CN112826981A - 在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,包括以下步骤:S1.将可降解金属打磨、抛光、清洗并干燥,得到金属基层;S2.在65‑75℃将S1所得金属基层在硝酸锌和氢氧化钠混合溶液中浸泡2‑4h,然后置于紫外下照射6‑8h,得到氧化金属基底层;S3.在20‑25℃避光条件下将S2所得氧化金属基底层于多巴胺溶液中浸泡6‑8h,然后清洗并吹干;重复该浸泡‑清洗‑吹干过程3‑5次;S4.在20‑25℃将S3所得样品于磷酸缓冲液、Ⅰ型胶原蛋白和氯化钙的混合溶液中浸泡12‑24h,清洗干燥,即得。本发明解决了现有技术中的涂层促骨修复和再生能力不足的问题,达到在降解过程中同时引导骨修复和再生的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物材料表面改性技术领域,尤其涉及一种在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法。
背景技术
可降解金属因其适中的腐蚀速率及锌离子潜在的生物功能性,有望应用于新一代可降解骨植入体材料。然而,可降解金属骨整合性差,促骨修复再生能力不足仍是制约其临床应用效果的关键。
当前,针对可降解金属的表面改性研究主要集中于调控其腐蚀行为以及改善其生物相容性,对于促骨修复再生的研究不足。
发明内容
本发明的目的在于:针对上述现有技术中存在的不足,提供一种在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,通过在可降解金属基底的表面构建具有微纳结构的杂化功能涂层,解决现有技术中的涂层促骨修复和再生能力不足的问题,达到在降解过程中同时引导骨修复和再生的目的。
本发明采用的技术方案如下:
一种在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,包括以下步骤:
S1.将可降解金属打磨、抛光、清洗并干燥,得到金属基层;
S2.在65-75℃将S1所得金属基层在硝酸锌和氢氧化钠混合溶液中浸泡2-4h,然后置于紫外下照射6-8h,得到氧化金属基底层;
S3.在20-25℃避光条件下将S2所得氧化金属基底层于多巴胺溶液中浸泡6-8h,然后清洗并吹干;重复该浸泡-清洗-吹干过程3-5次;
S4.在20-25℃将S3所得样品于磷酸缓冲液、Ⅰ型胶原蛋白和氯化钙的混合溶液中浸泡12-24h,清洗干燥,即得。
本发明的机理为:以可降解金属锌为例,通过化学转化法对锌基层进行预处理,生成一层氧化锌基底层,通过紫外照射增加其表面活性羟基,有利于后续多巴胺的沉积和组装。之后将上述涂层浸泡于PBS、I型胶原蛋白和氯化钙的混合溶液中制备杂化涂层。基于共价接枝和化学配位的原理,胶原蛋白和多巴胺表面的氨基/羟基活性位点以共价结合或是氢键的方式组装,锌、钙离子与多巴胺、胶原蛋白的配位螯合构建金属有机复合物,为磷酸钙/磷酸锌钙的沉积和生长提供形核位点,形成了复合杂化的功能涂层。
进一步地,本发明首先将金属基层浸没在硝酸锌溶液和氢氧化钠溶液的混合溶液中,在70℃液相沉积2小时构筑氧化锌基底层;通过紫外照射6h增加氧化锌层表面活性羟基进而循环沉积多巴胺层;再将PBS溶液、Ⅰ-型胶原蛋白和氯化钙溶液混合,采用液相沉积法制备复合涂层。基于配位化学原理,有机分子和无机组分复合杂化,并形成特定微纳结构,在保证有机分子的活性和稳定性的前提下,诱导无机磷酸相的生长。在两者的协同作用下提高了涂层的生物活性、生物相容和生物功能性。能够诱导活性钙磷盐的沉积,促进成骨细胞的生长、增殖和粘附;促进内皮细胞的增殖以及迁移,具有潜在促进血管生成的能力;此外,涂层还能有效的抑制可降解金属基体腐蚀降解速度,调控锌离子的释放。
进一步地,可降解金属为锌、镁或其合金。
进一步地,S1中采用水磨砂纸将可降解金属表面打磨至2000#。
进一步地,S1中依次采用去离子水和无水乙醇在超声条件下清洗2-3次,每次清洗3-5min后吹干。
进一步地,S1中依次采用去离子水和无水乙醇在超声条件下清洗3次,每次清洗3min后吹干。
进一步地,S2混合溶液中硝酸锌浓度为0.03-0.08M,氢氧化钠浓度为0.2-0.7M。
进一步地,S2混合溶液中硝酸锌浓度为0.05M,氢氧化钠浓度为0.5M。
进一步地,S3中多巴胺溶液的浓度为1-3mg/mL;优选为2mg/mL。
进一步地,S4混合溶液中磷酸缓冲液的浓度为3-6mM,Ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.002-0.5mg/mL,氯化钙的浓度为150-250mM。
进一步地,S4混合溶液中磷酸缓冲液的浓度为5mM,Ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.5mg/mL,氯化钙的浓度为200mM。
采用上述的方法制备得到的促骨修复和再生涂层。
综上所述,由于采用了上述技术方案,本发明的有益效果是:
1、本发明构筑了多组分的改性功能层,包含多巴胺以及天然骨组织的主要成分磷酸钙和I型胶原蛋白,基于材料化学原理,巧妙地将多组分结合在一起,形成了多尺度的表面微纳拓扑结构;
2、本发明中利用配位螯合形成金属有机复合物并诱导无机磷酸相的生长,将胶原蛋白和钙磷盐结合在一起,模拟天然骨组织成分与结构,有利于细胞外基质(ECM)的沉积以及成骨细胞的增殖粘附,具有良好的促骨整合作用;
3、本发明中采用的多巴胺、锌离子、钙离子能够促进内皮细胞的增殖粘附和迁移,具有潜在的促进血管生成的作用;
4、本发明构建的杂化功能层能够同时促进骨整合及血管生成,达到促骨修复与再生的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1锌基表面改性前后的扫描电镜图;
图2为实施例1锌基表面改性前后的XRD图;上方曲线为PDA/CaP/Col,下方曲线为Zn;
图3为实施例1锌基表面改性前后的XPS高分辨谱图;
图4为实施例1锌基表面改性前后的极化曲线图;
图5为实施例1锌基表面改性前后的(a)成骨细胞荧光染色图及(b)细胞活性统计结果;
图6为实施例1锌基表面改性前后的(a)内皮细胞荧光染色图及(b)细胞活性统计结果;
图7为实施例1锌基表面改性前后的(a)内皮细胞迁移光镜图及(b)迁移面积统计。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明,即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此,以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳的实施例提供一种在可降解金属锌表面制备促骨修复和再生涂层的方法,具体步骤如下:
a、将金属锌采用水磨砂纸打磨至2000#;采用去离子水和无水乙醇依次在超声条件下清洗各3次,每次3分钟并吹干备用;
b、在70℃条件下将步骤a所得的金属锌基层浸没在0.05M硝酸锌溶液和0.5M氢氧化钠溶液的混合溶液中2小时,得到氧化锌层;
c、在室温避光条件下将步骤b得到的氧化锌层置于浓度为2mg/ml的多巴胺溶液中浸泡6小时,然后清洗并吹干,重复该步骤3次;
d、在室温条件下将步骤c得到样品置于5mM磷酸的PBS缓冲液、0.2mg/mLⅠ型胶原蛋白和200mM氯化钙的混合液中静置12h,清洗干燥,即得。
实施例2
本发明较佳的实施例提供一种在可降解金属锌表面制备促骨修复和再生涂层的方法,具体步骤如下:
a、将金属锌采用水磨砂纸打磨至2000#;采用去离子水和无水乙醇依次在超声条件下清洗各4次,每次3分钟并吹干备用;
b、在70℃条件下将步骤a所得的金属锌基层浸没在0.04M硝酸锌溶液和0.6M氢氧化钠溶液的混合溶液中2小时,得到氧化锌层;
c、在室温避光条件下将步骤b得到的氧化锌层置于浓度为2.5mg/ml的多巴胺溶液中浸泡7小时,然后清洗并吹干,重复该步骤3次;
d、在室温条件下将步骤c得到样品置于4mM磷酸的PBS缓冲液、0.08mg/mLⅠ型胶原蛋白和220mM氯化钙的混合液中静置20h,清洗干燥,即得。
实施例3
本发明较佳的实施例提供一种在可降解金属镁表面制备促骨修复和再生涂层的方法,具体步骤如下:
a、将金属镁采用水磨砂纸打磨至2000#;采用去离子水和无水乙醇依次在超声条件下清洗各3次,每次3分钟并吹干备用;
b、在70℃条件下将步骤a所得的金属镁基层浸没在0.06M硝酸锌溶液和0.5M氢氧化钠溶液的混合溶液中3小时,得到氧化锌层;
c、在室温避光条件下将步骤b得到的氧化锌层置于浓度为1.5mg/ml的多巴胺溶液中浸泡7小时,然后清洗并吹干,重复该步骤3次;
d、在室温条件下将步骤c得到样品置于6mM磷酸的PBS缓冲液、0.12mg/mLⅠ型胶原蛋白和200mM氯化钙的混合液中静置17h,清洗干燥,即得。
实验例1
采用扫描电镜对实施例1制得的产品的微观结构进行观察。从扫描结果可以看出(图1),经过本方法改性之后的样品表面整体为相互交错的片状微纳结构,涂层整体覆盖完整。扫描结构说明涂层成功的构建在锌金属的表面。
实验例2
采用XRD以及XPS全谱图对实施例1制得的产品的无机相组分和结合状态进行观察。
经过XRD谱图的结果可知(图2),相比于纯锌金属,经过本发明的方法改性后的样品出现了氧化锌、磷酸钙和磷酸锌钙的峰,由此表面该杂化涂层的主要无机组分是氧化锌、磷酸钙和磷酸锌钙。
经过XPS高分辨的对比可以看出(图3),经过本发明方法改性后的样品出现了O=C、O-C以及N峰,而纯锌表面并未出现;此外,出现的Zn-O和N-Zn峰充分说明了锌离子和O、N发生了配位螯合作用,这充分说明成功在锌表面构建了杂化涂层。
实验例3
采用动电位极化曲线对实施例1制得产品的耐腐蚀性进行测试。
从动电位极化曲线可以得到(图4),相比于纯,本发明方法改性的样品自腐蚀电流密度更小,有一定的抗腐蚀能力,这表明该涂层可起到调控锌基底腐蚀降解的效果。
实验例4
考察锌金属以及实施例1制得的产品的骨相容性以及促内皮能力。
1.本实施例使用MC3T3-E1(ATCC CRL-2594,US)验证样品的成骨相容性,成骨细胞使用添加10%FBS的α-MEM(Hyclone)培养基。采用HUVECs细胞进行促内皮能力的验证,内皮细胞使用添加10%FBS的F-12DMEM(Hyclone)培养基。细胞培养至单层铺满约80%后,进行细胞接种。
2.本实验所用样品浸提液具体制备方法:样品紫外灭菌30分钟,按1.25cm2/mL的标准滴加含有血清的培养基在孵箱(37℃,5%CO2)中静置24h后取出备用。
3.细胞接种步骤为:
(a)实验前准备:实验器材进行高温灭菌处理;
(b)灭菌处理后的实验器材(离心管、镊子、注射器、吸管、枪头等)放入超净台紫外辐照30分钟以上;
(c)将生长状况良好及形态正常的成骨细胞/内皮细胞用生理盐水清洗三次,加入胰酶并保证胰酶与细胞完全接触,消化1-2min(光学显微镜下观察,细胞形态皱缩变圆并发亮,则加入含有血清的培养基终止消化)。并用吸管将细胞吹打均匀,将细胞悬浮液加入离心管中,在1200rpm/min条件下离心5min,进行细胞重悬;
(d)将1mL细胞重悬液滴加到细胞计数板进行计数;本实验采用的成骨细胞、内皮细胞种植密度均为2×104cells/mL;
(e)用移液枪将稀释好的细胞悬浮液接种到96孔板表面,每孔200μL,置于孵箱(37℃,5%CO2)培养一天之后用前述的细胞浸提液替换培养基,并培养1,3,5天。
4.本实验通过CCK-8检测细胞活性,具体步骤为:每个时间点用含有10%CCK-8的培养基孵育细胞3h,取出用酶标仪测试其吸光度值,并转换成细胞活性百分比。
5.通过罗丹明123(Rhodamine-phalloidin)染色细胞骨架以分析成骨细胞在样品表面的生长形态及粘附数量,并在荧光显微镜下进行观察分析。染色步骤如下:
(a)将培养板取出,吸出培养基,用生理盐水清洗三遍,加入2.5%戊二醛溶液固定4h;
(b)吸出戊二醛,用生理盐水清洗三遍,吹干,避光条件下滴加罗丹明60μL,染色15分钟,生理盐水清洗三遍并吹干,通过荧光显微镜观察。
成骨细胞培养结果如图5所示,未经改性的纯锌表面细胞在三个时间点都是皱缩状,且细胞的数量极少。改性的样品表面细胞显示出较好的细胞形态,铺展良好,并且随着培养时间的增加,细胞粘附数量增多。细胞活性检测的结果也显示出类似的趋势,培养到5天,细胞活性已经高于75%(图中虚线),表明了改性后的样品具有良好的生物相容性,能够促进成骨细胞的增殖、粘附和生长。
内皮细胞的培养结果如图6所示,未经改性的纯锌表面细胞数量极少,且呈皱缩状。改性后的样品细胞粘附数量接近对照组,且细胞铺展形态良好。细胞活性的检测也显示出同样的趋势,都高于75%,接近甚至超过对照组。表明改性后的样品能够促进内皮细胞的增殖、粘附和生长。
实验例5
考察锌金属以及实施例1制得的产品促内皮细胞迁移的能力。
细胞接种步骤与前述一致,本实验内皮细胞接种于24孔板中,种植密度均为5×104cells/ml,培养至铺满孔板之后,用1ml枪头划痕,并用氯化钠清洗三遍,加入前述浸提液替换培养基,在孵箱(37℃,5%CO2)中培养8h,24h,并用光学显微镜观察拍照。利用ImageJ计算内皮细胞迁移的面积。
结果如图7所示,从光学显微镜下可以看出,培养8h后,改性后的样品内皮细胞迁移数量和面积高于对照样,培养24h后,改性后的样品已经铺展均匀。迁移面积统计结果显示出同样的趋势。表面改性后的样品具有良好的促进内皮细胞迁移的能力。表明涂层有潜在的促进血管生成的能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.将可降解金属打磨、抛光、清洗并干燥,得到金属基层;
S2.在65-75℃将S1所得金属基层在硝酸锌和氢氧化钠混合溶液中浸泡2-4h,然后置于紫外下照射6-8h,得到氧化金属基底层;
S3.在20-25℃避光条件下将S2所得氧化金属基底层于多巴胺溶液中浸泡6-8h,然后清洗并吹干;重复该浸泡-清洗-吹干过程3-5次;
S4.在20-25℃将S3所得样品于磷酸缓冲液、Ⅰ型胶原蛋白和氯化钙的混合溶液中浸泡12-24h,清洗干燥,即得。
2.根据权利要求1所述的在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,其特征在于,所述可降解金属为锌、镁或其合金。
3.根据权利要求1所述的在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,其特征在于,所述S1中采用水磨砂纸将可降解金属表面打磨至2000#。
4.根据权利要求1所述的在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,其特征在于,所述S1中依次采用去离子水和无水乙醇在超声条件下清洗2-3次,每次清洗3-5min后吹干。
5.根据权利要求1所述的在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,其特征在于,所述S2混合溶液中硝酸锌浓度为0.03-0.08M,氢氧化钠浓度为0.2-0.7M。
6.根据权利要求1所述的在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,其特征在于,所述S3中多巴胺溶液的浓度为1-3mg/mL。
7.根据权利要求1所述的在可降解金属表面制备促骨修复和再生功能涂层的方法,其特征在于,所述S4混合溶液中磷酸缓冲液的浓度为3-6mM,Ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.002-0.5mg/mL,氯化钙的浓度为150-250mM。
8.采用权利要求1-7中任一项所述的方法制备得到的促骨修复和再生涂层。
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