CN101548916A - 一种携载细胞外基质的医疗器械及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种携载细胞外基质的医疗器械及其制备方法。包括医疗器械本体、涂敷在医疗器械本体表面的细胞外基质层，其中所述细胞外基质是胶原蛋白、层粘连蛋白、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白，以及培养内皮细胞然后去细胞处理获得内皮细胞外基质中的一种或者多种。本发明所述的医疗器械，本体表面的细胞外基质能够耐受血流以及其他体液的冲刷，通过缓慢释放促进血管的内皮化；如果与药物共同作用，既可降低再狭窄率，还可加速表面内皮化，提高治疗效果；本发明的制备方法简单，可不含载体，采用静电和/或微孔吸附原理，直接在本体表面涂覆细胞外基质，因此可避免载体带来的炎症等副作用。

Description

一种携载细胞外基质的医疗器械及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医疗器械，具体的说，涉及一种携载细胞外基质的医疗器械及其制备方法。

背景技术

1987年，希格沃特(Sigwart)等首次将血管内金属支架用于冠状动脉，这为治疗血管堵塞性疾病提供了良好的途径。然而血管支架内再狭窄一直是影响经皮冠状动脉介入治疗(PCI)疗效的主要原因。随着2004年强生Cypher雷帕霉素药物支架和2005年波士顿科学公司的Taxus紫杉醇药物支架的上市，药物洗脱支架将支架内再狭窄率从金属裸支架时代的30％降低到10％以下。

然而随着药物支架研究的深入和应用范围的不断扩大以及积累病例的逐步增加，人们对其使用应更趋理性，对其目前存在的问题也有了清醒的认识。第一代药物洗脱支架所携带的药物，雷帕霉素、紫杉醇以及它们的类似物能够很好地抑制血管平滑肌细胞增殖，降低支架内再狭窄，但同时，也抑制了血管内皮细胞的增殖，损害了内皮，因此延迟了支架表面的内皮化，从而增加了支架血栓的发生。同时第一代药物洗脱支架携载药物的聚合物基质的长期存在可能导致过敏和炎症反应。

生理学和病理学研究表明，血管内皮细胞具有以下功能：①减少血管通透性，调节组织与血液的物质交换，防止血浆成分和血液细胞无序地侵入；②抗血栓作用，平衡抗血液凝固纤溶系统和抗血小板机能，维持血液的流动性；③调节血管平滑肌功能，合成和分泌调节血管平滑肌舒张和收缩的相关因子；④抑制血管壁细胞的游走和增殖。因此，更多研究集中在支架植入术后如何加速支架内皮的修复方面。

分子生物学和细胞生物学研究结果表明，血管内皮的修复有以下两种途径：(1)周围内皮细胞的增殖和迁移，(2)内皮祖细胞在血管损伤处的归巢、分化和增殖。由此，理论上促进支架植入后内皮的修复有以下几种方法：(1)提供更适应内皮增殖和迁移的支架表面，如在支架涂覆内皮细胞外基质，胶原蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖和弹性蛋白。这些蛋白涂层改善了支架表面的细胞相容性和生物相容性，从而加速支架表面内皮修复，可能降低支架植入后的炎症、纤维化副作用，降低支架晚期血栓发生率。(2)通过在支架表面固定一些特异性捕获内皮祖细胞的物质，如单克隆抗体CD31、CD34、CD133、生物多肽RGD，加速内皮祖细胞在支架表面的归巢、分化和增殖。这两种方法是目前分子生物学和细胞生物学上对内皮修复最直接的影响因素，从理论上说应该是最有可能在临床上观察到效果的加速内皮修复的因素。

其中，细胞外基质是由细胞分泌合成，位于细胞外部，构成结缔组织，不仅具有连接、支持、保水、抗压及保护的物理作用，而且对细胞形状、结构、功能、存活、增殖、分化、迁移等一系列生命现象具有全面的影响，主要表现在：(1)影响细胞的存活、生长与死亡；(2)决定细胞的形状；(3)控制细胞的分化；细胞通过与特定的细胞外基质成分作用而发生分化。(4)参与细胞的迁移；细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向，并为细胞迁移提供脚手架。因此，在支架表面涂覆适合血管内皮生长的基质被认为是一种理想的促进内皮修复的方式。

但是细胞外涂层支架的实现在技术上存在不少难题：1)虽然细胞外基质的构成主要是由胶原蛋白、层粘连蛋白组成，但是其蛋白的不同亚型和不同构成可能会定向分化不同的细胞，因此如何找到适合内皮细胞增殖和迁移的细胞外基质成为关键因素；2)如何将适合内皮细胞增殖和迁移的细胞外基质牢固固定在支架表面，这也成为这一技术能否实现的关键因素。

Nexeon MedSystems公司的PROTEX支架采用在细胞外基质和支架之间设置一层不可降解高分子材料，然后采用化学接枝的方法固定细胞外基质涂层，这种方法虽然可行，但是增加了一层不可降解高分子载体，可能在机体引起炎症，并增加机体的负担；而且并没有给出携带的细胞外基质的种类。

另外现有细胞外基质涂层支架从理论上只是关注了内皮修复这一因素，而较大程度的忽视了抑制内膜增生这一关键因素，而这正是第一代药物洗脱支架成功应用于临床的主要原因。因此，如果细胞外基质涂层支架能够结合第一代药物洗脱支架抑制内膜增生的优势，即在细胞外基质涂层的基础上同时结合抑制平滑肌细胞增生的药物，有可能在充分发挥细胞外基质涂层支架快速内皮化优势的同时发挥抑制内膜增生的作用。

综上所述，如何选择合适的细胞外基质，如何将有效量的细胞外基质牢固负载在支架表面安全输送到血管病变部位，就成为制约这一技术应用于临床的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种携载细胞外基质的医疗器械及其制备方法。

本发明所述的携载细胞外基质的医疗器械，包括医疗器械本体、涂敷在医疗器械本体表面的细胞外基质构成的细胞外基质层，其中所述细胞外基质可以选用胶原蛋白、层粘连蛋白、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白，以及培养内皮细胞然后去细胞处理获得内皮细胞外基质中的一种或者几种。

本发明所述的携载细胞外基质的医疗器械还包括涂敷在医疗器械本体表面的药物构成的药物层。

所述药物层可以位于细胞外基质层的内部、与细胞外基质层完全重合或部分重合，或与细胞外基质层分列医疗器械本体的血管腔侧和近血管壁侧；

所述细胞外基质优先采用胶原蛋白和/或层粘连蛋白，当采用胶原蛋白和层粘连蛋白时，胶原蛋白和层粘连蛋白组合的最优比例为0.01～100∶1(质量比)。由于个体内皮细胞的增殖和迁移速度有所差别，也可以将不同配方的胶原蛋白和/或层粘连蛋白涂覆在支架或在塑料表面，然后在经过不同配方处理的表面种植人血管内皮细胞，根据人血管内皮细胞在表面的增殖和迁移情况，优选出最适合特定个体的内皮细胞增殖和迁移的比例。

优选以下复合物：层粘连蛋白-1和胶原蛋白I、层粘连蛋白-5和胶原蛋白I，以及培养内皮细胞然后去细胞处理获得内皮细胞外基质。

所述培养内皮细胞然后去细胞处理获得细胞外基质是现有的组织工程化细胞外基质的制备方法，该方法是组织工程常用的方法，简述如下：通过组织工程、细胞生物学的手段，将体外培养的人血管内皮细胞与分离、提取的动物源性细胞外基质混合构成组织工程化细胞外基质结构，并进行共同培养，在培养过程中，人血管内皮细胞仍然继续增殖，吸收动物源性细胞外基质，合成并重新分泌细胞外基质成分。待细胞外基质改建完成后，破除(如利用冻融，破膜等方法)人血管内皮细胞，获得细胞外基质。采用该方法制备的细胞外基质可以为内皮细胞生长代谢提供非常适合细胞外基质环境，特别适合血管内皮细胞增殖和迁移。

所述药物包括抗炎性免疫抑制剂、抗增殖药物、抗细胞迁移药物、冠脉内皮化药物、多肽药物，包括西罗莫司、他克莫司、艾罗莫司、免疫抑制剂ABT-578、地塞米松、咪唑立宾、雷帕霉素、紫杉醇、放线菌素、血管肽、长春新碱及其衍生物、他汀类药物、2-氯去氧腺苷、三氧化二砷(As2O3)、核酶、巴马司他、溴氯哌喹酮、C-蛋白酶抑制剂、普罗布可、雌二醇类的一种或者多种。优选雷帕霉素和/或艾罗莫司。

所述涂敷是将细胞外基质采用光化学偶联、微孔物理吸附和/或静电吸附、等离子体化学接枝、静电纺方法中的一种或多种固定在医疗器械本体表面。优选微孔物理吸附和/或静电吸附的方式。

所述的医疗器械是指血管支架、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭器械、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物器械、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管、血管护鞘等医疗器械中的一种或上述多种医疗器械的组合。所述医疗器械优选表面具有载药孔洞的医疗器械。更优选表面具有纳米孔洞的医疗器械，纳米孔洞的尺寸优选10-800nm。

所述医疗器械优选支架，更优选表面具有载药孔洞的支架。更优选表面具有纳米孔洞的支架，纳米孔洞的尺寸优选10-800nm。

本发明还提供的所述携载细胞外基质的医疗器械的制备方法：

1)在医疗器械本体表面采用化学腐蚀、电化学腐蚀、微弧氧化方法制备孔洞；

2)利用孔洞的物理吸附固定适量的细胞外基质(参考专利《药物洗脱器械用纳米级孔洞药物释放结构及其制备方法》，200610168125.0)，或采用静电作用和孔洞吸附双重作用的方法或者仅采用静电作用的方法在医疗器械本体表面固定适宜量的细胞外基质(参考专利《一种在医疗器械表面固定抗体的方法》，申请号200710107643.6)。

所述的利用静电作用携载细胞外基质的方法为：将表面带正电并有孔洞的金属医疗器械浸没在含有细胞外基质的溶液中，利用细胞外基质在缓冲溶液中呈负电性的特性，通过正负电荷相吸的静电吸附效应吸附到器械本体的表面和孔洞中，通过物理效应来固定细胞外基质。

所述细胞外基质包括胶原蛋白、层粘连蛋白、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白以及按照现有组织工程方法制备的内皮细胞外基质，其中优选层粘连蛋白-1和胶原蛋白I、层粘连蛋白-5和胶原蛋白I的复合物以及按照组织工程方法制备的内皮细胞外基质。

对本发明所述的含有药物层和细胞外基质层的医疗器械来说，其制备方法可以是在现有的药物洗脱医疗器械表面再涂覆一层促进内皮化的细胞外基质涂层；也可以在医疗器械本体的表面的不同位置分别涂敷药物层和细胞外基质层，如分别在医疗器械本体的表面的血管腔侧和近血管壁侧分别涂敷药物层和细胞外基质层；当然也可以先涂敷药物，再涂敷细胞外基质，使药物层和细胞外基质层部分或完全重合。

所述现有的药物洗脱医疗器械包括具有不可降解载药涂层的药物洗脱医疗器械、可降解载药涂层的药物洗脱医疗器械、无载体药物涂层医疗器械和全降解药物洗脱医疗器械。

具体的说，携载药物和细胞外基质医疗器械的制备方法主要包括以下几个步骤：

1)携载药物：可参考现有的制备药物洗脱器械的制备方法：①利用载体携载药物；②将医疗本体表面采用化学腐蚀、电化学腐蚀、微弧氧化方法制备孔洞，然后利用孔洞的物理吸附和/或电性作用固定药物；优选方法②；

2)携载细胞外基质：采用光化学偶联、微孔物理吸附和/或静电吸附、等离子体化学接枝、静电纺方法中的一种或多种在药物洗脱医疗器械的表面涂敷细胞外基质涂层；对表面具有载药孔洞的医疗器械，优选利用微孔物理吸附和/或静电吸附固定细胞外基质。

其中所述载体包括不可生物降解载体，如聚甲基丙烯酸丁酯、聚乙烯乙烯醋酸共聚物、乙烯或醋酸乙烯共聚物、聚丙烯或聚丙烯腈共聚物、聚ε己内酯；可生物降解载体，如乙交酯、丙交酯、ε-己内酯的均聚物或共聚物中的一种及其与多官能团氨基酸的共聚物、聚乳酸、甲壳质、壳聚糖、胶原蛋白。

其中所述药物包括抗炎性免疫抑制剂、抗增殖药物、抗细胞迁移药物、冠脉内皮化药物、多肽药物，包括西罗莫司、他克莫司、艾罗莫司、免疫抑制剂ABT-578、地塞米松、咪唑立宾、雷帕霉素、紫杉醇、放线菌素、血管肽、长春新碱及其衍生物、他汀类药物、2-氯去氧腺苷、三氧化二砷(As2O3)、核酶、巴马司他、溴氯哌喹酮、C-蛋白酶抑制剂、普罗布可、雌二醇类的一种或者多种。优选雷帕霉素和/或艾罗莫司。

主要的制备方法主要是将载体和药物按照不同比例需要溶解在有机溶剂中(如四氢呋喃、丙酮)，然后采用浸涂、喷涂、静电喷涂等方式涂覆在医疗器械本体表面形成药物洗脱医疗器械。

特别的，本发明提出一种细胞外基质涂层载药医疗器械，医疗器械本体的血管腔侧涂覆固定细胞外基质涂层，医疗器械血管壁侧涂覆抗平滑肌增殖药物。该种方式充分发挥了药物洗脱医疗器械抑制医疗器械内再狭窄的优势，也最大限度利用了细胞外基质涂层促进内皮修复的优势，为本发明专利的最优组合(具体见附图1)。

医疗器械血管腔侧涂覆固定细胞外基质可以采用光化学偶联、微孔物理吸附和/或静电吸附、等离子体化学接枝、静电纺方法连接。在该发明专利中优选微孔物理吸附和/或静电吸附的方式(在医疗器械表面采用化学腐蚀、电化学腐蚀、微弧氧化方法在医疗器械本体表面制备孔洞，然后利用孔洞的物理吸附固定细胞外基质)；医疗器械血管壁侧涂覆的药物，可以采用不可降解生物载体、可降解生物载体等方式携载，也可以采用在医疗器械本体表面直接致孔，通过孔洞方式携载。

本发明所述的细胞外基质涂层载药医疗器械是在现有药物洗脱医疗器械的基础上制备而成，在保留药物洗脱医疗器械抗再狭窄优势的同时加速其表面内皮化。

本发明所述的携载细胞外基质的医疗器械，可促进血管的内皮化；与药物共同作用，既可降低再狭窄率，还可加速表面内皮化。

而且本发明的携载细胞外基质的医疗器械可不含载体，利用表面具有孔洞的医疗器械，采用静电吸附和微孔物理吸附效应在器械本体表面直接涂覆具有治疗有效量的细胞外基质(以及药物)，其具有以下优点：1)减小了植入该医疗器械后引起的炎症及副作用；2)采用微孔或者静电吸附方式固定的细胞外基质相对牢固，能够耐受支架植入过程中高速冠脉血流的冲击，从而能够使治疗有效量的细胞外基质达到血管病变位置，从而达到靶向输送或局部定位细胞外基质的目的。

附图说明

图1为本发明专利的最优组合支架示意图；

图2为本发明实施例1结构示意图的横截面剖视图；

图3为本发明实施例2结构示意图的横截面剖视图；

图4为本发明实施例3结构示意图的横截面剖视图；

图5为本发明实施例4结构示意图的横截面剖视图；

图6为本发明实施例5结构示意图的横截面剖视图；

图7为本发明实施例6结构示意图的横截面剖视图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如物特别指明，实施例中使用的试剂、细胞外基质来源于来自美国sigma公司。

实施例1

制备携载细胞外基质(胶原蛋白I和层粘连蛋白1)的支架，其横截面剖视图如图2所示：

(1)将316L不锈钢裸支架经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的医用酒精中，在频率30khz的超声波清洗15分钟，温度设定在40℃，干燥60分钟后取出。

(2)将支架放入5mL玻璃试管中(1个支架对应1个试管)，然后向玻璃试管中加入1mL胶原蛋白I(浓度为150μg/mL，溶剂为12MHCl)，同时加入1mL的层粘连蛋白1(浓度为10μg/mL，溶剂为0.1MCBC缓冲液，pH9.0)，4℃振摇1h后，取出。

(3)将涂覆有胶原蛋白I和层粘连蛋白1的支架放置在紫外固化投光射灯DymaxTM Bluewave 200中固化30s，然后用去离子水冲洗干燥，于室温下晾干。

实施例2

制备细胞外基质(胶原蛋白I和层粘连蛋白5)涂层支架，其横截面剖视图如图3所示：

(1)将316L不锈钢裸支架经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的医用酒精中，在频率30khz的超声波清洗15分钟，温度设定在40℃，干燥60分钟后取出。然后将支架放置在～38％的盐酸腐蚀12小时后，将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于为28％的盐酸中，电流设定为20A，频率为2000赫兹，时间为5分钟，在316L金属裸支架本体表面制备孔洞。

(2)将支架放入5mL玻璃试管中(1个支架对应1个试管)，然后向玻璃试管中加入1mL胶原蛋白5(浓度为150μg/mL，溶剂为12MHCl)，同时加入1mL的层粘连蛋白1(浓度为10μg/mL，溶剂为0.1MCBC缓冲液，pH9.0)，4℃振摇1h后，取出后，于室温下晾干。

实施例3

制备一种细胞外基质(胶原蛋白I和层粘连蛋白1)载药(雷帕霉素)涂层支架，其横截面剖视图如图4所示：

(1)将316L不锈钢裸支架经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的医用酒精中，在频率30khz的超声波清洗15分钟，温度设定在40℃，干燥60分钟后取出。

(2)将0.8g聚乳酸加入10ml四氢呋喃溶液中，待溶解后加入0.2g雷帕霉素，然后喷涂于支架本体的表面，空气中固化60min，使支架的雷帕霉素载药量达到1.2μg/mm2。

(3)然后将制备好的药物支架放入5mL玻璃试管中(1个支架对应1个试管)，然后向玻璃试管中加入1mL胶原蛋白I(浓度为150μg/mL，溶剂为12M HCl)，同时加入1mL的层粘连蛋白1(浓度为10μg/mL，溶剂为0.1M CBC缓冲液，pH9.0)，4℃振摇1h后，取出。

(4)将涂覆有胶原蛋白I和层粘连蛋白1的支架放置在DymaxTM Bluewave 200中固化30s，然后用去离子水冲洗干燥，于室温下晾干即得。

实施例4

制备细胞外基质(胶原蛋白I和层粘连蛋白5)载药(雷帕霉素)涂层支架，其横截面剖视图如图5所示：

(1)将316L不锈钢裸支架经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的医用酒精中，在频率30khz的超声波清洗15分钟，温度设定在40℃，干燥60分钟后取出。然后将支架放置在～38％的盐酸腐蚀12小时后，将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于为28％的盐酸中，电流设定为20A，频率为2000赫兹，时间为5分钟，在316L金属裸支架本体表面制备孔洞。

(2)将0.2g雷帕霉素加入10ml四氢呋喃溶液中，将配制好的雷帕霉素药物在室温条件下分散均匀，然后喷涂于支架本体的表面，空气中固化60min；使支架的雷帕霉素载药量达到2.2μg/mm2，制备出无载体药物洗脱支架。

(3)然后将制备好的无载体药物洗脱支架放入5mL玻璃试管中(1个支架对应1个试管)，然后向玻璃试管中加入1mL胶原蛋白I(浓度为150μg/mL，溶剂为12M HCl)，同时加入1mL的层粘连蛋白1(浓度为10μg/mL，溶剂为0.1M CBC缓冲液，pH9.0)，4℃振摇1h后，取出。

(4)将涂覆有胶原蛋白I和层粘连蛋白1的无载体药物洗脱支架支架放置在DymaxTM Bluewave 200中固化30s，然后用去离子水冲洗干燥，于室温下晾干即得。

实施例5

制备细胞外基质(胶原蛋白I和层粘连蛋白1)和药物(艾罗莫司)联合支架，其横截面剖视图如图6所示：

(1)将316L不锈钢裸支架经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的医用酒精中，在频率30khz的超声波清洗15分钟，温度设定在40℃，干燥60分钟后取出。

(2)将0.8g聚乳酸加入10ml四氢呋喃溶液中，待溶解后加入0.2g艾罗莫司，用球囊保护带有孔洞的支架本体的血流侧表面，并将配制好的艾罗莫司药物在室温条件下分散均匀，然后喷涂于支架本体的血管侧表面，空气中固化60min；使支架的艾罗莫司载药量达到2.2μg/mm2，制备出预留出血流侧表面的艾罗莫司药物洗脱支架。

(3)然后将制备好的药物支架放入5mL玻璃试管中(1个支架对应1个试管)，然后向玻璃试管中加入1mL胶原蛋白I(浓度为150μg/mL，溶剂为12M HCl)，同时加入1mL的层粘连蛋白1(浓度为10μg/mL，溶剂为0.1M CBC缓冲液，pH9.0)，4℃振摇1h后，取出。

(4)将涂覆有胶原蛋白I和层粘连蛋白1的支架放置在DymaxTM Bluewave 200中固化30s，然后用去离子水冲洗干燥，于室温下晾干即得。

实施例6

制备细胞外基质(胶原蛋白I和层粘连蛋白5)和药物(雷帕霉素)联合支架，其横截面剖视图如图7所示：

(1)将316L不锈钢裸支架经切割、去渣、抛光，放置在浓度为75％的医用酒精中，在频率30khz的超声波清洗15分钟，温度设定在40℃，干燥60分钟后取出。然后将支架放置在～38％的盐酸腐蚀12小时后，将支架本体作为阳极与脉冲电源的正极连接，钛金属片作为阴极与脉冲电源的负极连接，将支架本体与阴极金属片同时置于为28％的盐酸中，电流设定为20A，频率为2000赫兹，时间为5分钟，在316L金属裸支架本体表面制备孔洞。

(2)将0.2g雷帕霉素加入10ml四氢呋喃溶液中，将配制好的雷帕霉素药物在室温条件下分散均匀，用球囊保护带有孔洞的支架本体的血流侧表面，并将配制好的雷帕霉素药物在室温条件下分散均匀，然后喷涂于支架本体的血管侧表面，空气中固化60min；使支架的雷帕霉素载药量达到2.2μg/mm2，制备出预留出血流侧表面的雷帕霉素药物洗脱支架。

(3)然后将制备好的预留出血流侧表面的雷帕霉素药物洗脱支架放入5mL玻璃试管中(1个支架对应1个试管)，然后向玻璃试管中加入1mL胶原蛋白I(浓度为150μg/mL，溶剂为12M HCl)，同时加入1mL的层粘连蛋白1(浓度为10μg/mL，溶剂为0.1M CBC缓冲液，pH9.0)，4℃振摇1h后，用去离子水冲洗干净，取出。于室温下晾干即得。

实施例7内皮细胞外基质支架的制备

(1)基质蛋白的提取，取猪新鲜心脏血管，绞成肉泥，3倍Tris-HCl缓冲液搅拌12小时，离心弃上清，将沉淀物用3％的冰醋酸萃取24小时后离心弃上清，将沉淀物溶解于含有1.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液中20小时，离心弃沉淀，在上清液中加入NaCl至终浓度2.5mol/L，盐析20小时，离心弃沉淀，沉淀物用0.1％冰醋酸溶解后透析纯化，冷冻干燥后备用。

(2)将按照(1)制备的基质蛋白用0.1％的醋酸溶液配制成5％的溶液，再按体积的10％加入胎牛血清和10mg/mL的DMEM培养基，调节pH值为7.2～7.4；加入人血管内皮细胞悬液，使终浓度为106个细胞/mL，培养4天，然后将细胞-基质蛋白培养物置于培养皿中的不锈钢支架上，继续加入培养液后培养，待不锈钢支架上爬满细胞后进行破细胞处理。

(3)将爬满细胞的不锈钢支架在-196℃放置30分钟后取出置于4℃中，如此反复三次，最后置于冷冻干燥机内干燥，彻底去除细胞后，即得内皮细胞外基质支架。

Claims (10)

1、一种携载细胞外基质的医疗器械，包括医疗器械本体、涂敷在医疗器械本体表面的细胞外基质构成的细胞外基质层，其中所述细胞外基质是胶原蛋白、层粘连蛋白、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白，以及培养内皮细胞然后去细胞处理获得的内皮细胞外基质中的一种或者多种。

2、如权利要求1所述的医疗器械，其特征在于，所述医疗器械还包括涂敷在医疗器械本体表面的药物构成的药物层。

3、如权利要求2所述的医疗器械，其特征在于，所述药物层位于细胞外基质层的内部、与细胞外基质层完全重合或部分重合，或与细胞外基质层分列医疗器械本体的血管腔侧和近血管壁侧。

4、如权利要求书1中所述的医疗器械，其特征在于，所述细胞外基质为胶原蛋白和/或层粘连蛋白和/或培养内皮细胞然后去细胞处理获得的内皮细胞外基质。

5、如权利要求书4中所述的医疗器械，其特征在于，所述胶原蛋白和层粘连蛋白为以下复合物：层粘连蛋白-1和胶原蛋白I；层粘连蛋白-5和胶原蛋白I。

6、如权利要求书2中所述的医疗器械，其特征在于，所述药物包括抗炎性免疫抑制剂、抗增殖药物、抗细胞迁移药物、冠脉内皮化药物、多肽药物；为西罗莫司、他克莫司、艾罗莫司、免疫抑制剂ABT-578、地塞米松、咪唑立宾、雷帕霉素、紫杉醇、放线菌素、血管肽、长春新碱及其衍生物、他汀类药物、2-氯去氧腺苷、三氧化二砷(As2O3)、核酶、巴马司他、溴氯哌喹酮、C-蛋白酶抑制剂、普罗布可、雌二醇类的一种或者多种；优选雷帕霉素和/或艾罗莫司。

7、如权利要求书1中所述的医疗器械，其特征在于，所述涂敷是采用光化学偶联、微孔物理吸附和/或静电吸附、等离子体化学接枝、静电纺方法中的一种或多种将细胞外基质固定在医疗器械本体表面；优选微孔物理吸附和/或静电吸附的方式。

8、如权利要求书1-7任一所述的医疗器械，其特征在于，所述的医疗器械是指血管支架、合成的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、除纤颤器、PFO隔膜封闭器械、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物器械、静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管、血管护鞘等医疗器械中的一种或上述多种医疗器械的组合。

9、如权利要求书8中所述的医疗器械，其特征在于，所述医疗器械是表面具有载药孔洞的医疗器械。

10、如权利要求书8或9中所述的医疗器械，其特征在于，所述医疗器械为支架。

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