CN112831462A - 诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物、培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物、培养基及方法,属于生物技术和基础医学领域。本发明在非整合的重编程基础上,利用小分子化合物ID‑8提高了人体细胞重编程为iPSC的效率。利用小分子化合物ID‑8和Kartogenin建立了无生长因子的iPSC细胞重编程体系。开发了低浓度生长因子bFGF、ID‑8、Kartogenin和E6基础培养基的组合物作为人胚胎干细胞培养体系。本发明一定程度上解决了体细胞在非整合重编程过程效率低以及人胚胎干细胞培养价格昂贵的问题,为获得临床治疗的iPSC提供了重要的研究基础,降低科学研究的成本,提高了iPSC临床转化的潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其是诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物、培养基及方法。
背景技术
随着细胞研究的发展,成体细胞可以通过重编程改变基因表达谱,重新获得多能干性。早期体细胞重编程的方法主要有体细胞核移植和细胞融合,但这两种方法仍然存在发育异常、免疫缺陷和伦理问题等问题。2006年,Takahashi和Yamanaka筛选出4个转录因子OSKM:Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc组合,可将终末分化的体细胞重编程为具有胚胎干细胞特性的iPSCs(诱导性多能干细胞,induced pluripotent stem cells),极大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。现在,iPSCs的研究应用体系日趋成熟,但也面临着重编程效率低、重编程机制不清楚、重编程细胞异质性强和安全性问题等缺陷。有研究报道了一种简单高效的、非整合的人类体细胞重编程方法(Okita K,et al.Nat Methods.2011)。利用p53抑制和L-myc,以及外源性质粒载体(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28和NANOG),制备人诱导多能干细胞,有望为细胞治疗提供重要支持。
用于细胞治疗和药物研发的人多能干细胞,需要化学成分明确无异源性因子(比如来源动物的生长因子、血清等)的培养系统。在现有的hPSC培养体系中,mTeSR干细胞培养基优化而来的Essential 8(E8)是最简单的培养基,能够支持hiPSCs的产生和稳定传代、成分明确且不含血清白蛋白。其中胰岛素和转铁蛋白能广泛生产,很容易从低成本的商业来源获得。然而TGFβ、bFGF价格昂贵,且bFGF在37℃培养条件下易失活,需要每天更换新鲜培养基,阻碍了hiPSCs在临床和大规模工业生产中的使用,并且加重了科研负担。
bFGF和TGFβ调控hPSC多能性的复杂信号通路,目前还没有找到合适的化学替代品。研究报道,Wnt信号通路激活剂Wnt3a与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)抑制剂ID-8能够替代TGFβ和bFGF(Hasegawa K,et al.Stem Cells Transl Med.2012),但是Wnt3a蛋白的价格依然昂贵。还有研究发现,Wnt信号通路激活剂CHIR99021能够替代Wnt3a的作用与ID-8协同维持干细胞的多能性并促进增殖能力(Yasuda SY,et al.Nat BiomedEng.2018),但并无法实现长期的培养。Wnt信号通路的另一个激活剂1-azakenpaullone(AK)与ID-8结合能够长期维持生长,但是细胞增殖缓慢;在这基础上添加钙调磷酸酶/NFAT信号通路抑制剂Tacrolimus(T)能够达到与E8培养基相同的作用效果,但是由于针对不同干细胞系其使用浓度跨度从20pM-200pM,限制了该培养基的广泛使用。
发明内容
基于背景技术中介绍的现有研究存在的一些缺陷,本发明提供诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物、培养基及方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明第一方面,提供Kartogenin在制备诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物中的应用。
在本发明的一个实施方式中,所述Kartogenin与ID-8组合在制备诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物中的应用。
在本发明的一个实施方式中,所述Kartogenin与ID-8、及生长因子bFGF组合在制备诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物中的应用。
本发明第二方面,提供一种用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物,包括Kartogenin与ID-8。
在本发明的一个实施方式中,用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物,包括Kartogenin与ID-8、及生长因子bFGF。
在本发明的一个实施方式中,所述ID-8的浓度为100nM至2μM,优选为200-300nM,进一步优选为250nM;
在本发明的一个实施方式中,所述Kartogenin的浓度为100nM至2μM,优选为200-500nM,进一步优选为500nM;
在本发明的一个实施方式中,所述生长因子bFGF的浓度为50ng/ml。
本发明用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物,该组合物基于OCT4、SOX2、KLF4、L-myc、LIN28五个转录因子及敲低P53实现人体细胞重编程;能够促进人体细胞重编程及维持克隆生长。
本发明第三方面,提供一种用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基,在E6培养基的基础上,还加入Kartogenin及ID-8,所述E6培养基,是指商业化Essential 8培养基中去除生长因子bFGF和TGFβ。
在本发明的一个实施方式中,用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基,在E6培养基的基础上,还加入Kartogenin、ID-8及生长因子bFGF。
在本发明的一个实施方式中,用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基中,所述ID-8的浓度为100nM至2μM,优选为200-300nM,进一步优选为250nM;
在本发明的一个实施方式中,用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基中,所述Kartogenin的浓度为100nM至2μM,优选为200-500nM,进一步优选为500nM;
在本发明的一个实施方式中,用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基中,所述生长因子bFGF的浓度为50ng/ml。
在本发明的一个实施方式中,用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基,为在E6培养基的基础上,还加入Kartogenin、ID-8及生长因子bFGF,ID-8的浓度为500nM,Kartogenin的浓度为500nM,bFGF的浓度为50ng/ml。
本发明第四方面,提供一种将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的方法,在人体细胞培养的过程中,加入Kartogenin与ID-8,优选加入bFGF,促使人体细胞重编程为诱导多能干细胞。
在本发明的一个实施方式中,所述人体细胞选择为人皮肤细胞。
在本发明的一个实施方式中,提供一种将人皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞的方法,包括如下步骤:
用成纤维细胞培养基培养人皮肤成纤维细胞至90-95%的密度;
第-3天,人皮肤成纤维细胞中加入能够实现OCT4、SOX2、KLF4、L-myc、LIN28过表达的质粒载体,以及敲低p53的质粒载体,实现OCT4、SOX2、KLF4、L-myc、LIN28过表达和p53敲低;皮肤成纤维细胞转染后在成纤维细胞培养基中培养2天;第-1天,将细胞重新消化接种于新的培养皿中;
第0天,开始加入能够促进人皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞的小分子药物ID-8进行诱导,从加入能够促进人皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞的小分子药物ID-8开始,培养基换为E6培养基,每天更换新鲜培养基且加入小分子化合物ID-8;
第7天,再向E6培养基中加入能够维持诱导多能干细胞克隆增殖的小分子药物ID-8和Kartogenin,保持每天更换新鲜培养基继续培养至21天,进行挑克隆建立细胞系;
其中,第-3天指的是电转染质粒的当天,第-1天指的是电转染质粒后的第2天,第0天指的是电转染质粒后第3天,第7天指的是从第0天起算的第7天。
在本发明的一个实施方式中,ID-8的浓度为500nM,Kartogenin的浓度为500nM。
所述E6培养基,是指商业化Essential 8培养基中去除生长因子bFGF和TGFβ。
本发明发现在基于OCT4、SOX2、KLF4、L-myc、LIN28五个转录因子及敲低P53实现人体细胞重编程的方法中,通过加入小分子药物,能够提高人体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。
本发明在非整合型体细胞重编程的基础上进行高通量化合物筛选,从表观修饰、信号通路及细胞增殖调控和代谢相关的化合物中筛选出能够促进体细胞重编程的小分子化合物。其次,筛选出能够替代bFGF和TGFβ作用的小分子化合物,建立无生长因子的重编程体系和新的iPSCs扩增培养体系。目的是利用具有稳定可控化合物提高重编程效率、揭示重编程潜在的机制,构建稳定高效的诱导体系,降低制备人胚胎干细胞系及培养的成本,提高iPSCs临床应用潜力。
本发明发现TGFβ信号通路激活剂Kartogenin(K)与ID-8能够维持并促进iPSC克隆的形成,染色结果呈TRA-1-60阳性,边界致密,且克隆明显大于ID-8/AK和ID-8/T组合。
本发明研究发现,在非整合的重编程基础上,利用小分子化合物ID-8提高了人体细胞重编程为iPSC的效率。利用小分子化合物ID-8和Kartogenin建立了无生长因子的iPSC细胞重编程体系。开发了低浓度生长因子bFGF、ID-8、Kartogenin和E6基础培养基的组合物作为人胚胎干细胞培养体系。本发明一定程度上解决了体细胞在非整合重编程过程效率低以及人胚胎干细胞培养价格昂贵的问题,为获得临床治疗的iPSC提供了重要的研究基础,降低科学研究的成本,提高了iPSC临床转化的潜力。
附图说明
图1为背景技术中非整合型诱导iPSC高通量化合物筛选过程,包括图1A、图1B、图1C。
图1A:本发明中细胞重编程过程的模式图,FM:皮肤细胞培养基;
图1B:13个小分子化合物高通量筛选的结果统计图,CHIR99021 3μM、1-azakenpaullone 500nM、XAV939 1μM、VPA 0.5mM、SB432542 1μM、RepSox 1μM、DAPT 2.5μM、LDN193189 50nM、SAG 100nM、Y2763 10μM、Forskolin 10μM、JQ-1 50nM、ID-8 500nM;三次独立生物学重复试验,***,P<0.001;
图1C:分别为各个小分子化合物处理之后的TRA-1-60免疫染色代表图。
图2为ID-8促进非整合型诱导iPSC的效率,包括图2A、图2B、图2C、图2D、图2E。
图2A:ID-8在不同浓度下处理原代成纤维细胞的统计结果图,三次技术重复试验,***,P<0.001;
图2B:ID-8在不同时间阶段处理原代成纤维细胞的统计结果图,三次技术重复试验,*,**,P<0.05,P<0.01;
图2C:左图为对照组,右图为ID-8在250nM处理原代成纤维细胞7天后的TRA-1-60免疫染色代表图;
图2D:C图的统计分析,三次独立生物学重复试验,**,P<0.01;
图2E:左图为对照组,右图为ID-8在250nM处理星形胶质细胞7天后的TRA-1-60免疫染色代表图;
图2F:E图的统计分析,三次独立生物学重复试验,***,P<0.001。
图3为无生长因子重编程体系的小分子化合物初筛,包括图3A、图3B、图3C、图3D。
图3A:本发明中无生长因子重编程体系筛选模式图,FM:皮肤细胞培养基;
图3B:在E6培养条件下筛选与ID-8 500nM共同维持诱导性多能干细胞增殖的小分子化合物,CHIR99021 3μM、1-azakenpaullone 500nM、Tacrolimus 20pM;
图3C:在E6培养条件下ID-8 500nM与不同浓度梯度的Kartogenin形成的iPSCs克隆的TRA-1-60免疫染色代表图;
图3D:在E6培养条件下ID-8 500nM与不同浓度梯度的Kartogenin形成的iPSCs克隆数量统计。
图4为无生长因子重编程体系的建立,包括图4A、图4B、图4C、图4D、图4E。
图4A:在不同时间点成纤维细胞向iPSC转变的形态变化;
图4B:成纤维细胞重编程的IK处理组和对照E6及E8的TRA-1-60免疫染色代表图;
图4C:B图的统计分析,三次独立生物学重复试验,*,P<0.05;
图4D:星形胶质细胞重编程的IK处理组和E6的TRA-1-60免疫染色代表图;
图4E:D图的统计分析,三次独立生物学重复试验,***,P<0.001。Scale bar为100μm。
图5为IK-iPSC多能性鉴定,包括图5A、图5B、图5C、图5D。
图5A:在E8培养基中培养的第1代挑出的克隆IK-iPSCs;
图5B:在IK培养基中培养的第1代挑出的克隆IK-iPSCs;
图5C:多能性干细胞基因的免疫荧光染色代表图。Scale bar为100μm;
图5D:IK-iPSCs染色体核型分析。
图6为低生长因子培养体系的筛选。
500nM ID-8,500nM Kartogenin与不同化合物组合下维持干细胞多能性的初筛,包括1μM SB203580,1μM Go6983(GO)、5mΜ SP600125(SP)、2μM Doramapimod(Dora)、20pMTacrolimus(T)、500nM 1-azakenpaullone(AK)。
图7为低生长因子培养IKB体系的建立,包括图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F、图7G、图7H、图7I、图7J、图7K、图7L、图7M。
图7A-G:对照组E8培养基和IK与不同浓度bFGF组合培养条件下H9人胚胎干细胞克隆形态;
图7H:H9胚胎干细胞在IKB组合培养条件下的克隆形态;
图7I:IK-iPSC细胞系在IKB组合培养条件的克隆形态;
图7J:H9胚胎干细胞在IKB培养条件下的24小时生存曲线;
图7K:H9胚胎干细胞在IKB组合培养条件下的增殖曲线;
图7L:H9胚胎干细胞在IKB组合培养传代6次后进行多能性干细胞标志物的染色;
图7M:H9胚胎干细胞在IKB组合培养传代6次后可自发诱导为皮层类器官和定向诱导为抑制性的中间神经元类器官。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1非整合型诱导iPSC高通量化合物筛选
已有研究证实小分子化合物可以通过调节表观修饰、细胞信号通路和代谢途径达到提高体细胞重编程的效率,本申请研究从组蛋白修饰、Wnt信号通路、TGFβ信号通路、激酶相关的抑制剂和激动剂进行化合物筛选,首选了14个小分子化合物。在第-3天,将三个游离质粒载体(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F,addgene,27077;pCXLE-hSK,addgene,27078;pCXLE-hUL,addgene,27080)转染人原代成纤维细胞;第-1天,将细胞重新消化,并以1-2万个细胞每孔接种到12孔板中;第0天,加入不同的小分子化合物进行处理,隔天换液并加入相同浓度的小分子化合物处理7天;7天后,在E8培养基中培养至第21天,固定后进行TRA-1-60染色,统计阳性克隆数目(图1A)。实验结果显示:GSK抑制剂CHIR99021(C)、1-azakenpaullone(AK)和XAV-939,组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA和TGFβ信号通路抑制剂SB431542和RepSox轻微提高重编程的效率;而ID-8在500nM处理7天之后,能够显著性提高重编程的效率(图1B),并且形成的克隆增殖速度较快,边界清晰,克隆较大(图1C)。
其中,第-3天指的是电转染质粒的当天,第-1天指的是电转染质粒后的第2天,第0天指的是电转染质粒后第3天,第7天指的是从第0天起算的第7天。
实施例2ID-8促进非整合型诱导iPSC效率
为了确定初筛结果的可靠性,本申请对ID-8进行了处理剂量实验,发现100nM至2μM都能显著提高重编程的效率,在250nM时达到最高的重编程效率(图2A)。在上面实验结果基础上,进行处理时程的实验,在不同时间阶段给药处理,实验结果显示:ID-8短期处理不利于体细胞的转变,从第0天至11天的加药处理之后,iPSCs的诱导效率达到最高(图2B)。在长时间的处理过程中并没有发现ID-8对细胞的毒性作用。这些结果表明,ID-8在250nM给药处理11天为最适作用条件,本申请进行多次生物学重复后,证实在这条件下能够显著性提高重编程的效率,与对照组相比提高了13倍的诱导效率(图2C、D)。同时,本研究在人的原代星形胶质细胞中也进行验证,结果显示:ID-8在这一条件下也能显著性的促进星形胶质细胞向iPSCs的转变,并发现只需诱导14天就能形成致密的克隆,与对照组相比大约有17倍的促进效率(图2E、F)。
实施例3利用小分子化合物建立无生长因子的重编程体系
在前期筛选过程中,在E6培养基中只给药处理7天后更换为E8培养基培养至21天,为了重编程后期替代E8成分中bFGF和TGFβ。
因此,本发明通过小分子化合物在ID-8处理7天之后筛选替代E8成分中bFGF和TGFβ的作用,建立稳定的iPSC诱导体系(图3A)。首先针对细胞增殖和抑制细胞分化的信号通路中确定了几个可能有作用的小分子化合物。研究表明WNT和TGFβ信号通路对多能干细胞增殖与分化具有显著的调控作用,因此在ID-8的基础上进行小分子化合物Kartogenin(K)、CHIR99021(C)、1-azakenpaullone(AK)、Tacrolimus(T)初筛实验,结果显示:ID-8和C在给药处理7天之后并不能维持克隆的生长,前期产生的小克隆基本出现分化,固定染色之后只有少许细胞维持多能性;ID-8/AK和ID-8/T组合尽管能够维持细胞的多能性状态,但是克隆增殖缓慢,无法达到建立干细胞系的目的;而TGFβ信号通路激活剂K与ID-8组合则能够维持并促进iPSC克隆的形成,染色结果呈阳性,边界致密,克隆明显大于ID-8/AK和ID-8/T组合(图3B)。为了确定Kartogenin的最适作用浓度进行剂量依赖实验,结果显示:Kartogenin在2μM的高浓度时会导致细胞分化,在500nM形成的克隆数量最高(图3C、D)。
为了进一步确定ID-8和Kartogenin在重编程后期的作用,进行多次生物学重复。研究发现第0天ID-8/K(简称IK)组与对照组E6细胞均保持成纤维细胞的形态;第7天出现形态转变的细胞,并且IK处理组转变的细胞与对照组E6培养相比,转变细胞较多;第14天形成致密的小克隆。在IK处理组,克隆的生长速率明显高于E6对照组;培养至第20天IK组的克隆边界清晰,且克隆致密、细胞核质比高。然而E6对照组中,克隆无法维持干性,大多数细胞出现分化(图4A)。经过多次生物学重复试验,发现与E6和E8对照组相比,IK组在重编程后期能够维持克隆的生长并保持iPSC的多潜能性(图4B)。统计结果发现,与E8对照组相比有4.9倍,与E6相比有3.9倍的促进效率(图4C)。另外,星形胶质细胞在相同的条件下2周左右即可形成致密的克隆,而E6对照组形成的克隆由于培养时间较短,克隆中有部分细胞维持多能干细胞状态,免疫染色呈现TRA-1-60阳性,但是克隆周边细胞已经出现分化无致密的边界,不具有构建细胞系的条件(图4D)。统计结果显示,IK组合能够显著性提高星形胶质细胞的重编程效率,与E6对照组相比有4.3倍促进效率(图4E)。
实施例4IK-iPSCs为多潜能干细胞
在重编程过程中IK组合能够维持克隆形态,且显示ESC样特征,细胞核质比高,本申请研究进一步验证IK组合是否能够建成iPSC细胞系。挑出培养至20天的致密克隆分别在E8和IK中继续培养发现,在E8培养基中克隆扩增速度较快,且无分化的细胞出现(图5A),经过3天的培养,将细胞重新消化传代,能够聚成克隆,最后能够建成稳定传代的iPS细胞系。进行多能性干细胞标志物免疫荧光染色,实验结果显示:OCT3/4、SOX2、NANOG、TRA-1-60、SSEA4都显著性表达,且克隆边界清晰,无分化的细胞产生(图5C)。在IK组合中继续培养的克隆前两天保持边界清晰的状态,同时染色体核型分析正常(图5D),遗憾的是,随培养周期的延长,细胞逐渐发生分化,因此IK组合并不能完全替代生长因子TGFβ和bFGF在干细胞生长过程中维持干性的作用(图5B)。
实施例5建立IKB多能干细胞培养体系
为了维持IK-iPSCs的长期培养,本发明测试了将其他化合物与IK结合能否维持多能干细胞的多潜能性。首先,筛选出一些与维持多能性有关的小分子药物SB203580,Go6983,SP600125,Doramapimod,Tacrolimus及1-azakenpaullone,但这些组合不能完全取代生长因子的作用(图6A)。因此,考虑低浓度的生长因子bFGF是否可以维持克隆的正常增殖。H9在10ng/ml和20ng/ml bFGF的浓度条件下,发现传代两次后,出现分化的细胞(图7A-G)。但在50ng/ml bFGF的条件下,能够稳定传代培养胚胎干细胞的6代以上(图7H)。IK-iPS细胞系也可以在IK+bFGF(简写为IKB)中保持致密的克隆形态(图7I)。H9在IKB培养基中的生存指数约为200%,相比与E8培养基没有显著性差异(图7J)。H9细胞在IKB和E8培养基条件下的扩增速率不存在显著性差异(图7K)。通过对多能干细胞标记物染色,在IKB中培养的H9显著性高表达多能干细胞标志物OCT3/4、SOX2、NANOG、TRA-1-60和SSEA4(图7L)。在IKB中培养的H9也可被诱导为皮层类器官和腹侧端脑类器官(图7M)。这些结果表明人胚胎细胞可以在IKB培养基中长期培养并能维持多潜能干细胞状态。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.Kartogenin在制备诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物中的应用,其特征在于,所述Kartogenin与ID-8组合在制备诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物中的应用。
2.根据权利要求1所述Kartogenin在制备诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物中的应用,其特征在于,所述Kartogenin与ID-8、及生长因子bFGF组合在制备诱导人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物中的应用。
3.一种用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物,其特征在于,包括Kartogenin与ID-8。
4.根据权利要求3所述一种用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物,其特征在于,用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物,包括Kartogenin与ID-8、及生长因子bFGF。
5.根据权利要求3或4所述一种用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的组合物,其特征在于,所述ID-8的浓度为100nM至2μM,优选为200-300nM,进一步优选为250nM;
所述Kartogenin的浓度为100nM至2μM,优选为200-500nM,进一步优选为500nM;或,
所述生长因子bFGF的浓度为50ng/ml。
6.一种用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基,其特征在于,在E6培养基的基础上,还加入Kartogenin、ID-8及生长因子bFGF,所述E6培养基是指商业化Essential8培养基中去除生长因子bFGF和TGFβ。
7.根据权利要求6所述一种用于将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基,其特征在于,所述ID-8的浓度为100nM至2μM,优选为200-300nM,进一步优选为250nM;
所述Kartogenin的浓度为100nM至2μM,优选为200-500nM,进一步优选为500nM;
所述生长因子bFGF的浓度为50ng/ml。
8.一种将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的方法,其特征在于,在人体细胞培养的过程中,加入Kartogenin与ID-8,促使人体细胞重编程为诱导多能干细胞。
9.根据权利要求8所述一种将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的方法,其特征在于,所述人体细胞选择为人皮肤细胞;
将人皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞的方法,包括如下步骤:
用成纤维细胞培养基培养人皮肤成纤维细胞至90-95%的密度;
第-3天,人皮肤成纤维细胞中加入能够实现OCT4、SOX2、KLF4、L-myc、LIN28过表达的质粒载体,以及敲低p53的质粒载体,实现OCT4、SOX2、KLF4、L-myc、LIN28过表达和p53敲低;皮肤成纤维细胞转染后在成纤维细胞培养基中培养2天;第-1天,将细胞重新消化接种于新的培养皿中;
第0天,开始加入能够促进人皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞的小分子药物ID-8进行诱导,从加入能够促进人皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞的小分子药物ID-8开始,培养基换为E6培养基,每天更换新鲜培养基且加入小分子化合物ID-8;
第7天,再向E6培养基中加入能够维持诱导多能干细胞克隆增殖的小分子药物ID-8和Kartogenin,保持每天更换新鲜培养基继续培养至21天,进行挑克隆建立细胞系;
其中,第-3天指的是电转染质粒的当天,第-1天指的是电转染质粒后的第2天,第0天指的是电转染质粒后第3天,第7天指的是从第0天起算的第7天。
10.根据权利要求9所述一种将人体细胞重编程为诱导多能干细胞的方法,其特征在于,ID-8的浓度为500nM,Kartogenin的浓度为500nM。
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