CN113462638A - 一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台及应用，所述平台能够高效地进行重编程，并且只需使用最少数量的重编程因子(OCT4、SOX2、E6、E7)，本发明在分离单克隆阶段，以SSEA4/TRA‑1‑60为筛选标记，通过流式细胞分选技术，获得大量单细胞克隆，本发明所述平台具有重编程效率高、安全性高、操作简单、可规模化生产等优点。

Description

一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台及 应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台及应用。

背景技术

2006年，Takahashi和Yamanaka将几个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)的多能性干细胞，称为“诱导产生的多能性干细胞”(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)(Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.)，2007年，Takahashi利用人的成纤维细胞成功获得了人的iPSCs(Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts bydefined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.)，同年，Yu和Thomson等人报道了通过不同的转录因子组合(POU5F1、Sox2、NANOG、和Lin28)诱导出人类iPSCs(Yu J,Vodyanik MA,Smuga-Otto K,et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells[J].Science,2007,318(5858):1917-1920)。

iPSC的成功诱导为干细胞的研究带来了突破性的进展，iPSC不仅克服了人ESCs研究中存在的伦理学争议等问题，而且避开了核移植技术缺乏人卵母细胞的难题，为疾病发生发展的机制研究、发育生物学研究、基因与蛋白质功能研究以及药物筛选研发等提供了重要的研究平台，同时，也为再生医学和干细胞的临床应用提供了种子细胞来源。iPSC的临床应用可分为3类：疾病模型(用于疾病机制的研究和罕见病药物筛查的研究)、干细胞疗法、组织器官再生，其中，利用iPSC建立疾病模型的优势在于：其携带与病人完全相同的遗传物质，具有与胚胎干细胞类似的克隆形成能力、自我更新和多能分化潜能，而且克服了临床上特定细胞取材在伦理和技术方面的限制；在干细胞治疗应用中，分离的iPSC中的遗传缺陷可首先通过基因靶向治疗，然后诱导细胞分化为目标祖细胞或功能细胞，这些自体细胞可以通过不同的方法传递到患者的损伤部位，以加速组织修复；在组织器官再生应用中，通过在合适的细胞外微环境中加入特定生物物理和生物化学诱导因子，使iPSC诱导分化为有功能的三维组织或器官。

根据载体的不同，现有的iPSC的诱导方法可分为整合型和非整合型。其中，整合型重编程常利用逆转录病毒、慢病毒载体等实现基因导入、整合，进而实现重编程，这种方法虽然高效，但是宿主细胞的基因组中整合了外源性的病毒DNA极有可能导致宿主基因表达的异常，进而导致得到的iPSCs不稳定，存在极大的癌变的可能，不具有安全性；非整合型重编程减少对染色体结构的改变，一定程度上降低了基因突变和癌变的可能，如腺病毒、仙台病毒、逆转录病毒、转座子、质粒、微小环DNA、重组蛋白、小分子化合物、RNAs等方式均可产生iPSCs。2011年，Norikatsu等用成熟双链RNA miR-200c结合mir-369和miR-302家族将小鼠和人类细胞重编程为诱导多能干细胞(Miyoshi N,Ishii H,Nagano H,etal.Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using maturemicroRNAs[J].Cell Stem Cell,2011,8(6):633-638)；hou等人经过筛选了10000个小分子化合物，使用VC6TFZ、VPA、E616452、CHIR、D4476 FSK、2-Me-5HT七个小分子化合物的组合使从小鼠体细胞重编程为多能性干细胞的效率达0.2％(Hou P,Li Y,Zhang X,etal.Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-moleculecompounds[J].Science,2013,341(6146):651-654)。

目前iPSC的诱导方法多种多样，但是存在以下技术缺陷：(1)基于iPSC的自体/同种异体细胞疗法需要稳定的、可重复性强的、无基因编辑的诱导方法，以及无动物源性培养基成分，而目前常用的iPSC诱导方法主要是基于基因整合和动物源性培养基；(2)细胞库、疾病建模和细胞治疗的应用对hiPSC技术提出了越来越高的要求，其中包括对安全性的要求，而目前常用的iPSC诱导方法通常采用较多数量的重编程因子，包括OCT4(POU5F1)、SOX2、L-MYC/l-MYC、KLF4、LIN28、NANOG、SV40LT，较多数量重编程因子的使用导致重编程得到的iPSC的安全性较差；(3)目前常用的iPSC诱导方法在分离单克隆阶段，通常采用物理手段获得单个克隆，该方法不能保证得到的克隆为单细胞克隆，同时也可能引入未分化的细胞，操作复杂，效率低。

发明内容

为了解决目前本领域面临的上述问题，本发明提供了一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台，所述平台能够高效地进行重编程，并且只需使用最少数量的重编程因子(OCT4、SOX2、E6、E7)，此外，本发明在分离单克隆阶段，以SSEA4、TRA-1-60为筛选标记，通过流式细胞分选技术，将阳性表征单个细胞分选到96孔板，只需很少的动手操作即可轻松获得大量单细胞克隆，可用于产业化生产。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞的重编程因子组合。

进一步，所述重编程因子组合选自OCT4、SOX2、E6、E7、KLF4、L-MYC、LIN28、NANOG、SV40LT；

优选地，所述重编程因子组合为OCT4、SOX2、E6、E7；

更优选地，所述重编程因子组合的形式包括DNA、RNA、蛋白质；

最优选地，所述DNA为cDNA、RNA为mRNA。

本文中使用的术语“诱导多能干细胞”、“诱导产生的多能性干细胞”、“iPSCs”和“iPSC”可互换使用，表示人工地将非多能性细胞(例如：体细胞)经重编程而获得的具有自我更新能力和向三胚层细胞分化潜能的一种多能性干细胞，其中，重编程是指通过外源基因表达、化合物诱导、表观遗传修饰等途径来获得诱导多能干细胞的过程。

本发明的第二方面提供了一种用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞的重编程因子载体。

进一步，所述重编程因子载体包括将本发明第一方面中所述的重编程因子在一个和/或多个骨架载体中编码得到的重编程因子载体；

优选地，所述骨架载体包括pEGFP N1、pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4；

更优选地，所述骨架载体为pEGFP N1；

优选地，所述重编程因子载体包括下列一种和/或多种重编程因子载体：编码OCT4的载体、编码SOX2的载体、编码E6的载体、编码E7的载体、编码OCT4和SOX2的载体、编码OCT4和E6的载体、编码OCT4和E7的载体、编码SOX2和E6的载体、编码SOX2和E7的载体、编码E6和E7的载体、编码OCT4和SOX2和E6的载体、编码OCT4和SOX2和E7的载体、编码OCT4和E6和E7的载体、编码SOX2和E6和E7的载体、编码OCT4和SOX2和E6和E7的载体；

更优选地，所述重编程因子载体包括下列两种重编程因子载体：编码OCT4和SOX2的载体、编码E6和E7的载体；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2通过间隔序列连接和/或直接连接；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2通过间隔序列连接；

最优选地，所述间隔序列包括IRES和/或自剪切多肽2A；

最优选地，所述自剪切多肽2A选自T2A、P2A、E2A、F2A；

最优选地，所述间隔序列为IRES；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2的连接方式包括：OCT4、IRES、SOX2依次串联、SOX2、IRES、OCT4依次串联；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2的连接方式为OCT4、IRES、SOX2依次串联；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7通过间隔序列连接和/或直接连接；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7通过间隔序列连接；

最优选地，所述间隔序列包括IRES、自剪切多肽2A和/或任意两个核苷酸；

最优选地，所述自剪切多肽2A选自T2A、P2A、E2A、F2A；

最优选地，所述任意两个核苷酸选自AA、TT、CC、GG、AT、TA、AC、CA、AG、GA、TC、CT、TG、GT、CG、GC；

最优选地，所述间隔序列为IRES；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7的连接方式包括：E6、IRES、E7依次串联、E7、IRES、E6依次串联；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7的连接方式为E6、IRES、E7依次串联；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

最优选地，所述编码E6和E7的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本文中使用的术语“IRES”，为内部核糖体进入位点(Internal ribosome entrysite)，是一种顺式作用的RNA序列，能够在翻译起始密码子上游的某些真核细胞和病毒信使RNA上介导40S核糖体亚基的内部进入，IRES的存在可以保证在同一启动子的控制下共同表达多个基因。

本发明的第三方面提供了一种体细胞来源的诱导多能干细胞的制备方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：向体细胞中递送本发明第一方面所述的重编程因子组合；

优选地，所述重编程因子组合的递送是通过将重编程因子载体导入体细胞中实现的；

更优选地，所述导入的方式包括电转染法、显微注射法、基因枪法、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙共沉淀转染法、人工脂质体法；

最优选地，所述导入的方式为电转染法；

最优选地，所述重编程因子载体为本发明第二方面所述的重编程因子载体；

最优选地，所述重编程因子载体的用量为：80～200万体细胞/100μL中加入0.5-8μg编码OCT4和SOX2的载体和编码E6和E7的载体；

优选地，对导入重编程因子载体得到的体细胞进行培养；

更优选地，将导入重编程因子载体得到的体细胞在细胞培养板中进行培养；

最优选地，所述细胞培养板为细胞外基质蛋白包被的培养板；

最优选地，所述细胞外基质蛋白包括层粘连蛋白；

最优选地，所述层粘连蛋白为人层粘连蛋白-521；

最优选地，所述细胞培养板中还包括造血干细胞；

更优选地，在培养第3天时半换液，使用E8培养基继续培养2-4天后进行全换液，使用E8培养基继续培养至形成大量克隆；

最优选地，对得到的克隆进行筛选标记并进行分选，得到体细胞来源的诱导多能干细胞；

最优选地，所述的筛选标记包括SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81、SSEA3、OCT4、SOX2、NANOG；

最优选地，所述的筛选标记选自SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81；

最优选地，所述的筛选标记为SSEA4、TRA-1-60；

最优选地，所述的分选是采用流式细胞分选技术进行的；

优选地，所述体细胞包括外周单核血细胞、成纤维细胞、脐带血细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、造血干细胞、胰岛细胞、胃上皮细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、脂肪细胞、胰腺β细胞、角质形成细胞、间充质基质细胞、上皮细胞、内皮细胞；

更优选地，所述体细胞为外周单核血细胞。

进一步，在所述的分选之前还包括采用ROCK信号通路抑制剂处理细胞以及对细胞进行消化；

优选地，所述处理时间为2h；

优选地，所述ROCK信号通路抑制剂包括Thiazovivin、Belumosudil mesylate、SAR407899、BDP5290、Belumosudil(SLx-2119)、ZINC00881524、HA 1100hydrochloride、Ripasudil(K-115)dihydrate、SR 3677、GSK180736A、Hydroxyfasudil hydrochloride、GSK269962A、Y-39983dihydrochloride、Fasudil、GSK429286A、RKI-1447、Fasudilhydrochloride、Y-27632dihydrochloride；

更优选地，所述ROCK信号通路抑制剂为Thiazovivin；

优选地，所述对细胞进行消化采用的消化液包括TRYPLE、胰蛋白酶、糜蛋白酶、肠激酶；

更优选地，所述消化液为TRYPLE。

进一步，所述方法还包括对分选得到的SSEA4和TRA-1-60单阳性或者双阳性的细胞进行培养传代；

优选地，所述培养为将分选得到的SSEA4和TRA-1-60单阳性或者双阳性的细胞铺种在人层粘连蛋白-521包被的细胞培养板中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养，培养7-14天，每日进行全换液；

更优选地，待细胞汇合度约70％-80％时，进行细胞的传代。

本发明的第四方面提供了一种体细胞来源的诱导多能干细胞或细胞群体。

进一步，所述诱导多能干细胞或细胞群体为采用本发明第三方面所述的方法制备得到的。

本发明的第五方面提供了一种重编程体细胞。

进一步，所述重编程体细胞为将本发明第二方面所述的重编程因子载体导入到体细胞中得到的细胞；

优选地，所述导入的方式包括电转染法、显微注射法、基因枪法、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙共沉淀转染法、人工脂质体法；

更优选地，所述导入的方式为电转染法；

优选地，所述体细胞包括外周单核血细胞、成纤维细胞、脐带血细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、造血干细胞、胰岛细胞、胃上皮细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、脂肪细胞、胰腺β细胞、角质形成细胞、间充质基质细胞、上皮细胞、内皮细胞。

进一步，所述“重编程体细胞”为重编程的中间态细胞，即一种处于不完全重编程的细胞状态，是重编程过程中的一种中间态，包括部分多能性基因被激活，在适宜培养条件下可被诱导为多能干细胞。

本发明的第六方面提供了一种用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基。

进一步，所述培养基为添加有选自OCT4蛋白、SOX2蛋白、E6蛋白、E7蛋白、KLF4蛋白、L-MYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白、SV40LT蛋白的培养基；

优选地，所述培养基为添加有OCT4蛋白、SOX2蛋白、E6蛋白、E7蛋白的培养基。

本发明的第七方面提供了一种用于产生诱导多能干细胞的试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的重编程因子组合、本发明第二方面所述的重编程因子载体和/或本发明第五方面所述的重编程体细胞。

本发明的第八方面提供了一种药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的第九方面提供了一种体细胞来源的诱导多能干细胞单克隆挑取的方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)选取对数生长期的细胞，消化细胞；

(2)使用筛选标记对步骤(1)得到的细胞进行标记；

(3)对步骤(2)得到的标记后的细胞采用流式细胞分选技术进行分选；

(4)将步骤(3)得到的细胞分选到细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，完成细胞单克隆的挑取；

优选地，步骤(1)中所述消化细胞前还包括采用ROCK信号通路抑制剂处理细胞；

更优选地，所述处理时间为2h；

更优选地，所述ROCK信号通路抑制剂包括Thiazovivin、Belumosudil mesylate、SAR407899、BDP5290、Belumosudil(SLx-2119)、ZINC00881524、HA1100hydrochloride、Ripasudil(K-115)dihydrate、SR 3677、GSK180736A、Hydroxyfasudil hydrochloride、GSK269962A、Y-39983dihydrochloride、Fasudil、GSK429286A、RKI-1447、Fasudilhydrochloride、Y-27632dihydrochloride；

最优选地，所述ROCK信号通路抑制剂为Thiazovivin；

优选地，步骤(1)中所述消化细胞采用的消化液包括TRYPLE、胰蛋白酶、糜蛋白酶、肠激酶；

更优选地，步骤(1)中所述消化细胞采用的消化液为TRYPLE；

优选地，步骤(2)中所述的筛选标记包括SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81、SSEA3、OCT4、SOX2、NANOG；

更优选地，步骤(2)中所述的筛选标记选自SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81；

最优选地，步骤(2)中所述的筛选标记为SSEA4、TRA-1-60；

优选地，步骤(4)中所述的细胞培养板为细胞外基质蛋白包被的细胞培养板；

更优选地，所述细胞外基质蛋白包括层粘连蛋白；

最优选地，所述层粘连蛋白为人层粘连蛋白-521。

进一步，所述方法还包括对细胞单克隆进行扩大培养。

本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用：

(1)E6、E7在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(2)本发明第一方面所述的重编程因子组合在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(3)本发明第二方面所述的重编程因子载体在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(4)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在产生分化细胞和/或分化细胞的前体细胞中的应用；

(5)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在构建疾病模型中的应用；

(6)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在构建肿瘤干细胞模型中的应用；

(7)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在制备治疗疾病的药物中的应用；

(8)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在筛选治疗疾病的候选药物中的应用；

(9)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在疾病治疗的药物评价中的应用；

(10)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在疾病的细胞治疗中的应用；

(11)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在细胞移植和组织修复中的应用；

(12)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在器官再生中的应用；

(13)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的应用；

(14)本发明第四方面所述的诱导多能干细胞或细胞群体、本发明第五方面所述的重编程体细胞在免疫细胞抗肿瘤治疗中的应用；

(15)本发明第六方面所述的培养基在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(16)本发明第七方面所述的试剂盒在产生诱导多能干细胞中的应用；

(17)本发明第八方面所述的药物组合物在预防和/或治疗疾病中的应用；

优选地，所述疾病包括阿尔兹海默症、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、X染色体易损综合征、雷特综合征、亨廷顿病、家族性自主神经功能异常疾病、精神分裂症、共济失调疾病、糖尿病、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、斯特格氏病、肾脏疾病、肝脏疾病、肺部疾病、血友病、骨髓瘤；

优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、宫颈癌、外阴癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫内膜癌、腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、膀胱癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌。

进一步，所述“前体细胞”是指在将诱导多能干细胞或细胞群体、重编程体细胞诱导分化产生分化细胞的过程中所有的中间态细胞，所述中间态细胞包括该过程中涉及的除起始细胞(诱导多能干细胞或细胞群体、重编程体细胞)和终端细胞(分化细胞)之外的所有细胞。

本发明的优点和有益效果：

相对于现有技术，本发明所提供的一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台通过使用最少数量的重编程因子降低了潜在的致癌性，同时获得了较高的诱导效率，提高了重编程技术的可操作性，此外，本发明在分离单克隆阶段，以SSEA4/TRA-1-60为筛选标记，通过流式细胞分选技术，将阳性表征单个细胞分选到96孔板，只需很少的动手操作即可轻松获得大量单细胞克隆，可用于产业化生产。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是本发明开发的高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台的流程图和目前iPSC诱导方法的流程图，其中，a图：目前iPSC诱导方法的流程图，b图：本发明开发的高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台的流程图；

图2是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒进行iPSC重编程，第1天PBMC电转后的形态图；

图3是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒进行iPSC重编程，第7天产生上皮样细胞的形态图；

图4是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒进行iPSC重编程，第20天产生上皮样细胞的形态图；

图5是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC碱性磷酸酶染色的结果图；

图6是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC免疫荧光结果图；

图7是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC流式检测结果图，其中，a图：NANOG，b图：OCT4，c图：SOX2，d图：SSEA1，e图：SSEA4，f图：TRA-1-60，g图：TRA-1-81；

图8是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC畸胎瘤切片HE染色结果图，其中，a为毛囊结构，b为软骨结构，c为消化道上皮结构；

图9是使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC核型检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1重编程质粒的构建

1、实验材料

本实施例中所述的pEGFP N1质粒购自于Addgene公司。

2、实验方法

(1)以pEGFP N1质粒为骨架载体，使用EcoR1和Not1为酶切位点；

(2)基因合成OCT4-IRES-SOX2和E6-E7，合成公司为安徽通用生物科技有限公司，将OCT4-IRES-SOX2和E6-E7插入pEGFP N1质粒的EcoR1和Not1之间，载体命名为OCT4-IRES-SOX2和E6-E7；

(3)OCT4-IRES-SOX2的序列如SEQ ID NO:1所示，OCT4和SOX2通过间隔序列依次连接，间隔序列为IRES，其中IRES序列可使用自剪切多肽2A(Self-cleaving 2A peptide，2A)替换，包括E2A，P2A，T2A，F2A等。

(4)E6-E7的序列如SEQ ID NO:2所示，E6和E7通过间隔序列依次连接，间隔序列为IRES，其中IRES序列可使用自剪切多肽2A(Self-cleaving 2Apeptide,2A)替换，包括E2A，P2A，T2A，F2A等，IRES序列也可使用任意两个核苷酸代替，如AA，TT，CC，GG，AT，TA，AC，CA，AG，GA，TC，CT，TG，GT，CG，GC。

实施例2 PBMC扩增准备操作

1、实验材料

外周血单个核细胞(PBMC)购自于STEMCELL Technologies公司，货号为#70072.2；StemSpan^TMSFEM II购自于STEMCELL Technologies公司，货号为#09655；StemSpan^TMCD34+Expansion Supplement购自于STEMCELL Technologies公司，货号为#02691。

2、实验方法

(1)从液氮罐中取出一支冻存1200-1500万的PBMC，将其置于水温37-40℃的热水浴中，轻轻摇晃，待冻存管内仅剩微小晶体时，用75％的酒精彻底消毒冻存管表面，无菌纱布擦去75％酒精，放入超净工作台；

(2)用移液枪将细胞悬液加入到含有10mL提前预热的造血干细胞基础培养基中，轻轻混匀后取样计数，同时以200g，10min配平离心；

其中，造血干细胞基础培养基组成为StemSpan^TMSFEM II和StemSpan^TMCD34+Expansion Supplement，按生产厂商要求进行配置；

(3)离心完成后，用移液枪轻轻吸弃上清，并用2mL造血干细胞扩增培养基(预热到37℃)重悬细胞，混匀后，以每孔1mL细胞悬液接种于12孔板，共接种2孔，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(4)培养3-6天至细胞增殖可形成较大的集落，且集落数目较多，多见于细胞密度较大的区域，然后再进行电转操作。

实施例3 PBMC电转操作

1、实验材料

本发明实施例1中构建得到的重编程质粒OCT4-IRES-SOX2和E6-E7，本发明实施例2中培养扩增得到的PBMC。

2、实验方法

(1)将待电转的细胞(PBMC)轻轻吹打后，收集细胞悬液至一个新的50mL离心管内；

(2)用2mL DPBS将细胞孔清洗一遍，并将清洗液转移到上述50mL离心管内，轻轻混匀后取样计数；

(3)配平后离心，200g，10min，离心并计数；

(4)根据计数结果，在6孔板上的接种细胞量为每孔80-200万细胞；

(5)离心结束后，根据细胞量，重悬细胞，使细胞浓度为0.8×10⁶-2.0×10⁶cells/100μL，重悬后取300μL细胞重悬液，即600万细胞，做3个电转反应；

(6)按照每个电转反应(80-200万细胞/100μL)加入0.5-8μg质粒(OCT4-IRES-SOX2和E6-E7)。

实施例4 PBMC重编程操作

1、实验材料

本发明实施例2中电转后得到的PBMC；重组人层粘连蛋白-521购自于赛默飞世尔科技有限公司，货号为A29249；E8培养基购自于赛默飞世尔科技有限公司，货号为A1517001；TRYPLE购自于赛默飞世尔科技有限公司，货号为12604013；Alexa

488anti-human SSEA-4Antibody购自于Biolegend公司，货号为330412；Alexa

594anti-human TRA-1-60-R Antibody购自于Biolegend公司，货号为330616。

2、实验方法

(1)将电转后的PBMC转移至重组人层粘连蛋白-521包被的6cm孔板/培养皿中，加入2mL造血干细胞扩增培养，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养；

(2)第1天观察拍照：此时已可见部分贴壁的细胞；

(3)第3天半换液，使用E8培养基继续培养；

(4)第5-7天，观察贴壁细胞的数量及形态变化；细胞形态将经历由具有极性的类神经样细胞逐渐变为短棒状，再至上皮样，细胞核区及核仁逐渐明显，可观察到形变的细胞形成小的细胞集落；对细胞进行全换液，使用E8培养基，继续培养；

(5)第7-21天，每天对细胞进行全换液，使用E8培养基；形成大量克隆，当克隆大小在100μm到1mm之间时，细胞数量约100-10000个细胞时，使用0-20μM ROCK信号通路抑制剂Thiazovivin处理细胞2小时，使用TRYPLE将克隆消化成单细胞；

(6)将细胞收集至12mL离心管中，离心，去上清液，使用DPBS清洗细胞2遍；

(7)按照供应商说明书操作，使用Alexa

488anti-human SSEA-4Antibody和Alexa

594anti-human TRA-1-60-R Antibody对细胞进行标记；

(8)标记后的细胞在流式细胞分选仪平台上进行分选，将SSEA-4和TRA-1-60单阳性或者双阳性的细胞，铺种在人层粘连蛋白-521包被的96cm孔板中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养；

(9)在96孔板中继续培养7-14天，每日均进行全换液操作，待细胞汇合度约70％-80％时，将细胞传代至48孔板中；

(10)继续培养细胞，待细胞汇合度约70％-80％时，进行传代操作，传代器皿要求：P0(24孔板)→P1(12孔板)→P2(T25瓶)→P3(T25瓶)→P4(T25/T75瓶)等。

3、实验结果

本发明开发的高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台的流程图见图1b，目前iPSC诱导方法的流程图见图1a；

实验结果显示，使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒进行iPSC重编程，第1天PBMC电转后细胞形态正常，细胞集落较少，背景干净，死细胞较少(见图2)；使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒进行iPSC重编程，第7天产生上皮样细胞，未完全呈现克隆样生长(见图3)；使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒进行iPSC重编程，第20天，产生上皮样细胞，呈现克隆样生长(见图4)。

实施例5 iPSC干性鉴定

1、实验方法

(1)取供试品iPS细胞约3×10⁴个，按照每孔1×10⁴cells，铺种到24孔细胞培养板已包被有Matrigel的孔中，共3个孔，每孔加入1mL新鲜制备含ROCK的E8完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24h；

(2)第二天换液操作，吸弃旧培养基，每孔加入1mL E8完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养至汇拢度达50％左右，且未形成成片集落时准备进行染色；

(3)配制碱性磷酸酶染色液(AP染色液)，所述碱性磷酸酶染色液的组成及含量见表1；

(4)吸弃24孔板内待检细胞培养基，用DPBS清洗2次，每次1min；

(5)随后在每孔中加入200μL 4％的多聚甲醛避光固定20min；

(6)吸弃固定液，再用DPBS清洗两次，每次1min；

(7)随后在每孔中加入200μL AP染色液，避光染色1h；

(8)染色结束后，用无菌水清洗1-2次，洗掉浮色，在孔中加无菌水，倒置显微镜下观察，拍照存档。

表1碱性磷酸酶染色液(AP染色液)的组成及含量

2、实验结果

实验结果显示，iPSC被碱性磷酸酶染色均呈现阳性表达(见图5)，表明了iPSC中碱性磷酸酶活性高，iPSC处于未分化的状态。

实施例6免疫荧光鉴定

1、实验材料

本实施例中所使用的一抗和二抗信息如下：Anti-Nanog抗体(Abcam公司，货号：ab109250)；Mouse anti-SSEA-4(Abcam公司，货号：ab16287)；Mouse anti-TRA-1-60(Abcam公司，货号：ab16288)；Anti-Oct4抗体(Abcam公司，货号：ab19857)；重组Anti-SOX2抗体[EPR3131](Abcam公司，ab92494)；Goat anti-Mouse IgG3 Cross-Adsorbed SecondaryAntibody,Alexa Fluor 488(Invitrogen，A-21151)；Goat anti-Mouse IgM(Heavy chain)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 488(Invitrogen，A-21042)；Donkeyanti-Rabbit IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 594(Invitrogen，A-21207)；Donkey anti-Rabbit IgG(H+L)Highly Cross-AdsorbedSecondary Antibody,Alexa Fluor488(Invitrogen，A-21206)。

2、实验方法

(1)在24孔培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

(2)用4％的多聚甲醛室温固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

(3)0.5％Triton X-100(5％BSA配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)；

(4)使用5％的BSA室温封闭1小时；

(5)去除封闭液，每孔添加400μL一抗，4℃过夜孵育；

以上步骤(1)-(5)是第一天工作；

(6)加荧光二抗：PBST浸洗3次，每次5min，添加稀释好的荧光二抗，室温孵育1h，PBST浸洗3次，每次5min；从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行；

(7)复染核：滴加DAPI，避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；

(8)添加500μL PBS，上机拍片。

3、实验结果

结果显示，经免疫荧光染色后，使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC表达干细胞表面标志物SOX2、OCT4、NANOG、SSEA4、TRA-1-60(见图6)，表明了所述iPSC具有干性。

实施例7流式检测

1、实验材料

本实施例中所使用的抗体均购自于Biolegend公司，所述抗体包括：Alexa

594anti-Nanog Antibody(674204)；Alexa

594anti-Oct4(Oct3)Antibody(653708)；Alexa

488anti-human SSEA-4Antibody(330412)；PE anti-mouse/human CD15(SSEA-1)Antibody(125605)；Alexa

488anti-human TRA-1-60-R Antibody(330613)；Alexa

488anti-human TRA-1-81Antibody(330709)；Alexa

555Mouse anti-Sox2(560293)。

2、实验方法

(1)将15mL离心管中iPSC细胞，200g离心10min，弃上清，分别转入1.5mL EP管后，加入1mL固定液(4％多聚甲醛)进行固定，于室温下孵育10min；

(2)微型离心机快速离心后，移去1.5mL EP管内固定液，用0.5mL DPBS洗3遍；

(3)快速离心后，移去1.5mL EP管内DPBS后，加入1mL 5％BSA封闭液，室温静置30min；

(4)将封闭好的样品按照设置实验进行分组、分装及标记；

(5)吸弃实验组上清，实验孔加入0.2mL一抗工作液，阴性对照组不做处理，室温孵育1h；

(6)吸弃上清，每孔加入0.2mL DPBS洗三次；

(7)每孔加入0.2mL二抗工作液，室温避光孵育1h；

(8)吸去上清，每孔加入0.5mL DPBS洗三次；

(9)制备好的流式样品进行流式上机，分析完成后保存文档。

3、实验结果

使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC流式检测的结果显示，NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81均为阳性，SSEA1为阴性(见图7a-g)，符合iPSC干细胞基因表达特性，进一步表明了所述iPSC具有干性。

实施例8畸胎瘤形成鉴定

1、实验方法

(1)准备iPSC细胞6×10⁶cells/只，在小鼠的前肢右腋下进行皮下注射，注射体积为0.2mL/点/只，注射后观察8周，观察内容包括小鼠移植部位肿瘤形成情况及小鼠的一般情况；

(2)动物安乐处死后，若有肿瘤，剥离肿瘤，取材，称瘤重，对肿瘤做病理组织学检查。

2、实验结果

使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC畸胎瘤切片HE染色的结果见图8a-c，其中，a为毛囊结构，b为软骨结构，c为消化道上皮结构，表明了得到的iPSC可成功形成畸胎瘤，具有体内分化的多能性。

实施例9核型检测

1、实验方法

(1)取供试品iPS细胞约3×10⁵个，铺种到包被有Matrigel的T25细胞培养瓶，每孔加入1mL新鲜制备含ROCK的E8完全培养基，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24h；

(2)第二天使用E8完全培养基换液，送外检，外检单位为：济南艾迪康医学检验中心。

2、实验结果

本实施例中使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC核型检测结果见图9，可见46条染色体，数目正常，性染色体为XX，为女性核型，染色体结构未见异常，表明了使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒得到的OSE6-iPSC不存在染色体的畸变，均表现为正常的核型。

实施例10 iPSC重编程效率的比较

1、实验材料

本实施例中使用的商品化重编程试剂盒CD34+Progenitor Reprogramming Kit购自于STEMCELL technologies公司，货号为#05925。

2、实验方法

(1)根据PBMC扩增方法准备PBMC细胞；

(2)单独使用OCT4-IRES-SOX2质粒(OS)，单独使用E6-E7质粒(E6/E7)，使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7质粒(OSE6)根据PBMC重编程方法进行操作；

(3)使用商品化重编程试剂盒CD34+Progenitor Reprogramming Kit，根据说明书进行重编程；

(4)比较上述4种方案的重编程效率以及最终得到的克隆数量。

2、实验结果

结果显示，单独使用OCT4-IRES-SOX2重编程(OS)、单独使用E6-E7重编程(E6/E7)、使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7重编程(OSE6)、使用商品化重编程试剂盒(kit)的重编程效率分别为0、0、2％-5％、0.2％-4.9％(见表2)；单独使用OCT4-IRES-SOX2重编程(OS)、单独使用E6-E7重编程(E6/E7)、使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7重编程(OSE6)、使用商品化重编程试剂盒(kit)最终得到的克隆数目分别为0、0、125±30、11±5(见表3)，表明了使用OCT4-IRES-SOX2和E6-E7重编程(OSE6)的重编程效率不仅优于目前市售的商品化重编程试剂盒(kit)，其最终得到的单克隆数目也远高于商品化重编程试剂盒(kit)，可用于产业化的生产。

表2使用OS、E6/E7、OSE6、kit重编程的重编程效率结果

表3使用OS、E6/E7、OSE6、kit重编程最终得到的克隆数目

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 呈诺再生医学科技（珠海横琴新区）有限公司

<120> 一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台及应用

<141> 2021-06-30

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2715

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgggac acctggcttc ggatttcgcc ttctcgcccc ctccaggtgg tggaggtgat 60

gggccagggg ggccggagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggctaag cttccaaggc 120

cctcctggag ggccaggaat cgggccgggg gttgggccag gctctgaggt gtgggggatt 180

cccccatgcc ccccgccgta tgagttctgt ggggggatgg cgtactgtgg gccccaggtt 240

ggagtggggc tagtgcccca aggcggcttg gagacctctc agcctgaggg cgaagcagga 300

gtcggggtgg agagcaactc cgatggggcc tccccggagc cctgcaccgt cacccctggt 360

gccgtgaagc tggagaagga gaagctggag caaaacccgg aggagtccca ggacatcaaa 420

gctctgcaga aagaactcga gcaatttgcc aagctcctga agcagaagag gatcaccctg 480

ggatatacac aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc 540

caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg 600

cggcccttgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca atgaaaatct tcaggagata 660

tgcaaagcag aaaccctcgt gcaggcccga aagagaaagc gaaccagtat cgagaaccga 720

gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg cagtgcccga aacccacact gcagcagatc 780

agccacatcg cccagcagct tgggctcgag aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac 840

cggcgccaga agggcaagcg atcaagcagc gactatgcac aacgagagga ttttgaggct 900

gctgggtctc ctttctcagg gggaccagtg tcctttcctc tggccccagg gccccatttt 960

ggtaccccag gctatgggag ccctcacttc actgcactgt actcctcggt ccctttccct 1020

gagggggaag cctttccccc tgtctccgtc accactctgg gctctcccat gcattcaaac 1080

tgaggtgcct gccctctagt ttacgcgtgg gggcggccgg ccgctttctc gaggccatcg 1140

atgtttaaac gatccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 1200

tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg 1260

gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 1320

cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 1380

aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 1440

ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 1500

cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 1560

caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 1620

atctggggcc tcggtacaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 1680

gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa atggccacac 1740

cgcgaattaa ttcgattccg catgtacaac atgatggaga cggagctgaa gccgccgggc 1800

ccgcagcaaa cttcgggggg cggcggcggc aactccaccg cggcggcggc cggcggcaac 1860

cagaaaaaca gcccggaccg cgtcaagcgg cccatgaatg ccttcatggt gtggtcccgc 1920

gggcagcggc gcaagatggc ccaggagaac cccaagatgc acaactcgga gatcagcaag 1980

cgcctgggcg ccgagtggaa acttttgtcg gagacggaga agcggccgtt catcgacgag 2040

gctaagcggc tgcgagcgct gcacatgaag gagcacccgg attataaata ccggccccgg 2100

cggaaaacca agacgctcat gaagaaggat aagtacacgc tgcccggcgg gctgctggcc 2160

cccggcggca atagcatggc gagcggggtc ggggtgggcg ccggcctggg cgcgggcgtg 2220

aaccagcgca tggacagtta cgcgcacatg aacggctgga gcaacggcag ctacagcatg 2280

atgcaggacc agctgggcta cccgcagcac ccgggcctca atgcgcacgg cgcagcgcag 2340

atgcagccca tgcaccgcta cgacgtgagc gccctgcagt acaactccat gaccagctcg 2400

cagacctaca tgaacggctc gcccacctac agcatgtcct actcgcagca gggcacccct 2460

ggcatggctc ttggctccat gggttcggtg gtcaagtccg aggccagctc cagcccccct 2520

gtggttacct cttcctccca ctccagggcg ccctgccagg ccggggacct ccgggacatg 2580

atcagcatgt atctccccgg cgccgaggtg ccggaacccg ccgcccccag cagacttcac 2640

atgtcccagc actaccagag cggcccggtg cccggcacgg ccattaacgg cacactgccc 2700

ctctcacaca tgtga 2715

<210> 2

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60

cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120

aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180

tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240

agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300

aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360

gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420

ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaaggt 480

gcctgccctc tagtttacgc gtgggggcgg ccggccgctt tctcgaggcc atcgatgttt 540

aaacgatccg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat 600

aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg 660

tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 720

tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt 780

cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 840

acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 900

cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 960

tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 1020

ggcctcggta cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc 1080

cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataaatggcc acaccgcgaa 1140

ttaattcgat tccgcatgca tggagataca cctacattgc atgaatatat gttagatttg 1200

caaccagaga caactgatct ctactgttat gagcaattaa atgacagctc agaggaggag 1260

gatgaaatag atggtccagc tggacaagca gaaccggaca gagcccatta caatattgta 1320

accttttgtt gcaagtgtga ctctacgctt cggttgtgcg tacaaagcac acacgtagac 1380

attcgtactt tggaagacct gttaatgggc acactaggaa ttgtgtgccc catctgttct 1440

cagaaaccat aa 1452

Claims (10)

1.一种用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞的重编程因子组合，其特征在于，所述重编程因子组合选自OCT4、SOX2、E6、E7、KLF4、L-MYC、LIN28、NANOG、SV40LT；

优选地，所述重编程因子组合为OCT4、SOX2、E6、E7；

更优选地，所述重编程因子组合的形式包括DNA、RNA、蛋白质；

最优选地，所述DNA为cDNA、RNA为mRNA。

2.一种用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞的重编程因子载体，其特征在于，所述重编程因子载体包括将权利要求1中所述的重编程因子在一个和/或多个骨架载体中编码得到的重编程因子载体；

优选地，所述骨架载体包括pEGFP N1、pCMVp-NEO-BAN、pEGFP、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4；

更优选地，所述骨架载体为pEGFP N1；

优选地，所述重编程因子载体包括下列一种和/或多种重编程因子载体：编码OCT4的载体、编码SOX2的载体、编码E6的载体、编码E7的载体、编码OCT4和SOX2的载体、编码OCT4和E6的载体、编码OCT4和E7的载体、编码SOX2和E6的载体、编码SOX2和E7的载体、编码E6和E7的载体、编码OCT4和SOX2和E6的载体、编码OCT4和SOX2和E7的载体、编码OCT4和E6和E7的载体、编码SOX2和E6和E7的载体、编码OCT4和SOX2和E6和E7的载体；

更优选地，所述重编程因子载体包括下列两种重编程因子载体：编码OCT4和SOX2的载体、编码E6和E7的载体；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2通过间隔序列连接和/或直接连接；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2通过间隔序列连接；

最优选地，所述间隔序列包括IRES和/或自剪切多肽2A；

最优选地，所述自剪切多肽2A选自T2A、P2A、E2A、F2A；

最优选地，所述间隔序列为IRES；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2的连接方式包括：OCT4、IRES、SOX2依次串联、SOX2、IRES、OCT4依次串联；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体中的OCT4和SOX2的连接方式为OCT4、IRES、SOX2依次串联；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7通过间隔序列连接和/或直接连接；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7通过间隔序列连接；

最优选地，所述间隔序列包括IRES、自剪切多肽2A和/或任意两个核苷酸；

最优选地，所述自剪切多肽2A选自T2A、P2A、E2A、F2A；

最优选地，所述任意两个核苷酸选自AA、TT、CC、GG、AT、TA、AC、CA、AG、GA、TC、CT、TG、GT、CG、GC；

最优选地，所述间隔序列为IRES；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7的连接方式包括：E6、IRES、E7依次串联、E7、IRES、E6依次串联；

最优选地，所述编码E6和E7的载体中的E6和E7的连接方式为E6、IRES、E7依次串联；

最优选地，所述编码OCT4和SOX2的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

最优选地，所述编码E6和E7的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种体细胞来源的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：向体细胞中递送权利要求1所述的重编程因子组合；

优选地，所述重编程因子组合的递送是通过将重编程因子载体导入体细胞中实现的；

更优选地，所述导入的方式包括电转染法、显微注射法、基因枪法、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙共沉淀转染法、人工脂质体法；

最优选地，所述导入的方式为电转染法；

最优选地，所述重编程因子载体为权利要求2所述的重编程因子载体；

最优选地，所述重编程因子载体的用量为：80～200万体细胞/100μL中加入0.5-8μg编码OCT4和SOX2的载体和编码E6和E7的载体；

优选地，对导入重编程因子载体得到的体细胞进行培养；

更优选地，将导入重编程因子载体得到的体细胞在细胞培养板中进行培养；

最优选地，所述细胞培养板为细胞外基质蛋白包被的培养板；

最优选地，所述细胞外基质蛋白包括层粘连蛋白；

最优选地，所述层粘连蛋白为人层粘连蛋白-521；

最优选地，所述细胞培养板中还包括造血干细胞；

更优选地，在培养第3天时半换液，使用E8培养基继续培养2-4天后进行全换液，使用E8培养基继续培养至形成大量克隆；

最优选地，对得到的克隆进行筛选标记并进行分选，得到体细胞来源的诱导多能干细胞；

最优选地，所述的筛选标记包括SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81、SSEA3、OCT4、SOX2、NANOG；

最优选地，所述的筛选标记选自SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81；

最优选地，所述的筛选标记为SSEA4、TRA-1-60；

最优选地，所述的分选是采用流式细胞分选技术进行的；

优选地，所述体细胞包括外周单核血细胞、成纤维细胞、脐带血细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、造血干细胞、胰岛细胞、胃上皮细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、脂肪细胞、胰腺β细胞、角质形成细胞、间充质基质细胞、上皮细胞、内皮细胞。

4.一种体细胞来源的诱导多能干细胞或细胞群体，其特征在于，所述诱导多能干细胞或细胞群体为采用权利要求3所述的方法制备得到的。

5.一种重编程体细胞，其特征在于，所述重编程体细胞为将权利要求2所述的重编程因子载体导入到体细胞中得到的细胞；

优选地，所述导入的方式包括电转染法、显微注射法、基因枪法、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙共沉淀转染法、人工脂质体法；

更优选地，所述导入的方式为电转染法；

优选地，所述体细胞包括外周单核血细胞、成纤维细胞、脐带血细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞、造血干细胞、胰岛细胞、胃上皮细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、脂肪细胞、胰腺β细胞、角质形成细胞、间充质基质细胞、上皮细胞、内皮细胞。

6.一种用于将体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基为添加有选自OCT4蛋白、SOX2蛋白、E6蛋白、E7蛋白、KLF4蛋白、L-MYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白、SV40LT蛋白的培养基；

优选地，所述培养基为添加有OCT4蛋白、SOX2蛋白、E6蛋白、E7蛋白的培养基。

7.一种用于产生诱导多能干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的重编程因子组合、权利要求2所述的重编程因子载体和/或权利要求5所述的重编程体细胞。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

9.一种体细胞来源的诱导多能干细胞单克隆挑取的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)选取对数生长期的细胞，消化细胞；

(2)使用筛选标记对步骤(1)得到的细胞进行标记；

(3)对步骤(2)得到的标记后的细胞采用流式细胞分选技术进行分选；

(4)将步骤(3)得到的细胞分选到细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，完成细胞单克隆的挑取；

优选地，步骤(1)中所述消化细胞前还包括采用ROCK信号通路抑制剂处理细胞；

更优选地，所述处理时间为2h；

更优选地，所述ROCK信号通路抑制剂包括Thiazovivin、Belumosudil mesylate、SAR407899、BDP5290、Belumosudil(SLx-2119)、ZINC00881524、HA1100hydrochloride、Ripasudil(K-115)dihydrate、SR 3677、GSK180736A、Hydroxyfasudil hydrochloride、GSK269962A、Y-39983dihydrochloride、Fasudil、GSK429286A、RKI-1447、Fasudilhydrochloride、Y-27632dihydrochloride；

最优选地，所述ROCK信号通路抑制剂为Thiazovivin；

优选地，步骤(1)中所述消化细胞采用的消化液包括TRYPLE、胰蛋白酶、糜蛋白酶、肠激酶；

更优选地，步骤(1)中所述消化细胞采用的消化液为TRYPLE；

优选地，步骤(2)中所述的筛选标记包括SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81、SSEA3、OCT4、SOX2、NANOG；

更优选地，步骤(2)中所述的筛选标记选自SSEA4、TRA-1-60、SSEA1、TRA-1-81；

最优选地，步骤(2)中所述的筛选标记为SSEA4、TRA-1-60；

优选地，步骤(4)中所述的细胞培养板为细胞外基质蛋白包被的细胞培养板；

更优选地，所述细胞外基质蛋白包括层粘连蛋白；

最优选地，所述层粘连蛋白为人层粘连蛋白-521。

10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：

(1)E6、E7在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(2)权利要求1所述的重编程因子组合在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(3)权利要求2所述的重编程因子载体在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(4)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在产生分化细胞和/或分化细胞的前体细胞中的应用；

(5)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在构建疾病模型中的应用；

(6)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在构建肿瘤干细胞模型中的应用；

(7)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在制备治疗疾病的药物中的应用；

(8)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在筛选治疗疾病的候选药物中的应用；

(9)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在疾病治疗的药物评价中的应用；

(10)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在疾病的细胞治疗中的应用；

(11)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在细胞移植和组织修复中的应用；

(12)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在器官再生中的应用；

(13)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的应用；

(14)权利要求4所述的诱导多能干细胞或细胞群体、权利要求5所述的重编程体细胞在免疫细胞抗肿瘤治疗中的应用；

(15)权利要求6所述的培养基在制备体细胞来源的诱导多能干细胞中的应用；

(16)权利要求7所述的试剂盒在产生诱导多能干细胞中的应用；

(17)权利要求8所述的药物组合物在预防和/或治疗疾病中的应用；

优选地，所述疾病包括阿尔兹海默症、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合症、X染色体易损综合征、雷特综合征、亨廷顿病、家族性自主神经功能异常疾病、精神分裂症、共济失调疾病、糖尿病、心血管疾病、年龄相关性黄斑变性、近视性黄斑变性、斯特格氏病、肾脏疾病、肝脏疾病、肺部疾病、血友病、骨髓瘤；

优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、宫颈癌、外阴癌、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫内膜癌、腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、膀胱癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌。

Images