CN111298198B - 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111298198B
CN111298198B CN201910312214.5A CN201910312214A CN111298198B CN 111298198 B CN111298198 B CN 111298198B CN 201910312214 A CN201910312214 A CN 201910312214A CN 111298198 B CN111298198 B CN 111298198B
Authority
CN
China
Prior art keywords
silk fibroin
membrane
layer
solution
nano
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910312214.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111298198A (zh
Inventor
戈旌
朱君
杨驰
王绍义
李萌宇
俞叶佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN201910312214.5A priority Critical patent/CN111298198B/zh
Publication of CN111298198A publication Critical patent/CN111298198A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111298198B publication Critical patent/CN111298198B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/46—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with phosphorus-containing inorganic fillers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
    • A61L2300/604—Biodegradation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用，该双层可吸收仿生屏障膜是由外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜和内层丝素蛋白/P物质多孔疏松膜构成。本发明采用旋蒸法和静电纺丝技术相结合，将促进软硬组织再生的丝素蛋白和无机纳米羟基磷灰石复合，再加载可募集BMSCs和促进血管再生的P物质，优势互补，构建了性能优良又较为便宜的SF/SP/nHA双侧可吸收仿生屏障膜。本发明的制备方法简单，制备过程绿色环保，在体内具有良好的生物相容性，可完全降解，降解产物无刺激，作为一种新型引导性组织屏障膜具有良好的应用前景。

Description

一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种新型双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法。
背景技术
引导性骨组织再生(Guided bone regeneration,GBR)是根据各类组织细胞迁移速度不同的特点，创造出促进骨组织优势生长的环境，即：将屏障膜置于软组织与骨缺损之间建立生物屏障、创造一个隔离空间、阻止干扰骨形成且迁移速度较快的结缔组织细胞和上皮细胞进入骨缺损区，允许有潜在生长能力、迁移速度较慢的前体成骨细胞优先进入骨缺损区，优势生长，同时保护血凝块，减缓组织压力，实现缺损区的修复性骨再生。目前GBR技术广泛用于治疗种植位点骨量不足、牙槽骨的骨开窗开裂、牙周骨缺损、牙槽突裂等颌骨骨缺损。GBR技术的核心是屏障膜，因此这一技术也被称之为膜引导骨再生技术。目前临床上常用的屏障膜有两种，其优缺点分别为：①可吸收胶原膜可完全降解，植入后不必取出，且质地柔软易操作。不足之处为可吸收胶原膜缺乏自成形能力，难以维持稳定的空间，在术后可能发生折叠塌陷，干扰术区骨再生；提取自动物胶原，降解速度不稳定，且有传播疾病的危险。②钛膜或ePTFE膜提供了坚强的纵向支撑力，防止发生塌陷，且可在体内持续发挥机械屏障作用，为目标组织的再生提供充足时间；但其需要二次手术取出，其表面不利于软组织的附着，一旦暴露容易感染。理想的屏障膜应具备的特征为：①具有良好的生物相容性，有利于骨再生；②具有足够的强度及硬度维持新骨形成的空间；③能阻挡成纤维细胞长入骨缺损区，同时能与外层的软组织整合；④具有一定的可渗透性，允许内外体液交换；⑤柔软易操作，能与骨面紧密贴合。目前临床上尚无任何一种屏障膜同时具备以上特征。
屏障膜的研究现状：为了改善这一现状，近年来屏障膜的研究日益热烈，目前主要分为四类：合成高分子材料、金属材料、天然材料和复合材料。①合成高分子材料主要为聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚乳酸-乙醇酸(polyglycolic acid,PLGA)及其共聚物，可以实现力学性能和降解速度的可控，但其细胞亲和性较差，因此有研究者采用外覆涂层(如胶原/壳聚糖、纳米HA、聚多巴胺+骨形成多肽1(bone-forming peptide 1,BFP1)、纳米氧化钛颗粒、胶原/纳米HA、用骨髓干细胞培养液上清处理、PCL+β-TCP、BMP-2等)方式改善，取得了良好的效果。但是这些措施仍然不能解决此类材料的降解产物易引起局部无菌性炎症、其制备过程不够绿色的缺点。②金属材料为镁基金属屏障膜，优点为可降解、促进成骨、且具有良好力学性能。不足之处在于降解速率过快、降解过程中产气影响成骨、厚度无法降低(>1.5mm)。③天然材料如胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、海藻酸盐等具有具有生物相容性好、毒副作用小、易降解、降解产物易吸收的特点，但力学性能不足，作为屏障膜无法维持成骨空间。④复合材料则是由两种或两种以上的不同材料组成，兼具几种材料的优点。因此，为了构建生物相容性好、具备支撑力、降解速度与新骨形成速度一致的屏障膜，有效的途径就是采用复合材料并进行调控优化。
仿生骨膜的发展现状：骨膜是紧密包覆在皮质骨外表面的一层薄膜，在骨折愈合和骨形成、骨改建中起到重要作用。骨膜富含神经和血管，提供皮质骨外表面1/3-1/4的血供。骨膜损伤后，其下方皮质骨缺血-坏死-部分再生的反应链启动，并影响相应范围内骨移植体的存活。自体和异体骨膜移植存在供体不足、供区并发症和免疫学问题。因此，研究者将组织工程的概念引入到骨膜中：Shalumon等制备了丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/BMP-2的复合纤维膜，发现可有效促进新骨再生。为了模拟骨膜内层含有多能间充质干细胞和骨母细胞的生发层，有研究者制备了间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)膜片，或MSCs与可吸收水凝胶复合，以及血管内皮细胞与MSCs混合的细胞膜片，包裹在骨支架材料外面，均取得了不同程度的良好效果。尽管组织工程骨膜取得了良好的促进新骨形成的效果，但外源性的干细胞移植存在来源单一、体内存活时间短、体外培养时间过长的缺点。在人体骨组织自然愈合过程中，需要多种生长因子和信号分子以一种时间/浓度依赖的方式参与。而直接加载蛋白可导致破骨细胞激活、水肿和炎症反应，因此目前组织工程材料的研究热点之一为两种或多种生长因子的仿生程序式释放。骨膜分布着大量含P物质(substance P,SP)的感觉神经，此种神经在骨折愈合过程中起到促进新骨生成和改建的作用。在体外研究中，发现SP在高浓度时可促进BMSCs的增殖，而低浓度时可促进BMSCs成骨分化。已有研究证明组织工程骨中移植神经束可以提高新骨形成和血管化。因此，仿生骨膜的分泌功能，募集间充质干细胞至骨缺损部位，可能对于修复具有更佳的效果。
人体自然组织是由纳米模块组装起来的，因此从仿生学的角度来看纳米结构应该具有更好的生物活性。丝素蛋白(silk fibroin,SF)作为天然高分子材料，具有良好的生物降解性、机械强度和生物相容性，且可以促进细胞增殖和分化，因此在骨、软骨、肝脏和皮肤的组织工程中得到广泛应用。同时，由于颌骨骨缺损往往伴有软组织量不足，而植骨后需要软组织无张力严密缝合；研究证实SF可显著促进软组织再生，因此选用SF作为屏障膜具有其他材料不可比拟的优势。采用静电纺丝技术，可将SF制备出纳微米级的纤维网，其力学强度较好，更仿真天然骨膜的物理结构；且能在常温下以水剂方式进行，避免药物或者活性物质在高温下失活，制备过程绿色环保。但电纺单层膜具有厚度薄、强度差、遇水溶胀的缺点。丝素蛋白与纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite,nHA)复合后，表面粗糙度和机械强度大大增加。静电纺丝时采用旋转接收器，可以使静电纺丝纤维形成一定的走向，以模拟骨膜天然结构中定向排列的胶原纤维，并增强电纺膜的厚度和力学强度。同时，通过调节纺丝液的性质和电纺丝的参数，可以使样品中形成更多的β-折叠结构，以增强电纺膜的湿态稳定性和力学强度。另一方面，调节丝蛋白提取过程中的肽链片段大小，可以调控SP的缓释速率，并延缓的半衰期。
目前，以Bio-Gide为主要代表的胶原膜在国内外广泛应用，但价格高昂，给普通患者造成极大的经济负担。因此，研发一种理想的适合中国国情的可降解组织再生膜势在必行。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种具有良好骨再生作用，可诱导牙龈组织爬行生长的双层可吸收仿生屏障膜。
本发明的第二个目的是提供上述双层可吸收仿生屏障膜的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述双层可吸收仿生屏障膜的应用。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种双层可吸收仿生屏障膜，其特征在于，是由外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜和内层丝素蛋白/P物质多孔疏松膜构成。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了一种双层可吸收仿生屏障膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：首先采用旋蒸法将丝素蛋白和纳米羟基磷灰石构成的旋蒸液制备成外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜，然后采用静电纺丝法将丝素蛋白和P物质构成的纺丝液制备成内层丝素蛋白/P物质多孔疏松膜复合到外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜上。
作为一个优选方案，所述旋蒸液的制备方法为：将丝素蛋白粉溶于水配制出40％的丝素蛋白溶液，再将纳米羟基磷灰石粉末直接溶于丝素蛋白溶液中配制成纳米羟基磷灰石含量为1％-4％的混合溶液，用超声进行处理使溶液充分混合。
作为一个优选方案，所述旋蒸法为将旋蒸液倒入培养皿中并盖上培养皿盖，将其放入37℃摇床中2到3天即可得到旋蒸膜，摇床参数设置为转速：100-500rpm，温度：25-37℃。
作为一个优选方案，所述纺丝液的制备方法为：将丝素蛋白粉溶于水配制出40％的丝素蛋白溶液，再将浓度为10-6—10-8M的P物质直接溶于丝素蛋白溶液中，用超声进行处理使溶液充分混合。
作为一个优选方案，所述静电纺丝法使用10ml注射器在静电纺丝仪器上进行纺丝，仪器参数设置为：纺丝时喷丝头采用7号针头，注射流量为0.4ml/h，喷头与接收板距离13cm，静电电压12kV。
为了实现上述第三个目的，本发明提供了双层可吸收仿生屏障膜在制备引导牙龈或骨组织再生的产品中的应用。
本发明将天然高分子材料丝素蛋白(silk fibroin,SF)、P物质(substance P,SP)与无机成分纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite,nHA)复合在一起形成复合材料，优势互补，构建SF/SP/nHA双侧可吸收仿生屏障膜。SF膜作为该屏障膜的主体材料，具有良好的生物降解性和生物相容性，可促进软硬组织的修复，在骨、软骨和皮肤的组织工程中得到广泛应用；nHA可改善SF膜力学性能不足的缺点，提高SF膜的表面粗糙度和机械强度；SP具有募集骨髓间充质干细胞、促进细胞增殖和成骨分化的作用。本发明的屏障膜不仅可用于骨缺损的修复，对于伴有牙龈组织不足的骨增量手术，其修复效果更佳。
静电纺丝(electrospinning)是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流进行纺丝加工的工艺。由静电纺丝制备出的纳米纤维由于具有小尺寸、大比表面积和特殊的表面与界面效应，从而表现出传统纤维材料所不具备的独特性能，成为当今材料科学技术的前沿和研究热点。
目前，静电纺丝纳米纤维的另一重要应用集中在组织工程方面。由于静电纺丝制备的纳米纤维支架与细胞外基质在形态结构上非常相似，作为组织工程支架材料不仅能起到支撑细胞的作用，还能发挥模板的功能，为细胞提供赖以粘附、生长、分化和增殖的场所，引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。因此，由胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、海藻酸盐等天然高分子材料通过静电纺丝制备成纳米纤维材料，广泛应用于软骨、骨、皮肤、血管、神经等组织工程和修复再生方面。
因此，本发明依据材料优化设计和仿生骨膜结构的研究思路进行生物材料的合成设计，将天然材料丝素蛋白和纳米羟基磷灰石复合后制备无孔致密膜，再在其上采用静电纺丝加载可募集BMSCs和促进血管再生的SP/SF多孔疏松膜，构建了仿生骨膜结构和分泌功能的双层可吸收仿生屏障膜。该再生膜，外层致密，阻挡成纤维细胞长入；内层疏松，有利于BMSCs粘附和增殖；双层复合后的力学强度足以维持成骨空间。内层屏障膜负载SP，提升屏障膜促进细胞募集和成骨分化的功能。本发明分别用扫描电镜、红外光谱、激光共聚焦显微镜和万能力学测试仪等对屏障膜进行了理化性能表征检测。本发明还观察了大鼠BMSCs在屏障膜上的粘附、增殖和成骨分化的能力。
本发明的优点在于，SF/SP/nHA双层可吸收仿生屏障膜具有优良的力学性能、降解性能、缓释SP性能等，同时具有良好的生物相容性，符合生物体内应用的要求，作为一种新型生物膜具有良好的应用前景。通过旋蒸法和静电纺丝滚轴编织技术制备的SF/SP/nHA双层可吸收仿生屏障膜在组织工程领域具有较大的应用潜力，尤其是作为组织工程的屏障，诱导软硬组织的再生。本发明对可降解性引导组织再生膜材料的合成和应用将会提供更广阔的前景，以适应各种临床上需要骨增量的需要。
附图说明
图1.SEM扫描观察。SF/nHA膜，可见表面无孔致密，均匀分布HA微晶结构。SF/SP膜，可见表面多孔疏松，纳米纤维光滑均一。
图2.傅里叶变换红外光谱仪结果。
图3.成骨细胞在SF/SP膜上培养1,2,3和5天后的激光共聚焦检测图。
图4.PBS中的降解实验。结果显示：随着HA含量的增加，膜的降解速度趋缓。
图5.蛋白酶降解实验。结果提示，早期(<10天)各材料的降解速率接近，之后随着HA含量的增加，膜的降解速度趋缓。
图6.SP缓释试验。结果提示，37℃所成的丝素膜，其具有较高的初始释放量，而在后期释放缓慢，而60℃所成的丝素膜，一直处于缓慢释放状态；相比纯丝素膜，SF/nHA复合膜具有相对较快的释放速率，60℃所成的SF/nHA复合膜比37℃所成的SF/nHA复合膜释放速率慢，同样是由于在60℃下形成了更为稳定的silk II结构。
图7.BMSCs增殖试验。结果显示在培养24h内，对照组和实验组屏障膜对BMSCs增殖的影响不大，24h后，实验组屏障膜上附着的BMSCs增殖显著快于对照组屏障膜，且SP浓度越高，BMSCs的增殖越快。
图8.ALP和ARS染色试验。结果显示，10-7M的SP可显著促进BMSCs分泌ALP和形成钙结节的能力。
图9.ALP半定量实验结果亦证实，10-7M的SP可显著促进BMSCs分泌ALP的能力。
图10.定量PCR结果显示，实验组屏障膜可显著上调BMSCs的转录因子RunX2 BMP2、以及成骨指标BSP、OCN、OPN、Col-1a的转录水平。
图11.Western Blotting结果显示，培养48h后，实验组屏障膜可显著上调BMSCs的RunX2和BMP2蛋白水平。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
实施例1.制备双层可吸收仿生屏障膜
1、丝素蛋白的提取
制备方法如下：
将20g的蚕丝生丝置于2L碳酸钠水溶液(5g/L)中煮沸1小时。烧煮过后，将蚕丝用去离子水反复冲洗5至6次。以去除蚕丝中的丝胶蛋白成分，洗净后将脱胶蛋白放置于60℃的电热恒温鼓风干燥箱中，放置12小时左右待脱胶蛋白彻底干燥。然后将脱胶丝素蛋白在80℃温度下溶解于摩尔比为1:8:2的氯化钙/水/乙醇三元溶剂中，待脱胶丝素彻底溶解后，对溶液进行3天的透析处理，第一天自来水透析，第二天自来水流水透析，第三天用超纯水透析，以充分去除溶液中的无机盐和乙醇。再对透析过的溶液进行抽滤处理以除去溶液中的不容微粒。然后将丝素蛋白水溶液置于-80℃的冷冻干燥仪器中冻干得到丝素蛋白粉。
2.静电纺丝膜的制备
(1)丝素蛋白/纳米羟基磷灰石(SF/nHA)复合旋蒸膜制备
将一定量(500-1000ul)的甘油加入40％丝素蛋白溶液(1.5-2ml)中，将混合液倒入5ml离心管中，再将纳米羟基磷灰石粉末直接溶于丝素蛋白溶液中配制成nHA含量为1％，2％和4％混合溶液，进行超声处理5min使溶液混合均匀。将超声处理完的混合液倒入培养皿中并盖上培养皿盖，将其放入37℃摇床中2到3天即可得到旋蒸膜，摇床参数设置为转速：100-500rpm，温度：25-37℃。
(2)丝素蛋白/P物质(SF/SP)复合静电纺丝膜制备
将所得的丝素蛋白粉溶于水配制出40％的丝素蛋白溶液，在将SP直接溶于丝素蛋白溶液中制备成SP含量为10-6M、10-7M和10-8M的混合溶液，用超声进行处理使溶液充分混合，使用10ml注射器在静电纺丝仪器上进行纺丝。
(3)双层复合(SF/SP/nHA)膜的制备
将制备完成的SF/nHA膜覆盖在静电纺丝滚筒接收装置上，将SF/SP混合溶液使用10ml注射器在静电纺丝仪器上进行纺丝，最后得到双层SF/SP/nHA膜。仪器参数设置为：纺丝时喷丝头采用7号针头，注射流量为0.4ml/h，喷头与接收板距离13cm，静电电压12kV。
实施例2.SF/SP/nHA双层可吸收仿生屏障膜的表征
1.仪器和方法
1.1.扫描电镜(JSM-5900LV,JEOL,日本)
静电纺丝得到的屏障膜，其表面经过离子溅射仪喷金镀膜后，表面形貌通过Hitachi S-4800场发射扫描电子显微镜来观察，加速电压设定为5～10kV。
1.2.傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 6700,Nicolet Co.,美国)
光谱采用衰减全反射附件(ATR)来测定。每个光谱都是在金刚石基底上累积32次扫描得到的，采用透过率模式，分辨率为4cm-1，光谱范围为4000～400cm-1。
1.3.激光共聚焦显微镜(Olympus,日本)
将屏障膜置于96孔板中，缓慢加入PI溶液(用PBS配制成浓度50μM的PI溶液，然后用稀释10倍)染色10分钟，再加入PBS清洗，每15分钟更换一次新的PBS，清洗3次，确保无残留染色剂。注意操作过程必须足够轻柔。然后用激光共聚焦显微镜拍摄显微照片(最大吸收波长为535nm，最大发射波长为615nm)。
1.4.电子万能试验机(深圳三思纵横科技股份有限公司，中国广东深圳)
用游标卡尺测量每个样品的厚度，宽度，长度。使用微机控制电子万能试验机进行单向拉伸试验，试验机配备了一个在室温下满载1000N的测力传感器。将入口力设定为0.5N以保证样品得到完全拉伸。拉伸速率恒定为5mm/min，在试验过程中试验机会自动收集载荷与位置数据。样品截面为0.02mm*6mm，样品长度为50mm，测试长度为30mm。每种样品测3次以上。
1.5.降解性能检测
将屏障膜在PBS溶液中和蛋白酶XIV(6.4U/mg)溶液中进行降解性能分析，进行为期2周的观察检测，2周内的每天对溶液中处理的丝素膜进行形貌观察及其质量的称量记录。
1.6.SP释放检测
将屏障膜用纯水浸泡15分钟后，30℃下干燥24小时，称取50mg样品，然后放在15ml无菌离心管中，用2ml的无菌PBS在37℃孵育，恒温摇床振荡(150-170rpm)，分别在1h,3h,5h,7h,9h,12h,24h,2d,3d,4d(10个点)后，收集上清液1ml放置在2ml的离心管中，并储存在-80℃，然后向15ml无菌离心管中加入1ml新鲜的PBS，孵育到下一个时间点。SP的释放采用SP酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D，美国)进行测量。每个时间点取两个样品重复。
2.结果
结果显示，外层SF/nHA膜为无孔致密的屏障膜，SF基质表面有散在分布的nHA颗粒，内层SF/SP膜为交错的电纺纤维构成的三维多孔结构的疏松膜(图1)。红外光谱仪结果显示，SF/nHA膜同样具有SF膜的特征性吸收峰(图2)。激光共聚焦显示，屏障膜表面BMSCs生长良好，提示屏障膜具有良好的生物相容性(图3)。万能测试仪显示，加入nHA后可显著增强SF膜的机械强度，而双层复合后显著提升了屏障膜的机械强度(表1)。降解性能测试结果显示，随着nHA含量提升，SF/nHA膜的降解减缓(图4,5)。SP缓释测试结果显示，在60℃下形成的SF膜，形成了更为稳定的Silk-Ⅱ结构，故SP可缓慢释放(图6)。
表1.制备的丝素蛋白膜的断裂应力及断裂伸长检测
Figure BDA0002031898040000091
实施例3.SF/SP/nHA双层可吸收仿生屏障膜的体外细胞生物相容性
1.主要试剂
DMEM培养液(Hyclone，美国)，胰蛋白酶(Gibco，美国)，胎牛血清(Gibco，美国)，CCK8试剂盒(同仁，日本)，BCIP-NBT碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天，中国)，碱性磷酸酶活性检测试剂盒(碧云天，中国)，BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天，中国)，RIPA蛋白裂解液(碧云天，中国)，CDNA合成试剂盒(TaKaRa，日本)，SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)，Anti-BMP2 antibody(Abcam，英国)，Anti-Runx2 antibody(CST，美国)。
2.仪器和设备
超净工作台(Heraeus，德国)，HERA cell恒温C02细胞培养箱(Heraeus，德国)，台式冷冻高速离心机(Thermo，美国)，HumanReader酶标仪(Human，美国)，Realtime-PCR仪(Bio-Rad，德国)，蛋白垂直平板型电泳槽、电泳仪(Bio-Rad，德国)。
3.实验方法
3.1骨髓间充质干细胞的分离培养
采用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs：将4周的大鼠脱颈椎处死，将其浸泡于75％的酒精中15min；对大鼠双侧股骨和胫骨进行分离，用剪刀剪除股骨和胫骨两端的部分骨质，暴露骨髓腔。使用10ml注射器抽取含有10％胎牛血清和青链霉素的DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液；采用1000r/min、10min的离心，弃上清液，重悬，将细胞接种于直径为10cm的塑料培养皿中，置于37℃，CO2体积分数为5％的饱和湿度培养箱中培养；5～7d时对细胞进行首次换液，之后每3d全量换液一次，待原代BMSCs达80～90％融合后，按1:2的比例进行传代，以纯化和扩增OVX-BMSCs。后续实验均采用P3代。
3.2 BMSCs接种到SF/SP/nHA屏障膜表面
实验组为含有不同浓度SP的屏障膜，对照组为不含有SP的屏障膜。将消毒灭菌后的屏障膜放在孔板中，将BMSCs细胞悬液调整细胞浓度为5×104个/ml，接种到屏障膜表面，24h后进行换液，以弃去未贴壁的细胞。
3.2 SF/SP/nHA屏障膜对BMSCs增殖的影响
将BMSCs接种到实验组和对照组屏障膜的表面，接种后每24h使用CCK8法检测细胞增殖，在酶标仪上在490nm波长处测定各孔OD值，记录结果。共检测7天，以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
3.3 SF/SP/nHA屏障膜对BMSCs体外矿化能力的影响
采用Transwell细胞培养室，上室放置SF/SP/nHA屏障膜，下室接种BMSCs，在第7天和第21天分别进行ALP染色和ARS染色，在第4,7,10天进行ALP半定量测定。
3.4 SF/SP/nHA屏障膜对BMSCs成骨相关基因和蛋白表达的影响
将BMSCs接种到SF/SP/nHA屏障膜表面，采用定量PCR和Western Blotting检测成骨转录因子(RunX2、BMP2)、成骨中晚期指标(BSP、OCN、OPN、Col-1a)的mRNA及蛋白水平。
3.5结果
CCK8试验显示，BMSCs在实验组屏障膜表面增殖良好，呈S曲线；而对照组的BMSCs增殖在24h时与实验组接近，24h之后显著低于实验组；该结果提示加入SP的复合模可促进BMSCs增殖，且浓度越高，增殖越快(图7)。ALP和ARS染色结果提示，实验组屏障膜可显著上调BMSCs分泌ALP和形成钙结节的能力，且10-7M的SP促成骨效果最佳(图8)；ALP半定量实验结果亦证实上述结论(图9)。以上结果提示，加入SP的复合模可促进BMSCs增殖和成骨分化的能力，且10-7M的SP促成骨效果最佳。定量PCR和Western Blotting结果显示，实验组屏障膜可显著上调BMSCs的RunX2和BMP2表达量，促进成骨指标BSP、OCN、OPN、Col-1a的转录(图10,11)。该结果提示，加入SP的复合膜可促进BMSCs成骨分化。以上结果表明，SF/SP/nHA屏障膜具有良好的生物相容性，且可促进BMSCs的增殖和成骨分化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于引导牙龈及骨组织再生的产品中的双层可吸收仿生屏障膜，其特征在于，是由外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜和内层丝素蛋白/P物质多孔疏松膜构成，其中，所述外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜的组分包括丝素蛋白溶液和纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石的质量百分含量为1％-4％，所述内层丝素蛋白/P物质多孔疏松膜的组分包括丝素蛋白溶液和P物质，所述P物质的摩尔浓度为10-6-10-8M。
2.一种权利要求1所述用于引导牙龈及骨组织再生的产品中的双层可吸收仿生屏障膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：首先采用旋蒸法将丝素蛋白和纳米羟基磷灰石构成的旋蒸液制备成外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜，然后采用静电纺丝法将丝素蛋白和P物质构成的纺丝液制备成内层丝素蛋白/P物质多孔疏松膜复合到外层丝素蛋白/纳米羟基磷灰石无孔致密膜上。
3.根据权利要求2所述的用于引导牙龈及骨组织再生的产品中的双层可吸收仿生屏障膜的制备方法，其特征在于，所述旋蒸液的制备方法为：将丝素蛋白粉溶于水配制出40％的丝素蛋白溶液，再将纳米羟基磷灰石粉末直接溶于丝素蛋白溶液中配制成纳米羟基磷灰石含量为1％—4％的混合溶液，用超声进行处理使溶液充分混合。
4.根据权利要求2所述的用于引导牙龈及骨组织再生的产品中的双层可吸收仿生屏障膜的制备方法，其特征在于，所述旋蒸法为将旋蒸液倒入培养皿中并盖上培养皿盖，将其放入37℃摇床中2到3天即可得到旋蒸膜，摇床参数设置为转速：100-500rpm，温度：25-37℃。
5.根据权利要求2所述的用于引导牙龈及骨组织再生的产品中的双层可吸收仿生屏障膜的制备方法，其特征在于，所述纺丝液的制备方法为：将丝素蛋白粉溶于水配制出40％的丝素蛋白溶液，再将浓度为10-6—10-8M的P物质直接溶于丝素蛋白溶液中，用超声进行处理使溶液充分混合。
6.根据权利要求2所述的用于引导牙龈及骨组织再生的产品中的双层可吸收仿生屏障膜的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝法使用10ml注射器在静电纺丝仪器上进行纺丝，仪器参数设置为：纺丝时喷丝头采用7号针头，注射流量为0.4ml/h，喷头与接收板距离13cm，静电电压12kV。
CN201910312214.5A 2019-04-18 2019-04-18 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用 Active CN111298198B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910312214.5A CN111298198B (zh) 2019-04-18 2019-04-18 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910312214.5A CN111298198B (zh) 2019-04-18 2019-04-18 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111298198A CN111298198A (zh) 2020-06-19
CN111298198B true CN111298198B (zh) 2022-03-01

Family

ID=71144741

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910312214.5A Active CN111298198B (zh) 2019-04-18 2019-04-18 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111298198B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115068689B (zh) * 2022-06-17 2024-01-19 北京邦塞科技有限公司 骨填充囊袋及其制备方法和应用
CN115581805A (zh) * 2022-10-13 2023-01-10 苏州大学附属第一医院 一种促进骨再生的水坝样双相仿生骨膜的制备方法
CN116392647B (zh) * 2023-05-17 2024-04-09 上海栎元医疗科技有限公司 一种用于牙周再生的丝素基三维结构双层膜及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080292667A1 (en) * 2004-10-29 2008-11-27 Seoul National University Industry Foundation Nonwoven Nanofibrous Membranes of Silk Fibroin for Guided Bone Tissue Regeneration and Their Preparation Method
CN101474430A (zh) * 2009-01-13 2009-07-08 武汉大学 一种生物活性组织再生膜及其制备方法
GB2461125A (en) * 2008-06-25 2009-12-30 Spintec Engineering Gmbh A silk membrane for bone graft material
CN103394131A (zh) * 2013-07-26 2013-11-20 宁夏医科大学 一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法
CN104771785A (zh) * 2015-04-03 2015-07-15 周宏志 具有神经多肽诱导陈骨活性的骨修复材料的制造方法
CN105327401A (zh) * 2015-11-17 2016-02-17 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法
CN106668940A (zh) * 2016-12-27 2017-05-17 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种丝素蛋白双层膜及制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080292667A1 (en) * 2004-10-29 2008-11-27 Seoul National University Industry Foundation Nonwoven Nanofibrous Membranes of Silk Fibroin for Guided Bone Tissue Regeneration and Their Preparation Method
GB2461125A (en) * 2008-06-25 2009-12-30 Spintec Engineering Gmbh A silk membrane for bone graft material
CN101474430A (zh) * 2009-01-13 2009-07-08 武汉大学 一种生物活性组织再生膜及其制备方法
CN103394131A (zh) * 2013-07-26 2013-11-20 宁夏医科大学 一种新型双层复合引导组织再生膜及其制备方法
CN104771785A (zh) * 2015-04-03 2015-07-15 周宏志 具有神经多肽诱导陈骨活性的骨修复材料的制造方法
CN105327401A (zh) * 2015-11-17 2016-02-17 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法
CN106668940A (zh) * 2016-12-27 2017-05-17 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种丝素蛋白双层膜及制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111298198A (zh) 2020-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. Bone regeneration with micro/nano hybrid-structured biphasic calcium phosphate bioceramics at segmental bone defect and the induced immunoregulation of MSCs
Shao et al. A biomimetic multilayer nanofiber fabric fabricated by electrospinning and textile technology from polylactic acid and Tussah silk fibroin as a scaffold for bone tissue engineering
Fu et al. Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method
Lee et al. The effect of bacterial cellulose membrane compared with collagen membrane on guided bone regeneration
CN111298198B (zh) 一种双层可吸收仿生屏障膜及其制备方法和应用
Cheng et al. Promoting osteogenic differentiation in pre-osteoblasts and reducing tibial fracture healing time using functional nanofibers
CN111714706B (zh) 可促进血管细胞增殖和分泌细胞外基质的血管支架、血管支架的制备方法及活性人工血管
Wang et al. Polyurethane membrane/knitted mesh-reinforced collagen–chitosan bilayer dermal substitute for the repair of full-thickness skin defects via a two-step procedure
Wang et al. Artificial periosteum in bone defect repair—A review
WO2010081408A1 (zh) 一种生物活性组织再生膜及其制备方法
Hu et al. Mercerization of tubular bacterial nanocellulose for control of the size and performance of small-caliber vascular grafts
Xu et al. 3D polycaprolactone/gelatin-oriented electrospun scaffolds promote periodontal regeneration
Cao et al. A biomimetic biphasic scaffold consisting of decellularized cartilage and decalcified bone matrixes for osteochondral defect repair
Yang et al. Surface modified small intestinal submucosa membrane manipulates sequential immunomodulation coupled with enhanced angio-and osteogenesis towards ameliorative guided bone regeneration
Zheng et al. Biofunctionalization of electrospun fiber membranes by LbL-collagen/chondroitin sulfate nanocoating followed by mineralization for bone regeneration
Olyveira et al. Human dental pulp stem cell behavior using natural nanotolith/bacterial cellulose scaffolds for regenerative medicine
Zhou et al. A silk fibroin/chitosan/nanohydroxyapatite biomimetic bone scaffold combined with autologous concentrated growth factor promotes the proliferation and osteogenic differentiation of BMSCs and repair of critical bone defects
Liu et al. Facile fabrication of biomimetic silicified gelatin scaffolds for angiogenesis and bone regeneration by a bioinspired polymer-induced liquid precursor
Zhu et al. Three-dimensionally printed porous biomimetic composite for sustained release of recombinant human bone morphogenetic protein 9 to promote osteointegration
Al-Bishari et al. JK-2 loaded electrospun membrane for promoting bone regeneration
Yang et al. An engineered lamellar bone mimicking full-scale hierarchical architecture for bone regeneration
CN113559329A (zh) 一种仿牙周有序双层结构支架材料及其制备方法和应用
Xun et al. Calcium crosslinked macroporous bacterial cellulose scaffolds with enhanced in situ mineralization and osteoinductivity for cranial bone regeneration
Xu et al. Electrospun the oriented silk fibroin/bioactive glass@ silk fibroin/polycaprolactone composite bi-layered membranes for guided bone regeneration
CN108096634B (zh) 一种人工骨移植材料及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant