样品)。由图1A和图1B可知，实施例1的MAL组所得脂质体的粒径约在200nm左右；MAL组所得脂质体的Zeta电位约为15mV左右。根据图1C可计算出脂质体中GFP质粒DNA的包载效率为60％。
(三)MAL脂质体向小鼠心脏特别是心肌组织内递送siRNA
(1)本部分中所用N.C.siRNA序列如下所示(由苏州贝信生物技术有限公司合成)：
Sense(正义链)：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:3)
Anti-sense(反义链)：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO:4)。
(2)将通过第(一)部分所述方法得到的荧光染料DiD标记的不同官能团(DSPE-PEG-MAL2000(实施例1)/DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3))修饰的PEG脂质体(按第(一)部分所述方法制备)通过尾静脉注射(500μl每只)打入C57BL/6小鼠体内。24h后，脱颈处死小鼠，分离小鼠主要组织器官，通过本领域常规的小动物活体成像技术(使用小动物活体成像仪检测)检测心脏器官中的DiD荧光强度。
图2(注射的是转染了GFP质粒的脂质体)给出了小鼠尾静脉注射DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体后C57BL/6小鼠心脏的DiD荧光强度的统计结果(由于心肌细胞中检测不到GFP荧光，故此处检测的是DiD荧光强度)。结果显示，注射了DiD标记的MAL脂质体后(实施例1)，小鼠心脏中DiD荧光强度明显高于其他组(对比例1-3)，荧光强度较其他组均高出2倍以上(图2中的2k即指PEG分子量为2k)。
图3A(注射的是含有GFP质粒的脂质体。图3A是冰冻切片经DiD、鬼笔环肽(phalloidin)和DAPI染色后直接Merged合并的图片)给出了DiD标记的不同官能团修饰PEG脂质体后C57BL/6小鼠心肌组织切片的激光共聚焦(按照本领域常规实验操作进行)结果。图中的鬼笔环肽(phalloidin)染色和DAPI染色均按本领域常规步骤进行，其中AlexaFluorTM 488Phalloidin、Alexa FluorTM 555Phalloidin均购于molecular probes；DAPI-Fluoromount-G荧光封片剂购于SouthernBiotech，phalloidin按1:40(体积比，PBS溶液稀释)稀释到工作浓度，4℃避光染色半小时即可。含DAPI的封片剂直接封片过夜晾干即可。其中，DiD为标记脂质体的染料。Phalloidin染色主要用于与心脏组织的细胞中聚合的微丝结合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布，主要用于细胞的骨架染色。DAPI即DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，主要是一种能够与DNA、RNA强力结合的荧光染料，用于追踪核酸。结果显示，注射了DiD标记的MAL脂质体后(实施例1)，小鼠心肌组织中DiD荧光分布明显高于其他组(对比例1-3)。本发明人在BABL/c小鼠中也进行了相同的实验，实验结果如图3B所示，其荧光表达与图3A类似。
由上述实验可以得出：通过DSPE-PEG2000-MAL修饰的脂质体，可以特异性的分布在心脏特别是心肌组织例如心肌细胞内。同时可以递送多种核酸到心肌细胞内表达。而其它官能团修饰的脂质体颗粒(如DSPE-PEG2000(对比例1)/DSPE-PEG2000-NH2(对比例2)/DSPE-PEG2000-COOH(对比例3))进入心脏特别是心肌组织例如心肌细胞效率明显低于DSPE-PEG2000-MAL修饰的脂质体。
(3)接着，将荧光染料DiD标记的MAL修饰的PEG脂质体通过尾静脉注射打入接受同种同基因C57BL/6小鼠或同种异基因BALB/c小鼠供体来源的心脏移植C57BL/6小鼠体内。其中，SPF级BALB/c与C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠心脏移植模型的制备方法参考文献：Corry RJ,Winn HJ,Russell PS.Primarily vascularizedallografts of hearts in mice.The role of H-2D,H-2K,and non-H-2antigens inrejection.Transplantation.1973；16:343-350。24h后，脱颈处死小鼠，分离小鼠主要组织器官，通过小动物活体成像检测不同组织器官中的DiD荧光强度。
图4(注射的是含有siRNA的脂质体，PBS组即未注射任何脂质体的空白对照组，1、2、3分别代表三只小鼠)给出了DiD标记的MAL脂质体尾静脉注射后，受体心脏组(受体小鼠C57BL/6自身的心脏)与心脏移植物(左右图分别是上述同种同基因C57BL/6小鼠供体来源的心脏移植C57BL/6小鼠的心脏移植物，和同种异基因BALB/c小鼠供体来源的心脏移植C57BL/6小鼠的心脏移植物)的DiD荧光强度的分布结果。结果显示，注射了DiD标记的MAL脂质体后，小鼠心脏移植物心肌组织中DiD荧光分布明显高于PBS对照组。同时，同种异基因小鼠供体来源的心脏移植物中DiD荧光分布明显高于同种同基因小鼠供体来源的心脏移植物(心脏移植物是指移植后的心肌组织)。
图5(注射的是含有siRNA的脂质体。与图3A类似，图5是冰冻切片经DiD、phalloidin和DAPI染色后直接Merged的图片)给出了移植3天后DiD标记的MAL修饰PEG脂质体尾静脉注射后C57BL/6小鼠心脏移植物心肌切片的激光共聚焦结果。结果显示，注射了DiD标记的MAL脂质体后，小鼠心肌组织中DiD荧光分布明显高于对照组。同时，同种异基因小鼠供体来源心脏移植物心肌切片中DiD荧光分布明显高于同种同基因小鼠供体来源心脏移植物。
由上述结果可以看出，MAL修饰的脂质体在同种异基因心脏移植物中相对于同种同基因心脏移植物中更多的富集，显示出与心脏移植免疫排斥的正相关性，能够应用于移植免疫中靶向心脏移植物中核酸药物的递送，对抑制免疫排斥、延长移植物生存期存在重大意义。
图6(注射的是含有siRNA的脂质体，NP-Did指Did标记的脂质体)。给出了移植后第3天、第7天的DiD标记的MAL修饰PEG脂质体尾静脉注射后C57BL/6小鼠心脏移植物心肌切片的激光共聚焦结果。结果显示，在小鼠心脏移植物(来自同种异基因BALB/c小鼠移植到C57BL/6小鼠受体的心脏移植物)的正常心肌组织(虚线左侧和上侧)中DiD荧光分布明显高于异常心肌组织(虚线右下侧)(正常心肌组织与异常心肌组织中，不同心肌部位破坏程度不同，因此存在正常组织与破坏严重异常组织)中。实验结果表明，MAL修饰PEG脂质体能够通过尾静脉注射后将siRNA递送到C57BL/6正常心肌组织内。由MAL修饰脂质体能够富集于正常心肌组织中可见，未来可通过携带相关抑制免疫排斥反应药物能够抑制受体免疫系统对正常心肌组织的排斥反应，保护正常心肌组织，延长移植物存活时间。
(4)图7为使用不同浓度的MAL修饰PEG脂质体时C57BL/6小鼠心肌切片激光共聚焦观察结果。具体为：在合成MAL脂质体时，将部分DSPE-PEG-MAL2K(简称MAL2K)替换成DSPE-PEG2K(简称PEG2K)。75％(w/w)MAL即MAL2K：PEG2K＝3：1；50％MAL即MAL2K：PEG2K＝1：1；25％MAL即MAL2K：PEG2K＝1：3，其余步骤均按照上述进行。通过包载DiD染料(与图3分布实验条件一致)经激光共聚焦显微镜拍摄仍可发现进入心肌组织的脂质体纳米颗粒。说明不同比例的MAL(25％～100％，优选100％)修饰的脂质体颗粒均可进入心肌组织。
实施例2MAL官能团修饰的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA))聚合物纳米颗粒的制备
1.材料：
PLGA(Sigma-Aldrich，由50％乳酸和50％羟基乙酸组成)100mg/ml的浓度，溶解于CHCl3
DiD(Molecular Probes) 5mg/ml的浓度，溶解于DMSO DSPE-PEG2000-MAL(购于西安瑞禧生物技术有限公司) 10mg/mL的浓度，溶解于H2O
DNA/siRNA/mRNA stock solution溶解于H2O
2.步骤
(1)吸取2μL DiD溶液、100μL PLGA溶液与398μL CHCl3加入50mL离管中，再加入DSPE-PEG2000-MAL溶液625μL与2.375mL ddH2O。有机相(CHCl3)：水相(ddH2O)＝1:6(v/v)(核酸DNA/siRNA/mRNA通常在此步骤中添加即可，核酸的用量为本领域常规(通常PLGA/核酸质量比可以为125:1-250:1)，本发明人经过实验可知，PLGA纳米颗粒可以不添加核酸，合成时PLGA与辅助脂质含量不受其他影响，同时不影响该纳米颗粒进入心脏递送的效果)。
(2)混匀超声，每10s停1s，共60s，功率90w。将超声后的溶液转入50mL圆底烧瓶中，旋转蒸发去除CHCl3。
(3)将旋蒸后的溶液转入离管中，1100g离5min。吸取上清
(4)上一步上清溶液，30000g离30min。
(5)去除上清，1mL ddH2O重悬沉淀。30000g离30min。
(6)弃上清，ddH2O重悬纳米颗粒，4℃保存。
以下所用聚合物纳米颗粒按上述制备方法制得。此外，本发明中所用的聚合物纳米颗粒也可根据现有技术的方法来进行制备或者通过商购获得。
实施例3MAL官能团修饰的PLGA聚合物纳米颗粒向小鼠心脏特别是心肌细胞核酸递送体系
具体操作步骤如实施例1所示。图8为DiD标记的MAL-DSPE-PEG修饰后的PLGA纳米颗粒通过尾静脉注射到C57BL/6小鼠体内后在小鼠心脏内的分布。激光共聚焦结果显示，DSPE-PEG2000-MAL修饰后的PLGA聚合物纳米颗粒也能分布于C57BL/6小鼠心肌组织中。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学第一医院
<120> MAL官能团修饰的纳米颗粒在靶向心脏递送中的应用
<130> P19015352C
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7572
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP质粒的DNA序列
<400> 1
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
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gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620
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cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740
aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860
tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc tagcatggtg 1920
agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 1980
gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 2040
ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 2100
accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 2160
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 2220
gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 2280
cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 2340
gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 2400
aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 2460
taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 2520
agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 2580
gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaggatcc 2640
gcggccgcgc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata 2700
aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt 2760
gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 2820
cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 2880
ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 2940
caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 3000
ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 3060
attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 3120
gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc 3180
gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgataa tacctccgga atgattgaac 3240
aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 3300
gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 3360
gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg 3420
cagcgcggct atcgtggctg gccgcgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 3480
tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 3540
catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 3600
atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 3660
cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 3720
ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc 3780
tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 3840
ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 3900
ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 3960
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 4020
tctgagtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 4080
actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcgt 4140
taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 4200
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 4260
ttatcatgtc tggaattgac tcaaatgatg tcaattagtc tatcagaagc tcatctggtc 4320
tcccttccgg gggacaagac atccctgttt aatatttaaa cagcagtgtt cccaaactgg 4380
gttcttatat cccttgctct ggtcaaccag gttgcagggt ttcctgtcct cacaggaacg 4440
aagtccctaa agaaacagtg gcagccaggt ttagccccgg aattgactgg attccttttt 4500
tagggcccat tggtatggct ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag 4560
cagcgagaag cgttcagagg aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc 4620
ccgcacgctg ccggctcggg gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg 4680
gctcgctgct gccccctagc gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg 4740
gggctgtccc tgatatctat aacaagaaaa tatatatata ataagttatc acgtaagtag 4800
aacatgaaat aacaatataa ttatcgtatg agttaaatct taaaagtcac gtaaaagata 4860
atcatgcgtc attttgactc acgcggtcgt tatagttcaa aatcagtgac acttaccgca 4920
ttgacaagca cgcctcacgg gagctccaag cggcgactga gatgtcctaa atgcacagcg 4980
acggattcgc gctatttaga aagagagagc aatatttcaa gaatgcatgc gtcaatttta 5040
cgcagactat ctttctaggg ttaatctagc tgcatcagga tcatatcgtc gggtcttttt 5100
tccggctcag tcatcgccca agctggcgct atctgggcat cggggaggaa gaagcccgtg 5160
ccttttcccg cgaggttgaa gcggcatgga aagagtttgc cgaggatgac tgctgctgca 5220
ttgacgttga gcgaaaacgc acgtttacca tgatgattcg ggaaggtgtg gccatgcacg 5280
cctttaacgg tgaactgttc gttcaggcca cctgggatac cagttcgtcg cggcttttcc 5340
ggacacagtt ccggatggtc agcccgaagc gcatcagcaa cccgaacaat accggcgaca 5400
gccggaactg ccgtgccggt gtgcagatta atgacagcgg tgcggcgctg ggatattacg 5460
tcagcgagga cgggtatcct ggctggatgc cgcagaaatg gacatggata ccccgtgagt 5520
tacccggcgg gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 5580
tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 5640
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 5700
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 5760
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 5820
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 5880
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 5940
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 6000
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 6060
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 6120
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 6180
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 6240
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 6300
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 6360
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 6420
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 6480
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 6540
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 6600
agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 6660
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 6720
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 6780
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 6840
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 6900
cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 6960
ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 7020
cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 7080
ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 7140
cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 7200
ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 7260
tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 7320
ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 7380
aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 7440
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 7500
gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 7560
ttgaatactc at 7572
<210> 2
<211> 6085
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RFP mRNA的序列
<400> 2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattcgcc 960
accatggcct tctccgagga cgtcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 1020
ggctccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 1080
ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 1140
atcctgtccc ctcagttcca gtacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc 1200
cccgactact tgaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 1260
gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc 1320
tacaaggtga agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag 1380
accatgggct gggaggcctc caccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc 1440
gagatcaaga tgaggctgaa gctgaaggac ggcggccact acgacgccga ggtcaagacc 1500
acctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acaagaccga catcaagctg 1560
gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg cgccgagggc 1620
cgccactcca ccggcgcctg actcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc 1680
tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 1740
accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 1800
tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 1860
gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg 1920
gaaagaacca gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc 1980
gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc 2040
gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct 2100
ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa 2160
aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc 2220
cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca 2280
ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat 2340
tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt 2400
gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2460
atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 2520
tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc 2580
cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta 2640
tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct 2700
tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat 2760
ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 2820
gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 2880
gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 2940
agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 3000
tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 3060
actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 3120
ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 3180
cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 3240
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 3300
tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 3360
atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 3420
gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 3480
aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 3540
attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 3600
gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 3660
cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 3720
ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta 3780
taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 3840
gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc 3900
gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 3960
tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc 4020
ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 4080
aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 4140
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 4200
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 4260
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 4320
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 4380
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 4440
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 4500
cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 4560
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 4620
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 4680
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 4740
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct 4800
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 4860
tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 4920
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 4980
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 5040
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 5100
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 5160
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 5220
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 5280
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 5340
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 5400
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 5460
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 5520
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 5580
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 5640
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 5700
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 5760
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 5820
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 5880
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 5940
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 6000
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 6060
tccccgaaaa gtgccacctg acgtc 6085
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-sense（反义链）
<400> 3
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense（正义链）
<400> 4
uucuccgaac gugucacgut t 21

Claims (10)

1.一种MAL官能团修饰的纳米颗粒在制备靶向心脏递送的药物或药物载体中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向心脏递送为靶向心肌组织递送，优选靶向心肌细胞递送；
和/或，所述纳米颗粒为长循环纳米颗粒，优选为经PEG或其衍生物修饰的长循环纳米颗粒；所述PEG的相对分子质量优选为2000-5000，例如为2000、3000、4000或5000。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗心脏移植的药物，优选为抑制移植心脏免疫排斥反应的药物；
和/或，所述药物包含活性物质，所述活性物质优选为生物类活性物质，更优选核酸、多肽和/或蛋白质；所述核酸优选为DNA和/或RNA，所述RNA优选为siRNA和/或mRNA。
4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述MAL官能团修饰的纳米颗粒为MAL官能团修饰的脂质体纳米颗粒和/或MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述MAL官能团修饰的脂质体纳米颗粒包括阳离子脂质和第一辅助脂质，所述第一辅助脂质连接有MAL官能团；
较佳地，所述阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DODMA、DOSPA、DTAB、TTAB、CTAB、DDAB、DORI、DORIE、DPRIE、DSRIE、DMRIE、DOGS、DOSC、CD-Chol、LPLL和SA中的一种或多种，优选DOTAP；
和/或，所述第一辅助脂质选自连接了MAL官能团的PE、DOPE、DSPE、DPPE、DPPC、DSPC和PC中的一种或多种，优选为连接了MAL官能团的DSPE，更优选为DSPE-PEG-MAL；
和/或，所述第一辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比为1:14～1:55；
和/或，所述脂质体纳米颗粒还包括第二辅助脂质，其未连接MAL官能团，所述第二辅助脂质优选自胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-NH2、DSPE-PEG-COOH、PE、DOPE、DPPE、DPPC、DSPC和PC中的一种或多种，优选胆固醇和/或DSPE-PEG；所述第二辅助脂质与所述阳离子脂质的摩尔比优选为1:2～2:1，更优选为1:1；
和/或，所述脂质体纳米颗粒还包括染料，优选脂溶性荧光染料，更优选DiD；
和/或，所述脂质体纳米颗粒的粒径为160nm～250nm，优选200nm。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述脂质体纳米颗粒的制备方法为薄膜分散法；
较佳地，所述薄膜分散法包括如下步骤：
(1)将混合后的所述阳离子脂质和有机溶剂蒸干形成薄膜脂层；
(2)将所得薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加所述第一辅助脂质，旋转混匀即可；
更佳地，当所述脂质体纳米颗粒还包括第二辅助脂质时，步骤(1)为将混合后的所述阳离子脂质、所述第二辅助脂质和有机溶剂蒸干形成薄膜脂层；
和/或，步骤(1)中，所述有机溶剂为CHCl3；
和/或，步骤(1)中，所述蒸干为通过氮气吹干；
和/或，步骤(1)中，所述蒸干的时间为40～60分钟；
和/或，当所述药物包含活性物质时，步骤(2)为将所得薄膜脂层溶解并超声水浴，滴加所述活性物质和所述第一辅助脂质的混合物，旋转混匀即可；
和/或，步骤(2)中，所述溶解为使用醋酸钠和乙醇的混合溶液溶解；
和/或，步骤(2)中，所述超声水浴的时间为1-2分钟；
和/或，步骤(2)中，所述旋转混匀的时间为15-30分钟；
和/或，所述步骤(2)后还包括透析的步骤；所述透析的透析液为PBS；所述透析的透析袋优选3.5KD透析袋；所述透析的温度为室温。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒中所含聚合物为生物可降解的高分子化合物，优选为乳酸、乙醇酸、己内酯、羟基乙酸中的一种或至少两种的共聚物；
较佳地，所述聚合物为PCL、PLA和/或PLGA；所述PLGA例如由90％乳酸和10％羟基乙酸组成，或由75％乳酸和25％羟基乙酸组成，或50％乳酸和50％羟基乙酸组成；所述PLGA的分子量优选为7000-17000；当所述药物包含活性物质时，所述聚合物与所述活性物质的质量比优选为125:1-250:1。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述MAL官能团修饰的聚合物纳米颗粒还包括辅助脂质，所述辅助脂质优选连接有MAL官能团，更优选自连接了MAL官能团的PE、DOPE、DSPE、DPPE、DPPC、DSPC和PC中的一种或多种，进一步优选为连接了MAL官能团的DSPE，最优选为DSPE-PEG-MAL；所述聚合物与所述辅助脂质的质量比优选为1:1-4:1，更优选1.6:1。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述聚合物纳米颗粒的制备方法为超声乳化法；
较佳地，所述超声乳化法包括如下步骤：将与有机溶剂混合后的所述聚合物超声、旋转蒸发；然后离心后收集聚合物纳米颗粒；
更佳地，当聚合物纳米颗粒还包括辅助脂质和/或当所述药物包含活性物质时，所述超声乳化法包括将与有机溶剂混合后的所述聚合物以及所述辅助脂质和/或所述活性物质超声、旋转蒸发的步骤；和/或，所述有机溶剂为CHCl3；
和/或，所述超声的功率90w；
和/或，所述超声的时间为60s，优选每隔10s停1s；
和/或，所述旋转蒸发以除去所述有机溶剂；
和/或，所述离心包括第一次离心和第二次离心，所述第一次离心的时间优选为5±1min；所述第一次离心的转速优选为1100±100g；所述第二次离心的时间优选为30±5min；所述第二次离心的转速优选为30000±1000g；
和/或，所述收集为经过重悬所述离心后的上清即可，所述重悬优选为用水优选双蒸水重悬；所述重悬后还优选包括第三次离心再重悬的步骤，所述第三次离心的时间优选为30±5min；转速优选为30000±1000g，所述再重悬优选为用水优选双蒸水重悬。
10.如权利要求7～9任一项所述的应用，其特征在于，所述聚合物纳米颗粒还包括染料，优选脂溶性荧光染料，更优选DiD。
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