CN112301052A - 一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法以及由此得到的诱导多功能干细胞。该方法包括将因子Oct4和Nanog作为重编程诱导因子导入体细胞后进行重编程；然后，将部分或完全重编程的体细胞培养在含有特定化学诱导剂的培养基中以得到诱导多功能干细胞。在本发明中，重编程诱导因子的不同存在形式和作为化学诱导剂的三种小分子化合物的组合能够显著提高人体细胞的重编程效率，并降低所获诱导多功能干细胞的致瘤性。

Description

一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法以及由此得到的诱导多功能干细胞。
背景技术
2006年，Yamanaka团队发明了一种由Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因构成的Cocktail，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞通过转基因方式重编程成为诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。该方法技术相对简单和稳定，突破了在医学上使用人胚胎干细胞的道德伦理限制，可以解决细胞移植治疗中的免疫排斥问题，很大程度上拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。
此外，iPSCs的技术在细胞替代性治疗、发病机制的研究、新药筛选等方面具有巨大的潜在价值。然而，随着生成iPSCs的技术的发展，其弊端和问题也逐渐凸显，如部分重编程的不完全性、诱导效率低下、原癌基因的致癌性等。因此，研究者们试图寻找Yamanaka四因子的替代者并尝试优化重编程系统，如替换具有致瘤性的转录因子、添加提高重编程效率的转录因子或化合物，甚至完全摈弃转录因子而使用小分子化合物诱导重编程，从而在一定程度上避免潜在缺陷。
同时，多个小分子化合物已被发现能诱导iPSCs产生，但重编程效率较低，而且比较耗时，难以满足临床需求。这些小分子有的是通过抑制基因组甲基化作用，直接提高受体细胞被诱导的效率；有的则通过影响特定的信号通路，使诱导过程中产生的中间过渡型细胞和部分重编程的细胞转化为稳定的完全的多能干细胞。
迄今为止，研究组已经在许多种不同类型的细胞上尝试了重编程技术，并取得了成功。甚至包括利用四因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的蛋白和RNA都能实现成功的重编程得到iPSCs。
因此，提供一种来源广泛的细胞，通过添加重编程诱导因子或重编程诱导因子的不同形式载体，及小分子化合物组合一起诱导重编程得到iPSCs，并能提高重编程效率，且操作简单、安全高效的制备方法具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞(iPSCs)的方法。
本发明的另一个目的是提供一种通过上述方法制备的诱导多功能干细胞(iPSCs)。
本发明方法中，将因子Oct4和Nanog作为重编程诱导因子导入体细胞后进行重编程，进一步将部分或完全重编程的体细胞培养在含有特定化学诱导剂的培养基中，最终得到诱导多功能干细胞。其中，所述化学诱导剂为多种小分子化合物的特定组合，共同诱导产生多潜能干细胞。
因此，一方面，本发明提供了一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法，包括：将Oct4和Nanog作为重编程诱导因子导入体细胞后进行重编程；然后，将部分或完全重编程的体细胞培养在含有化学诱导剂的培养基中以得到诱导多功能干细胞，其中，所述化学诱导剂包括TGFβ受体抑制剂616452、环AMP(cAMP)激动剂Forskolin和糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2。
TGFβ受体抑制剂616452的化学名称为[2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶](2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine，CAS No:446859-33-2)。
环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的化学名称为[(3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-3-乙烯基-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-5,6,6a,8,9,10-六氢-2H-苯并[f]色烯-5-基]乙酸酯([(3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-3-ethenyl-6,10,10b-trihydroxy-3,4a,7,7,10a-pentamethyl-1-oxo-5,6,6a,8,9,10-hexahydro-2H-benzo[f]chromen-5-yl]acetate,CAS No:66575-29-9)。
糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的化学名称为6,7,9,10,12,13,15,16,18,19-十氢-5,29:20,25-二甲烯-26H-二苯并[n,t]吡咯[3,4-q][1,4,7,10,13,22]四氧杂二氮杂四环素-26,28(27H)-二酮(6,7,9,10,12,13,15,16,18,19-Decahydro-5,29:20,25-dimetheno-26H-dibenzo[n,t]pyrrolo[3,4-q][1,4,7,10,13,22]tetraoxadiazacyclotetracosine-26,28(27H)-dione，CAS No:436866-52-3)。
在本发明方法中，优选地，作为重编程诱导因子的Oct4和Nanog可以以载体上携带的DNA的形式，以其mRNA的形式，或者以其蛋白产物的形式导入体细胞中。
在本发明方法中，可以在体外表达上述Oct4和Nanog诱导因子，获得相应的蛋白质后，导入到分化的细胞中，从而实现本发明的目的。将蛋白质导入到细胞中的技术在本领域中是公知的，包括但不限于Tat-delivery及相关技术，电转(核转染)，基因枪，SLO细胞通透，蛋白和细胞配体结合。
本领域的普通技术人员也可以理解，可以将上述Oct4和Nanog诱导因子的mRNA直接导入到分化的细胞中，使其在细胞中表达产生相应的蛋白，从而实现本发明的目的。将mRNA导入到细胞中的技术与将蛋白质导入到细胞中的技术相类似，并且在本领域中是公知的。
在本发明方法中，优选地，所述体细胞可以是本领域已知的任何分化的细胞，例如，皮肤来源的细胞，血液来源的细胞，也可以包括尿液来源的细胞，肝细胞，上皮细胞，胃细胞，角质细胞等。更优选地，所述皮肤来源的细胞可以是皮肤成纤维细胞。更优选地，所述血液来源的细胞可以是红系祖细胞。
在本发明方法中，优选地，所述体细胞来源于人，即为人类体细胞。
在本发明方法中，优选地，所述TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为0.1-20μM，更优选5-10μM，还更优选5μM。
在本发明方法中，优选地，所述环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的工作浓度为0.1-50μM，更优选2-20μM，还更优选10μM。
在本发明方法中，优选地，所述糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的工作浓度为0.1-20μM，更优选2-10μM，还更优选5μM。
在本发明方法中，优选地，所述“将Oct4和Nanog作为重编程诱导因子导入体细胞后进行重编程”为：将含有Oct4和Nanog重编程诱导因子的载体通过电转或化学转染的方式转入体细胞后进行重编程；或者，将含有以RNA形式存在的Oct4和Nanog重编程诱导因子的病毒Sendai Virus与细胞混合培养。其中，电转方式可为在细胞悬液中加入含有诱导因子Oct4和Nanog的重编程载体，混匀后加入电转杯中，将电转杯置于电转仪中，进行电转。
在本发明方法中，优选地，自重编程诱导因子导入后第2天开始在培养基中添加上述特定化学诱导剂。
另一方面，本发明提供了一种诱导多功能干细胞，其通过上述方法得到。
在本发明中，重编程诱导因子的不同存在形式和作为化学诱导剂的三种小分子化合物的组合能够显著提高人类体细胞的重编程效率，并降低所获iPSCs的致瘤性。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将通过具体实施例进一步对本发明的技术方案进行说明。本领域的普通技术人员可以理解本发明并不限于所述实施例，并且本领域的普通技术人员可以基于说明书的教导对实施例进行修改。这些修改同样包含在本发明由后附的权利要求所定义的本发明的范围内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
1.1将来源于人的皮肤组织放入培养皿中，用4℃预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)快速反复漂洗4次。
1.2用灭菌后的眼科剪和手术刀处理皮肤组织，使白色皮下脂肪去除，拨离表皮及皮下组织，留下真皮层，得到预处理的皮肤组织。将预处理的皮肤组织转移到培养基中后，切成小块，得到边缘整齐的皮肤组织块。
1.3取3mL的胎牛血清(FBS)均匀加到6孔细胞培养板的每孔后，放入皮肤组织块放置培养箱孵育0.5-1h，使组织粘在培养板底部。
1.4在6孔细胞培养板中加入1mL含有20％(v/v)FBS的DMEM(Gibco)培养基，放回培养箱培养。
1.5显微镜下观察到有成纤维细胞爬出时即可换液，将DMEM培养基的量增加至3mL，每隔1-3天更换培养基。
1.6待成纤维细胞在每个培养孔中汇合到孔的边缘时，弃旧培养基，PBS洗2遍，加入1mL的0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)，细胞培养箱内放置约4～6min，待细胞变圆脱落、漂浮时，立即加入含有20％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化，将细胞轻轻吹起后转移至15mL离心管，200g离心3min，吸弃上清液，加入细胞培养基混匀，转移细胞至培养瓶中，置于细胞培养箱中继续培养。
1.7当第2代皮肤成纤维细胞融合率达到80％-90％，弃旧培养基，细胞用PBS洗两遍后，加入3mL 0.25％的胰酶-EDTA(Gibco)消化至细胞分散，加入含有20％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化，将细胞轻轻吹起后转移至15mL离心管，200g离心3min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞，血球计数板计数。
1.8取约8×105皮肤成纤维细胞，200g离心3min，PBS洗2遍，OPTI-MEM(Gibco)洗一遍，弃上清，按Celetrix Kit试剂盒说明书，加入相应电转液试剂，重悬细胞，在细胞悬液中加入含有诱导因子Oct4和Nanog的重编程载体，混匀后加入电转杯中，将电转杯置于电转仪中，以430V，30ms，进行电转。
其中，所述重编程载体构建方法如下：①以质粒(Addgen#20922)为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F1/R1、F2/R2、F3/R3分别扩增得到EF-1α、OCT4和NANOG片段(引物序列和扩增后的序列见下表1)。②以pcDNA3.1(-)质粒为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F4/R4扩增得到pcDNA3.1片段(引物序列和扩增得到的序列见下表1)。③用NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle for LargeFragments(NEB#E2623)，通过同源重组的方式将pcDNA3.1与EF-1α、OCT4和NANOG连接，即得到目的载体，即pcDNA3.1-EF-OCT4-NANOG(载体序列见下表2)。
1.9电转结束后，取出电转杯，迅速将细胞悬液吸出加入铺好Matrigel(Corning)的细胞培养板内，培养板中提前加入2mL含20％(v/v)FBS的DMEM培养基。第2天，更换为2～3mL TeSR-E7培养基(Stem Cell Technologies)，37℃细胞培养箱静置培养。此后每天进行全量换液。其中第2天开始使用的培养基中含有小分子化合物组合，小分子化合物的工作浓度如下：TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为5μM，环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的工作浓度为10μM，糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的工作浓度为5μM。
第12天左右出现iPSC样克隆。
实施例2
2.1将来源于人的皮肤组织放入培养皿中，用4℃预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)快速反复漂洗4次。
2.2用灭菌后的眼科剪和手术刀处理皮肤组织，使白色皮下脂肪去除，拨离表皮及皮下组织，留下真皮层，得到预处理的皮肤组织。将预处理的皮肤组织转移到培养基中后，切成小块，得到边缘整齐的皮肤组织块。
2.3取3mL的胎牛血清(FBS)均匀加到6孔细胞培养板的每孔后，放入皮肤组织块放置培养箱孵育0.5-1h，使组织粘在培养板底部。
2.4在6孔细胞培养板中加入1mL含有20％(v/v)FBS的DMEM(Gibco)培养基，放回培养箱培养。
2.5显微镜下观察到有成纤维细胞爬出时即可换液，将DMEM培养基的量增加至3mL，每隔1-3天更换培养基。
2.6待成纤维细胞在每个培养孔中汇合到孔的边缘时，弃旧培养基，PBS洗2遍，加入1mL的0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)，细胞培养箱内放置约4～6min，待细胞变圆脱落、漂浮时，立即加入含有20％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化，将细胞轻轻吹起后转移至15mL离心管，200g离心3min，吸弃上清液，加入细胞培养基混匀，转移细胞至培养瓶中，置于细胞培养箱中继续培养。
2.7当第2代皮肤成纤维细胞融合率达到80％-90％，弃旧培养基，细胞用PBS洗两遍后，加入3mL 0.25％的胰酶-EDTA(Gibco)消化至细胞分散，加入含有20％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化，将细胞轻轻吹起后转移至15mL离心管，200g离心3min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞，血球计数板计数。
2.8取约8×105皮肤成纤维细胞，200g离心3min，PBS洗2遍，OPTI-MEM(Gibco)洗一遍，弃上清，按Celetrix Kit试剂盒说明书，加入相应电转液试剂，重悬细胞，在细胞悬液中加入含有诱导因子Oct4和Nanog的重编程载体，混匀后加入电转杯中，将电转杯置于电转仪中，以430V，30ms，进行电转。
其中，所述重编程载体构建方法如下：①以质粒(Addgen#20922)为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F5/R5、F6/R6、F7/R7、F8/R8、F9/R9分别扩增得到EF-1α、OCT4、NANOG、EBNA1和OriP片段(引物序列和扩增后的序列见下表1)。②以pcDNA3.1(-)质粒为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F10/R10扩增得到pcDNA3.1片段(引物序列和扩增得到的序列见下表3)。③用NEBuilder HiFi DNAAssembly Bundle for Large Fragments(NEB#E2623)，通过同源重组的方式将pcDNA3.1与EF-1α、OCT4、NANOG、EBNA1和OriP连接，即得到目的载体，即pcDNA3.1-EF-OCT4-NANOG-EBNA1-OriP(载体序列见下表4)。
2.9电转结束后，取出电转杯，迅速将细胞悬液吸出加入铺好Matrigel(Corning)的细胞培养板内，培养板中提前加入2mL含20％(v/v)FBS的DMEM培养基。第2天，更换为2～3mL TeSR-E7培养基(Stem Cell Technologies)，37℃细胞培养箱静置培养。此后每天进行全量换液。其中第2天开始使用的培养基中含有小分子化合物组合，小分子化合物的工作浓度如下：TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为5μM，环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的工作浓度为10μM，糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的工作浓度为5μM。
第12天左右出现iPSC样克隆。
实施例3
3.1将来源于人的皮肤组织放入培养皿中，用4℃预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)快速反复漂洗4次。
3.2用灭菌后的眼科剪和手术刀处理皮肤组织，使白色皮下脂肪去除，拨离表皮及皮下组织，留下真皮层，得到预处理的皮肤组织。将预处理的皮肤组织转移到培养基中后，切成小块，得到边缘整齐的皮肤组织块。
3.3取3mL的胎牛血清(FBS)均匀加到6孔细胞培养板的每孔后，放入皮肤组织块放置培养箱孵育0.5-1h，使组织粘在培养板底部。
3.4在6孔细胞培养板中加入1mL含有20％(v/v)FBS的DMEM(Gibco)培养基，放回培养箱培养。
3.5显微镜下观察到有成纤维细胞爬出时即可换液，将DMEM培养基的量增加至3mL，每隔1-3天更换培养基。
3.6待成纤维细胞在每个培养孔中汇合到孔的边缘时，弃旧培养基，PBS洗2遍，加入1mL的0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)，细胞培养箱内放置约4～6min，待细胞变圆脱落、漂浮时，立即加入含有20％(v/v)FBS的DMEM培养基终止消化，将细胞轻轻吹起后转移至15mL离心管，200g离心3min，吸弃上清液，加入细胞培养基混匀，转移细胞至培养瓶中，置于细胞培养箱中继续培养。
3.7当第2代皮肤成纤维细胞融合率达到80％-90％，将含有以RNA形式存在的Oct4和Nanog重编程诱导因子的病毒Sendai Virus，与细胞混合培养2天后，弃掉培养基，加入2mL的20％(v/v)FBS的DMEM培养基培养，每隔一天进行换液。培养5天后，加入1mL的0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)，细胞培养箱内放置约4～6min，待细胞变圆脱落、漂浮时，加入到Vitronectin(Gibco)包被的细胞培养板培养。其中第2天开始使用的DMEM培养基中含有小分子化合物组合，小分子化合物的工作浓度如下：TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为5μM，环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的工作浓度为10μM，糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的工作浓度为5μM。
第12天左右出现iPSC样克隆。
实施例4
4.1取10mL来源于人的外周血，使用RosetteSepTM和SepMateTM试剂盒(Stem CellTechnologies)富集并扩增红系祖细胞。具体为将10mL血液从采血管里转移至普通离心管中，加入50μL RosetteSepTM Human Progenitor Cell Basic Pre-Enrichment Cocktail，充分混匀，室温静置10min。
4.2在SepMate离心管中沿着中心孔分别加入3.5mL LymphoprepTM，室温孵育10min后，加入10mL PBS+2％FBS，充分混匀，分别将5mL血液沿着SepMate离心管壁，1200g离心10min，小心将黄色上清迅速倒入新的普通离心管中(注意不要混入底部杂细胞)，300g离心8min。
4.3离心完毕后，弃去上清液，加入0.5mL StemSpanTM SFEM II培养基重悬计细胞总数，按5×106/mL的密度取2mL细胞分别接种到6孔板内，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
4.4第1天：将细胞悬液转移至新的6孔板中，以去除贴壁的杂细胞，每孔补加入0.5mL StemSpanTM SFEM II培养基，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
4.5第2天、第4天、第6天和第8天：分别将细胞悬液收集到离心管里，400g离心5min，弃上清，加入StemSpanTM SFEM II培养基重悬，吹打3-4次后，以2mL体积分别接种至新的6孔板每孔中，充分摇匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
4.6第9天：红系祖细胞数量明显增加，并在第10天时迅速富集，当细胞数量达到2×106可以进行电转。将细胞悬液收集，400g离心5min，弃上清弃上清，按Celetrix Kit试剂盒说明书，加入相应电转液试剂，重悬细胞，在细胞悬液中加入含有诱导因子Oct4和Nanog的重编程载体，混匀后加入电转杯中，将电转杯置于电转仪中，以430V,30ms，进行电转。
其中，所述重编程载体构建方法如下：①以质粒(Addgen#20922)为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F1/R1、F2/R2、F3/R3分别扩增得到EF-1α、OCT4和NANOG片段(引物序列和扩增后的序列见下表1)。②以pcDNA3.1(-)质粒为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F4/R4扩增得到pcDNA3.1片段(引物序列和扩增得到的序列见下表1)。③用NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle for LargeFragments(NEB#E2623)，通过同源重组的方式将pcDNA3.1与EF-1α、OCT4和NANOG连接，即得到目的载体，即pcDNA3.1-EF-OCT4-NANOG(载体序列见下表2)。
4.7电转结束后，取出电转杯，迅速将细胞悬液吸出加入Matrigel包被(Corning)的细胞培养板内，培养板中提前加入StemSpanTM SFEM II培养基。第2天，每孔补加1mLStemSpanTM SFEM II培养基，37℃细胞培养箱静置培养。第3天和第5天，每孔补加1mLReproTeSR培养基(Stem Cell Technologies)。第7天，可见有细胞开始贴壁生长，弃掉旧培养基，此后每天每孔更换为2mL ReproTeSR培养基。其中第2天开始使用的培养基中含有小分子化合物组合，小分子化合物的工作浓度如下：TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为5μM，环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的工作浓度为10μM，糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的工作浓度为5μM。
第12天左右出现细胞克隆状。
实施例5
5.1取10mL来源于人的外周血，使用RosetteSepTM和SepMateTM试剂盒(Stem CellTechnologies)富集并扩增红系祖细胞。具体为将10mL血液从采血管里转移至普通离心管中，加入50μL RosetteSepTM Human Progenitor Cell Basic Pre-Enrichment Cocktail，充分混匀，室温静置10min。
5.2在SepMate离心管中沿着中心孔分别加入3.5mL LymphoprepTM，室温孵育10min后，加入10mL PBS+2％FBS，充分混匀，分别将5mL血液沿着SepMate离心管壁，1200g离心10min，小心将黄色上清迅速倒入新的普通离心管中(注意不要混入底部杂细胞)，300g离心8min。
5.3离心完毕后，弃去上清液，加入0.5mL StemSpanTM SFEM II培养基重悬计细胞总数，按5×106/mL的密度取2mL细胞分别接种到6孔板内，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
5.4第1天：将细胞悬液转移至新的6孔板中，以去除贴壁的杂细胞，每孔补加入0.5mL StemSpanTM SFEM II培养基，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
5.5第2天、第4天、第6天和第8天：分别将细胞悬液收集到离心管里，400g离心5min，弃上清，加入StemSpanTM SFEM II培养基重悬，吹打3-4次后，以2mL体积分别接种至新的6孔板每孔中，充分摇匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
5.6第9天：红系祖细胞数量明显增加，并在第10天时迅速富集，当细胞数量达到2×106可以进行电转。将细胞悬液收集，400g离心5min，弃上清弃上清，按Celetrix Kit试剂盒说明书，加入相应电转液试剂，重悬细胞，在细胞悬液中加入含有诱导因子Oct4和Nanog的重编程载体，混匀后加入电转杯中，将电转杯置于电转仪中，以430V,30ms，进行电转。
其中，所述重编程载体构建方法如下：①以质粒(Addgen#20922)为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F5/R5、F6/R6、F7/R7、F8/R8、F9/R9分别扩增得到EF-1α、OCT4、NANOG、EBNA1和OriP片段(引物序列和扩增后的序列见下表3)。②以pcDNA3.1(-)质粒为模板，用KOD-Plus-Neo(TOYOBO#KOD-401)高保真酶和引物F10/R10扩增得到pcDNA3.1片段(引物序列和扩增得到的序列见下表3)。③用NEBuilder HiFi DNAAssembly Bundle for Large Fragments(NEB#E2623)，通过同源重组的方式将pcDNA3.1与EF-1α、OCT4、NANOG、EBNA1和OriP连接，即得到目的载体，即pcDNA3.1-EF-OCT4-NANOG-EBNA1-OriP(载体序列见下表4)。
5.7电转结束后，取出电转杯，迅速将细胞悬液吸出加入Matrigel包被(Corning)的细胞培养板内，培养板中提前加入StemSpanTM SFEM II培养基。第2天，每孔补加1mLStemSpanTM SFEM II培养基，37℃细胞培养箱静置培养。第3天和第5天，每孔补加1mLReproTeSR培养基(Stem Cell Technologies)。第7天，可见有细胞开始贴壁生长，弃掉旧培养基，此后每天每孔更换为2mL ReproTeSR培养基。其中第2天开始使用的培养基中含有小分子化合物组合，小分子化合物的工作浓度如下：TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为5μM，环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的工作浓度为10μM，糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的工作浓度为5μM。
第12天左右出现细胞克隆状。
实施例6
6.1取10mL来源于人的外周血，使用RosetteSepTM和SepMateTM试剂盒(Stem CellTechnologies)富集并扩增红系祖细胞。具体为将10mL血液从采血管里转移至普通离心管中，加入50μL RosetteSepTM Human Progenitor Cell Basic Pre-Enrichment Cocktail，充分混匀，室温静置10min。
6.2在SepMate离心管中沿着中心孔分别加入3.5mL LymphoprepTM，室温孵育10min后，加入10mL PBS+2％FBS，充分混匀，分别将5mL血液沿着SepMate离心管壁，1200g离心10min，小心将黄色上清迅速倒入新的普通离心管中(不要混入底部杂细胞)，300g离心8min。
6.3离心完毕后，弃去上清液，加入0.5mL StemSpanTM SFEM II培养基重悬计细胞总数，按5×106/mL的密度取2mL细胞分别接种到6孔板内，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
6.4第1天：将细胞悬液转移至新的6孔板中，以去除细胞，每孔补加入0.5mLStemSpanTM SFEM II培养基，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
6.5第2天、第4天、第6天和第8天：分别将细胞悬液收集到离心管里，400g离心5min，弃上清，加入StemSpanTM SFEM II培养基重悬，吹打3-4次后，以2mL体积分别接种至新的6孔板每孔中，充分摇匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
6.6第9天：红系祖细胞数量明显增加，将细胞悬液收集，400g离心5min，弃上清，加入含有以RNA形式存在的Oct4和Nanog重编程诱导因子的病毒Sendai Virus，与细胞混合培养2天后，弃掉培养基，加入2mL ReproTeSR培养基。此后每天每孔更换2mL ReproTeSR培养基。其中第2天开始使用的培养基中含有小分子化合物组合，小分子化合物的工作浓度如下：TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为5μM，环AMP(cAMP)激动剂Forskolin的工作浓度为10μM，糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂TD114-2的工作浓度为5μM。
第12天左右出现细胞克隆状。
表1.PCR扩增产物
Figure BDA0002152513110000101
Figure BDA0002152513110000111
Figure BDA0002152513110000121
Figure BDA0002152513110000131
表2.pcDNA3.1-EF-OCT4-NANOG载体序列
Figure BDA0002152513110000132
Figure BDA0002152513110000141
Figure BDA0002152513110000151
Figure BDA0002152513110000161
表3：PCR扩增产物
Figure BDA0002152513110000162
Figure BDA0002152513110000171
Figure BDA0002152513110000181
Figure BDA0002152513110000191
Figure BDA0002152513110000201
Figure BDA0002152513110000211
Figure BDA0002152513110000221
表4.pcDNA3.1-EF-OCT4-NANOG-EBNA1-OriP载体序列
Figure BDA0002152513110000222
Figure BDA0002152513110000231
Figure BDA0002152513110000241
Figure BDA0002152513110000251
Figure BDA0002152513110000261
本发明的制备iPSCs的方法减少重编程所需的转录因子至2个，降低了成瘤性，并通过3个小分子化合物的组合提高转化效率。用这种方法制备的iPSC将更适合于临床转化和应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于熟悉本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江霍德生物工程有限公司
<120> 一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法
<130> DI19-1150-XC37
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
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<223> 扩增后序列
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atacgactca ctataggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc 60
cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg 120
gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa 180
ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga 240
acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct 300
tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctc cagtacgtga ttcttgatcc cgagctggag 360
ccaggggcgg gccttgcgct ttaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420
ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480
tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540
aagatagtct tgtaaatgcg ggccaggatc tgcacactgg tatttcggtt tttgggcccg 600
cggccggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660
cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720
gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780
ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctcc agggggctca aaatggagga 840
cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900
cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960
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agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080
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gctctgcaga aagaactcga gcaatttgcc aagctcctga agcagaagag gatcaccctg 480
ggatatacac aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc 540
caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg 600
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gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg cagtgcccga aacccacact gcagcagatc 780
agccacatcg cccagcagct tgggctcgag aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac 840
cggcgccaga agggcaagcg atcaagcagc gactatgcac aacgagagga ttttgaggct 900
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ggtaccccag gctatgggag ccctcacttc actgcactgt actcctcggt ccctttccct 1020
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<210> 9
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增后序列
<400> 9
atgcattcaa actgagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag 60
aaccctggac ctatgagtgt ggatccagct tgtccccaaa gcttgccttg ctttgaagca 120
tccgactgta aagaatcttc acctatgcct gtgatttgtg ggcctgaaga aaactatcca 180
tccttgcaaa tgtcttctgc tgagatgcct cacacggaga ctgtctctcc tcttccttcc 240
tccatggatc tgcttattca ggacagccct gattcttcca ccagtcccaa aggcaaacaa 300
cccacttctg cagagaagag tgtcgcaaaa aaggaagaca aggtcccggt caagaaacag 360
aagaccagaa ctgtgttctc ttccacccag ctgtgtgtac tcaatgatag atttcagaga 420
cagaaatacc tcagcctcca gcagatgcaa gaactctcca acatcctgaa cctcagctac 480
aaacaggtga agacctggtt ccagaaccag agaatgaaat ctaagaggtg gcagaaaaac 540
aactggccga agaatagcaa tggtgtgacg cagaaggcct cagcacctac ctaccccagc 600
ctttactctt cctaccacca gggatgcctg gtgaacccga ctgggaacct tccaatgtgg 660
agcaaccaga cctggaacaa ttcaacctgg agcaaccaga cccagaacat ccagtcctgg 720
agcaaccact cctggaacac tcagacctgg tgcacccaat cctggaacaa tcaggcctgg 780
aacagtccct tctataactg tggagaggaa tctctgcagt cctgcatgca gttccagcca 840
aattctcctg ccagtgactt ggaggctgcc ttggaagctg ctggggaagg ccttaatgta 900
atacagcaga ccactaggta ttttagtact ccacaaacca tggatttatt cctaaactac 960
tccatgaaca tgcaacctga agacgtgtga aacttgttta ttgca 1005
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F4
<400> 10
aacttgttta ttgcagctta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R4
<400> 11
tatagtgagt cgtattaatt 20
<210> 12
<211> 3204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增后序列
<400> 12
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 180
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 240
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 300
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 360
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 420
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 480
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 540
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 600
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 660
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 720
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 780
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 840
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 900
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 960
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 1020
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 1080
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 1140
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 1200
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 1260
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 1320
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 1380
tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 1440
tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 1500
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 1560
tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 1620
ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 1680
gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 1740
aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 1800
ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 1860
tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 1920
ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 1980
aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 2040
ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 2100
ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 2160
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 2220
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 2280
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtcgacgg atcgggagat 2340
ctcccgatcc cctatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 2400
agtatctgct ccctgcttgt gtgttggagg tcgctgagta gtgcgcgagc aaaatttaag 2460
ctacaacaag gcaaggcttg accgacaatt gcatgaagaa tctgcttagg gttaggcgtt 2520
ttgcgctgct tcgcgatgta cgggccagat atacgcgttg acattgatta ttgactagtt 2580
attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 2640
cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 2700
caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 2760
tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta 2820
cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 2880
ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 2940
tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 3000
caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 3060
ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 3120
gggaggtcta tataagcaga gctctctggc taactagaga acccactgct tactggctta 3180
tcgaaattaa tacgactcac tata 3204
<210> 13
<211> 6424
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pcDNA3.1-EF-OCT4-NANOG
<400> 13
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
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tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
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ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacctg gctccagtac 1200
gtgattcttg atcccgagct ggagccaggg gcgggccttg cgctttagga gccccttcgc 1260
ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc 1320
accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac 1380
ctgctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccag gatctgcaca 1440
ctggtatttc ggtttttggg cccgcggccg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat 1500
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agtcggggtg gagagcaact ccgatggggc ctccccggag ccctgcaccg tcacccctgg 2400
tgccgtgaag ctggagaagg agaagctgga gcaaaacccg gaggagtccc aggacatcaa 2460
agctctgcag aaagaactcg agcaatttgc caagctcctg aagcagaaga ggatcaccct 2520
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ccggcgccag aagggcaagc gatcaagcag cgactatgca caacgagagg attttgaggc 2940
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ctgagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc 3180
tatgagtgtg gatccagctt gtccccaaag cttgccttgc tttgaagcat ccgactgtaa 3240
agaatcttca cctatgcctg tgatttgtgg gcctgaagaa aactatccat ccttgcaaat 3300
gtcttctgct gagatgcctc acacggagac tgtctctcct cttccttcct ccatggatct 3360
gcttattcag gacagccctg attcttccac cagtcccaaa ggcaaacaac ccacttctgc 3420
agagaagagt gtcgcaaaaa aggaagacaa ggtcccggtc aagaaacaga agaccagaac 3480
tgtgttctct tccacccagc tgtgtgtact caatgataga tttcagagac agaaatacct 3540
cagcctccag cagatgcaag aactctccaa catcctgaac ctcagctaca aacaggtgaa 3600
gacctggttc cagaaccaga gaatgaaatc taagaggtgg cagaaaaaca actggccgaa 3660
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ctaccaccag ggatgcctgg tgaacccgac tgggaacctt ccaatgtgga gcaaccagac 3780
ctggaacaat tcaacctgga gcaaccagac ccagaacatc cagtcctgga gcaaccactc 3840
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ctataactgt ggagaggaat ctctgcagtc ctgcatgcag ttccagccaa attctcctgc 3960
cagtgacttg gaggctgcct tggaagctgc tggggaaggc cttaatgtaa tacagcagac 4020
cactaggtat tttagtactc cacaaaccat ggatttattc ctaaactact ccatgaacat 4080
gcaacctgaa gacgtgtgaa acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 4140
tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 4200
caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc 4260
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catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 4380
attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 4440
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aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 4620
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 4680
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 4740
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tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 4860
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 4920
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tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 5040
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 5100
ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 5160
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtt tttttgtttg 5220
caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 5280
ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 5340
aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 5400
tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 5460
agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 5520
gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 5580
accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 5640
tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 5700
tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 5760
acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 5820
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aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 5940
tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 6000
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ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 6180
atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 6240
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tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 6420
cgtc 6424
<210> 14
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R7
<400> 14
cccctcgtca gacataggtc cagggttctc ctccacgtct ccagcctgct tcagcaggct 60
gaagttagta gctcacacgt cttcaggttg ca 92
<210> 15
<211> 1062
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增后序列
<400> 15
atgcattcaa actgagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag 60
aaccctggac ctatgagtgt ggatccagct tgtccccaaa gcttgccttg ctttgaagca 120
tccgactgta aagaatcttc acctatgcct gtgatttgtg ggcctgaaga aaactatcca 180
tccttgcaaa tgtcttctgc tgagatgcct cacacggaga ctgtctctcc tcttccttcc 240
tccatggatc tgcttattca ggacagccct gattcttcca ccagtcccaa aggcaaacaa 300
cccacttctg cagagaagag tgtcgcaaaa aaggaagaca aggtcccggt caagaaacag 360
aagaccagaa ctgtgttctc ttccacccag ctgtgtgtac tcaatgatag atttcagaga 420
cagaaatacc tcagcctcca gcagatgcaa gaactctcca acatcctgaa cctcagctac 480
aaacaggtga agacctggtt ccagaaccag agaatgaaat ctaagaggtg gcagaaaaac 540
aactggccga agaatagcaa tggtgtgacg cagaaggcct cagcacctac ctaccccagc 600
ctttactctt cctaccacca gggatgcctg gtgaacccga ctgggaacct tccaatgtgg 660
agcaaccaga cctggaacaa ttcaacctgg agcaaccaga cccagaacat ccagtcctgg 720
agcaaccact cctggaacac tcagacctgg tgcacccaat cctggaacaa tcaggcctgg 780
aacagtccct tctataactg tggagaggaa tctctgcagt cctgcatgca gttccagcca 840
aattctcctg ccagtgactt ggaggctgcc ttggaagctg ctggggaagg ccttaatgta 900
atacagcaga ccactaggta ttttagtact ccacaaacca tggatttatt cctaaactac 960
tccatgaaca tgcaacctga agacgtgtga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 1020
ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg tctgacgagg gg 1062
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F8
<400> 16
atgtctgacg aggggccagg tacaggacct ggaaatgg 38
<210> 17
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R8
<400> 17
ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 60
aagtttcact cctgcccttc ctcac 85
<210> 18
<211> 1991
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增后序列
<400> 18
atgtctgacg aggggccagg tacaggacct ggaaatggcc taggagagaa gggagacaca 60
tctggaccag aaggctccgg cggcagtgga cctcaaagaa gagggggtga taaccatgga 120
cgaggacggg gaagaggacg aggacgagga ggcggaagac caggagcccc gggcggctca 180
ggatcagggc caagacatag agatggtgtc cggagacccc aaaaacgtcc aagttgcatt 240
ggctgcaaag ggacccacgg tggaacagga gcaggagcag gagcgggagg ggcaggagca 300
ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggaggg 360
gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga 420
ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca ggaggagggg caggaggggc aggagcagga 480
ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagc aggaggaggg 540
gcaggagggg caggagcagg aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggagga 600
ggggcaggag caggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca 660
ggaggagggg caggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca 720
ggagcaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg 780
gcaggagcag gaggggcagg aggggcagga gcaggaggag gggcaggagg ggcaggagca 840
ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggggcaggag gggcaggagc aggaggggca 900
ggaggggcag gagcaggagg ggcaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggagcagga 960
ggggcaggag caggaggtgg aggccggggt cgaggaggca gtggaggccg gggtcgagga 1020
ggtagtggag gccggggtcg aggaggtagt ggaggccgcc ggggtagagg acgtgaaaga 1080
gccagggggg gaagtcgtga aagagccagg gggagaggtc gtggacgtgg agaaaagagg 1140
cccaggagtc ccagtagtca gtcatcatca tccgggtctc caccgcgcag gccccctcca 1200
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R9
<400> 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 扩增后序列
<400> 21
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<212> DNA
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<220>
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<400> 23
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aggagcagga ggggcaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg 5100
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atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct gtatccgggt agcatatgct 7560
atcctaatag agattagggt agtatatgct atcctaattt atatctgggt agcatatact 7620
acccaaatat ctggatagca tatgctatcc taatctatat ctgggtagca tatgctatcc 7680
taatctatat ctgggtagca taggctatcc taatctatat ctgggtagca tatgctatcc 7740
taatctatat ctgggtagta tatgctatcc taatttatat ctgggtagca taggctatcc 7800
taatctatat ctgggtagca tatgctatcc taatctatat ctgggtagta tatgctatcc 7860
taatctgtat ccgggtagca tatgctatcc tcatgcatat acagtcagca tatgataccc 7920
agtagtagag tgggagtgct atcctttgca tatgccgcca cctcccaagg gggcgtgaat 7980
tttcgctgct tgtccttttc cttataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat 8040
ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 8100
ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 8160
cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 8220
tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 8280
ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 8340
taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 8400
agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 8460
cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 8520
tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 8580
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 8640
gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 8700
acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 8760
acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 8820
cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 8880
gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 8940
gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tttttttgtt tgcaagcagc 9000
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 9060
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 9120
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 9180
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 9240
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 9300
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 9360
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 9420
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 9480
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 9540
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 9600
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 9660
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 9720
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 9780
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 9840
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 9900
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 9960
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 10020
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 10080
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 10140
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 10196

Claims (9)

1.一种通过体细胞重编程制备诱导多功能干细胞的方法，包括：将因子Oct4和Nanog作为重编程诱导因子导入体细胞后进行重编程；然后，将部分或完全重编程的体细胞培养在含有化学诱导剂的培养基中以得到诱导多功能干细胞，其中，所述化学诱导剂包括TGFβ受体抑制剂616452、环AMP激动剂Forskolin和糖原合成酶激酶抑制剂TD114-2。
2.根据权利要求1所述的方法，其中重编程诱导因子Oct4和Nanog以载体上携带的DNA的形式，以其mRNA的形式，或者以其蛋白产物的形式导入体细胞中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体细胞是皮肤来源的细胞，血液来源的细胞，尿液来源的细胞，肝细胞，上皮细胞，胃细胞，或者角质细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述皮肤来源的细胞是皮肤成纤维细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述血液来源的细胞是红系祖细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体细胞来源于人。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，
TGFβ受体抑制剂616452的工作浓度为0.1-20μM，更优选5-10μM，还更优选5μM；和
环AMP激动剂Forskolin的工作浓度为0.1-50μM，更优选2-20μM，还更优选10μM；和
糖原合成酶激酶抑制剂TD114-2的工作浓度为0.1-20μM，更优选2-10μM，还更优选5μM。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述将Oct4和Nanog作为重编程诱导因子导入体细胞后进行重编程为：将含有Oct4和Nanog重编程诱导因子的载体通过电转的方式转入体细胞后进行重编程；或者，将含有以RNA形式存在的Oct4和Nanog重编程诱导因子的病毒Sendai Virus与细胞混合培养。
9.一种诱导多功能干细胞，其通过权利要求1-8中任一项所述的方法得到。
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