CN110292654B - 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法 - Google Patents

一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110292654B
CN110292654B CN201810234833.2A CN201810234833A CN110292654B CN 110292654 B CN110292654 B CN 110292654B CN 201810234833 A CN201810234833 A CN 201810234833A CN 110292654 B CN110292654 B CN 110292654B
Authority
CN
China
Prior art keywords
titanium alloy
collagen
antibacterial polypeptide
loaded
dopamine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810234833.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110292654A (zh
Inventor
董亮亮
陈淡嫦
李奕恒
罗思施
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Trauer Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Trauer Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Trauer Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Trauer Biotechnology Co ltd
Priority to CN201810234833.2A priority Critical patent/CN110292654B/zh
Publication of CN110292654A publication Critical patent/CN110292654A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110292654B publication Critical patent/CN110292654B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/04—Metals or alloys
    • A61L27/06—Titanium or titanium alloys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D1/00—Processes for applying liquids or other fluent materials
    • B05D1/02—Processes for applying liquids or other fluent materials performed by spraying
    • B05D1/04—Processes for applying liquids or other fluent materials performed by spraying involving the use of an electrostatic field
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D7/00—Processes, other than flocking, specially adapted for applying liquids or other fluent materials to particular surfaces or for applying particular liquids or other fluent materials
    • B05D7/14—Processes, other than flocking, specially adapted for applying liquids or other fluent materials to particular surfaces or for applying particular liquids or other fluent materials to metal, e.g. car bodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D7/00—Processes, other than flocking, specially adapted for applying liquids or other fluent materials to particular surfaces or for applying particular liquids or other fluent materials
    • B05D7/24—Processes, other than flocking, specially adapted for applying liquids or other fluent materials to particular surfaces or for applying particular liquids or other fluent materials for applying particular liquids or other fluent materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/606—Coatings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/02—Methods for coating medical devices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/06—Coatings containing a mixture of two or more compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D2202/00—Metallic substrate
    • B05D2202/30—Metallic substrate based on refractory metals (Ti, V, Cr, Zr, Nb, Mo, Hf, Ta, W)
    • B05D2202/35—Metallic substrate based on refractory metals (Ti, V, Cr, Zr, Nb, Mo, Hf, Ta, W) based on Ti

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开了一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法。本发明结合静电喷涂技术，在多孔钛合金表面同时构建负载抗菌多肽的胶原涂层，工艺简单方便，喷涂效率高；多巴胺通过氧化形成聚多巴胺具有良好的粘附性，能够增强涂层与钛合金基体的结合，不易脱落，涂层能与多孔钛合金表面微弧氧化结构共存，同时有利于将抗菌多肽负载到钛合金表面；负载抗菌多肽的胶原涂层能够诱导骨和软骨的生成，为钛合金植入体提供更稳定的化学键合和更高的生物活性，更有利于新生骨组织的长入，兼具良好的抗菌性，能够有效降低钛合金植入后引发感染的风险，提高植入效果。

Description

一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用涂层技术领域，具体涉及一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法。
背景技术
钛合金缺乏良好的骨诱导性，其表面惰性氧化层在降低宿主排斥反应的同时限制了其与周围骨组织的整合。钛合金材料植入体内，常见的生物反应主要发生在植入体的表面，因而钛合金的表面生物功能化受到广泛研究者的关注。
钛合金的表面生物功能化不仅能够保持钛合金的力学性能，还能显著改善植入体的骨整合性能，提高植入手术的成功率。钛合金表面复合胶原蛋白技术是近期生物活化表面修饰领域又一热点技术。胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，广泛存在于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏及肌腱、韧带、巩膜等部位，是细胞外基质的主要组成成分，其中Ⅰ型胶原应用最为广泛。胶原具有低免疫源性、降解可控性、降解产物无毒无害，包含有促进细胞粘附和生长的RGD(由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成)结构域，可诱导细胞迁移，刺激细胞增殖，是较早通过FDA及SFDA批准的生物材料之一。活性胶原可与纤维蛋白，糖胺多糖、壳聚糖、海藻酸盐等构建成复合支架，或负载生长因子如bFGF、BMP，或负载基因、干细胞等，用于促进骨、肌肉、人工血管、神经、角膜等组织的修复，在创伤敷料、人工皮肤以及药物释放等领域具有非常广阔的应用前景。然而，钛合金表面与胶原涂层结合比较差，涂层容易脱落。
此外，钛合金植入材料表面容易积聚菌斑，种植体表面宿主免疫力较差，导致钛合金进入人体后容易引发细菌感染，而植入材料表面粘附细菌和形成生物膜易引发感染，而材料界面引发的感染导致植入材料的松动和脱落，甚至引发相邻的组织和器官的坏死，给病人身体带来更大的痛苦和经济负担，因此，有必要提高钛合金表面的抗菌性，改善钛合金的植入效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法，该钛合金表面胶原涂层中涂层与钛合金基体结合力较强，且兼具良好的成骨性能和抗感染性能，制备工艺简单。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将多孔钛合金经丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗各3次；
(2)配制浓度为0.5～6wt％胶原溶液；
(3)将浓度为1～10mg/mL的多巴胺溶液加入到步骤(1)得到的胶原溶液中，其中，多巴胺与胶原的重量比为0.1～0.3:1，常温反应2～12h后，加入抗菌多肽，混合均匀，形成胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为15～100μg/mL；
(4)将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液经静电喷涂在钛合金表面上，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
上述技术方案中结合静电喷涂技术，在多孔钛合金表面同时构建负载抗菌多肽的胶原涂层，工艺简单方便，喷涂效率高；多巴胺通过氧化形成聚多巴胺具有良好的粘附性，能够增强涂层与钛合金基体的结合，不易脱落，涂层并且能与钛合金表面多孔结构共存，粗糙多孔表面有助于提高基体与涂层的结合力，促进Ca、P的沉积；同时有利于将抗菌多肽负载到钛合金表面上，负载抗菌多肽的胶原涂层能够诱导骨和软骨的生成，胶原作为抗菌多肽的载体能够有效保护其生物活性，为钛合金植入体提供更稳定的化学键合和更高的生物活性，更有利于新生骨组织的长入。
抗菌多肽通常为阳离子型，抗菌多肽可以通过静电作用吸引到带有负电荷的细菌表面，改变细胞膜的通透性从而起到杀菌或抑菌的效果。通常，材料表面通过物理吸附的方式吸附抗菌多肽，易导致突释、药物利用率低、毒性大等问题，而通过化学接枝的方式固定抗菌多肽，则容易导致多肽构象发生改变，影响其抗菌性能。
多巴胺在碱性溶液中可自组装形成聚多巴胺，在钛合金表面形成具有超强黏性的聚多巴胺层，提高涂层与钛合金表面的结合力，可以实现钛合金表面的胶原和抗菌多肽的超强粘附，且不会造成抗菌多肽的突释和影响抗菌多肽的构象。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述多巴胺溶液浓度为2～5mg/mL。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述胶原溶液中胶原的质量分数为1％。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为40～60μg/mL。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，静电喷涂的控制参数为：静电电压10～30kV，针头与样品距离为15～25cm，进样速度为0.5～3mL，静电喷涂时间为1～10min。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，静电喷涂的控制参数为：静电电压20kV、针头与样品距离为20cm、进样速度为1mL，静电喷涂时间为5min。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述多孔钛合金为微弧氧化多孔钛合金。
钛合金经过微弧氧化处理，获得形貌均一，粗糙多孔的钛合金表面，植入体内后，有利于提高界面结合力和Ca、P离子的沉积，从而促进成骨。
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的优选实施方式，所述胶原的分子量为285kDa。
本发明还提供了根据上述方法制备得到的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明结合静电喷涂技术，在多孔钛合金表面同时构建负载抗菌多肽的胶原涂层，工艺简单方便，喷涂效率高；多巴胺通过氧化形成聚多巴胺具有良好的粘附性，能够增强涂层与钛合金基体的结合，不易脱落，涂层并且能与多孔钛合金表面微弧氧化结构共存，同时有利于将抗菌多肽负载到胶原涂层中；负载抗菌多肽的胶原涂层能够诱导骨和软骨的生成，为钛合金植入体提供更稳定的化学键合和更高的生物活性，有利于新生骨组织的长入，且兼具良好的抗菌性，有效降低钛合金植入后引发感染的风险，提高植入效果。
附图说明
图1为抗菌率测定结果图。
图2为mBMSCs在材料表面培养3、7和14d的细胞增殖结果图；其中，1表示实施例1的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层，2表示微弧氧化多孔钛合金，3表示对比例2制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
图3为ALP活性测定结果图；其中，1表示实施例1的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层，2表示微弧氧化多孔钛合金，3表示对比例2制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例选用的抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，由上海吉尔生化有限公司合成。以下实施例选用胶原的分子量为285kDa。
实施例1
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的一种实施例，本实施例所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：使用丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗微弧氧化多孔钛合金，每种试剂清洗3次，每次10min，清洗后真空干燥箱中烘干；
(2)将胶原溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌3h，配制浓度为3wt％胶原溶液；
(3)将浓度为4mg/mL的多巴胺溶液加入到步骤(1)得到的胶原溶液中，其中，多巴胺与胶原的重量比为0.15:1，常温反应8h后，加入抗菌多肽，混合均匀，形成胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为40μg/mL；
(4)静电喷涂：将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液转移至20mL注射器中，置换静电纺丝针头，固定在进样器上，将高压电源电压调至20kV，进样器速度调至1mL/h，针头与样品距离调至20cm，调试机器，强光照射针头处，直至可见雾状物喷出，开始进行样品制备，使用固定辅助配件将样品平房固定至接收器上，样品上下圆柱底面各自喷涂5min，然后置换固定辅助配件将样品侧立固定至接收器上，样品圆柱侧面前后各静电喷涂相应时间，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
实施例2
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的一种实施例，本实施例所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：使用丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗微弧氧化多孔钛合金，每种试剂清洗3次，每次10min，清洗后真空干燥箱中烘干；
(2)将胶原溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌3h，配制浓度为6wt％胶原溶液；
(3)将浓度为1mg/mL的多巴胺溶液加入到步骤(1)得到的胶原溶液中，其中，多巴胺与胶原的重量比为0.3:1，常温反应4h后，加入抗菌多肽，混合均匀，形成胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为100μg/mL；
(4)静电喷涂：将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液转移至20mL注射器中，置换静电纺丝针头，固定在进样器上，将高压电源电压调至30kV，进样器速度调至6mL/h，针头与样品距离调至20cm，调试机器，强光照射针头处，直至可见雾状物喷出，开始进行样品制备，使用固定辅助配件将样品平房固定至接收器上，样品上下圆柱底面各自喷涂1min，然后置换固定辅助配件将样品侧立固定至接收器上，样品圆柱侧面前后各静电喷涂相应时间，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液经静电喷涂在钛合金表面上，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
实施例3
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的一种实施例，本实施例所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：使用丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗微弧氧化多孔钛合金，每种试剂清洗3次，每次10min，清洗后真空干燥箱中烘干；
(2)将胶原溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌3h，配制浓度为0.5wt％胶原溶液；
(3)将浓度为10mg/mL的多巴胺溶液加入到步骤(1)得到的胶原溶液中，其中，多巴胺与胶原的重量比为0.1:1，常温反应2h后，加入抗菌多肽，混合均匀，形成胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为60μg/mL；
(4)静电喷涂：将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液转移至20mL注射器中，置换静电纺丝针头，固定在进样器上，将高压电源电压调至25kV，进样器速度调至10mL/h，针头与样品距离调至25cm，调试机器，强光照射针头处，直至可见雾状物喷出，开始进行样品制备，使用固定辅助配件将样品平房固定至接收器上，样品上下圆柱底面各自喷涂10min，然后置换固定辅助配件将样品侧立固定至接收器上，样品圆柱侧面前后各静电喷涂相应时间，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液经静电喷涂在钛合金表面上，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
实施例4
作为本发明所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法的一种实施例，本实施例所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：使用丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗微弧氧化多孔钛合金，每种试剂清洗3次，每次10min，清洗后真空干燥箱中烘干；
(2)将胶原溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌3h，配制浓度为4wt％胶原溶液；
(3)将浓度为6mg/mL的多巴胺溶液加入到步骤(1)得到的胶原溶液中，其中，多巴胺与胶原的重量比为0.2:1，常温反应12h后，加入抗菌多肽，混合均匀，形成胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为15μg/mL；
(4)静电喷涂：将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液转移至20mL注射器中，置换静电纺丝针头，固定在进样器上，将高压电源电压调至10kV，进样器速度调至3mL/h，针头与样品距离调至15cm，调试机器，强光照射针头处，直至可见雾状物喷出，开始进行样品制备，使用固定辅助配件将样品平房固定至接收器上，样品上下圆柱底面各自喷涂5min，然后置换固定辅助配件将样品侧立固定至接收器上，样品圆柱侧面前后各静电喷涂相应时间，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液经静电喷涂在钛合金表面上，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
对比例1
本对比例所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：使用丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗微弧氧化多孔钛合金，每种试剂清洗3次，每次10min，清洗后真空干燥箱中烘干；
(2)将胶原溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌3h，配制浓度为3wt％胶原溶液；
(3)加入抗菌多肽，形成胶原-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为40μg/mL；
(4)静电喷涂：将步骤(3)得到的胶原-抗菌多肽复合溶液转移至20mL注射器中，置换静电纺丝针头，固定在进样器上，将高压电源电压调至20kV，进样器速度调至1mL/h，针头与样品距离调至20cm，调试机器，强光照射针头处，直至可见雾状物喷出，开始进行样品制备，使用固定辅助配件将样品平房固定至接收器上，样品上下圆柱底面各自喷涂5min，然后置换固定辅助配件将样品侧立固定至接收器上，样品圆柱侧面前后各静电喷涂相应时间，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
对比例2
本对比例所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法包括以下步骤：
(1)样品前处理：使用丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗未经微弧氧化处理的表面光滑的钛合金钛合金，每种试剂清洗3次，每次10min，清洗后真空干燥箱中烘干；
(2)将胶原溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌3h，配制浓度为3wt％胶原溶液；
(3)将浓度为4mg/mL的多巴胺溶液加入到步骤(1)得到的胶原溶液中，其中，多巴胺与胶原的重量比为0.15:1，常温反应8h后，加入抗菌多肽，混合均匀，形成胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为40μg/mL；
(4)静电喷涂：将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液转移至20mL注射器中，置换静电纺丝针头，固定在进样器上，将高压电源电压调至20kV，进样器速度调至1mL/h，针头与样品距离调至20cm，调试机器，强光照射针头处，直至可见雾状物喷出，开始进行样品制备，使用固定辅助配件将样品平房固定至接收器上，样品上下圆柱底面各自喷涂5min，然后置换固定辅助配件将样品侧立固定至接收器上，样品圆柱侧面前后各静电喷涂相应时间，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
1、涂层结合力测试
采用划痕法对钛合金表面制备的涂层进行结合力测试，其结果如表1所示。
表1不同涂层结合力测试结果
样品 实施例1 对比例1 对比例2
结合力/N 46.8 22.5 28.3
由表1可知，与对比例1～2制备的涂层相比，实施例1制备的涂层与基体的结合有了提高，植入体内后不容易脱落，钛合金经微弧氧化处理形成的形貌均一，多孔粗糙的表面，且静电喷涂处理获得的涂层保留粗糙多孔结构，结合多巴胺在材料表面氧化形成具有超强粘性的聚多巴胺，能够有效提高涂层与基体的结合力，不易脱落。
2、体外细胞毒性试验
样品：实施例1制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层钛合金人工骨。
(1)细胞株
小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs，ATCC CRL-12424)细胞。
(2)供试液的制备
1)样品浸提液：按0.2g/mL的比例加入浸提介质，37℃下浸提24h。
2)空白对照：同批培养基(1×)37℃下放置24h，作为空白对照液。
3)阴性对照：取高密度聚乙烯，用超纯水洗净晾干，紫外线照射过夜后剪碎。按表面积3cm2/mL的比例加入同批培养基(1×)37℃下浸提24h，作为阴性对照液。
4)阳性对照：含有有机锡添加剂的聚氯乙烯材料(经确认可重现细胞毒性)，用超纯水洗净晾干，紫外线照射过夜，按0.2mg/mL的比例充入浸提介质，37℃下浸提24h，作为阳性对照。
(3)试验方法
将已培养48～72h生长旺盛的细胞用消化液消化后加入细胞培养基，用移液枪吹打混匀后在显微镜下计数，将细胞悬液配置成密度1.5×105cell/mL接种于直径35mm培养皿，每皿2mL，共12皿。置CO2培养箱(CO2体积百分比浓度5％)37℃培养至近汇合单侧细胞形成。
弃去原培养液。分别加入空白对照液、阴性对照、阳性对照液、样品浸提液各3皿，每皿1.8mL每皿加入0.2mL小牛血清。置CO2培养箱37℃培养48h。
(4)试验结果
48h培养结束后，将培养皿至显微镜下观察，结果见表2。
表2细胞毒性试验结果
Figure BDA0001603419130000091
Figure BDA0001603419130000101
(5)结论：
供试样品组细胞毒性反应级别为0分。按相关标准判定，供试品组细胞毒性反应程度为无细胞毒。
3、抗菌实验
分别用金黄色葡萄球菌通过抑菌率实验对实施例1制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层作为实验组，以微弧氧化多孔钛合金作为对照组，分别在1×SBF溶液中浸泡1d和5d后进行抗菌性能测试。抑菌率实验中，将金黄色葡萄球菌配成浓度为3×107CFU/mL的细菌悬液，取100μL细菌悬液滴在材料表面，用盖玻片覆盖，在37℃培养箱中培养1d。用PBS洗脱细菌，取100μL洗脱液涂在琼脂平板上培养，计算抗菌率，结果如图1所示。
由图1结果可知，与微弧氧化多孔钛合金相比，本发明制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层具有更好抑菌效果，抗菌多肽的加入能够提高钛合金的抗菌性，有效降低钛合金植入后引发感染的风险，提高植入效果。同时，浸泡5d后的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层仍具有保持比较高的抑菌率，涂层不会造成抗菌多肽的突释。
4、细胞增殖实验
以实施例1的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层(1)作为实验组，以微弧氧化多孔钛合金(2)和对比例2制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层(3)作为对照组，研究其对小鼠的骨髓间充质干细胞(mBMSCs，ATCCCRL-12424)的细胞行为影响。采用CCK-8试剂盒测定细胞增殖情况，接种细胞数量为1×104/孔，在37℃，5％CO2的培养箱中分别培养1，3，7d后，将样品转移到新的48孔板中，每孔分别加入250μL含有10％CCK-8的H-DMEM，置于培养箱中培养1h，取出100μL的上清液转移到96孔板中，通过酶标仪测定上清液在450nm处的吸光度，每组6个平行样品，结果如图2所示。
由图2结果可知，与对照组相比，在实施例1制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层具有显著的细胞增殖效果，胶原涂层与钛合金表面多孔结构共存，粗糙多孔表面促进Ca、P的沉积，有利于促进mBMSCs的增殖。
5、ALP活性测定
以实施例1的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层(1)作为实验组，以微弧氧化多孔钛合金(2)和对比例2制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层(3)作为对照组，研究其对小鼠的骨髓间充质干细胞(mBMSCs，ATCCCRL-12424)的ALP活性的影响。接种细胞数量为5×104/孔，采用含有成骨诱导液的完全培养基培养，隔天换液，在37℃，5％CO2的培养箱中分别培养7d和14d后，吸出培养基，将样品转移到新的培养板中，用冰冻的PBS清洗3次，每孔加入250μL的细胞裂解液(将Triton X-100溶于10mM的Tris-HCl缓冲液中，浓度为0.1％，pH值为7.4)，并在冰上裂解2小时。用移液枪反复吹洗样品表面，将样品的细胞刮下来，将细胞裂解液转移到1mL的离心管中，超声破碎，在13200rpm，4℃的冷冻离心机离心10min，取上清液备用。分别测定酶活性和蛋白总量，ALP活性通过酶活性/总蛋白计算得到。每组6个平行样品，结果如图3所示。
碱性磷酸酶(ALP)是评价mBMSCs成骨分化能力的重要指标之一。从图3可以看出，与对照组相比，在实施例1制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层具有显著的ALP活性上调效果，表明本发明制备的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层能够促进成骨分化，提高成骨的速度。
本发明中将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的抗菌多肽替换为多黏菌素、杆菌肽、短杆菌肽S也具有良好的抗菌效果；本发明中采用本领域常规的微弧氧化方法处理钛合金形成多孔微弧氧化表面。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州创尔生物技术股份有限公司
<120> 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Arg Trp Thr Trp Arg Gly Ser Gly Arg Trp Thr Trp Arg
1 5 10

Claims (8)

1.一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将多孔钛合金经丙酮、乙醇、纯水依次超声清洗各3次；所述多孔钛合金为微弧氧化多孔钛合金；
(2)配制浓度为0.5～6wt％胶原溶液；
(3)将浓度为1～10mg/mL的多巴胺溶液加入到步骤(1)得到的胶原溶液中，其中，多巴胺与胶原的重量比为0.1～0.3:1，常温反应2～12h后，加入抗菌多肽，混合均匀，形成胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为15～100μg/mL；所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(4)将步骤(3)得到的胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液经静电喷涂在钛合金表面上，得到所述负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
2.根据权利要求1所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，其特征在于，所述多巴胺溶液浓度为2～5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液中胶原的质量分数为1％。
4.根据权利要求1所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，其特征在于，所述胶原-多巴胺-抗菌多肽复合溶液中抗菌多肽的浓度为40～60μg/mL。
5.根据权利要求1所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，静电喷涂的控制参数为：静电电压10～30kV，针头与样品距离为15～25cm，进样速度为0.5～3mL，静电喷涂时间为1～10min。
6.根据权利要求1所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，静电喷涂的控制参数为：静电电压20kV、针头与样品距离为20cm、进样速度为1mL，静电喷涂时间为5min。
7.根据权利要求1所述的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层的制备方法，其特征在于，所述胶原的分子量为285kDa。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法制备得到的负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层。
CN201810234833.2A 2018-03-21 2018-03-21 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法 Active CN110292654B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810234833.2A CN110292654B (zh) 2018-03-21 2018-03-21 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810234833.2A CN110292654B (zh) 2018-03-21 2018-03-21 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110292654A CN110292654A (zh) 2019-10-01
CN110292654B true CN110292654B (zh) 2021-12-17

Family

ID=68025410

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810234833.2A Active CN110292654B (zh) 2018-03-21 2018-03-21 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110292654B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111671971B (zh) * 2020-07-30 2022-01-25 齐鲁工业大学 伯氨基暴露量为6％的多肽单层膜及其制备方法与应用
KR102384715B1 (ko) * 2021-08-26 2022-04-11 (주)제일메디칼코퍼레이션 골 유착능이 우수한 다공성 생체 임플란트 및 이의 제조방법
CN114053481A (zh) * 2021-09-18 2022-02-18 广东省华源康泰生物科技有限责任公司 一种负载抗菌多肽和抗菌离子的钛基骨齿科植入材料的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008045184A1 (en) * 2006-10-05 2008-04-17 Boston Scientific Limited Polymer-free coatings for medical devices formed by plasma electrolytic deposition

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060121083A1 (en) * 2003-07-18 2006-06-08 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anti-microbial medical implants and uses thereof
WO2008030388A2 (en) * 2006-09-06 2008-03-13 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical devices having a coating for promoting endothelial cell adhesion
KR101388567B1 (ko) * 2011-02-11 2014-04-23 서울대학교산학협력단 우수한 골 재생효능을 갖는 표면개질된 지지체 및 그의 제조방법
CN108187135A (zh) * 2018-02-07 2018-06-22 四川大学 基于聚多巴胺修饰的多功能钛种植体及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008045184A1 (en) * 2006-10-05 2008-04-17 Boston Scientific Limited Polymer-free coatings for medical devices formed by plasma electrolytic deposition

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
activity of a novel designed antimicrobial peptied and its interaction with lipids;lanlan ye et al;《journal of peptide science》;20150216;全文 *
纯钛表面微弧氧化结合胶原对成骨细胞黏附增殖的影响;冉丹丹;《华西医学》;20110730;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110292654A (zh) 2019-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111035803B (zh) 一种兼具抗感染及促进骨结合功能的钛植入体材料及其制备方法
CN110292654B (zh) 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法
Huang et al. Modification and evaluation of micro-nano structured porous bacterial cellulose scaffold for bone tissue engineering
Zhou et al. Improving osteogenesis of three-dimensional porous scaffold based on mineralized recombinant human-like collagen via mussel-inspired polydopamine and effective immobilization of BMP-2-derived peptide
Wang et al. Effect of composition of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) on growth of fibroblast and osteoblast
Fu et al. Enhanced proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts on graphene oxide-impregnated PLGA–gelatin nanocomposite fibrous membranes
Araujo et al. Surface controlled biomimetic coating of polycaprolactone nanofiber meshes to be used as bone extracellular matrix analogues
Lin et al. Fabrication of multi-biofunctional gelatin-based electrospun fibrous scaffolds for enhancement of osteogenesis of mesenchymal stem cells
CN107661544B (zh) 抗菌促成骨复合功能多孔骨科植入物及其制备方法
CN107213529B (zh) 一种用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法
Chen et al. Biomimetic mineralisation of eggshell membrane featuring natural nanofiber network structure for improving its osteogenic activity
Almodóvar et al. Chitosan‐heparin polyelectrolyte multilayers on cortical bone: Periosteum‐mimetic, cytophilic, antibacterial coatings
KR101461159B1 (ko) 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물
US20110229970A1 (en) Dual-chamber perfusion bioreactor for orthopedic tissue interfaces and methods of use
Birgani et al. Stimulatory effect of cobalt ions incorporated into calcium phosphate coatings on neovascularization in an in vivo intramuscular model in goats
CN107937880B (zh) 一种金属材料表面改性的方法及其产品和用途
Olyveira et al. Human dental pulp stem cell behavior using natural nanotolith/bacterial cellulose scaffolds for regenerative medicine
CN105816912A (zh) 一种抗感染和促进成骨分化的抗菌肽修饰钛合金假体及其制备方法
CN107198794B (zh) 具有活性离子释放功能的天然高分子生物活性创伤修复材料及其制备方法
CN111298198B (zh) 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用
CN108404222B (zh) 一种用于硬组织材料的多孔钛基纳米复合材料及其制备方法、应用
Zhang et al. RETRACTED ARTICLE: Degradable poly-L-lysine-modified PLGA cell microcarriers with excellent antibacterial and osteogenic activity
Wang et al. Characteristics and cyto-compatibility of Collagen/Ca–P coatings on Ti6Al4V substrate
CN114920274B (zh) 表面修饰载药层状双氢氧化物的聚乳酸复合材料及制备方法与应用
CN114989475A (zh) 一种生物功能化表面改性的聚醚醚酮材料的制备方法和产品应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant