CN114904047A - 三维石墨烯/细胞外基质复合支架及其制备方法与应用 - Google Patents

三维石墨烯/细胞外基质复合支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三维石墨烯/细胞外基质复合支架及其制备方法与应用。所述方法包括：以聚‑L‑鸟氨酸、层粘连蛋白对所述三维石墨烯泡沫支架进行包被处理；以及，将分泌细胞外基质的细胞接种于所述包被处理后的三维石墨烯泡沫支架，之后进行细胞培养、诱导细胞外基质分泌沉积、去细胞化处理，获得三维石墨烯/细胞外基质复合支架。本发明制备的三维石墨烯/细胞外基质复合支架可以改善三维石墨烯的亲水性差、细胞负载率低的缺陷；并能提供优良的细胞生长微环境以及各种细胞因子，更有利于细胞的粘附与增殖分化；同时，本发明提供的方法只需将接种细胞的三维石墨烯连续培养、诱导细胞外基质分泌沉积、去细胞化即可获得三维石墨烯/细胞外基质复合支架，可操作强，有利于推广。

Description

三维石墨烯/细胞外基质复合支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于组织工程领域技术领域，具体涉及一种三维石墨烯/细胞外基质复合支架及其制备方法与应用。
背景技术
石墨烯具有由碳原子通过sp2杂化形成的二维纳米结构的六角形的蜂巢状结构，此种独特的结构赋予了石墨烯优异的电学和较大的比表面积及良好热学性能。三维石墨烯泡沫是基于二维的石墨烯片通过空间交联形成的三维网状结构。三维墨烯泡沫不仅具有二维石墨烯的固有性质，还将二维石墨烯在纳米尺度的理化性能扩展到宏观领域，具有多孔结构、表面活性较高和导电性较好等优势。
近年来，三维石墨烯泡沫支架材料在生物医学与组织工程领域有着广泛应用。例如，三维石墨烯泡沫支架促进神经干细胞的粘附、增殖和定向分化为功能性神经元(Li etal.Scientific Report.2013)；三维石墨烯泡沫支架复合骨髓间充质干细胞能显著促进皮肤伤口愈合(Li et al.Materials Science and Engineering.2015)；生物矿化的三维石墨烯泡沫促进人间充质干细胞的增殖和成骨分化(Zhang et al.Carbon.2016)；胶原蛋白包被的三维石墨烯泡沫可诱导间充质干细胞向多巴胺能神经元分化(Nishatet al.StemCells International.2018)。
随着研究的不断深入，石墨烯的一些缺点逐渐被发现。石墨烯具有完整的苯六元环结构，使得石墨烯表面表现惰性，化学性能稳定，难以修饰其他营养物质，如细胞因子等。另外，由于水滴内部水分子间的结合能远远大于它们与石墨烯表面间的吸附能，致使石墨烯表现出强疏水性，因此细胞难以吸附在石墨烯材料上，细胞负载率低。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种三维石墨烯/细胞外基质复合支架及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备方法，其包括：
提供三维石墨烯泡沫支架；
以聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白对所述三维石墨烯泡沫支架进行包被处理；
以及，将分泌细胞外基质的细胞接种于所述包被处理后的三维石墨烯泡沫支架，之后进行细胞培养、诱导细胞外基质分泌沉积、去细胞化处理，获得三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
本发明实施例还提供了前述方法制备的三维石墨烯/细胞外基质复合支架，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架包括三维石墨烯泡沫支架，包被于三维石墨烯泡沫支架所含孔洞表面的聚-L-鸟氨酸层，包被于聚-L-鸟氨酸层表面的层粘连蛋白层以及形成于层粘连蛋白层表面的细胞外基质层。
本发明实施例还提供了前述的三维石墨烯/细胞外基质复合支架于生物医学与组织工程领域中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中的细胞外基质是由细胞产生分泌并在细胞外空间沉积的大分子物质，主要包括两大类成分：结构蛋白和蛋白聚糖；细胞外基质不仅为细胞提供了物理结构支持，还可以调节细胞表型和功能，比如细胞粘附、增殖、分化以及在体内的相互作用；本发明制备的三维石墨烯/细胞外基质复合支架可以改善三维石墨烯的亲水性差、细胞负载率低的缺陷；并能提供优良的细胞生长微环境以及各种细胞因子，更有利于细胞的粘附与增殖分化；同时，本发明提供的方法只需将接种细胞的三维石墨烯连续培养后、诱导细胞外基质分泌沉积、去细胞化即可获得三维石墨烯/细胞外基质复合支架，可操作强，有利于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a-1b是本发明实施例1中聚-L-鸟氨酸溶液、层粘连蛋白溶液包被处理三维石墨烯泡沫支架的扫描电镜图；
图2a-2b是本发明实施例3中三维石墨烯/细胞外基质复合支架表面的扫描电镜图；
图3a-3b是本发明实施例5中聚-L-鸟氨酸溶液、层粘连蛋白溶液包被处理三维石墨烯泡沫支架及三维石墨烯/细胞外基质复合支架的细胞粘附效率图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是将细胞接种于三维石墨烯，之后进行连续培养、去细胞化即可获得复合支架，制备的三维石墨烯/细胞外基质复合支架可以改善三维石墨烯的亲水性差、细胞负载率低的缺陷，并能提供优良的细胞生长微环境以及各种细胞因子，更有利于细胞的增殖分化。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一个方面提供了一种三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备方法，其包括：
提供三维石墨烯泡沫支架；
以聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白对所述三维石墨烯泡沫支架进行包被处理；
以及，将分泌细胞外基质的细胞接种于所述包被处理后的三维石墨烯泡沫支架，之后进行细胞培养、诱导细胞外基质分泌沉积、去细胞化处理，获得三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
本发明中，细胞外基质是由细胞产生分泌并在细胞外空间沉积的天然大分子物质，相比于单一的蛋白组分(如层粘连蛋白)，细胞外基质可以提供接近真实环境的细胞生长微环境，具体包括多种结构蛋白组分、适宜细胞黏附生长的拓扑结构、细胞生长分化所需的生物因子，介导细胞间通讯的外泌体等。另外细胞外基质和三维石墨烯均能诱导神经干细胞的定向分化神经元，因此将细胞外基质与三维石墨烯复合将极大的改善三维石墨烯的亲水性和细胞负载率，并且两者在促进干细胞分化方面具有协同作用。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将所述三维石墨烯泡沫支架浸润于包含聚-L-鸟氨酸的溶液中，并于37℃包被处理2～3h，之后浸润于包含层粘连蛋白的溶液，并于37℃包被处理2～3h，再经清洗处理，获得包被处理的三维石墨烯泡沫支架。
进一步的，所述包含聚-L-鸟氨酸的溶液中聚-L-鸟氨酸的浓度为0.1～0.5mg/mL。
进一步的，所述包含层粘连蛋白的溶液中层粘连蛋白的浓度为3～8mg/mL。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法还包括：在对所述三维石墨烯泡沫支架进行包被处理前，先对所述三维石墨烯泡沫支架进行活化、灭菌处理。
进一步的，所述活化处理具体包括：采用真空等离子技术对所述三维石墨烯泡沫支架进行表面活化处理，其中，活化处理时使用的真空等离子装置的额定功率为18W，活化处理的时间为1～3min。
进一步的，所述灭菌处理包括：将活化处理后的三维石墨烯泡沫支架先置于乙醇溶液中浸渍处理不少于20min，之后紫外照射处理不少于30min。
进一步的，所述浸渍处理的时间为20～30min，所述紫外照射处理的时间为30～40min，所述紫外照射的波长为254nm。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将分泌细胞外基质的细胞接种于所述包被处理后的三维石墨烯泡沫支架，之后于增殖培养基中培养2～4天，再于刺激培养基(刺激分泌细胞外基质的培养基)中培养10～16天，其中，所述刺激培养基每48h更换一次。
在一些较为具体的实施方案中，所述增殖培养基包括DMEM/F12、胎牛血清及双抗。
进一步的，所述增殖培养基中胎牛血清的含量为10v/v％(体积比)。
进一步的，所述增殖培养基中双抗的含量为1v/v％(体积比)。
进一步的，所述增殖培养基中的双抗包括青霉素及链霉素。
进一步的，所述增殖培养基中青霉素的浓度为100U/mL。
进一步的，所述增殖培养基中链霉素的浓度为0.1mg/mL。
在一些较为具体的实施方案中，所述刺激培养基包括DMEM/F12、胎牛血清、非必需氨基酸、谷氨酸、L型维生素C、抗坏血酸钠及双抗。
进一步的，所述刺激培养基中胎牛血清的含量为20v/v％。
进一步的，所述刺激培养基中L型维生素C的浓度为40～60μg/mL。
进一步的，所述刺激培养基中抗坏血酸钠的浓度为80～120μg/mL。
进一步的，所述刺激培养基中双抗的含量为1v/v％。
进一步的，所述刺激培养基中的双抗包括青霉素及链霉素。
进一步的，所述增殖培养基中青霉素的浓度为100U/mL。
进一步的，所述增殖培养基中链霉素的浓度为0.1mg/mL。
在一些较为具体的实施方案中，所述刺激培养基至少能够促进细胞分泌细胞外基质。
进一步的，所述分泌细胞外基质的细胞包括人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、人肾上皮细胞、小鼠胚胎成纤维细胞中的任意一种，且不限于此。
进一步的，所述细胞外基质是由细胞分泌并在细胞外空间沉积的大分子物质。
进一步的，所述细胞外基质包括结构蛋白和蛋白聚糖，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述去细胞化处理包括：使用包含TritonX-100和脱氧胆酸盐的混合溶液对所获细胞培养处理后的三维石墨烯泡沫支架处理10～15min，之后以DNA酶于37℃处理不少于20min，获得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
进一步的，所述混合溶液包括0.5v/v％(体积比)TritonX-100及1m/v％(质量体积比：g/mL)脱氧胆酸盐。
进一步的，包含所述DNA酶的溶液的浓度为80-120U/mL。
在一些较为具体的实施方案中，所述去细胞化处理包括：对所获细胞培养处理后的三维石墨烯泡沫支架进行反复冻融处理，获得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
进一步的，所述冻融处理具体包括：将所获细胞培养处理后的三维石墨烯泡沫支架于低于-20℃的条件下进行冷冻处理不少于20min，之后于室温进行融化处理，从而获得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
进一步的优选的，所述冷冻处理、融化处理的次数大于3次。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：采用化学气相沉积法制备所述三维石墨烯泡沫支架，其中，使用的泡沫镍模板的密度为295～345g/m2，孔径为100～300μm，孔隙率为99.3～99.7％。
在一些更为具体的实施方案中，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备方法具体包括：
(1)化学气相沉积法制备三维石墨烯泡沫支架
①将泡沫镍模板(密度320±25g/m2，孔隙100～300μm，孔隙率99.5％±0.2％)，浸泡于pH＝5的稀盐酸溶液中处理，除去其表面氧化物，改善其催化效率，之后分别使用丙酮及无水乙醇超声清洗3次，晾干备用；
②装入管式炉石英管内，关闭密封装置；抽真空，通入氩气至常压，再次抽真空；
③升温：通入氩气和氢气至常压，升温至950℃，时长为25min；
④退火：调节氩气和氢气气体流量，保持950℃，时长为15min；
⑤生长：调节氩气、氢气、甲烷气体流量，停止加热，时长为10min；
⑥腐蚀：用道康宁RTV胶水将生长好的三维石墨烯泡沫支架粘于细胞培皿底部，过夜晾干；然后用75％乙醇中浸润，以去除三维石墨烯多孔结构中吸附的空气；加入120g/L的Fe(NO3)3·HNO3溶液中浸泡过夜，以除去金属镍；分别用5％、2.5％及1％硝酸溶液清洗，之后用去离子水清洗3次，无水乙醇浸泡，静置晾干；
三维石墨烯泡沫支架生长条件，见下表1所示：
表1三维石墨烯泡沫支架生长条件
Figure BDA0002938015560000051
(2)三维石墨烯泡沫支架的表面处理
①真空等离子处理：利用真空等离子清洗机对三维石墨烯泡沫支架进行表面活化，额定功率18W(～150mA、240V、50％输出功率)作用3min；
②灭菌：75wt％乙醇浸泡30min，通风晾干后于超净工作台紫外照射30min。
③蛋白包被：37℃、0.1mg/mL的聚-L-鸟氨酸溶液包被处理2h，之后于5mg/mL的层粘连蛋白溶液包被处理过夜，再用PBS缓冲液清洗3次，培养基清洗1次；
(3)三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备
①细胞培养
将适宜浓度的分泌细胞外基质的细胞接种与包被处理后的三维石墨烯支架上，之后于增殖培养基(DMEM/F12，10％胎牛血清，1％双抗)培养2-4天；
用刺激培养基(促进分泌细胞外基质的培养体系)(DMEM/F12，20％胎牛血清，非必需氨基酸+谷氨酸+50μg/mL L型维生素C+100μg/mL抗坏血酸钠+1v/v％双抗)连续培养10-16天，每48小时更换一次所述刺激培养基。
②去细胞化处理
用37℃去离子水冲洗培养处理后的三维石墨烯泡沫支架20min，然后用0.5％TritonX-100+1％脱氧胆酸盐处理10-15min，蒸馏水洗三次，再用80-120U/mL的DNA酶37℃处理30min，PBS缓冲液清洗三遍，然后用含有1v/v％双抗的PBS缓冲液4℃保存备用，即制得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
或者，通过冻融进行去细胞化处理，具体包括：将培养处理后的三维石墨烯泡沫支架在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎，从而制得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架，其中，所述冻融处理的次数至少3次以上。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的三维石墨烯/细胞外基质复合支架，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架包括三维石墨烯泡沫支架，包被于三维石墨烯泡沫支架所含孔洞表面的聚-L-鸟氨酸层，包被于聚-L-鸟氨酸层表面的层粘连蛋白层以及形成于层粘连蛋白层表面的细胞外基质层。
进一步的，本发明中，三维石墨烯/细胞外基质复合支架中聚-L-鸟氨酸层、层粘连蛋白层的厚度很小，可忽略不计。
进一步的，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架中细胞外基质层的厚度为100nm～500nm。
进一步的，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架的孔径为100～300μm，孔隙率为99.5％±0.2％。
本发明实施例的另一个方面还提供了述的三维石墨烯/细胞外基质复合支架于生物医学与组织工程领域中的用途。
下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1
(1)化学气相沉积法制备三维石墨烯泡沫支架
①将泡沫镍模板(密度320±25g/m2，孔隙100～300μm，孔隙率99.5％±0.2％)，浸泡于pH＝5的稀盐酸溶液中处理，除去其表面氧化物，改善其催化效率，之后分别使用丙酮及无水乙醇超声清洗3次，晾干备用；
②装入管式炉石英管内，关闭密封装置；抽真空，通入氩气至常压，再次抽真空；
③升温：通入氩气和氢气至常压，升温至950℃，时长为25min；
④退火：调节氩气和氢气气体流量，保持950℃，时长为15min；
⑤生长：调节氩气、氢气、甲烷气体流量，停止加热，时长为10min；
⑥腐蚀：用道康宁RTV胶水将生长好的三维石墨烯泡沫支架粘于细胞培皿底部，过夜晾干；然后用75％乙醇中浸润，以去除三维石墨烯多孔结构中吸附的空气；加入120g/L的Fe(NO3)3·HNO3溶液中浸泡过夜，以除去金属镍；分别用5％、2.5％及1％硝酸溶液清洗，之后用去离子水清洗3次，无水乙醇浸泡，静置晾干；
三维石墨烯泡沫支架生长条件，见下表2所示：
表2三维石墨烯泡沫支架生长条件
Figure BDA0002938015560000071
(2)三维石墨烯泡沫支架的表面处理
①真空等离子处理：利用真空等离子清洗机对三维石墨烯泡沫支架进行表面活化，额定功率18W(～150mA、240V、50％输出功率)作用3min；
②灭菌：75％乙醇浸泡30min，通风晾干后超净工作台紫外照射30min。
③蛋白包被：37℃、0.1mg/mL的聚-L-鸟氨酸溶液包被处理2h，之后于5mg/mL的层粘连蛋白溶液包被处理过夜，再用PBS缓冲液清洗3次，培养基清洗1次；
聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白溶液包被处理后的三维石墨烯泡沫支架表面形态的扫描电镜图如图1a-1b所示，图1b是图1a的放大图。
(3)三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备
①细胞培养
将适宜浓度的人脐带间充质干细胞接种与包被处理后的三维石墨烯支架上，之后于增殖培养基(DMEM/F12，10％胎牛血清，1％双抗)培养2-4天；
用刺激培养基(促进分泌细胞外基质的培养体系)(DMEM/F12，20v/v％胎牛血清，非必需氨基酸+谷氨酸+50μg/mL L型维生素C+100μg/mL抗坏血酸钠+1v/v％双抗)连续培养10-16天，每48小时更换一次所述刺激培养基。
②去细胞化处理
用37℃去离子水冲洗培养处理后的三维石墨烯泡沫支架20min，然后用0.5v/v％TritonX-100+1m/v％脱氧胆酸盐(g/mL)处理10-15min，蒸馏水洗三次，再用80-120U/mL的DNA酶37℃处理30min，PBS缓冲液清洗三遍，然后用含有1v/v％双抗的PBS缓冲液4℃保存备用，即制得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
实施例2
(1)化学气相沉积法制备三维石墨烯泡沫支架
①将泡沫镍模板(密度320±25g/m2，孔隙100～300μm，孔隙率99.5％±0.2％)，浸泡于pH＝5的稀盐酸溶液中处理，除去其表面氧化物，改善其催化效率，之后分别使用丙酮及无水乙醇超声清洗3次，晾干备用；
②装入管式炉石英管内，关闭密封装置；抽真空，通入氩气至常压，再次抽真空；
③升温：通入氩气和氢气至常压，升温至950℃，时长为25min；
④退火：调节氩气和氢气气体流量，保持950℃，时长为15min；
⑤生长：调节氩气、氢气、甲烷气体流量，停止加热，时长为10min；
⑥腐蚀：用道康宁RTV胶水将生长好的三维石墨烯泡沫支架粘于细胞培皿底部，过夜晾干；然后用75％乙醇中浸润，以去除三维石墨烯多孔结构中吸附的空气；加入120g/L的Fe(NO3)3·HNO3溶液中浸泡过夜，以除去金属镍；分别用5％、2.5％及1％硝酸溶液清洗，之后用去离子水清洗3次，无水乙醇浸泡，静置晾干；
三维石墨烯泡沫支架生长条件，见下表3所示：
表3三维石墨烯泡沫支架生长条件
Figure BDA0002938015560000091
(2)三维石墨烯泡沫支架的表面处理
①真空等离子处理：利用真空等离子清洗机对三维石墨烯泡沫支架进行表面活化，额定功率18W(～150mA、240V、50％输出功率)作用3min；
②灭菌：75％乙醇浸泡30min，通风晾干后超净工作台紫外照射30min。
③蛋白包被：37℃、0.1mg/mL的聚-L-鸟氨酸溶液包被处理2h，之后于5mg/mL的层粘连蛋白溶液包被处理过夜，再用PBS缓冲液清洗3次，培养基清洗1次；
(3)三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备
①细胞培养
将适宜浓度的人脐带间充质干细胞接种与包被处理后的三维石墨烯支架上，之后于增殖培养基(DMEM/F12，10v/v％胎牛血清，1v/v％双抗)培养2-4天；
用刺激培养基(促进分泌细胞外基质的培养体系)(DMEM/F12，20v/v％胎牛血清，非必需氨基酸+谷氨酸+50μg/mL L型维生素C+100μg/mL抗坏血酸钠+1v/v％双抗)连续培养10-16天，每48小时更换一次所述刺激培养基。
②去细胞化处理
将培养处理后的三维石墨烯泡沫支架在-20度以下冰冻，室温融解，之后重复冰冻、室温融解3次，从而制得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
实施例3扫描电子显微镜观察三维石墨烯/细胞外基质复合支架表面结构
①将hUMSCs(人脐带间充质干细胞)接种于包被处理后的三维石墨烯支架上，37℃及饱和湿度条件下培养48h。
②移去培养液，PBS清洗细胞2次。
③2％戊二醛水溶液，室温固定细胞30min；去离子水清洗2次，每次5min。
④分别使用30％、50％、70％、80％、90％及无水乙醇脱水处理10min。
⑤叔丁醇置换2次，每次5min；加入叔丁醇至浸没支架与细胞表面，-20℃冷冻30min。
⑥真空冷冻干燥，喷金后扫描电子显微镜观察细胞形态。
结果：如图2a-2b所示，图2b是图2a的放大图。可以看到细胞外基质基本均匀地沉积在三维石墨烯的表面，将有效的改善三维石墨烯泡沫的生物学性能。
实施例4水接触角测试三维石墨烯/细胞外基质复合支架亲水性
采用去离子水，将水滴滴于实施例1制备的三维石墨烯/细胞外基质复合支架的薄膜表面1min后进行测试，每个样品取相巨间距5mm的3个点进行测量，共6次渎数，取算术平均值。
结果：聚-L-鸟氨酸溶液、层粘连蛋白溶液包被处理三维石墨烯泡沫支架水接触角为20°～30°，三维石墨烯/细胞外基质复合支架水接触角为0°，即水滴完全被泡沫支架吸收，说明三维石墨烯/细胞外基质复合支架亲水性优于聚-L-鸟氨酸溶液、层粘连蛋白溶液包被处理三维石墨烯泡沫支架。
实施例5荧光标记检测细胞粘附效率
①将等量细胞分别种植在聚-L-鸟氨酸溶液、层粘连蛋白溶液包被处理三维石墨烯泡沫以及三维石墨烯/细胞外基质复合支架中，过夜。
②吸取培养液，PBS清洗3次，固定。
③加DAPI染色液，染色5min，用PBS清洗四次，每次5min。
④激光共聚聚焦显微镜拍照
结果：如图3a-3b所示，三维石墨烯/细胞外基质复合支架上的细胞明显比仅使用聚-L-鸟氨酸溶液、层粘连蛋白溶液包被处理三维石墨烯泡沫多，说明三维石墨烯/细胞外基质复合支架的细胞负载率更高。
实施例6
(1)化学气相沉积法制备三维石墨烯泡沫支架
①将泡沫镍模板(密度320±25g/m2，孔隙100～300μm，孔隙率99.5％±0.2％)，浸泡于pH＝5的稀盐酸溶液中处理，除去其表面氧化物，改善其催化效率，之后分别使用丙酮及无水乙醇超声清洗3次，晾干备用；
②装入管式炉石英管内，关闭密封装置；抽真空，通入氩气至常压，再次抽真空；
③升温：通入氩气和氢气至常压，升温至950℃，时长为25min；
④退火：调节氩气和氢气气体流量，保持950℃，时长为15min；
⑤生长：调节氩气、氢气、甲烷气体流量，停止加热，时长为10min；
⑥腐蚀：用道康宁RTV胶水将生长好的三维石墨烯泡沫支架粘于细胞培皿底部，过夜晾干；然后用75％乙醇中浸润，以去除三维石墨烯多孔结构中吸附的空气；加入120g/L的Fe(NO3)3·HNO3溶液中浸泡过夜，以除去金属镍；分别用5％、2.5％及1％硝酸溶液清洗，之后用去离子水清洗3次，无水乙醇浸泡，静置晾干；
三维石墨烯泡沫支架生长条件，见下表3所示：
表3三维石墨烯泡沫支架生长条件
Figure BDA0002938015560000111
(2)三维石墨烯泡沫支架的表面处理
①真空等离子处理：利用真空等离子清洗机对三维石墨烯泡沫支架进行表面活化，额定功率18W(～150mA、240V、50％输出功率)作用3min；
②灭菌：75％乙醇浸泡20min，通风晾干后超净工作台紫外照射40min。
③蛋白包被：37℃、0.5mg/mL的聚-L-鸟氨酸溶液包被处理3h，之后于3mg/mL的层粘连蛋白溶液包被处理过夜，再用PBS缓冲液清洗3次，培养基清洗1次；
(3)三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备
①细胞培养
将适宜浓度的骨髓间充质干细胞接种于包被处理后的三维石墨烯支架上，之后于增殖培养基(DMEM/F12，10v/v％胎牛血清，1v/v％双抗)培养2-4天；
用刺激培养基(促进分泌细胞外基质的培养体系)(DMEM/F12，20v/v％胎牛血清，非必需氨基酸+谷氨酸+40μg/mL L型维生素C+80μg/mL抗坏血酸钠+1v/v％双抗)连续培养10-16天，每48h更换一次所述刺激培养基。
②去细胞化处理
将培养处理后的三维石墨烯泡沫支架在-20度以下冰冻，室温融解，之后重复冰冻、室温融解3次，从而制得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
实施例7
(1)化学气相沉积法制备三维石墨烯泡沫支架
①将泡沫镍模板(密度320±25g/m2，孔隙100～300μm，孔隙率99.5％±0.2％)，浸泡于pH＝5的稀盐酸溶液中处理，除去其表面氧化物，改善其催化效率，之后分别使用丙酮及无水乙醇超声清洗3次，晾干备用；
②装入管式炉石英管内，关闭密封装置；抽真空，通入氩气至常压，再次抽真空；
③升温：通入氩气和氢气至常压，升温至950℃，时长为25min；
④退火：调节氩气和氢气气体流量，保持950℃，时长为15min；
⑤生长：调节氩气、氢气、甲烷气体流量，停止加热，时长为10min；
⑥腐蚀：用道康宁RTV胶水将生长好的三维石墨烯泡沫支架粘于细胞培皿底部，过夜晾干；然后用75％乙醇中浸润，以去除三维石墨烯多孔结构中吸附的空气；加入120g/L的Fe(NO3)3·HNO3溶液中浸泡过夜，以除去金属镍；分别用5％、2.5％及1％硝酸溶液清洗，之后用去离子水清洗3次，无水乙醇浸泡，静置晾干；
三维石墨烯泡沫支架生长条件，见下表3所示：
表3三维石墨烯泡沫支架生长条件
Figure BDA0002938015560000121
(2)三维石墨烯泡沫支架的表面处理
①真空等离子处理：利用真空等离子清洗机对三维石墨烯泡沫支架进行表面活化，额定功率18W(～150mA、240V、50％输出功率)作用3min；
②灭菌：75％乙醇浸泡25min，通风晾干后超净工作台紫外照射35min。
③蛋白包被：37℃、0.3mg/mL的聚-L-鸟氨酸溶液包被处理2.5h，之后于8mg/mL的层粘连蛋白溶液包被处理过夜，再用PBS缓冲液清洗3次，培养基清洗1次；
(3)三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备
①细胞培养
将适宜浓度的脂肪干细胞接种于包被处理后的三维石墨烯支架上，之后于增殖培养基(DMEM/F12，10v/v％胎牛血清，1v/v％双抗)培养2-4天；
用刺激培养基(促进分泌细胞外基质的培养体系)(DMEM/F12，20v/v％胎牛血清，非必需氨基酸+谷氨酸+60μg/mL L型维生素C+120μg/mL抗坏血酸钠+1v/v％双抗)连续培养10-16天，每48h更换一次所述刺激培养基。
②去细胞化处理
将培养处理后的三维石墨烯泡沫支架在-20度以下冰冻，室温融解，之后重复冰冻、室温融解3次，从而制得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

Claims (10)

1.一种三维石墨烯/细胞外基质复合支架的制备方法，其特征在于包括：
提供三维石墨烯泡沫支架；
以聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白对所述三维石墨烯泡沫支架进行包被处理；
以及，将分泌细胞外基质的细胞接种于所述包被处理后的三维石墨烯泡沫支架，之后进行细胞培养、诱导细胞外基质分泌沉积、去细胞化处理，获得三维石墨烯/细胞外基质复合支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：
将所述三维石墨烯泡沫支架浸润于包含聚-L-鸟氨酸的溶液中，并于37℃包被处理2～3h，之后浸润于包含层粘连蛋白的溶液，并于37℃包被处理2～3h，再经清洗处理，获得包被处理的三维石墨烯泡沫支架；
优选的，所述包含聚-L-鸟氨酸的溶液中聚-L-鸟氨酸的浓度为0.1～0.5mg/mL；优选的，所述包含层粘连蛋白的溶液中层粘连蛋白的浓度为3～8mg/mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于还包括：在对所述三维石墨烯泡沫支架进行包被处理前，先对所述三维石墨烯泡沫支架进行活化、灭菌处理；
优选的，所述活化处理具体包括：采用真空等离子技术对所述三维石墨烯泡沫支架进行表面活化处理，其中，活化处理时使用的真空等离子装置的额定功率为18W，活化处理的时间为1～3min；
优选的，所述灭菌处理包括：将活化处理后的三维石墨烯泡沫支架先置于乙醇溶液中浸渍处理不少于20min，之后紫外照射处理不少于30min；优选的，所述浸渍处理的时间为20～30min，所述紫外照射处理的时间为30～40min，所述紫外照射的波长为254nm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：
将分泌细胞外基质的细胞接种于所述包被处理后的三维石墨烯泡沫支架，之后于增殖培养基中培养2～4天，再于刺激培养基中培养10～16天；
优选的，所述增殖培养基包括DMEM/F12、胎牛血清及双抗；优选的，所述增殖培养基中胎牛血清的含量为10v/v％；优选的，所述增殖培养基中的双抗包括青霉素及链霉素；优选的，所述增殖培养基中青霉素的浓度为100U/mL；优选的，所述增殖培养基中链霉素的浓度为0.1mg/mL；
优选的，所述刺激培养基包括DMEM/F12、胎牛血清、非必需氨基酸、谷氨酸、L型维生素C、抗坏血酸钠及双抗；优选的，所述刺激培养基中胎牛血清的含量为20v/v％；优选的，所述刺激培养基中L型维生素C的浓度为40～60μg/mL；优选的，所述刺激培养基中抗坏血酸钠的浓度为80～120μg/mL；优选的，所述刺激培养基中的双抗包括青霉素及链霉素；优选的，所述增殖培养基中青霉素的浓度为100U/mL；优选的，所述增殖培养基中链霉素的浓度为0.1mg/mL；
优选的，所述刺激培养基能够促进细胞分泌细胞外基质。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述分泌细胞外基质的细胞包括人脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、人肾上皮细胞、小鼠胚胎成纤维细胞中的任意一种；
和/或，所述细胞外基质是由细胞分泌并在细胞外空间沉积的大分子物质；优选的，所述细胞外基质包括结构蛋白和蛋白聚糖。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述去细胞化处理包括：使用包含TritonX-100和脱氧胆酸盐的混合溶液对所获细胞培养处理后的三维石墨烯泡沫支架处理10～15min，之后以DNA酶于37℃处理20～30min，获得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架；
优选的，所述混合溶液包括0.5v/v％TritonX-100及1m/v％脱氧胆酸盐；
优选的，包含所述DNA酶的溶液的浓度为80-120U/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述去细胞化处理包括：对所获细胞培养后的三维石墨烯泡沫支架进行冻融处理，获得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架；
优选的，所述冻融处理具体包括：将所获细胞培养处理后的三维石墨烯泡沫支架于低于-20℃的条件下进行冷冻处理不少于20min，之后于室温进行融化处理，从而获得所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架；进一步的优选的，所述冷冻处理、融化处理的次数大于3次。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括：采用化学气相沉积法制备所述三维石墨烯泡沫支架，其中，使用的泡沫镍模板的密度为295～345g/m2，孔径为100～300μm，孔隙率为99.3～99.7％。
9.由权利要求1-8中任一项所述方法制备的三维石墨烯/细胞外基质复合支架，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架包括三维石墨烯泡沫支架，包被于三维石墨烯泡沫支架所含孔洞表面的聚-L-鸟氨酸层，包被于聚-L-鸟氨酸层表面的层粘连蛋白层以及形成于层粘连蛋白层表面的细胞外基质层；
优选的，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架中细胞外基质层的厚度为100nm～500nm；
优选的，所述三维石墨烯/细胞外基质复合支架所含的孔径为100～300μm，孔隙率为99.5％±0.2％。
10.权利要求9所述的三维石墨烯/细胞外基质复合支架于生物医学与组织工程领域中的用途。
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