CN101249287B

CN101249287B - 一种治疗冠心病的血管支架

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Publication number: CN101249287B
Application number: CN2008101035248A
Authority: CN
Inventors: 张玉霄; 王吉成
Original assignee: 张玉霄; 王吉成
Current assignee: Xtent Inc
Priority date: 2008-04-08
Filing date: 2008-04-08
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2028-04-08
Also published as: CN101249287A

Abstract

本发明公开了一种治疗冠心病的血管支架。该支架是由裸金属支架、裸金属支架接触血管壁一侧涂层和裸金属支架接触血管腔一侧涂层构成的；所述裸金属支架接触血管壁一侧涂层是可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组表达载体与可降解聚合物的混合物；所述裸金属支架接触血管腔一侧涂层是促进血管内皮化的基因与可降解聚合物的混合物。本发明支架通过非对称涂层工艺制作使支架的功能得到更好的优化，可同时解决平滑肌细胞增殖、血管内皮化延迟和聚合物永久残留导致的一系列问题，从而最大程度地改善冠心病支架治疗的效果。

Description

一种治疗冠心病的血管支架

技术领域

本发明涉及一种治疗冠心病的血管支架。

背景技术

目前用于治疗冠心病的支架有裸金属支架(BMS)和药物洗脱支架(DES)两类。裸金属支架的材料主要有316L不锈钢和钴铬合金两种。DES是将裸金属支架、聚合物以及抗再狭窄药物结合在一起的支架(该聚合物是将药物携载到裸金属支架上的载体)，按照支架所携载的抗再狭窄药物分为：雷帕霉素及其衍生物洗脱支架(如美国生产的Cypher^TM和Endeaver^TM；中国生产的Firebird^TM、Partner^TM和EXCEL^TM等)和紫杉醇洗脱支架(如美国生产的TAXUS^TM系列支架)两种；按照支架使用的聚合物是否可降解分为：聚合物不可降解药物洗脱支架(如Cypher^TM、Endeaver^TM、Firebird^TM、Partner^TM以及TAXUS^TM系列支架)和聚合物可降解药物洗脱支架(如EXCEL^TM)。冠状动脉内植入裸金属支架后再狭窄率高达20％～30％(研究认为，裸金属支架术后再狭窄的主要原因是血管平滑肌细胞增殖)，导致患者术后心脏不良事件发生率增加；为了克服裸金属支架的这些缺点，人们首先研制出了聚合物不可降解的DES，它可使支架术后再狭窄率降至10％以内，因此DES被誉为冠心病介入治疗史上的第三个里程碑。

但是，除EXCEL^TM支架外，其它的DES均是在支架所有部位都涂有聚合物和抗再狭窄药物涂层的全面涂层支架(称为对称涂层)，支架接触血管壁一侧所携载的抗再狭窄药物通过抑制血管平滑肌细胞增殖起到抗再狭窄的作用，而支架接触血管腔一侧所携载的抗再狭窄药物则抑制内皮细胞的生长，使得血管内皮细胞修复延迟，导致支架段血管内皮化不完全，从而，增加了支架内血栓形成甚至造成患者死亡的危险；另一方面，使用不可降解聚合物的DES因为其聚合物永久残留，导致血管壁发生炎症反应，甚至严重的超敏反应，因此，使血管内皮修复更加延缓，而且还存在导致晚期支架贴壁不良(LSM)及支架处动脉瘤形成等危险的发生。

针对不可降解聚合物全面涂层DES的上述缺点，本专利发明人王吉成研制出了聚合物可降解(该聚合物在体内最终降解为CO₂和H₂O)、单面涂层(即仅在支架接触血管壁一侧涂有聚合物和药物涂层，称为非对称涂层)的药物洗脱支架-EXCEL^TM。初步的临床研究显示：它能够有效预防支架内再狭窄和支架内血栓事件的发生(张玉霄，卢才义，薛桥，等.载雷帕霉素可降解聚合物涂层支架治疗冠心病的临床观察.中华心血管病杂志.2006；34(11)：971-974.)；动物实验显示：支架段血管的内皮化时间比文献报道的Cypher^TM支架短，局部炎症反应轻，与裸金属支架相似(张玉霄，卢才义.载雷帕霉素可降解聚合物涂层支架治疗冠心病的临床及实验研究.中国人民解放军军医进修学院博士论文.2006.)。也说明单面涂层的EXCEL^TM支架在血管内皮化方面，并不优于裸金属支架，仍然存在因为支架段血管内皮化不完全而引发支架内血栓形成的危险。

目前的动物实验及临床研究认为，血管平滑肌细胞增殖、支架段血管内皮化延迟和不可降解聚合物永久残留导致的局部血管壁炎症反应是植入DES后发生再狭窄和晚期支架内血栓的主要原因。因此，只有同时解决血管平滑肌细胞增殖、支架段血管内皮化延迟和不可降解聚合物永久残留的问题，才能从根本上解决支架内再狭窄和因为支架段血管内皮化不全所导致的支架内血栓形成的问题。

针对支架段血管内皮化延迟和内皮化不全的问题，Dirk H博士等人研制了一种基因洗脱支架——是用聚合物将促进血管内皮增生的phVEGF-2携载到裸金属支架上制成的支架，动物实验证明该支架具有显著的促进支架段血管内皮化的作用，但是，该支架上没有携载抑制血管平滑肌细胞增殖的药物，理论上，它不能阻止因为血管平滑肌细胞增殖造成的再狭窄发生，因此它是否具备肯定而有效的抗再狭窄作用有待进一步实验证实。

人血管内皮生长因子(hVEGF，GeneID：7422，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)是由两个相同多肽链以二硫键组成的二聚体糖蛋白，分子量为46kD(Connolly DT，Heuvelman DM，Nelson R，et al.[J].J ClinInvest，1989；84(5)：1470-1478)可促进血管内皮细胞增生，其编码基因位于染色体的6q21.3，全长14kb，包括交替剪接的8个外显子和7个内含子(Wei MH，Popescu NC，Lerman MI，et al.Localization of the hμman vascular endothelial growth factor gene，VEGF，at chromosome 6q12[J].Hμm Genet，1996，97(1)：794-797)，可以形成人血管内皮生长因子121(hVEGF121)、人血管内皮生长因子165(hVEGF165)、人血管内皮生长因子189(hVEGF189)、人血管内皮生长因子206(hVEGF206)和人血管内皮生长因子145(hVEGF145)等至少5种蛋白异构体(Mingqing S，Sreemathy R，Sμmathi R，et al.Angiogenic role for glycodelin in tμmorigenesis[J].Medical Sciences，2001，98(16)：9 265-9 270.)。这几型人血管内皮生长因子生物活性相近，它们是由同一种原始转录物按不同方式拼接形成的，在人类细胞中VEGF121和VEGF165是主要的异构体形式。而多数细胞分泌VEGF又以VEGF165为主，这也是VEGF发挥作用的主要形式。目前，人们利用细胞表达VEGF及其各种亚型的技术已经成熟。

成纤维生长因子(FGF)是一种对中胚层来源的细胞有强烈促增殖和分化作用的细胞生长因子，这种中胚层来源的细胞包括了3种主要血管细胞：成纤维母细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。FGF有7种家族系列(Schott RJ，Morrow LA.[J].Cardiovascres，1993；27(7)：1155-1161)，研究较多的为酸性成纤维母细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维母细胞生长因子(bFGF)，aFGF由140个氨基酸组成，bFGF则由146个氨基酸组成，两者的氨基酸排列顺序约53％相同，bFGF的分布较广泛，见于血管内皮、血管平滑肌、心肌细胞以及富含血管的组织器官中，aFGF分布相对局限，未见其在血管内皮分布的报道。两因子在脑、心脏等许多器官内广泛存在，并参与组织的分化和修复。FGF通过其特异性受体发挥作用，FGF效应细胞表面存在两种受体：高亲和力和低亲和力受体，高亲和力受体的分子克降表明，它们分别是FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4(Jaye M，Schlessinger J，Dionne CA，et al.[J].Biochim BiophysActa，1992；1135(2)：185-199)。体外研究发现在毛细血管中加入FGF，不但可以促进细胞增殖、分裂和生长，而且还可以诱导毛细血管样管腔形成。同时发现对血管内皮细胞有强烈的趋化作用(Thomas KA.Rios CM，Gimenez GG，et al.[J].Proc Natl Acad SciUSA，1985；82(19)：6409-6419)。体内研究发现FGF有强烈的促血管形成作用(ClarkeMSF，Khakee R，McNeil PL.[J].J Cell sci 1993，106(1)：121-123；Unger EF，Banai S，ShouM，et al.[J].Am J physiol，1994；266(4pt 2)：H1588-1595)。FGF促进血管形成的作用主要有：①促进血管内皮细胞的增殖；②促进内皮细胞的迁移；③促进具有降解基底膜作用的蛋白激酶的释放；④促进内皮细胞形成管腔。

发明内容

针对裸金属支架、不可降解聚合物全面涂层DES、可降解聚合物单面涂层药物洗脱支架和单纯phVEGF(可表达hVEGF基因的重组质粒载体)洗脱支架存在的不足，本发明提供了具有非对称涂层的可同时抗再狭窄、促进血管内皮生长的治疗冠心病的血管支架。

本发明所提供的治疗冠心病的血管支架，含有非对称的载抗再狭窄药物的可降解聚合物涂层和载可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组表达载体的可降解聚合物涂层的血管支架；是由裸金属支架、裸金属支架接触血管壁一侧涂层和裸金属支架接触血管腔一侧涂层构成；所述裸金属支架接触血管壁一侧涂层是抗再狭窄药物与可降解聚合物的混合物；所述裸金属支架接触血管腔一侧涂层是可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组表达载体与可降解聚合物的混合物。所述抗再狭窄药物为雷帕霉素和/或雷帕霉素衍生物和/或紫杉醇；所述雷帕霉素衍生物可为Biolimus A₉、ABT578、Everolimus或Tacrolimus。

所述人血管内皮生长因子可为人血管内皮生长因子165(hVEGF165)和/或人血管内皮生长因子121(hVEGF121)和/或人血管内皮生长因子2(hVEGF2)。

所述可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组表达载体优选为可表达人血管内皮生长因子的重组表达载体；所述可表达人血管内皮生长因子的重组表达载体优选为可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体。

所述可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体是将人血管内皮生长因子165的编码基因插入到真核表达载体中得到的可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体。所述可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体优选为pcDNA3-VEGF165。

所述裸金属支架为不锈钢血管支架或钴铬合金血管支架，可为市售任意治疗冠心病的裸金属支架，其结构为管状，管壁有镂空，外观呈网管状。

所述可降解聚合物为聚乳酸。所述聚乳酸优选为外消旋聚乳酸(D，L-PLA)。

所述裸金属支架接触血管壁一侧涂层中所述雷帕霉素的含量为90μg～180μg/cm²；所述裸金属支架接触血管腔一侧涂层中所述可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体的含量为70μg～140μg/cm²。

所述裸金属支架规格(直径×长度)范围为2.5mm～4.0mm×14mm～33mm。本发明的支架每枚支架的雷帕霉素含量可为192μg～376μg，每枚支架的可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体含量为100μg～200μg。

所述裸金属支架接触血管壁一侧涂层或所述裸金属支架接触血管腔一侧涂层的厚度为5μm～10μm。

本发明的支架的制备方法可包括：

1)制备支架接触血管壁一侧涂层液：将粘度为0.2dl/g-1.5dl/g的聚乳酸与雷帕霉素按10∶2.5-15.0的重量比混和，再加入有机溶剂(如丙酮、乙酸乙酯或氯仿等)在不超过60℃的条件下采用振荡或超声的方法混匀，得到支架接触血管壁一侧涂层液；

2)制备支架接触血管腔一侧涂层液：粘度为0.2dl/g-1.5dl/g的聚乳酸与所述可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组表达载体按10∶0.03-10.0的重量比混和，再加入有机溶剂(如丙酮、乙酸乙酯或氯仿等)在不超过60℃的条件下采用振荡或超声的方法混匀，制得裸金属支架接触血管腔一侧涂层液；

3)利用沾涂法将上述制得的支架接触血管壁一侧涂层液涂在裸金属支架接触血管壁一侧的金属表面，将制得的支架接触血管腔一侧涂层液涂在裸金属支架接触血管腔一侧的的金属表面，经干燥、灭菌得到治疗冠心病的血管支架。

本发明的支架采用了抗再狭窄药物和可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组载体分别涂于支架血管壁和血管腔一侧的不对称涂层设计，使支架的功能得到了优化。一方面，在血管壁一侧涂层中有抗再狭窄药物，而在血管腔一侧涂层中没有抗再狭窄药物，既起到抑制平滑肌细胞增殖防止再狭窄的作用，又避免了抗再狭窄药物对血管内皮细胞的抑制作用造成的血管内皮细胞修复延迟和支架段血管内皮化不全的不良后果(即避免了抗再狭窄药物对血管内皮细胞修复的抑制作用)；另一方面，支架接触血管腔一侧涂层中的可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组表达载体起促进支架段血管内皮化，避免支架内血栓形成的作用；在支架接触血管壁一侧涂层中没有可表达人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子的重组表达载体，避免了人血管内皮生长因子和/或人成纤维生长因子对支架接触的血管壁一侧细胞的影响。

本发明的支架使用的聚乳酸作为抗再狭窄药物和促进内皮化基因的载体，在人体内可以完全降解为对人无害的CO₂和H₂O，不在体内残留，动物实验结果证明在同一枚裸金属支架接触血管壁一侧涂具有抗再狭窄作用的雷帕霉素和支架接触血管腔一侧涂具有促进支架段血管内皮化的可表达人血管内皮生长因子的重组表达载体是安全而有效的，提示本发明的支架可以应用于冠心病的临床介入手术中。

附图说明

图1为本发明的血管支架截面图。

图2为本发明的血管支架展开后正视图(平面图)。

图3为本发明的血管支架展开后立体图。

图4为本发明的血管支架植入术后24小时支架和支架撑杆周围的血管内皮细胞扫描电镜照片。图4中A为支架撑杆表面改变的扫描电镜照片；图4中B为支架撑杆周围内皮细胞变化的扫描电镜照片。

图5为实施例1制备的支架植入术后1个月支架段血管内皮化情况和支架撑杆不同部位血管内皮细胞形态及其排列的扫描电镜照片；A为实施例1制备的支架植入术后1个月支架撑杆表面100％被新生内膜覆盖；B为支架撑杆不同部位内皮细胞的形态和排列；C为支架撑杆部位新生内皮细胞呈“铺路石”样形态；D为远离支架撑杆部位新生内皮细胞呈“梭形”，其长轴与血流方向一致；E为在支架撑杆弧线走行部位内皮细胞呈“漩涡样”排列。

图6为实施例1制备的支架植入术后1个月，支架段血管壁合成态血管平滑肌细胞和收缩态血管平滑肌细胞的透射电镜照片；图中A为合成态血管平滑肌细胞；B为收缩态血管平滑肌细胞。

图7为实施例1制备的支架植入术后1个月支架段血管光镜观察的结果；图中A为支架段血管壁三层结构、新生内膜增生与中膜和外膜受压情况的光镜照片，B为支架段血管壁炎症反应的光镜照片(HE染色，×1000)。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明所使用的裸金属支架规格(直径×长度)范围为2.5mm～4.0mm×14mm～33mm。

实施例1、本发明的血管支架的制备

以2.5mm×14mm支架为例介绍该支架的制作工艺及主要参数：

将10.0g粘度为0.9dl/g的聚乳酸(外消旋聚乳酸)加入4.5g雷帕霉素，置于一洁净的烧杯内，加入100ml的乙酸乙酯在0-60℃下500转/分钟混合10分钟，然后在20KHZ下超声20分钟，所得溶液即为涂层液，即裸金属支架接触血管壁一侧涂层液。

将10.0g粘度为0.9dl/g的聚乳酸(外消旋聚乳酸)加入1.0g pcDNA3-VEGF165质粒(购自北京亿利高科生物技术研究所有限公司，pcDNA3-VEGF 165是以pcDNA3.1为出发质粒，插入人VEGF165的编码基因片段得到的可表达人VEGF165的重组质粒)，加入100ml的乙酸乙酯在0-60℃下500转/分钟混合10分钟，然后在20KHZ下超声20分钟，制得裸金属支架接触血管腔一侧涂层液。

将裸金属支架(新加坡百盛公司生产的S支架，支架的型号(直径×长度)为2.5mm×14mm)浸泡于水中，超声清洁，直到支架表面无污染物(支架清洁液在光线明亮处检查应无肉眼可见的颗粒)。

用沾涂法将清洗过的裸金属支架的接触血管腔一侧涂上上述制得的裸金属支架接触血管腔一侧涂层液，涂层厚度为7μm；在裸金属支架接触血管壁一侧用沾涂法涂上上述制得的裸金属支架接触血管壁一侧涂层液，涂层厚度为7μm。

将完成涂层后的支架置于一洁净的容器内，保持真空度为0.1-0.07MPa，0-60℃温度下，使溶剂挥发，即得到支架接触血管壁一侧涂有聚乳酸和雷帕霉素，支架接触血管腔一侧涂有聚乳酸和pcDNA3-VEGF165质粒的血管支架。

支架经过上述处理后，在生产线上将支架预装到球囊上，给予该球囊爆破压的压力充盈球囊，肉眼观察支架伸展是否均匀、涂层是否有爆裂和脱落等问题，之后在电镜下观察涂层是否爆裂或脱落。结果表明，上述制备的血管支架在球囊完全充盈后无伸展不均匀、涂层爆裂和涂层脱落等现象发生。

用金相显微镜测定表明，该支架接触血管壁一侧的涂层厚度为7μm，接触血管腔一侧的涂层厚度为7μm。用HPLC测定表明，该支架接触血管壁一侧涂层的雷帕霉素含量为140μg/cm²；接触血管腔一侧涂层的pcDNA3-VEGF165质粒含量为110μg/cm²。该血管支架的结构图如图1、图2和图3所示，图1为本发明的血管支架截面图，图2为本发明的血管支架展开后图，自血管壁一侧正视图，图3为本发明的血管支架展开后立体图；图1、图2和图3中1为支架接触血管壁一侧涂层，2为支架的金属部分，3为支架接触血管腔一侧涂层。

实施例2、本发明的血管支架的制备

以2.75mm×14mm支架为例介绍该支架的制作工艺及主要参数：

将10.0g粘度为0.2dl/g的聚乳酸(外消旋聚乳酸)中加入2.5g雷帕霉素，置于一洁净的烧杯内，加入100ml的丙酮在0-60℃下500转/分钟混合10分钟，然后在20KHZ下超声20分钟，所得溶液即为涂层液，即制得裸金属支架接触血管壁一侧涂层液。

在10.0g粘度为0.2dl/g的聚乳酸中加入0.03g pcDNA3-VEGF165质粒(购自北京亿利高科生物技术研究所有限公司，pcDNA3-VEGF165是以pcDNA3.1为出发质粒，插入人VEGF165的编码基因片段得到的可表达人VEGF165的重组质粒)，加入100ml的丙酮在0-60℃下500转/分钟混合10分钟，然后在20KHZ下超声20分钟混匀，制得裸金属支架接触血管腔一侧涂层液。

将裸金属支架(新加坡百盛公司生产的S支架，支架的型号(直径×长度)为2.75mm×14mm)浸泡于碱溶液(浓度为0.5M的NaOH溶液)中，超声清洁，直到支架表面无污染物(支架清洁液在光线明亮处检查应无肉眼可见的颗粒)。

用沾涂法将清洗过的裸金属支架接触血管腔一侧涂上上述制得的裸金属支架接触血管腔一侧涂层液，涂层厚度为10μm；在支架接触血管壁一侧用沾涂法涂上上述制得的裸金属支架接触血管壁一侧涂层液，涂层厚度为10μm。

用金相显微镜测定表明，该支架的接触血管壁一侧涂层厚度为10μm，接触血管腔一侧涂层为10μm。用HPLC测定表明，该支架的接触血管壁一侧涂层的雷帕霉素浓度为110μg/cm²；接触血管腔一侧涂层的pcDNA3-VEGF165质粒浓度为72μg/cm²。该血管支架的结构图如图1、图2和图3所示，图1为本发明的血管支架截面图，图2为本发明的血管支架展开后，自血管壁一侧正视图，图3为本发明的血管支架展开后立体图；图1、图2和图3中1为接触血管壁一侧涂层，2为支架的裸金属支架部分，3为接触血管腔一侧涂层。

实施例3、本发明的血管支架的制备

以3.0mm×14mm支架为例介绍该支架的制作工艺及主要参数：

将10.0g粘度为1.2dl/g的聚乳酸加入15g雷帕霉素，置于一洁净的烧杯内，加入100ml的氯仿在0-60℃下500转/分钟混合10分钟，然后在20KHZ下超声20分钟，所得溶液即为涂层液，即裸金属支架接触血管壁一侧的涂层液。

将10.0g粘度为1.0的聚乳酸加入10.0g pcDNA3-VEGF165质粒(购自北京亿利高科生物技术研究所有限公司，pcDNA3-VEGF165是以pcDNA3.1为出发质粒，插入人VEGF165的编码基因片段得到的可表达人VEGF165的重组质粒)，加入100ml的氯仿在0-60℃下500转/分钟混合10分钟，然后在20KHZ下超声20分钟混匀，制得裸金属支架接触血管腔一侧涂层液。

将裸金属支架(新加坡百盛公司生产的S支架，支架的型号(直径×长度)为3.0mm×14mm)，浸泡于20g丙酮中，振荡清洁，直到支架表面无污染物(支架清洁液在光线明亮处检查应无肉眼可见的颗粒)。

用沾涂法将清洗过的裸金属支架接触血管腔一侧涂上上述制得的裸金属支架接触血管腔一侧涂层液，涂层厚度为5μm；在支架接触血管壁一侧用沾涂法涂上上述制得的裸金属支架接触血管壁一侧涂层液，涂层厚度为5μm。

用金相显微镜测定表明，该支架接触血管壁一侧的涂层厚度为5μm，接触血管腔一侧涂层为5μm。用HPLC测定表明，该支架的接触血管壁一侧涂层的雷帕霉素浓度为180μg/cm²；接触血管腔一侧涂层的pcDNA3-VEGF165质粒浓度为140μg/cm²。该血管支架的结构图如图1、图2和图3所示，图1为本发明的血管支架截面图，图2为本发明的血管支架展开后，自血管壁一侧正视图，图3为本发明的血管支架展开后立体图；图1、图2和图3中1为接触血管壁一侧涂层，2为金属裸金属支架，3为接触血管腔一侧涂层。

实施例4、本发明的血管支架的制备

以4.0mm×14mm支架为例介绍该支架的制作工艺及主要参数：

将10.0g粘度为1.5dl/g的聚乳酸，15g雷帕霉素，置于一洁净的烧杯内，加入100ml的氯仿在0-60℃下500转/分钟混合10分钟，然后在20KHZ下超声20分钟，即制得裸金属支架接触血管壁一侧涂层液。

在10.0g粘度为1.0dl/g的聚乳酸中加入10.0g pcDNA3-VEGF165质粒(购自北京亿利高科生物技术研究所有限公司，pcDNA3-VEGF165是以pcDNA3.1为出发质粒，插入人VEGF165的编码基因片段得到的可表达人VEGF165的重组质粒)，按上述方法混匀，制得裸金属支架接触血管腔一侧涂层液。

将裸金属血管支架(新加坡百盛公司生产的S支架，支架的型号(直径×长度)为4.0mm×14mm)浸泡于20g丙酮中，振荡清洁，直到支架表面无污染物(支架清洁液在光线明亮处检查应无肉眼可见的颗粒)。

用金相显微镜测定表明，该支架的接触血管壁一侧涂层厚度为5μm，接触血管腔一侧涂层为5μm。用HPLC测定表明，该支架的接触血管壁一侧涂层的雷帕霉素浓度为110μg/cm²；接触血管腔一侧涂层的pcDNA3-VEGF165质粒浓度为140μg/cm²。该血管支架的结构图如图1、图2和图3所示，图1为本发明的血管支架截面图，图2为本发明的血管支架展开后，自血管壁一侧正视图，图3为本发明的血管支架展开后立体图；图1、图2和图3中1为接触血管壁一侧涂层，2为金属裸金属支架，3为接触血管腔一侧涂层。

实施例5、本发明的血管支架的植入效果检测

一、动物血管支架植入

1、动物来源

健康杂种犬6只(由中国人民解放军总医院动物实验中心提供)，于其冠状动脉内植入实施例1制备的血管支架(每只犬各植入1枚支架)；支架的参数(直径×长度)均为2.5mm×14mm，术中选择支架球囊直径/血管直径＝1.1～1.3∶1的血管段植入支架。

2、实验过程中动物的处理

将步骤1所述的实验犬进行如下实验(支架植入过程中有1只犬于支架植入后发生室颤死亡)：

1)随机取1只犬于支架植入术后24小时处死；

2)其余犬于支架植入术后1个月处死。

所有实验犬均于支架植入术前12小时禁食水；术前24小时喂阿司匹林肠溶片300mg，术后150mg/天，直至动物处死；支架植入术中用肝素抗凝。

处死前进行冠状动脉造影(CAG)观察：有无支架内和支架边缘再狭窄及冠状动脉瘤样扩张发生；

对支架段血管进行扫描电镜观察：支架段血管内皮化情况；

透射电镜观察：新生内膜血管平滑肌细胞的数量和表型变化；

光镜观察：支架段血管壁结构；中膜、外膜的受压程度和相应部位的内膜增生程度、新生内膜厚度和面积；管腔面积和新生内膜的细胞成分。

定义血管壁中膜受压程度分为轻度、中度和重度三级；与相邻未受压的中膜比较，轻度受压为厚度减少≤30％；中度为厚度减少＞30％≤60％；重度为厚度减少＞60％；血管壁外膜受压程度分为轻度、中度和重度三级；与相邻未受压的外膜比较，轻度受压为厚度减少≤30％；中度为厚度减少＞30％≤60％；重度为厚度减少＞60％。

在整个过程中对实验犬进行的各种检查的方法如下所述：

(1)冠脉造影检查

动物麻醉及术中监护：按20～25mg/kg给3％戊巴比妥钠静脉注射麻醉，保留套管针静脉输液及追加戊巴比妥钠以维持适当的麻醉深度；麻醉成功后，将动物固定在专用手术架上进行气管插管、心电图和血压监测并记录心电图和血压。

冠状动脉造影：先切开犬右侧颈部皮肤，分离皮下组织，暴露颈总动脉，直视下以Seldinger法穿刺右侧颈总动脉，置入7F动脉鞘并结扎固定鞘管，同时结扎颈总动脉远心端；鞘管内给肝素300IU/kg，术程每增加1小时追加肝素500IU；直接选择7F/JR3.5～4.0或6F/JR3.5～4.0大腔指引导管在左前斜位40°～45°行冠状动脉造影。

(2)支架植入手术

冠状动脉内支架植入术：植入支架前经导管向冠状动脉内注射硝酸甘油50μg，5-10分钟后采用支架球囊直径/血管直径＝1.1～1.3∶1对目标段血管进行直接植入支架，扩张压力为14～18个大气压，扩张时间为10～15秒。

术后处理：手术结束时拔除动脉鞘管，结扎颈总动脉近心端，逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤并用复合碘消毒创口；术后连续肌注青霉素400万单位/d，共3天。

(3)处死前冠状动脉造影

采取与支架植入相同的手术方式经左侧颈总动脉途径进行冠状动脉造影检查，观察有无支架内和支架边缘再狭窄及冠状动脉瘤样扩张发生。

(4)动物处死、取材及相关检查标本的制作

①动物处死：冠状动脉造影检查结束后，放血处死动物，之后立即开胸取出心脏(保留升主动脉)。

②支架段血管的冲洗：每个标本均在支架近、远端的支架网眼之间各取约1mm³的组织1块，放入3％的戊二醛中固定，用以制作透射镜标本。

③取材固定：将步骤②中的支架段血管加压冲洗，分离出支架段及支架近、远端各5mm的血管段，先将非支架段血管组织剪下分别放入4％的中性甲醛中固定以备制作光镜标本；根据方便操作的原则，从一端沿血管长轴剪开支架段血管长度的1/2后，再沿垂直血管长轴方向剪下该段血管，小心展开后放入3％的戊二醛中固定以备制作扫描电镜标本；另一半放入4％的中性甲醛中固定以备制作光镜标本。

(5)扫描电镜标本制作

①样品的清洗：将步骤(4)中的步骤③中固定好的用于制作扫描电镜标本的样品，用等渗的生理盐水清洗表面。

②固定：将步骤①得到的样品用戊二醛和锇酸双固定。

③脱水：将步骤②得到的样品用乙醇脱水。

④干燥：将步骤③得到的样品在六甲基二硅胺烷中干燥。

⑤金属镀膜：将步骤④得到的样品按常规方法给标本表面镀金。

⑥照相、记录及结果分析：将步骤⑤得到的样品在专业技术人员和心血管病理医师的指导下照相、记录并分析结果。

(6)透射电镜标本制作

按照下述步骤进行标本制作和结果分析：

①样品脱水：将步骤(4)的步骤②中处理后用于制作透射镜的标本按常规采用体积百分浓度为70％～100％丙酮溶液进行梯度脱水。

②浸透：将步骤①得到的样品，按常规用812包埋剂、DMP-30及丙酮浸透。

③包埋：将步骤②得到的样品，常规包埋在多孔橡胶包埋模板中，然后烘干、聚合硬化，形成包埋块。

④半薄切片及定位：将步骤③得到的样品，用超薄切片机制作半薄切片；在光镜下观察定位。

⑤载网和支持膜：将步骤④得到的样品，固定到200目的铜网中并制作支持膜覆盖组织切片。

⑥染色：将步骤⑤得到的样品，用含铅染液进行染色。

⑦照相、记录及结果分析：在专业技术人员和心血管病理医师的指导下照相、记录并分析结果。

(7)含支架组织的光镜标本的制作

①组织包埋的基本步骤

A：固定脱水：将固定好的标本用自来水冲洗过夜后先后浸泡于如下步骤脱水(此过程均在4℃环境中进行)：用体积百分含量为40％的乙醇溶液浸泡1～2天，然后用体积百分含量为70％的乙醇溶液浸泡l～2天，然后用体积百分含量为95％的乙醇溶液浸泡2天，然后用100％乙醇浸泡1天，最后用用二甲苯浸泡1天。

B：浸透包埋：首先配制浸液，之后对固定脱水的组织进行包埋。

浸液的配制：

溶液I：甲基丙烯酸甲酯75ml和邻苯二甲酸二丁酯25ml搅拌混匀3小时。

溶液II：甲基丙烯酸甲酯75ml，邻苯二甲酸二丁酯25ml，过氧化苯甲酰2.5g搅拌混匀3小时。

溶液III：甲基丙烯酸甲酯75ml，邻苯二甲酸二丁酯25ml，过氧化苯甲酰62.5g搅拌混匀4～6小时。

浸液浸泡程序：用溶液I浸泡2天，然后用溶液II浸泡2天，最后用溶液III浸泡1～2天。

包埋程序：在干净的25ml玻璃瓶中加入5ml新鲜配制的溶液III，加盖后室温过夜，再放入42℃烤箱内，1～3聚合成固体。把浸液的标本放入上述准备好的玻璃瓶中，摆好位置，再装满新鲜溶液III，加盖后室温过夜，之后再放入42℃烤箱内聚合凝固，包埋好的标本在室温下存放。

②组织切片

将装有包埋好的组织块的玻璃瓶放入冰箱内冷冻片刻后，用锤子击碎玻璃瓶，取出包埋块，用专用工具修剪成适当大小和形状(标本周围要保留至少数毫米)以便于切片时固定；用骨科专用切片机(碳化钨钢刀)按每片l0～15μm厚度垂直管腔长轴方向切片，每个标本连续切6片，经过脱塑处理后，任选三片进行染色。

③染色、封片、照相

将处理好的标本固定在经过预处理的载玻片上，Giemsa-伊红和HE染色后封片；在光镜下根据观察目的选取不同部位照相；采用Image-Pro Plus 5.0微图像分析软件测定支架段血管的新生内膜厚度、面积、管腔面积和包括新生内膜的血管横截面积；每个标本的各个参数都取3个切片测量值的平均值。

(8)不含支架组织的光镜标本制作

①组织包埋

A：脱水：将固定好的标本用自梯度乙醇按常规方法脱水。

B：透明：先后用二甲苯透明处理2次。

C：浸蜡：在62℃～65℃的液蜡中反复浸蜡3次。

D：包埋：将完成浸蜡的标本用石蜡包埋

②切片、染色、照相及图像分析：按常规石蜡包埋组织的切片方法对每个标本连续切6片，任选三片进行染色；观察非支架段血管的内膜结构和细胞成份并与支架段血管进行比较。

二、支架效果的检测结果

1、植入实施例1制备的血管支架的冠状动脉造影结果

实施例1制备的血管支架植入术后24小时处死实验犬1只；术后1个月处死实验犬4只。

对术后1个月处死的实验犬，于处死前行冠状动脉造影检查：4只犬均无支架内再狭窄、支架边缘再狭窄和支架段血管瘤样扩张发生。

2、植入实施例1制备的血管支架后支架段血管的内皮化情况

(1)大体观：实施例1制备的血管支架植入术后24小时处死实验犬1只，其支架部位无内皮覆盖；1个月处死的实验犬4只，其支架部位全部被半透明新生内膜覆盖。

(2)扫描电镜观察结果

①实施例1制备的血管支架植入术后24小时处死的1只犬，于支架撑杆上覆盖有纤维蛋白、血小板和少量血细胞，支架撑杆附近的内皮细胞数量极少，而且内皮细胞的排列及结构均被破坏(图4中A，B)。图4中A为支架撑杆表面改变的扫描电镜照片；图4中B为支架撑杆周围内皮细胞变化的扫描电镜照片。

②术后1个月处死的4只犬，其新生内皮细胞的共同特点是：支架撑杆表面100％被新生内膜覆盖，但新生内皮细胞在支架撑杆的不同部位形状和排列不同，在支架撑杆表面及其附近的内皮细胞呈“铺路石”样，可见细胞核部位突起和细胞表面的微绒毛结构，细胞之间的间隙增大，在支架撑杆的直线走行部位内皮细胞的长轴沿血流方向排列，在弧线走行部位内皮细胞呈“漩涡样”排列，细胞的长轴与血管长轴的关系不固定；远离支架撑杆部位的内皮细胞呈“梭形”，可见细胞核部位突起和细胞表面的微绒毛结构，细胞排列较密集，长轴与血流方向一致(图5中A，B，C，D和E)。图5中，A为实施例1制备的支架植入术后1个月支架撑杆表面100％被新生内膜覆盖；B为支架撑杆不同部位内皮细胞的形态和排列；C为支架撑杆部位新生内皮细胞呈“铺路石”样形态；D为远离支架撑杆部位新生内皮细胞呈“梭形”，其长轴与血流方向一致；E为在支架撑杆弧线走行部位内皮细胞呈“漩涡样”排列。

3、植入实施例1制备的血管支架后支架段血管平滑肌细胞及新生内膜的变化：

(1)透射电镜观察结果

植入实施例1制备的血管支架后1个月处死的4只犬，新生内膜中血管平滑肌细胞数量相对较少，以胶原和细胞外基质为主；其中，处于去分化状态的“合成态”血管平滑肌细胞比分化程度较好的“收缩态”血管平滑肌细胞少，“合成态”血管平滑肌细胞的胞体大而致密、细胞核增大、胞浆内线粒体和游离核糖体增多、粗面内质网明显扩张和肌丝含量较少，而“收缩态”的血管平滑肌细胞胞体及核相对较小，胞浆内粗面内质网、高尔基体、线粒体较少、肌丝含量比“合成态”血管平滑肌细胞多(见图6中A和B)。图6中A为合成态血管平滑肌细胞；B为收缩态血管平滑肌细胞。

(2)光镜观察结果

①血管壁结构和受压程度的改变：术后1个月，血管壁三层结构清晰(即内膜、中膜和外膜)，非支架撑杆部位的内弹力膜完整，部分支架撑杆部位的内弹力膜断裂，均未见支架撑杆贴壁不良现象。在不同部位的支架撑杆处，中膜和外面的受压程度不同，85％～90％的支架撑杆部位中膜轻度受压，而外膜无受压改变，相应部位的新生内膜增生程度较轻；10％～15％的支架撑杆部位中膜中到重度受压，相应部位的外膜表现为轻度到中度受压，该部位的新生内膜增生程度较受压程度轻的部位明显，总体趋势是中膜和外膜的受压程度越重则该部位新生内膜增生越明显(见图7中A)。

②支架段血管的新生内膜厚度：支架段血管的平均新生内膜厚度为(0.04±0.03)mm。

③新生内膜面积：支架段血管的平均新生内膜面积为(0.46±0.21)mm²。

④管腔面积：支架段血管的平均管腔面积为(2.70±0.15)mm²。

⑤新生内膜的细胞成分：支架段血管的新生内膜主要成分为平滑肌细胞和细胞外基质；远离支架撑杆部位的细胞成份与支架撑杆部位的细胞成份基本相同。支架撑杆周围可见少量淋巴细胞、中性粒细胞，偶见巨噬细胞，未见嗜酸性粒细胞(见图7中B)。图7中A为支架段血管壁三层结构、新生内膜增生与中膜和外膜受压情况的光镜照片；B为支架段血管壁炎症反应的光镜照片(HE染色，×1000)

实施例6、实施例2-4所制备的支架的效果

将实施例2、3、4所制备的支架按照实施例5所述的方法分别植入6只犬中，按照实施例5的方法对所述的实验犬进行如下实验：

1)随机取1只于支架植入术后24小时处死；

2)其余犬于支架植入术后1个月处死。

对支架段血管进行扫描电镜观察：支架段血管内皮化情况；

实验结果如下所述

1、植入实施例1制备的血管支架的冠状动脉造影结果

对实施例2、3、4所制备的支架植入术后1个月处死的实验犬，于处死前行冠状动脉造影检查：均无支架内再狭窄、支架边缘再狭窄和支架段血管瘤样扩张发生。

2、植入实施例1制备的血管支架后支架段血管的内皮化情况

(1)大体观：实施例2、3、4所制备的支架植入术后均于24小时处死实验犬1只，其支架部位均无内皮覆盖；实施例2、3、4所制备的支架植入术后1个月处死的实验犬，其支架部位全部被半透明新生内膜覆盖。

(2)扫描电镜观察结果

①实施例2、3、4所制备的支架植入术后24小时处死的1只犬，于支架撑杆上覆盖有纤维蛋白、血小板和少量血细胞，支架撑杆附近的内皮细胞数量极少，而且内皮细胞的排列及结构均被破坏。

②实施例2、3、4所制备的支架植入术后1个月处死的犬，其新生内皮细胞的共同特点是：支架撑杆表面100％被新生内膜覆盖，但新生内皮细胞在支架撑杆的不同部位形状和排列不同，在支架撑杆表面及其附近的内皮细胞呈“铺路石”样，可见细胞核部位突起和细胞表面的微绒毛结构，细胞之间的间隙增大，在支架撑杆的直线走行部位内皮细胞的长轴沿血流方向排列，在弧线走行部位内皮细胞呈“漩涡样”排列，细胞的长轴与血管长轴的关系不固定；远离支架撑杆部位的内皮细胞呈“梭形”，可见细胞核部位突起和细胞表面的微绒毛结构，细胞排列较密集，长轴与血流方向一致。

3、植入实施例2、3、4所制备的支架后支架段血管平滑肌细胞及新生内膜的变化：

(1)透射电镜观察结果

植入实施例2、3、4所制备的支架后1个月处死的犬，新生内膜中血管平滑肌细胞数量相对较少，以胶原和细胞外基质为主；其中，处于去分化状态的“合成态”血管平滑肌细胞比分化程度较好的“收缩态”血管平滑肌细胞少，“合成态”血管平滑肌细胞的胞体大而致密、细胞核增大、胞浆内线粒体和游离核糖体增多、粗面内质网明显扩张和肌丝含量较少，而“收缩态”的血管平滑肌细胞胞体及核相对较小，胞浆内粗面内质网、高尔基体、线粒体较少、肌丝含量比“合成态”血管平滑肌细胞多。

(2)光镜观察结果

血管壁结构和受压程度的改变：实施例2、3、4所制备的支架植入术后1个月，血管壁三层结构清晰(即内膜、中膜和外膜)，非支架撑杆部位的内弹力膜完整，部分支架撑杆部位的内弹力膜断裂，均未见支架撑杆贴壁不良现象。在不同部位的支架撑杆处，中膜和外面的受压程度不同，85％～90％的支架撑杆部位中膜轻度受压，而外膜无受压改变，相应部位的新生内膜增生程度较轻；10％～15％的支架撑杆部位中膜中到重度受压，相应部位的外膜表现为轻度到中度受压，该部位的新生内膜增生程度较受压程度轻的部位明显，总体趋势是中膜和外膜的受压程度越重则该部位新生内膜增生越明显。

新生内膜的细胞成分：支架段血管的新生内膜主要成分为平滑肌细胞和细胞外基质；远离支架撑杆部位的细胞成份与支架撑杆部位的细胞成份基本相同。支架撑杆周围可见少量淋巴细胞、中性粒细胞，偶见巨噬细胞，未见嗜酸性粒细胞。

上述实验结果得出的结论

(1)本发明的血管支架接触血管壁一侧的雷帕霉素涂层具有显著的抑制支架术后再狭窄的作用。

(2)本发明的血管支架接触血管腔一侧的可表达hVEGF165的载体涂层具有促进支架段血管内皮化的作用。

(3)涂层中所使用的可降解聚乳酸引起的支架段血管壁的炎症反应较轻。

(4)本实验结果还证明在同一枚裸金属支架接触血管壁一侧涂具有抗再狭窄作用的雷帕霉素和支架接触血管腔一侧涂具有促进支架段血管内皮化的可表达hVEGF165的载体是安全可行的，而且能够实现我们最初的发明设想。

总之，通过动物实验，发现本发明的血管支架在取得理想的抑制再狭窄作用的同时具有促进支架段血管内皮化的作用。

Claims

1.一种治疗冠心病的血管支架，是由裸金属支架、裸金属支架接触血管壁一侧涂层和裸金属支架接触血管腔一侧涂层构成；所述裸金属支架接触血管壁一侧涂层是抗再狭窄药物与可降解聚合物的混合物；所述裸金属支架接触血管腔一侧涂层是可表达人血管内皮生长因子的重组表达载体与可降解聚合物的混合物；所述抗再狭窄药物为雷帕霉素和/或雷帕霉素衍生物和/或紫杉醇；所述雷帕霉素衍生物为Biolimus A₉、ABT578、Everolimus和Tacrolimus中的一种或一种以上任意组合；所述人血管内皮生长因子为人血管内皮生长因子165和/或人血管内皮生长因子121和/或人血管内皮生长因子2；所述可降解聚合物为聚乳酸。

2.根据权利要求1所述的血管支架，其特征在于：所述可表达人血管内皮生长因子的重组表达载体为可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的血管支架，其特征在于：所述可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体为pcDNA3-VEGF165。

4.根据权利要求1所述的血管支架，其特征在于：所述聚乳酸为外消旋聚乳酸。

5.根据权利要求4所述的血管支架，其特征在于：所述裸金属支架为不锈钢血管支架或钴铬合金血管支架。

6.根据权利要求5所述的血管支架，其特征在于：所述裸金属支架接触血管壁一侧涂层中所述雷帕霉素的含量为90μg～180μg/cm²；所述裸金属支架接触血管腔一侧涂层中所述可表达人血管内皮生长因子165的重组表达载体的含量为70μg～140μg/cm²。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的血管支架，其特征在于：所述裸金属支架接触血管壁一侧涂层或所述裸金属支架接触血管腔一侧涂层的厚度为5μm～10μm。

8.治疗冠心病的血管支架的制备方法，包括下述步骤：

1)制备支架接触血管壁一侧涂层液：将粘度为0.2dl/g-1.5dl/g的聚乳酸与雷帕霉素按10∶2.5-15.0的重量比混和，再加入有机溶剂在不超过60℃的条件下采用振荡或超声的方法混匀，得到支架接触血管壁一侧涂层液；

2)制备支架接触血管腔一侧涂层液：将粘度为0.2dl/g-1.5dl/g的聚乳酸与所述可表达人血管内皮生长因子的重组表达载体按10∶0.03-10.0的重量比混和，再加入有机溶剂在不超过60℃的条件下采用振荡或超声的方法混匀，制得裸金属支架接触血管腔一侧涂层液；

所述人血管内皮生长因子为人血管内皮生长因子165和/或人血管内皮生长因子121和/或人血管内皮生长因子2；

3)利用沾涂法将步骤1)制得的支架接触血管壁一侧涂层液涂在裸金属支架接触血管壁一侧的金属表面，将步骤2)制得的支架接触血管腔一侧涂层液涂在裸金属支架接触血管腔一侧的金属表面，经干燥、灭菌得到治疗冠心病的血管支架。