CN102309781A - 一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架，其表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白。本发明所述冠脉支架在植入人体以后，通过支架载带的hCREG糖蛋白成分的持续释放来抑制血管平滑肌细胞增殖，并促进血管壁再内皮化，使损伤血管壁迅速愈合，从而防止医疗器械管腔内血栓的发生，减少病人术后服用抗血栓和血小板药物的时间。

Description

一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程和生物工程医疗器械的制备，具体地说，涉及一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架及其制备方法。属于生物工程和植入体内的介入医疗器械领域。

背景技术

心血管疾病严重威胁着人类健康，据WHO报道，每年因心血管疾病死亡的人数高达全球死亡总数的30％。经皮冠状动脉内介入治疗术(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前冠心病的主要治疗手段之一，全球每年有超过150万的冠心病患者接受PCI治疗，但术后10-70％的血管再狭窄(restenosis，RS)发生率显著降低了手术获益。如何有效预防并控制RS发生，改善PCI术后患者的生存质量是广大医务工作者面临的巨大挑战。

研究表明，血管内皮功能损伤和血管平滑肌细胞(Vascular smoothmuscle cell，VSMCs)过度增殖/迁移是RS发生的重要环节。PCI术后血管再狭窄的原因尚不完全清楚，目前认为主要与炎症反应、血管弹性回缩、血栓形成以及VSMCs增殖/迁移等因素造成血管新生内膜的形成有关，而血管内皮功能损伤正是RS重要的始动因素。近年研究发现，血管内皮细胞(endothelial cells，Ecs)不仅是内膜表面的单层细胞，同时是一个具有内分泌功能的器官，保证完整的血管内皮结构对维持血管稳态具有重要意义。PCI术中，由于球囊或支架的使用不可避免地对ECs造成损害，导致ECs凋亡和内皮功能受损，进而引起血管内皮渗透性增加和血管平滑肌细胞增生，启动了RS病理过程的“瀑布反应”。

同时，大量研究证实，动脉中膜VSMCs向内膜的增殖/迁移是RS发展并最终形成的关键环节。正常生理状态下，动脉中膜VSMCs处于收缩表型，其主要功能是通过收缩/舒张调节血管张力和组织的血流供应。病理情况下，当血管壁特别是血管内膜受到球囊或支架损伤后，动脉中膜VSMCs表型发生改变(由静息/收缩状态转变为增殖/合成表型)，在多种细胞因子的作用下，VSMCs不断增殖并向内膜迁移，同时过度合成和分泌大量细胞外基质，导致血管新生内膜形成并引起再狭窄。鉴于ECs和VSMCs在PCI术后RS发生中的重要地位，寻找有效靶点加速损伤内皮的修复和/或抑制VSMCs的过度增殖/迁移已成为目前RS防治研究领域的两大主要方向。

长期以来，临床内科学和介入治疗学界针对RS的发生机制展开了大量新型支架的研究工作，但距离理想支架的标准仍有差距。目前，装载血管平滑肌细胞增殖抑制剂(雷帕霉素及其类似物、紫杉醇)的药物洗脱支架(drug-eluting stent，DES)是临床预防再狭窄最常用的治疗手段。尽管DES的应用有效降低了术后短期内的再狭窄发生率，但研究表明，DES在抑制血管平滑肌细胞增殖的同时，也延缓了内皮修复，从而引起支架内膜化不完全、血栓形成，造成急性心肌梗死等心血管不良事件，最终削弱了其抗再狭窄的远期疗效。此外，DES的高分子聚合物载体涂层还会造成血管壁炎症及过敏反应。

近来，越来越多的学者将目光投向了具有生物相容性的蛋白类药物涂层支架上。目前国内外在研的蛋白洗脱支架主要有：1.抑制血管损伤后炎症反应类支架，包括装载TNF-α抗体支架、装载环状RGD多肽支架等；2.加速血管内皮化进程的血管内皮生长因子(bFGF和VEGF)释放支架；3.通过抗凝和保持正常凝血平衡而抑制局部血栓形成的补体蛋白C释放支架等。

然而，已有研究表明，RS的发生机制复杂，ECs和VSMCs之间本身存在密不可分的调控机制，这种相互依存、相互制约的特性在RS形成的血管壁自稳调控过程中不容忽视。因此，从RS发生的两大关键环节共同入手，寻找到更为理想的生物分子，以期在抑制血管平滑肌细胞增殖/迁移的同时，加速血管内皮化进程依旧是亟待解决的难题。2007年，世界知名心血管病专家Serruys在“冠脉支架5-10年展望”中提出：生物可吸收并兼备“抑制增生”和“加速内皮化”功能的支架将是未来5-10年理想支架的标准。

人E1A激活基因阻遏子(cellular repressor ofE1 A-stimulated genes，CREG)是1998年美国哈佛大学医学院Gill从子宫颈内膜癌Hela细胞cDNA文库中克隆的一个新的转录相关调控因子。其早期研究认为，CREG可与外源性腺病毒蛋白E1A、哺乳动物体内转录因子E2F家族蛋白竞争性结合在靶基因的启动子区，阻遏E1A蛋白和E2F对靶基因的转录并抑制细胞增殖。进一步研究发现，CREG属于小分子量分泌型糖蛋白，在分化成熟的组织细胞中广泛表达，但在未分化组织如胚胎干(ES)细胞和畸胎瘤细胞中表达水平很低。Veal等将外源性CREG基因导入体外培养的肿瘤细胞中，发现CREG基因表达可以显著抑制肿瘤细胞增殖并诱导其分化；同样地，在没有特异性诱导剂存在的情况下，添加分沁型的CREG蛋白可以单独诱导体外培养ES细胞和畸胎瘤细胞向神经细胞分化。相似的研究结果在单个核细胞和骨髓样细胞诱导分化实验中相继得到证实。上述研究提示：CREG作为小分子量的分泌型糖蛋白，可以诱导并维持组织或细胞分化。

本发明研究人员自1999年应用mRNA差异显示技术，首次从体外培养的人胸廓内动脉VSMCs中成功克隆了人CREG基因，经过数年的一系列基础研究证实：

1.CREG表达与体外培养VSMCs的增殖及分化高度相关，提示CREG参与了VSMCs分化表型的转化调控。VSMCs在去血清体外培养时呈CREG高表达状态，其分化表型标志物表达同时增高，而在加入血清刺激后(即：体外模拟血管内膜损伤造成VSMCs暴露)，VSMCs中CREG的表达明显降低，其分化表型标志物表达随之下调；应用逆转录病毒载体介导外源性CREG过表达后发现，体外培养VSMCs的增殖明显受抑，细胞呈现分化表型；相反，通过反义RNA技术抑制VSMCs中CREG的表达后，VSMCs分化能力明显减弱、增殖能力和凋亡能力均显著增加。

2.CREG参与了血管正常生理功能的维持，其表达下调可能是血管病理损伤的始动机制之一。关于CREG在病理损伤血管中的表达研究发现，CREG在正常哺乳动物血管壁大量表达，并且在血管ECs中的表达强度显著高于VSMCs；体外实验证实CREG过表达可以促进内皮细胞的迁移和增殖，同时升高VEGF的表达，血管病理损伤后，CREG蛋白在血管壁的表达明显下调，CREG蛋白的表达抑制效应在血管ECs中表现更为显著，提示CREG参与了血管内皮的损伤修复反应。

3.动物在体实验表明，CREG过表达有利于减少PCI术后RS的发生。大鼠颈动脉经球囊拉伤后，CREG表达与损伤血管中的VSMCs增殖能力呈负相关；通过逆转录病毒和腺病毒载体分别介导CREG基因过表达发现，球囊损伤后大鼠及兔颈动脉新生内膜的形成受到显著抑制，有效降低了RS的发生。

迄今为止，国内外已发表的有关CREG基因的研究工作仍然有限，大部分研究结果主要来自哈佛大学医学院Gill实验室对肿瘤细胞分化的研究和本发明研究人员对RS损伤调控机制的研究。二者前期研究一致证实：CREG蛋白是成熟生物体内维持组织和细胞分化的重要分子，在肿瘤细胞诱导分化和抑制损伤血管VSMCs去分化、促进内皮功能恢复中均具有积极的生物学功能。因此，我们提出设想：以CREG为切入点，深入探讨PCI术后RS的发生机制，并开发新型的重组人源性E1A激活基因阻遏子(human cellular repressor of E1A-stimulatedgenes，hCREG)生物蛋白洗脱支架。

目前，已成功构建hCREG糖蛋白真核表达载体，并获得高度纯化的重组hCREG糖蛋白。蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的重要方式，生物体内大约50％的蛋白质都是糖基化蛋白，包括酶、载体蛋白、激素、毒素、各种凝集素和结构蛋白等。作为分泌型糖蛋白，hCREG蛋白在合成过程中进行正确的糖基化修饰是其保证其具有正常结构和功能的基本条件。Veal等研究发现，CREG为分泌型糖蛋白，通过自分泌和旁分泌发挥其生物学功能；Alessandra Di Bacco研究也证实，CREG诱导的细胞生长抑制依赖于M6P/IGF2R，而M6P/IGF2R优先与糖基化的CREG结合，只有极少量与非糖基化的CREG结合。上述研究提示，无论从生物相容性、经济实效性以及效应最大化的角度而言，成功获取人源性hCREG糖蛋白对于未来新型支架的临床应用研究都至关重要。

目前已成功构建了pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体(申请号200810007540.7，公开号CN101519663A)，并探索出稳定表达外源性hCREG糖蛋白和高度纯化的技术手段，为最大限度发挥hCREG生物学功能，进行新型支架的研发奠定了坚实基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架，支架表面分布的hCREG糖蛋白成分可持续释放来抑制血管壁平滑肌细胞增殖，并促进血管再内皮化，促进损伤血管壁的愈合，防止支架内血栓的发生，减少病人术后服用抗血栓和血小板药物的时间。

本发明的另一目的是提供一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架在抑制血管壁平滑肌细胞增殖、防治血管再狭窄中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架，其采用重组hCREG糖蛋白均匀涂布于冠脉支架表面。

所述重组hCREG糖蛋白为重组人源性CREG糖蛋白及其衍生物。

所述重组hCREG糖蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)重组基因载体的构建：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框，终止密码突变的hCREG RT-PCR引物如下：上游引物为5’-aa ggatcc atggccgggctatcccgc-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物为：5’-gc gaattc Gcactgaactgtgacattataatattcttctgg-3’(SEQ IDNO.2)，其中大写字母代表C/G突变的终止密码。构建带有his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3.1-his/myc-hCREG。重组hCREG蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO.3)如下：

MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDWGALATISTLEAVRGRPFADVLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTNFCKKHGFDPQSPLCVHIMLSGTVTKVNETEMDIAKHSLFIRHPEMKTWPSSHNWFFAKLNITNIWVLDYFGGPKIVTPEEYYNVTVQCEFCRYPAQWRPLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH&

2)重组人源性CREG蛋白的表达应用lipofectamine2000将pcDNA3.1-his/myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分析法进行重组CREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度。

3)蛋白提纯  根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱(美国Invitrogen公司)纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB)脱盐。

4)重组蛋白生物学活性鉴定将纯化的重组CREG蛋白添加于10％血清培养的VSMCs培养基中，用流式细胞仪分析细胞周期观察重组CREG蛋白对VSMCs增殖的影响，鉴定重组CREG蛋白的生物学活性。

所述重组hCREG糖蛋白可以与选自于下述各类药物活性组分的一种或几种联合使用：免疫抑制剂及抗炎药物、抗增殖药物、促再内皮化药物、抗细胞迁移药物以及细胞间基质调节剂。

所述抗增殖药物包括西罗莫司，他克莫司，艾罗莫司，免疫抑制剂ABT-578，地塞米松，咪唑立宾，雷帕霉素，紫杉醇及其衍生物，放线菌素，长春新碱及其衍生物，他汀类药物，2-氯去氧腺苷，核酶，巴马司他，溴氯哌喹酮，普罗布可，可选用其中任一种或几种。

所述药物层由一种或多种药物组成，药物和重组hCREG糖蛋白的分布为层层结构，或为支架外管腔和支架内管腔两个不同表面分别分布药物层和糖蛋白层。

本发明所述冠脉支架为药物涂层支架，其金属材料选自钛、钴、钽、镍钛合金、镍钛锘合金、医用不锈钢，也可以选用聚合物材料，其包括可降解或不可降解材料，可降解材料如PCL、PLGA、以及二者之间不同的配比组成。

所述冠脉支架表面均匀分布100-800nm的微孔。

所述的冠脉支架的重组hCREG糖蛋白或药物涂层不含聚合物载体，其直接分布在金属支架表面或支架表面的纳米孔中。

本发明所述冠脉支架的制备方法，其采用如下任意方法制成：

将重组hCREG糖蛋白、重组hCREG糖蛋白与药物溶于单一溶剂或混合溶剂中，通过直接喷涂、浸涂或者两种方法联用等方法涂覆于支架表面；

或将重组hCREG糖蛋白、重组hCREG糖蛋白与药物各溶于单一溶剂或混合溶剂中，采用静电喷涂或者阳极极化方法喷涂或浸涂到支架表面。

其中，所述溶于重组hCREG糖蛋白的溶剂为蒸馏水、生理盐水、pH值为3.0-9.0的硼酸盐缓冲溶液、pH值为8.0-10.0碳酸盐缓冲溶液、pH值为3.0-9.0醋酸盐缓冲溶液、浓度为1-20％的乙醇溶液或pH值为3.0-9.0磷酸盐缓冲溶液。

所述重组hCREG糖蛋白的浓度为0.001-1mg/ml。

所述药物的溶剂可以为链烷烃、烯烃、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烃、氢化烃、萜烯烃、卤代烃、杂环化物、含氮化合物及含硫化合物等等，可以优选丙酮、四氢呋喃、三氯甲烷、二氯甲烷。

本发明所述的静电喷涂或者阳极极化喷涂或浸涂的方法，可采用CN101337093A公开的方法制备。

本发明含重组hCREG糖蛋白的洗脱支架在用于抑制血管壁平滑肌细胞增殖、防治血管再狭窄中的应用。

本发明通过支架表面分布的hCREG糖蛋白成分的持续释放来抑制血管壁平滑肌细胞增殖，并促进血管再内皮化，促进损伤血管壁的愈合，防止支架内血栓的发生，减少病人术后服用抗血栓和血小板药物的时间。

附图说明

图1A-1B为本发明成功构建重组pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表达载体，获得纯化的重组野生型CREG-myc/his融合蛋白，其中图1A为蛋白的电泳分析，显示蛋白纯度在95％以上；图1B为CREG糖蛋白对平滑肌细胞抑制的流式细胞图谱，从图中可以看出CREG糖蛋白对平滑肌细胞有显著得抑制作用；

图2为本发明所述CREG糖蛋白洗脱支架体外洗脱曲线，横坐标为释放的时间，纵坐标为支架上CREG糖蛋白的残留百分比；

图3为HE染色显示4周时裸金属支架组内膜明显增厚；

图4为CD31染色显示4周时CREG组内皮化程度明显增强；

图5为本发明支架电镜图；

A、纳米微孔裸支架电镜图(左)，B、CREG糖蛋白洗脱支架电镜图(右)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1重组hCREG糖蛋白及其冠脉支架的制备

一、制备纳米孔重组hCREG糖蛋白洗脱支架

1.1重组hCREG糖蛋白的制备

1.1.1重组基因载体的构建  自1999年应用mRNA差异显示技术，首次从体外培养的人胸廓内动脉VSMCs中成功克隆了人CREG基因，用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框，终止密码突变的hCREG RT-PCR引物如下：上游引物为5’-aa ggatccatggccgggctatcccgc-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物为：5’-gc gaattcGcactgaactgtgacattataatattcttctgg-3’(SEQ ID NO.2)，其中大写字母代表C/G突变的终止密码。

构建带有his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3.1-his/myc-hCREG。重组hCREG蛋白氨基酸序列(SEQ IDNO.3)如下：

MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAARVARFVTHVSDWGALATISTLEAVRGRPFADVLSLSDGPPGAGSGVPYFYLSPLQLSVSNLQENPYATLTMTLAQTNFCKKHGFDPQSPLCVHIMLSGTVTKVNETEMDIAKHSLFIRHPEMKTWPSSHNWFFAKLNITNIWVLDYFGGPKIVTPEEYYNVTVQCEFCRYPAQWRPLESRGPFEQKLISEEDLMHTGHHHHHH&

1.1.2重组人源性CREG蛋白的表达应用lipofectamine2000将pcDNA3.1-his/myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分析法进行重组CREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度。

1.1.3蛋白提纯  根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱(美国Invitrogen公司)纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB)脱盐。

1.1.4重组蛋白生物学活性鉴定  将纯化的重组CREG蛋白添加于10％血清培养的VSMCs培养基中，用流式细胞仪分析细胞周期观察重组CREG蛋白对VSMCs增殖的影响，鉴定重组CREG蛋白的生物学活性(见图1A-1B)。从图1A-1B中可以看hCREG能够显著地抑制VSMCs的增殖。

2纳米微孔重组hCREG糖蛋白洗脱支架的制备

2.1纳米微孔金属裸支架的选择  采用乐普(北京)医疗器械股份有限公司的纳米微孔金属裸支架，该支架是在316L不锈钢金属裸支架的基础上，采用化学腐蚀的方法使不锈钢金属裸支架的表面形成大小均一的纳米孔洞，纳米孔大小为100-800nm。

2.2制备CREG蛋白洗脱支架  利用纳米孔洞的物理作用吸附原理，通过立体喷涂及浸入，溶剂采用pH为9.6(0.05mol/l)的碳酸钠缓冲溶液中，使将金属裸支架负载重组hCREG糖蛋白液(1.6mg/ml)，于浸泡48小时终止吸附，-55℃真空干燥机中冻干。

2.3蛋白吸附效率测定

采用¹²⁵I放射性标记单抗的方法hCREG糖蛋白液在支架上的吸附及其在一定流量下的释放进行了定量的检测。确定制备支架的最佳蛋白液浸泡时间、支架的最大蛋白负载量，并绘制体外蛋白释放曲线。见图2。

从图2可以看出载有hCREG糖蛋白的支架在2小时测定时，支架表面的蛋白含量为原始包被含量的85％，随后平稳下降，在28天以后，支架表面的蛋白含量仍然有原始包被含量的12％。

实施例2药物蛋白联合支架的制备

本实施例的冠脉支架表面均匀分布有重组hCREG糖蛋白和雷帕霉素药物。雷帕霉素药物分布在支架外层，支架内管腔分布重组hCREG糖蛋白。

配置有纳米孔的支架：其支架采用316L医用不锈钢基质，表面均匀配置有500nm左右的纳米孔。

制备三面雷帕霉素药物支架：用丙酮溶液精确配置浓度为1％的雷帕霉素药物。保护支架的内表面，在支架的外表面喷涂雷帕霉素药物。

制备CREG蛋白洗脱支架：利用纳米孔洞的物理作用吸附原理，将重组hCREG糖蛋白固定到支架的内管腔。溶剂采用pH为9.6(0.05mol/l)的碳酸钠缓冲溶液中，使将金属裸支架负载重组hCREG糖蛋白液(1.6mg/ml)，于浸泡后48小时后终止吸附，-55℃真空干燥机中冻干。

实施例3双药物蛋白联合支架的制备

本实施例的冠脉支架表面均匀分布有重组hCREG糖蛋白、雷帕霉素和紫杉醇药物。雷帕霉素和紫杉醇药物分布在支架外表面，支架内管腔分布重组hCREG糖蛋白。

配置有纳米孔的支架：其支架采用316L医用不锈钢基质，表面均匀配置有500nm左右的纳米孔。

制备三面雷帕霉素药物支架：保护支架的内表面，在支架的外表面喷涂雷帕霉素和紫杉醇药物，药物浓度为1％，药物溶剂采用四氢呋喃，雷帕霉素和紫杉醇药物之间的比值1∶1。

制备CREG蛋白洗脱支架：利用纳米孔洞的物理作用吸附原理，将重组hCREG糖蛋白固定到支架的内管腔。溶剂采用pH为9.6(0.05mol/l)的碳酸钠缓冲溶液中，使将金属裸支架负载重组hCREG糖蛋白液(1.6mg/ml)，于浸泡后48小时后终止吸附，-55℃真空干燥机中冻干。

试验例1重组hCREG糖蛋白洗脱支架的生物学效能评价

1、重组hCREG糖蛋白洗脱支架的生物学效能评价

1.1研究对象  选择沈阳农业大学良种场培养的健康良种小型猪，雄性，月龄9-10月，体重30-40公斤。

1.2实验分组  分为纳米微孔金属裸支架组(METAL)【乐普(北京)北京医疗器械股份有限公司】，雷帕霉素药物洗脱支架组(SRL)【Nano，乐普(北京)北京医疗器械股份有限公司】及hCREG蛋白洗脱支架组(CREG)(本发明实施例1的支架)。分别在每头猪的前降支、右冠及回旋支各植入一枚支架，支架随机置入，每组15枚支架，4周时处死，取标本。

1.3支架置入模型的建立

1.3.1术前准备术前3天始每日喂服阿司匹林(300mg/d)和氯吡格雷(75mg/d)。

1.3.2麻醉肌注戊巴比妥0.5mg/kg及氯胺酮10mg/kg麻醉动物。动物麻醉后仰卧固定于手术台，建立静脉通路，气管插管及呼吸机辅助呼吸。

1.3.3冠脉造影  局部消毒后，穿刺右股动脉，经穿刺针送入导引钢丝，沿钢丝送入6F股动脉鞘，经鞘管给予肝素200U/kg。经鞘管送入6F右冠指引导管分别行左右冠状动脉造影。

1.3.4支架植入术  选择血管的近中段作为支架植入处，尽量避开分支血管。支架与血管直径之比为1.1～1.2∶1，选取靶血管时尽量避开大的血管分支。在体外用压力泵充盈球囊至8ATM释放支架，持续10s，待支架完全贴壁后撤出球囊。术后复查造影。撤出导管，拔出股动脉鞘，术区局部加压止血。猪清醒后送回笼中继续喂养。

2.新型支架抗RS发生的生物学效能评价

2.1复查时肉眼观察是否存在动脉瘤及支架内血栓，计算RS发生率。

2.2组织学处理PCI术后的2周和4周分别复查冠脉造影，之后处死动物，即刻开胸取出心脏，肉眼观察支架周围的心肌是否存在坏死、纤维化等表现。分离支架置入处冠状动脉血管，留做组织学分析或Western blot用。

2.3形态学分析

A.将血管中的支架抽出，制成厚度5μm石蜡切片。苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察VSMC的移行、增殖及内膜厚度变化，拍照以作记录。

B.将图像摄入计算机图像分析系统中进行图像编辑，测算外弹力膜内横截面积(external elastic lamina area，EEL截面积)、内弹力膜内横截面积(Intimal elastic lamina area，IEL截面积)、血管腔面积、新生内膜面积、中膜面积、管腔狭窄百分比及内膜与中膜面积比。

2.4计算血管损伤积分

评估血管损伤程度，评分方法如下：0分：内弹力膜完好未受压；1分：内弹力膜受压，变形＜45°；2分：内弹力膜受压，变形＞45°；3分：内弹力膜受压撕裂；4分：外弹力膜受压撕裂。血管截面的损伤积分为单个金属柱杆积分的平均值。根据支架金属柱周围粒细胞数计算炎症积分，0分：无炎症细胞；1分：1-10个；2分：11-20个；3分＞20个，血管截面的炎症积分为单个金属柱杆积分的平均值。具体见表1。

表1 4周组形态学分析

术后4周，3组支架均观察到不同程度的内膜增生。而CREG组的新生内膜厚度显著小于METAL组及SRL组，在支架丝附着处的内膜增生程度明显高于无支架丝附着的部位，裸支架组的内膜增生显著，且已经完全覆盖支架表面，其厚度为原有中膜的几倍。3组的内弹力板完整，仅在与支架丝接触处有轻微的受压变形，其中膜也有受压的迹象。

4周时各组间管腔面积及中膜面积无显著差异，但是各组间新生内膜面积存在显著差异(p＝0.01)，其中SRL组及CREG组新生内膜面积较METAL组显著减少，而SRL组及CREG组间新生内膜面积无显著差异(p＝0.87)。同时，各组间管腔狭窄程度存在显著差异(p＜0.01)，其中METAL组管腔狭窄程度比SRL组(48％±4％vs.15％±4％，p＜0.01)及CREG组(48％±4％vs.20％±3％，p＜0.01)明显增大，SRL组与CREG组间管腔狭窄程度无显著差异(20％±4％vs.15％±3％，p＝0.06)。

以上结果表明，CREG组及SRL组在抑制血管新生内膜增生方面具有优势。

4周时3组炎症积分无明显差异。4周时各组间内皮化积分存在显著差异，其中METAL组及SRL组内皮化积分无显著差异(1.83±0.58vs.1.88±0.67，p＝0.51)；CREG组内皮化积分SRL组(2.50±0.52vs.1.88±0.67，p＝0.04)及METAL组(2.50±0.65vs.1.83±0.58，p＝0.04)明显增加。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种含重组hCREG糖蛋白的冠脉支架，其特征在于，其表面均匀涂布有重组hCREG糖蛋白。

2.根据权利要求1所述的冠脉支架，其特征在于，所述重组hCREG糖蛋白为重组人源性CREG糖蛋白及其衍生物。

3.根据权利要求1或2所述的冠脉支架，其特征在于，所述重组hCREG糖蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)重组基因载体的构建：用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框，终止密码突变的hCREG RT-PCR引物如SEQ IDNO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示，其中大写字母代表C/G突变的终止密码；构建带有his标签蛋白的重组人源性CREG蛋白表达载体pcDNA3.1-his/myc-hCREG；重组hCREG蛋白氨基酸序列如如SEQ ID NO.3所示；

2)重组人源性CREG蛋白的表达应用lipofectamine2000将pcDNA3.1-his/myc-hCREG转染至人HEK293F细胞中，通过G418抗性筛选稳定表达的HEK293F细胞克隆，收集细胞培养上清液，用Ni-NTA柱纯化和制备重组CREG蛋白；应用Bradford蛋白质定量分析法进行重组CREG蛋白的定量，Western blot分析进行重组CREG蛋白的定性，考马斯亮兰染色聚丙酰胺凝胶确定重组蛋白纯度；

3)蛋白提纯  根据6×His亲和层析原理，应用Ni-NTA柱纯化重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap脱盐柱脱盐。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的冠脉支架，其特征在于，所述重组hCREG糖蛋白还可以与选自于下述各类药物组分的一种或几种联合使用：免疫抑制剂及抗炎药物、抗增殖药物、促再内皮化药物、抗细胞迁移药物以及细胞间基质调节剂。

5.根据权利要求4所述的冠脉支架，其特征在于，所述抗增殖药物包括其中任一种或几种：西罗莫司，他克莫司，艾罗莫司，免疫抑制剂ABT-578，地塞米松，咪唑立宾，雷帕霉素，紫杉醇及其衍生物，放线菌素，长春新碱及其衍生物，他汀类药物，2-氯去氧腺苷，核酶，巴马司他，溴氯哌喹酮，普罗布可。

6.根据权利要求4所述的冠脉支架，其特征在于，所述药物和重组hCREG糖蛋白的分布为层层结构，或为支架外管腔和支架内管腔两个不同表面分别分布药物和重组hCREG糖蛋白。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的冠脉支架，其特征在于，所述冠脉支架的金属材料选自钛、钴、钽、镍钛合金、镍钛锘合金、医用不锈钢或选用聚合物材料。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的冠脉支架，其特征在于，所述支架表面均匀分布100-800nm的微孔。

9.制备权利要求1-8任意一项所述支架的方法，其特征在于，其采用如下任意方法制成：

将重组hCREG糖蛋白、重组hCREG糖蛋白与药物各溶于单一溶剂或混合溶剂中，通过直接喷涂、浸涂或二者结合的方法涂覆于支架表面；

或将重组hCREG糖蛋白、重组hCREG糖蛋白与药物溶于单一溶剂或混合溶剂中，采用静电喷涂或者阳极极化方法浸涂到支架表面。

10.权利要求1-8任意一项所述支架用于抑制血管壁平滑肌细胞增殖、防治血管再狭窄中的应用。

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