CN114032214A - Msi1 c端蛋白短肽在诱导和维持人胚胎干细胞原始态中的应用 - Google Patents
Msi1 c端蛋白短肽在诱导和维持人胚胎干细胞原始态中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,是MSI1 C端蛋白短肽在诱导和维持人胚胎干细胞原始态中的应用。
背景技术
和Primed状态下的干细胞在体外培养下或者在畸胎瘤实验中都具有分化为三胚层细胞系的能力,但研究表明只有状态的胚胎干细胞具有全能性,能够形成嵌合体胚胎。在四倍体囊胚中注射干细胞即四倍体补偿实验(检验干细胞全能性的金标准)中,只有状态下的干细胞能够生长发育为个体,而Primed状态下的干细胞不但在四倍体补偿实验中不能发育为成熟个体,而且在嵌合体胚胎实验中也极易发生凋亡。这些现象均说明状态下的干细胞具有比Primed状态下干细胞更高的全能性。
中国专利申请:CN201310239565.0公开了一种人皮肤干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法,利用机械法分离人皮肤干细胞,体外培养人皮肤干细胞,利用人皮肤干细胞体外形成拟胚体的方法进行分化,分化后用骨形态发生蛋白-4、干细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子体外诱导14天,可获得一些能够表达早期生殖细胞基因的原始生殖细胞样细胞;之后采用猪的卵泡液进行诱导。本发明方法获得了与体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达原始生殖细胞样细胞,细胞荧光分析体外诱导得到的原始生殖细胞样细胞表达Stra8和Dazl,能够达到早期减数分裂。
中国专利申请:CN201710500403.6公开了一种建立家族遗传性卵巢早衰来源的诱导全能干细胞向原始生殖嵴细胞诱导分化的方法,该方法应用家族遗传性卵巢早衰病人的成体细胞,通过在体外重编程为诱导的全能干细胞,然后诱导分化为卵母细胞的前体细胞原始生殖嵴细胞。
但是关于本发明MSI1 C端蛋白短肽在诱导和维持人胚胎干细胞原始态中的应用目前还未见报道。
发明内容
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
第一方面,本发明提供了MSI1 C端蛋白短肽在制备诱导胚胎干细胞原始态的试剂盒中的应用。
第二方面,本发明提供了MSI1 C端蛋白短肽在制备维持胚胎干细胞原始态的试剂盒中的应用。
优选地,所述胚胎干细胞包括人胚胎干细胞。
第三方面,本发明提供了MSI1 C端蛋白短肽在制备形成异种嵌合体胚胎试剂盒中的应用。
优选地,所述的异种嵌合体胚胎包括人-猪嵌合体胚胎。
第四方面,本发明提供了一种提高胚胎干细胞原始态诱导率和提高原始态稳定性的方法,其特征在于,包括使用MSI1 C端蛋白短肽的步骤。
优选地,MSI1 C端蛋白短肽可以促进胚胎干细胞原始态转换效率。
优选地,MSI1 C端蛋白短肽可以维持干细胞25代原始态的稳定性。
本发明优点在于:
附图说明
附图1是证明成功构建内源性表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞系H9-Clone8,其中:
A)基因编辑内源性表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞及检测引物示意图;
B)基因组PCR检测证实H9-Clone8细胞系的MSI1基因发生缺失;
C)免疫荧光检测MSI1N端证实H9-Clone8细胞系表达的MSI1缺失N端;
D)免疫荧光检测MSI1 C端证实H9-Clone8细胞系表达的MSI1具有C端。
B)QPCR检测证实内源性表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞系H9-Clone8在向状态诱导后,干细胞多能性标志基因POU5F1、NANOG、KLF4与状态标志基因TBX3、DNMT3L具有更高的表达;
C)成克隆实验证实内源性表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞系H9-Clone8具有更强的成克隆能力。
A)Western检测过表达MSI1全长细胞系H9-Flag-MSI1、MSI1 C端蛋白短肽MSI1138-362细胞系H9-Flag-MSI1V138和MSI1 C蛋白端短肽MSI1272-362细胞系H9-Flag-MSI1V272。结果证实成功构建过表达MSI1 C端蛋白短肽的人胚胎干细胞系;
C)状态的人胚胎干细胞传代至25代后进行类囊胚诱导,结果证实对照组细胞H9-Vector和过表达MSI1全长细胞系H9-Falg-MSI1无法形成类囊胚,过表达MSI1 C端蛋白短肽MSI1138-362细胞系H9-Flag-MSI1V138和MSI1 C端蛋白短肽MSI1272-362细胞系H9-Flag-MSI1V272仍可以形成类囊胚。
附图4是人MSI1基因及氨基酸序列,NCBI数据库ID:NM_002442.4。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1方法及结果
(1)基因编辑获取内源性表达MSI1 C端蛋白短肽的人胚胎干细胞
基因编辑所使用的gRNA位点如图1A所示。使用InvitrogenTM精密gRNA合成试剂盒(A29377)合成靶向MSI1基因gRNA。gRNA序列为:
gRNA1:5’-TGGGGCGCGTCAGTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.1)
gRNA2:5’-CTCACCTCGGTGCCGGTTGG-3’(SEQ ID NO.2)。
将合成到的gRNA与Cas9蛋白按下体系混合
管1组分见表1,管2组分见表2
表1:gRNA1
表2:gRNA2
将管中组分混合均匀置于室温5-20min使gRNA与Cas9蛋白结合,再将管1与管2混合置于冰上待用。
使用Accutase(Thermo A1110501)消化人胚胎干细胞,5min,37℃。反复吹打为单细胞。加入两倍体积的PBS终止消化,转移至离心管,500g,3min离心。加入1mL PBS重悬细胞,洗一次并计数。取2×105的细胞500g,5min离心。小心尽可能吸净上清,加入10μLResuspension Buffer R重悬细胞。取5μL重悬的细胞与gRNA-Cas9蛋白复合物混合,使用10μL电转头吸取细胞-gRNA-Cas9蛋白混合物置于电转室中,电转参数为1200V/20 ms/2 plus(电转系统为Neon,Thermo MPK5000)。将电转后的细胞转移到预热好的含有10μM Y27632mTeSR1培养液的六孔板一孔中。第二天换为不含Y27632的mTeSR1培养基。约7天后标记圆形的单克隆,使用枪头刮下一部分细胞提取基因组。
使用验证PCR验证基因组敲除情况。引物序列为:
验证基因组成功缺失引物:
Cut-Forward:5’-CAGGGACCTGAGAGGGAAGA-3’(SEQ ID NO.3)
Cut-Reverse:5’-ATCCAGCCCCACTCTCATCT-3’(SEQ ID NO.4)
产生的PCR产物大小为950bp或小于950bp。
验证基因组未成功缺失引物:
Uncut-Forward:5’-AAGGAGTGTCTGGTGATGCG-3’(SEQ ID NO.5)
Uncut-Reverse:5’-AGAGTTCACAGAAGCCACCG-3’(SEQ ID NO.6)
产生的PCR产物大小为608bp。
PCR鉴定结果如图1B所示。
将成功发生缺失的细胞挑出进一步扩增培养。利用免疫荧光染色技术,分别使用识别MSI1蛋白N端抗体(Abcam 52865)和识别MSI1蛋白C端抗体(GeneTex GT2377)检测细胞内MSI1蛋白的表达情况。结果如图1C和1D所示:与野生型细胞相比识别MSI1蛋白N端抗体检测为阴性,识别MSI1蛋白C端抗体检测为阳性,信号定位于细胞核。
步骤1:
将人胚胎干细胞转移至Feeder细胞上培养两代,使细胞适应Feeder培养环境。待细胞适应后吸去培养液,加入PBS洗一遍,使用Accutase消化在Feeder培养环境下的人胚胎干细胞,5min,37℃。反复吹打为单细胞。加入两倍体积的PBS,转移至离心管,500g,3min离心。去上清,加入MEF培养基将细胞重悬,将细胞悬液转移到培养皿中。放入细胞培养箱中静置30min使Feeder贴壁去除Feeder细胞。取培养皿上清,转移至离心管中500g,3min离心。用mTeSR1重悬细胞,细胞计数。将细胞悬液转移到提前一天铺好Feeder的培养皿中,2×105细胞/12孔板一孔,培养基为mTeSR1,并加入ROCK抑制剂Y27632,终浓度为10μM。第二天吸去含有Y27632的mTeSR1培养液,换为5i/L/A培养液。每隔一天换液,在诱导期间会有一波细胞死亡的高峰期,可用PBS洗一遍去除死细胞。在第10天左右能看到致密球形的人胚胎干细胞克隆。可挑取形态良好的细胞克隆或直接传代扩增。克隆形态如图2A。5i/L/A培养液配方见下表3。
步骤2:
使用TRIzolTM试剂(Thermo,15596018)提取RNA,使用Uni All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR(One-Step
gDNA Removal)(北京全式金,AU341-02)试剂盒进行逆转录获得cDNA。使用PowerUpTM SYBRTM Green预混液(Thermo,A25779)进行QPCR检测状态标志基因表达量,检测引物序列如下表4,其中GAPDH为内参引物。
表4检测引物序列
检测结果如图2B所示,内源表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞在诱导中,标志基因具有更高的表达。结晶紫染色结果如图2C所示内源表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞具有更多的克隆形成。以上结果说明基因编辑后的内源表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞具有更高的诱导效率。
(3)构建过表达MSI1 C端蛋白短肽的人胚胎干细胞系
步骤1:构建MSI1 C端短肽过表达载体
本实施例中过表达载体为CSll-EF-MSC,载体购自于Addgene,并进行改造:使用PCDNA3.1(购自于Invitrogen公司)的多克隆位点替换了原本过表达基因。
本实施例中使用MSI1 C端短肽特异性引物扩增含有Flag标签的MSI1片段。实现表达Flag融合MSI1 C端短肽重组蛋白。
使用的引物如下:
BamH1-Flag-MSI1:
5’-AAAGGATCCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGGAGACTGACGCGCCC-3’(SEQ IDNO.19)
EcoRV-Flag-MSI1-R:
5’-AAAGATATCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTGGTACCCATTGGTGAAGGCTG-3’(SEQID NO.20)
PCR产物大小为1161bp
BamH1-Flag-MSI1V138-F:
5’-AAAGGATCCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGCTGATGTTCGACAAAACCACC-3’(SEQID NO.21)
EcoRV-Flag-MSI1-R:
5’-AAAGATATCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTGGTACCCATTGGTGAAGGCTG-3’(SEQID NO.20)
PCR产物大小为756bp
BamH1-Flag-MSI1V272-F:
5’-AAAGGATCCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGTGGAATGTAAGAAAGCTCAGCCAA-3’(SEQ ID.22)
EcoRV-Flag-MSI1-R:
5’-AAAGATATCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTGGTACCCATTGGTGAAGGCTG-3’(SEQID 20)
PCR产物大小为627bp
以常规方法提取人胚胎干细胞RNA,然后使用InvitrogenTM SuperScript IVFirst-Strand Synthesis System将RNA反转录成cDNA,以cDNA为模板,通过PCR扩增出长度为1125、720bp和591bp的片段,通过限制性内切酶BamHI和EcoRV酶切,构建到CSll-EF-MSC载体中,最终构建成CSll-EF-MSI1V138和CSll-EF-MSI1V272载体,用于表达Flag-MSI1、Flag-MSI1V138和Flag-MSI1V272融合蛋白。
步骤3:包装慢病毒
用293FT细胞进行转染包装慢病毒,以转染100mm培养皿的293FT细胞为例。取汇合度约为90%-100%的293FT细胞,吸去MEF培养液。加入5mL PBS洗涤一遍。加入3mL 0.05%trypsin-EDTA 37℃消化5分钟。反复吹打至单细胞,转移到15mL离心管中加入6mL MEF中和胰酶,500g,5min离心。
用MEF培养液重悬细胞1:2细胞传代。
第二天细胞密度约为80%此时细胞形态伸展适合转染制备病毒。
使用Lipofectamine 3000转染系统获得高质量病毒,按下表5加入以下组分
表5各管组分
将管A与管B混合,室温静置10min。
将转染混合液逐滴加入细胞培养皿中,轻柔混匀培养液。
转染6h后换为Lentivirus packing medium(DMEM,5%FBS,1×GlutaMAX,100mMSodium Pyruvate)。
转染24h后收集第一批含有病毒的上清液,置于4℃。
转染52h后收集第二批含有病毒的上清液,与第一波收集的上清混合。
3000g,10min离心上清液,用0.45μm的针式过滤器过滤上清去除细胞碎片。
加入上清三分之一体积的40%PEG8000,置于旋转混合仪上,4℃混合过夜。
16000g,4℃1h离心,去上清,加入500μL DMEM/F12重悬病毒沉淀。分装病毒液-80℃冻存。
步骤3:人胚胎干细胞的病毒感染
吸去mTeSR1培养液,加入PBS洗一遍,使用Accutase消化人胚胎干细胞,5min,37℃。反复吹打为单细胞。加入两倍体积的PBS终止消化,转移至离心管,500g,3min离心。
加入mTeSR1培养液重悬细胞,并计数。
取2×105的细胞,接种入预先铺被好Matrigel的24孔板中。培养液中加入终浓度为10μM的Y27632防止细胞凋亡。
加入100μL病毒液与细胞混匀,12h后换液去除死细胞。
利用Western blot检测过表达情况,结果如图3A所示融合蛋白均能在人胚胎干细胞中过表达。
参照方法(2)步骤1的方法将细胞诱导为状态,然后参照方法(2)步骤2的方法检测状态标志基因的表达量。结果如图3B所示,与野生型细胞相比过表达Flag-MSI1V138和Flag-MSI1V272的人胚胎干细胞具有更高的表达量。说明过表达MSI1 C端短肽的Flag-MSI1V138和Flag-MSI1V272可以提高人胚胎干细胞诱导效率。
将方法(4)过表达MSI1 C端短肽的状态人胚胎干细胞传代25代。然后利用Accutase消化细胞,将细胞团打散为单细胞。离心沉淀后用类囊胚诱导培养基(DMEM/F12,1×N2,1×B27+,1.5mM PD0325901,1mM A83-01,10mM Y-27632)重悬计数,200个细胞一孔转移入U型底低吸附96孔板中,400g离心3分钟。在细胞培养箱中培养48小时后观察类囊胚形成。如图3C所示野生型和过表达MSI1全长蛋白的人胚胎干细胞不能形成类囊胚,而过表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞可以形成类囊胚。说明MSI1 C端蛋白可以稳定人胚胎干细胞的状态,使其在传代25代后仍然具有全能性
2结论
结果见图1-3。其中,图1表明成功构建内源性表达MSI1 C端短肽的人胚胎干细胞系H9-Clone8。图2表明内源性表达MSI1 C端蛋白短肽的人胚胎干细胞具有更高的诱导效率。图3表明MSI1 C端蛋白短肽可以提高诱导效率,并且延长细胞形成类囊胚的潜能,维持了的状态。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市同济医院
<120> MSI1 C端蛋白短肽在诱导和维持人胚胎干细胞原始态中的应用
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<170> PatentIn version 3.3
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a 61
Claims (8)
1.MSI1 C端蛋白短肽在制备诱导胚胎干细胞原始态的试剂盒中的应用。
2.MSI1 C端蛋白短肽在制备维持胚胎干细胞原始态的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1-2任一所述的应用,其特征在于,所述胚胎干细胞包括人胚胎干细胞。
4.MSI1 C端蛋白短肽在制备形成异种嵌合体胚胎试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的异种嵌合体胚胎包括人-猪嵌合体胚胎。
6.一种提高胚胎干细胞原始态诱导率和提高原始态稳定性的方法,其特征在于,包括使用MSI1 C端蛋白短肽的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,MSI1 C端蛋白短肽可以促进胚胎干细胞原始态转换效率。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,MSI1 C端蛋白短肽可以维持干细胞25代原始态的稳定性。
Priority Applications (1)
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