CN109053903B

CN109053903B - 一种重组人CREG-Fc融合蛋白的制备及其应用

Info

Publication number: CN109053903B
Application number: CN201811060510.2A
Authority: CN
Inventors: 韩雅玲; 闫承慧; 田孝祥; 刘丹; 李洋; 罗安德; 刘睿; 陶荣; 段颖
Original assignee: Simcere Biological Medicine Technology Co ltd; General Hospital of Northern Theater Command of PLA
Current assignee: Simcere Biological Medicine Technology Co ltd; General Hospital of Shenyang Military Region
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2038-09-12
Also published as: CN109053903A

Abstract

本发明公开了一种重组人CREG‑Fc蛋白及其应用，本发明利用分子生物学和细胞生物学技术，构建人CREG全长蛋白与人IgG1Fc片段的融合蛋白；本发明提供的融合蛋白可用于高血压及高血压血管重塑的预防或治疗。

Description

一种重组人CREG-Fc融合蛋白的制备及其应用

技术领域

本发明主要涉及生物和医药技术领域，具体涉及一种新的重组人CREG-Fc融合蛋白、其制备方法及其用途。

背景技术

高血压是一种患病率高、致残率高的慢性非传染性疾病。高血压的诊断界值为收缩压>140mmHg或舒张压>90mmHg。中国现有高血压病人2.3亿。预计到2025年，全球约1/4成人(超过15亿人)达到高血压诊断标准。高血压是心脑血管病的独立危险因素，参与冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中、心力衰竭等疾病的发生发展。全球每年与高血压相关的死亡将达到1040万例。近几十年来，全球疾病负担的主要原因已经由传染性疾病过渡到非传染性疾病，其中高血压已成为全球负担的主要原因。此外，高血压是一种年龄相关性疾病，对于在中年阶段没有高血压的人群，在老年阶段将有90％的几率发生高血压。因此，高血压是老化的必然结局。随着人们寿命的延长及老龄化社会的到来，高血压的患病率将逐渐增加，高血压相关的危害也将日益加重。

血管重塑(血管重构)是指血管壁对血管损伤、血流改变及血管老化等因素作出的一系列结构及功能改变。研究表明，高血压是引起血管重塑的主要原因之一，而血管重塑是高血压引起靶器官损害的病理生理基础。虽然目前临床上已有ARB/ACEI、CCB、利尿剂、β受体阻滞剂及α受体阻滞剂用于高血压的治疗，但这些药物除ACEI外，均没有明确的对抗血管重塑的作用。因此，开发具有降压及对抗血管重塑的药物对高血压及高血压靶器官损伤的治疗具有重要意义。

人CREG蛋白含有220个氨基酸，是一种分泌型糖蛋白，含有3个糖基化位点，分子量约为24kDa。CREG蛋白在成人脑组织以外的多个脏器广泛表达，并且在成人心脏、血管、肝脏及肾脏等重要脏器高表达。研究表明，CREG基因在维持心血管系统稳态中发挥重要作用。本发明人所在实验室之前自主制备了人CREG-His融合蛋白，在小鼠模型中发现其具有多种心血管保护作用，包括降低血压及改善血管重构作用。但是，人CREG-His融合蛋白上的His标签属外源性蛋白，具有免疫原性，可激发机体免疫反应，因此不能用于临床治疗。

为克服上述缺点，本发明提供了制备重组人CREG与人IgG1Fc片段的融合蛋白的方法。第一，本发明采用的人IgG1Fc融合蛋白技术可以明显延长进入人体的CREG蛋白的半衰期，维持CREG蛋白的血药浓度，并且没有免疫原性，不会引起排斥反应。第二，本发明采用(G4S)₃作为CREG蛋白与IgG1Fc片段的接头，保证CREG蛋白与IgG1Fc片段相对独立，CREG蛋白的生物学活性不受影响。第三，本发明采用哺乳动物细胞系统中国地仓鼠细胞CHO-KSM4表达CREG-Fc融合蛋白，保存了CREG蛋白的糖基化修饰，对于CREG发挥治疗效果非常重要。第四，现有降压药物均为化学药，有很多不良反应，而CREG-Fc融合蛋白用于开发成药物，所得到的药物属于生物药范畴，且CREG蛋白为内源性蛋白，因此CREG-Fc蛋白的作用更接近生理情况。

本发明公开了一种重组人CREG-Fc融合蛋白的制备方法，根据该方法提供的融合蛋白可用于高血压及高血压血管重塑的预防或治疗。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组人CREG-Fc融合蛋白，所述融合蛋白的氨基端是CREG全长蛋白，羧基端是人IgG1Fc片段，CREG蛋白与Fc片段之间通过(G4S)₃连接肽融合，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述重组人CREG-Fc融合蛋白的编码序列，其基因序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种包含SEQ ID No.2所示基因序列的表达载体及宿主细胞。

本发明的第四个目的是提供上述重组人CREG-Fc融合蛋白的生产方法，采用如下技术方案：使用动物细胞表达载体pcDNA3.1-GS在中国地仓鼠细胞CHO-KSM4内表达基因序列SEQ ID No.2，然后进行分离纯化即得；所述表达载体pcDNA3.1-GS的基因序列如SEQ IDNo.3所示。进一步地，所述CREG-Fc采用Eshmuno A亲和层析方法进行分离纯化。

本发明的第五个目的是提供重组人CREG-Fc融合蛋白在制备抗高血压及高血压血管重构药物中的应用。

因此，在一个方面，本发明提供一种重组人CREG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重组人CREG-Fc融合蛋白是人CREG全长蛋白与人免疫球蛋白IgG1Fc片段的融合蛋白，其中CREG蛋白与Fc片段之间通过接头融合；在一个实施方案中，CREG-Fc融合蛋白包含如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供一种编码所述重组人CREG-Fc融合蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸包含如SEQ ID No.2所示的序列。

在又一个方面，本发明提供一种载体，其特征在于，含有本发明所述的核酸。

在另一个方面，本发明提供一种细胞，其特征在于，含有本发明所述的核酸或本发明所述的载体。

在又一个方面，本发明提供一种本发明所述的人CREG-Fc融合蛋白的生产方法，其特征在于，使用表达载体pcDNA3.1-GS在动物细胞(例如中国地仓鼠细胞CHO-KSM4)内表达序列SEQ ID No.2，然后进行分离纯化即得；所述表达载体pcDNA3.1-GS的序列如SEQ IDNo.3所示。

在另一个方面，本发明提供根据本发明所述的人CREG-Fc融合蛋白的生产方法，其特征在于，所述人CREG-Fc融合蛋白采用亲和层析方法(例如Eshmuno A亲和层析方法)进行分离纯化。

在又一个方面，本发明提供本发明所述的重组人CREG-Fc融合蛋白在制备抗高血压和/或血管重构(例如高血压血管重构)的药物中的应用。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明所述的重组人CREG-Fc融合蛋白、本发明所述的编码本发明所述重组人CREG-Fc融合蛋白的核酸、本发明所述的载体或本发明所述的细胞。

在又一个方面，本发明提供治疗高血压和/或血管重构(例如高血压血管重构)的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的组合物。

在另一个方面，本发明提供本发明所述的组合物在治疗高血压和/或血管重构(例如高血压血管重构)中的用途。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

图1是CREG-Fc融合蛋白的蛋白质印迹检测结果。

图2是CREG-Fc融合蛋白经糖苷酶酶切后的蛋白质印迹检测结果。

图3是CREG-Fc融合蛋白对AngII诱导的小鼠高血压的治疗作用。

图4是CREG-Fc融合蛋白对AngII诱导的小鼠血管重塑的治疗作用。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明主要利用动物细胞表达载体pcDNA3.1-GS在中国地仓鼠细胞CHO-KSM4中，表达并纯化人CREG蛋白及人免疫球蛋白IgG1 Fc片段融合蛋白CREG-Fc，并进一步检测CREG-Fc对高血压及血管重构的作用。所述人CREG蛋白的编码序列如SEQ ID No.4所示。所述人免疫球蛋白IgG1Fc片段的编码序列如SEQ ID No.5所示。所述的连接肽(G4S)₃序列如SEQ ID No.6所示。所述CREG-Fc融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例1：CREG-Fc融合蛋白制备

CREG-Fc融合蛋白的制备过程主要包括基因克隆、载体构建、转染细胞、融合蛋白表达及纯化。

1、基因克隆

在基因合成的专业公司(苏州金唯智生物科技有限公司)合成带有酶切位点的编码CREG-Fc融合蛋白的基因全序列(见SEQ ID No.7，全长1384bp)。其中，1-3是保护性碱基，4-9为Hind III酶切位点，10-18为Kozak序列，19-678为终止密码子缺失突变的人CREG基因，679-723为G4S 3次重复的接头序列，724-1377为带有终止密码子的人IgG1Fc片段基因序列，1378-1383为EcoR I酶切位点，1384为保护性碱基。

2、表达载体构建

2.1获得酶切片段

用限制性内切酶Hind III、EcoR I分别对合成的CREG-Fc编码基因片段和pcDNA3.1-GS载体进行双酶切。酶切体系分别为：

37℃酶切过夜。将酶切产物加入10×上样缓冲液后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，分别回收大片段。采用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)对回收的大片段进行纯化。采用紫外分光光度计测定纯化的双链DNA片段浓度。

2.2连接反应

用DNA连接试剂盒2.1(TaKaRa)参照该试剂盒说明书进行连接反应，连接体系如下：

10×T4 DNA连接酶缓冲液	2.5μl
		合成的CREG-Fc双酶切片段	0.3pmol
pcDNA3.1-GS双酶切载体片段	0.03pmol
		T4 DNA连接酶	1μl
dH<sub>2</sub>O	补至25μl

16℃反应过夜。构建表达载体pcDNA3.1-GS-CREG-Fc。加入2.5μl的3M CH₃COONa(pH5.2)。加入62.5μl的冷无水乙醇，-20℃放置30-60min。12000rpm离心15min回收沉淀，放在超净台中室温干燥。用25μl TE溶解DNA沉淀。

3、转化感受态细菌

从-80℃冰箱中取出100μl感受态细胞XL10-Gold化学感受态细胞(Stratagene)置于冰上解冻。取10μl上述连接反应制备的连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀后冰上放置30min。42℃水浴中热休克60s，迅速移至冰上放置3min。加入1ml LB培养基，混匀后37℃振荡培养1h。将上述菌液摇匀后，取100μl涂于含Amp(100μg/ml)的LB平板上。37℃培养16h。挑取5个大的阳性克隆，在含Amp的LB培养基中振荡培养16h进行扩增。一部分菌液加入80％甘油放在-20℃冰箱中冻存，另一部分菌液直接送上海生工测序。测序引物序列如下：上游测序引物T7：TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID No.8)；下游测序引物BGHrev：TAGAAGGCACAGTCGAGG(SEQ ID No.9)。测序正确的克隆菌标记为pcDNA3.1-GS-CREG-Fc，常规摇菌扩增，用质粒大提试剂盒QIAGEN质粒纯化Maxi试剂盒提取质粒，测定浓度。

4、稳转细胞库(Stable-Pool)构建

复苏CHO-KSM4细胞至摇瓶，20ml CDM4(HyClone^TM)+6mM谷氨酰胺(Gln)(Gibco)培养基培养，传代不低于3次。使细胞处于倍增期，存活率在95％以上。

取10mg构建好的pcDNA3.1-GS-CREG-Fc质粒，首先将其用ScaI单酶切线性化。用电穿孔方法，按照每10⁷个细胞加10mg质粒的量电击2次，参数为电压250V，脉冲时间15ms。用CDM4培养液恢复48h后加入3.5μg/ml的MSX(Sigma)筛选压力，待活率恢复至95％，倍增时间恢复至18h至24h后，10％DMSO冻存10⁷个细胞标记为CREG-Fc SP(稳转细胞库)。

5、蛋白表达

取CREG-Fc SP在37℃水浴中复苏，加入20ml CDM4培养液，3.5μg/ml MSX压力下传代直至细胞活率升至95％以上，扩增至250ml，实际细胞数2.56×10⁶，活率97％，即种子。反应器参数如下：

pH：	6.8±0.4
		转速：	200rpm
DO(溶解氧)：	40％

加CDM4至1000ml，记为D0，从培养第3天开始，每天加Cell Boost 5(HyClone^TM)(100g/L)初始体积的4％，活率降至80％以下终止培养，离心取上清。

6、CREG-Fc蛋白纯化

配制以下缓冲液：

缓冲液A：	20mM PB(磷酸盐缓冲液)，pH 7.0
		缓冲液B：	20mM PB，1M NaCl，pH 7.0
缓冲液C：	20mM HAc-NaAc，pH 3.4

将Eshmuno A层析柱(Merck Millipore)接入AKTA纯化仪100层析系统(GEHealthcare Life Science)。缓冲液A平衡，发酵上清过滤后上样(RT＝3min)，缓冲液B洗涤，收集记为P1。缓冲液A平衡后，缓冲液C洗脱，收集洗脱峰，分别收集前部、中段和峰尾，记为P2-1、P2-2和P2-3。BCA法测定P2-2蛋白浓度。P2-2用1M Tris-HCl中和至pH5.8后，10K超滤浓缩离心管置换至PBS中，调节浓度至1mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，分装冻存于-80℃冰箱。将P2-1(5μl)、P2-2(5μg)、P2-3(5μl)进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，结果见附图1。

CREG-Fc为糖基化蛋白，糖苷酶PNGase可识别糖基化位点，将其切掉。因此，CREG-Fc经糖苷酶处理并进行SDS-PAGE后，分子量比未处理的CREG-Fc低，结果见附图2。

实施例2：CREG-Fc融合蛋白对高血压及血管重塑的治疗作用

1、分组

1.(1)对照组(n＝5)：不给予任何处理；

2.(2)PBS对照组(n＝5)：右侧背部皮下埋置28d微渗透泵(含100μl PBS)；

3.(3)AngII处理组(n＝5)：右侧背部皮下埋置28d微渗透泵(含溶于100μl PBS的AngII，给药剂量为400ng/kg/min，按小鼠平均体重23g计算，每个微渗透泵含16μg AngII)；

4.(4)AngII+CREG-His(n＝5)：右侧背部皮下埋置含AngII的28d微渗透泵1个(400ng/kg/min)，左侧背部皮下埋置含重组人CREG-His融合蛋白(浓度1μg/μl，总体积100μl，Abcam公司ab131699)的28d微渗透泵1个；

5.(5)AngII+CREG-Fc(n＝5)：右侧背部皮下埋置含AngII的28d微渗透泵1个(400ng/kg/min)，左侧背部皮下埋置含重组人CREG-FC融合蛋白(浓度1μg/μl，总体积100μl)的28d微渗透泵1个。

2、实施步骤

将小鼠称重，随机分组如前述5组。测量基线血压水平。计为第0天血压。按实验分组中的药物剂量装载微渗透泵。采用异氟烷麻醉小鼠，将微渗透泵植入到小鼠背部皮下。植入微渗透泵后次日，计为第1天。采用尾套法，用BP-2010(北京软隆生物技术有限公司)无创测定第1、2、3、7、14、21及28天小鼠血压。第28天处死小鼠，留取主动脉，多聚甲醛固定。将固定的主动脉组织常规石蜡包埋及切片，并进行HE染色及Masson染色，评价各组小鼠主动脉的血管重构情况。

3、实验结果

在第7、14、21及28天时，与AngII组相比，CREG-His及CREG-Fc组收缩压均显著降低。在第14、21及28天时，与CREG-His组相比，CREG-Fc组收缩压显著降低。结果见附图3。

在第28天时，与AngII组相比，CREG-His及CREG-Fc均能改善AngII诱导的血管重塑。其中，CREG-Fc对血管重塑的改善程度较CREG-His更大。结果见附图4。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对上述细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 中国人民解放军沈阳军区总医院; 先声生物医药科技有限公司

<120> 一种重组人CREG-Fc融合蛋白的制备及其应用

<130> IDC180077

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Gly Leu Ser Arg Gly Ser Ala Arg Ala Leu Leu Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ser Thr Leu Leu Ala Leu Leu Val Ser Pro Ala Arg Gly Arg

20 25 30

Gly Gly Arg Asp His Gly Asp Trp Asp Glu Ala Ser Arg Leu Pro Pro

35 40 45

Leu Pro Pro Arg Glu Asp Ala Ala Arg Val Ala Arg Phe Val Thr His

50 55 60

Val Ser Asp Trp Gly Ala Leu Ala Thr Ile Ser Thr Leu Glu Ala Val

65 70 75 80

Arg Gly Arg Pro Phe Ala Asp Val Leu Ser Leu Ser Asp Gly Pro Pro

85 90 95

Gly Ala Gly Ser Gly Val Pro Tyr Phe Tyr Leu Ser Pro Leu Gln Leu

100 105 110

Ser Val Ser Asn Leu Gln Glu Asn Pro Tyr Ala Thr Leu Thr Met Thr

115 120 125

Leu Ala Gln Thr Asn Phe Cys Lys Lys His Gly Phe Asp Pro Gln Ser

130 135 140

Pro Leu Cys Val His Ile Met Leu Ser Gly Thr Val Thr Lys Val Asn

145 150 155 160

Glu Thr Glu Met Asp Ile Ala Lys His Ser Leu Phe Ile Arg His Pro

165 170 175

Glu Met Lys Thr Trp Pro Ser Ser His Asn Trp Phe Phe Ala Lys Leu

180 185 190

Asn Ile Thr Asn Ile Trp Val Leu Asp Tyr Phe Gly Gly Pro Lys Ile

195 200 205

Val Thr Pro Glu Glu Tyr Tyr Asn Val Thr Val Gln Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 2

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccgggc tatcccgcgg gtccgcgcgc gcactgctcg ccgccctgct ggcgtcgacg 60

ctgttggcgc tgctcgtgtc gcccgcgcgg ggtcgcggcg gccgggacca cggggactgg 120

gacgaggcct cccggctgcc gccgctacca ccccgcgagg acgcggcgcg cgtggcccgc 180

ttcgtgacgc acgtctccga ctggggcgct ctggccacca tctccacgct ggaggcggtg 240

cgcggccggc ccttcgccga cgtcctctcg ctcagcgacg ggcccccggg cgcgggcagc 300

ggcgtgccct atttctacct gagcccgctg cagctctccg tgagcaacct gcaggagaat 360

ccatatgcta cactgaccat gactttggca cagaccaact tctgcaagaa acatggattt 420

gatccacaaa gtcccctttg tgttcacata atgctgtcag gaactgtgac caaggtgaat 480

gaaacagaaa tggatattgc aaagcattcg ttattcattc gacaccctga gatgaaaacc 540

tggccttcca gccataattg gttctttgct aagttgaata taaccaatat ctgggtcctg 600

gactactttg gtggaccaaa aatcgtgaca ccagaagaat attataatgt cacagttcag 660

ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gaagcgcacc agaactgctg 720

ggcggcccaa gcgtgttcct gtttccaccc aagcctaaag acacactgat gattagtagg 780

actcccgagg tcacctgcgt ggtcgtggac gtgtcccacg aggatcctga agtcaagttt 840

aactggtacg tggatggcgt cgaagtgcat aatgctaaga ccaaaccaag agaggaacag 900

tacaactcca cttatcgcgt cgtgagcgtc ctgaccgtgc tgcatcagga ttggctgaac 960

ggcaaggagt ataagtgcaa agtgagcaat aaggctctgc ccgcacctat cgagaaaacc 1020

atttctaagg caaaaggaca gcctcgagaa ccacaggtgt acacactgcc tccaagccgt 1080

gaggaaatga ccaagaacca ggtctctctg acatgtctgg tgaaaggctt ctatccttca 1140

gacattgctg tggagtggga atccaatgga cagccagaga acaattacaa gaccacaccc 1200

cctgtgctgg acagcgatgg ctctttcttt ctgtattcta agctgaccgt ggataaaagt 1260

cggtggcagc agggaaatgt cttttcttgt agtgtgatgc acgaagccct gcacaaccac 1320

tacactcaga agtcactgtc cctgtctccc ggtaaataa 1359

<210> 3

<211> 5755

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960

agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1020

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1080

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1140

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1200

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 1260

gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta 1320

agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 1380

cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 1440

gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 1500

aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 1560

cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 1620

acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 1680

tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg 1740

tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 1800

tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 1860

gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 1920

tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 1980

ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 2040

gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg 2100

gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatggc cacctcagca agttcccact 2160

tgaacaaaaa catcaagcaa atgtacttgt gcctgcccca gggtgagaaa gtccaagcca 2220

tgtatatctg ggttgatggt actggagaag gactgcgctg caaaacccgc accctggact 2280

gtgagcccaa gtgtgtagaa gagttacctg agtggaattt tgatggctct agtacctttc 2340

agtctgaggg ctccaacagt gacatgtatc tcagccctgt tgccatgttt cgggacccct 2400

tccgcagaga tcccaacaag ctggtgttct gtgaagtttt caagtacaac cggaagcctg 2460

cagagaccaa tttaaggcac tcgtgtaaac ggataatgga catggtgagc aaccagcacc 2520

cctggtttgg aatggaacag gagtatactc tgatgggaac agatgggcac ccttttggtt 2580

ggccttccaa tggctttcct gggccccaag gtccgtatta ctgtggtgtg ggcgcagaca 2640

aagcctatgg cagggatatc gtggaggctc actaccgcgc ctgcttgtat gctggggtca 2700

agattacagg aacaaatgct gaggtcatgc ctgcccagtg ggagttccaa ataggaccct 2760

gtgaaggaat ccgcatggga gatcatctct gggtggcccg tttcatcttg catcgagtat 2820

gtgaagactt tggggtaata gcaacctttg accccaagcc cattcctggg aactggaatg 2880

gtgcaggctg ccataccaac tttagcacca aggccatgcg ggaggagaat ggtctgaagc 2940

acatcgagga ggccatcgag aaactaagca agcggcaccg gtaccacatt cgagcctacg 3000

atcccaaggg gggcctggac aatgcccgtc gtctgactgg gttccacgaa acgtccaaca 3060

tcaacgactt ttctgctggt gtcgccaatc gcagtgccag catccgcatt ccccggactg 3120

tcggccagga gaagaaaggt tactttgaag accgccgccc ctctgccaat tgtgacccct 3180

ttgcagtgac agaagccatc gtccgcacat gccttctcaa tgagactggc gacgagccct 3240

tccaatacaa aaactaagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa 3300

cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat 3360

cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt 3420

cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 3480

aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 3540

caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg 3600

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 3660

cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 3720

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 3780

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 3840

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 3900

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3960

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 4020

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 4080

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 4140

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 4200

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4260

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4320

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4380

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4440

aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4500

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt gcaagcagca 4560

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4620

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4680

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 4740

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 4800

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 4860

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 4920

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 4980

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 5040

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 5100

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 5160

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 5220

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 5280

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 5340

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 5400

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 5460

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 5520

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 5580

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 5640

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 5700

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtc 5755

<210> 4

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggccgggc tatcccgcgg gtccgcgcgc gcactgctcg ccgccctgct ggcgtcgacg 60

ctgttggcgc tgctcgtgtc gcccgcgcgg ggtcgcggcg gccgggacca cggggactgg 120

gacgaggcct cccggctgcc gccgctacca ccccgcgagg acgcggcgcg cgtggcccgc 180

ttcgtgacgc acgtctccga ctggggcgct ctggccacca tctccacgct ggaggcggtg 240

cgcggccggc ccttcgccga cgtcctctcg ctcagcgacg ggcccccggg cgcgggcagc 300

ggcgtgccct atttctacct gagcccgctg cagctctccg tgagcaacct gcaggagaat 360

ccatatgcta cactgaccat gactttggca cagaccaact tctgcaagaa acatggattt 420

gatccacaaa gtcccctttg tgttcacata atgctgtcag gaactgtgac caaggtgaat 480

gaaacagaaa tggatattgc aaagcattcg ttattcattc gacaccctga gatgaaaacc 540

tggccttcca gccataattg gttctttgct aagttgaata taaccaatat ctgggtcctg 600

gactactttg gtggaccaaa aatcgtgaca ccagaagaat attataatgt cacagttcag 660

<210> 5

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaccagaac tgctgggcgg cccaagcgtg ttcctgtttc cacccaagcc taaagacaca 60

ctgatgatta gtaggactcc cgaggtcacc tgcgtggtcg tggacgtgtc ccacgaggat 120

cctgaagtca agtttaactg gtacgtggat ggcgtcgaag tgcataatgc taagaccaaa 180

ccaagagagg aacagtacaa ctccacttat cgcgtcgtga gcgtcctgac cgtgctgcat 240

caggattggc tgaacggcaa ggagtataag tgcaaagtga gcaataaggc tctgcccgca 300

cctatcgaga aaaccatttc taaggcaaaa ggacagcctc gagaaccaca ggtgtacaca 360

ctgcctccaa gccgtgagga aatgaccaag aaccaggtct ctctgacatg tctggtgaaa 420

ggcttctatc cttcagacat tgctgtggag tgggaatcca atggacagcc agagaacaat 480

tacaagacca caccccctgt gctggacagc gatggctctt tctttctgta ttctaagctg 540

accgtggata aaagtcggtg gcagcaggga aatgtctttt cttgtagtgt gatgcacgaa 600

gccctgcaca accactacac tcagaagtca ctgtccctgt ctcccggtaa ataa 654

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaggaggag gaagcggagg aggaggaagc ggaggaggag gaagc 45

<210> 7

<211> 1384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccaagcttg ccgccaccat ggccgggcta tcccgcgggt ccgcgcgcgc actgctcgcc 60

gccctgctgg cgtcgacgct gttggcgctg ctcgtgtcgc ccgcgcgggg tcgcggcggc 120

cgggaccacg gggactggga cgaggcctcc cggctgccgc cgctaccacc ccgcgaggac 180

gcggcgcgcg tggcccgctt cgtgacgcac gtctccgact ggggcgctct ggccaccatc 240

tccacgctgg aggcggtgcg cggccggccc ttcgccgacg tcctctcgct cagcgacggg 300

cccccgggcg cgggcagcgg cgtgccctat ttctacctga gcccgctgca gctctccgtg 360

agcaacctgc aggagaatcc atatgctaca ctgaccatga ctttggcaca gaccaacttc 420

tgcaagaaac atggatttga tccacaaagt cccctttgtg ttcacataat gctgtcagga 480

actgtgacca aggtgaatga aacagaaatg gatattgcaa agcattcgtt attcattcga 540

caccctgaga tgaaaacctg gccttccagc cataattggt tctttgctaa gttgaatata 600

accaatatct gggtcctgga ctactttggt ggaccaaaaa tcgtgacacc agaagaatat 660

tataatgtca cagttcaggg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga 720

agcgcaccag aactgctggg cggcccaagc gtgttcctgt ttccacccaa gcctaaagac 780

acactgatga ttagtaggac tcccgaggtc acctgcgtgg tcgtggacgt gtcccacgag 840

gatcctgaag tcaagtttaa ctggtacgtg gatggcgtcg aagtgcataa tgctaagacc 900

aaaccaagag aggaacagta caactccact tatcgcgtcg tgagcgtcct gaccgtgctg 960

catcaggatt ggctgaacgg caaggagtat aagtgcaaag tgagcaataa ggctctgccc 1020

gcacctatcg agaaaaccat ttctaaggca aaaggacagc ctcgagaacc acaggtgtac 1080

acactgcctc caagccgtga ggaaatgacc aagaaccagg tctctctgac atgtctggtg 1140

aaaggcttct atccttcaga cattgctgtg gagtgggaat ccaatggaca gccagagaac 1200

aattacaaga ccacaccccc tgtgctggac agcgatggct ctttctttct gtattctaag 1260

ctgaccgtgg ataaaagtcg gtggcagcag ggaaatgtct tttcttgtag tgtgatgcac 1320

gaagccctgc acaaccacta cactcagaag tcactgtccc tgtctcccgg taaataagaa 1380

ttcc 1384

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taatacgact cactataggg 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagaaggcac agtcgagg 18

Claims

1.一种重组人CREG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重组人CREG-Fc融合蛋白是人CREG全长蛋白与人免疫球蛋白IgG1 Fc片段的融合蛋白，其中CREG蛋白与Fc片段之间通过接头融合；其中CREG-Fc融合蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。

2.一种编码权利要求1所述重组人CREG-Fc融合蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸由SEQ ID No.2所示的序列组成。

3.一种载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸。

4.一种细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的载体。

5.一种权利要求1所述的人CREG-Fc融合蛋白的生产方法，其特征在于，使用表达载体pcDNA3.1-GS在动物细胞内表达序列SEQ ID No.2，然后进行分离纯化即得；所述表达载体pcDNA3.1-GS的序列由SEQ ID No.3所示的序列组成。

6.权利要求5所述的人CREG-Fc融合蛋白的生产方法，其特征在于，所述动物细胞是中国地仓鼠细胞CHO-KSM4。

7.权利要求5或6所述的人CREG-Fc融合蛋白的生产方法，其特征在于，所述人CREG-Fc融合蛋白采用亲和层析方法进行分离纯化。

8.权利要求7所述的人CREG-Fc融合蛋白的生产方法，其特征在于，所述亲和层析方法是Eshmuno A亲和层析方法。

9.权利要求1所述的重组人CREG-Fc融合蛋白在制备抗高血压和/或血管重构的药物中的应用。

10.权利要求1所述的重组人CREG-Fc融合蛋白在制备抗高血压血管重构的药物中的应用。

11.一种组合物，其包含权利要求1所述的重组人CREG-Fc融合蛋白、权利要求2所述的编码权利要求1所述重组人CREG-Fc融合蛋白的核酸、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的细胞。

12.权利要求11所述的组合物在制备用于治疗高血压和/或血管重构的药物中的用途。

13.权利要求11所述的组合物在制备用于治疗高血压血管重构的药物中的用途。