CN115581805A

CN115581805A - 一种促进骨再生的水坝样双相仿生骨膜的制备方法

Info

Publication number: CN115581805A
Application number: CN202211257900.5A
Authority: CN
Inventors: 陈亮; 顾勇; 徐宗瀚
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2022-10-13
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2023-01-10

Abstract

本发明属于骨领域，具体涉及一种序贯调控骨免疫微环境促进骨再生的水坝样双相仿生骨膜的制备方法。本发明首先公开了一种水坝样双相仿生骨膜的制备方法，包括利用微溶胶静电纺丝技术将IL‑4包裹于电纺纤维核芯结构中，通过京尼平将羧甲基壳聚糖和I型胶原在电纺纤维上交联形成羧甲基壳聚糖‑胶原水凝胶涂层，即得到水坝样双相仿生骨膜。本发明制备得到的水坝样双相仿生骨膜凭借其程序性释放IL‑4调控免疫微环境的功能和模拟天然骨膜的结构特性，在体内实验中展现了卓越的免疫调控功能和成骨成血管活性，也证明了其长期可持续的骨再生能力，为骨损伤患者带来了福音。

Description

一种促进骨再生的水坝样双相仿生骨膜的制备方法

技术领域

本发明属于骨领域，具体涉及一种序贯调控骨免疫微环境促进骨再生的水坝样双相仿生骨膜的制备方法。

背景技术

近年来，临床上针对由创伤、肿瘤和骨病等引起的骨缺损已有了较为完善的治疗策略，包括骨移植、人工骨、组织工程骨以及骨搬运技术等，但仍有约5%-10%的患者出现骨不愈合或延迟愈合，主要原因是忽视了骨膜的重要性。骨膜是覆盖于骨组织表面的一种薄而坚韧的高度血管化的双层结缔组织膜，作为骨组织的“脐带”为其提供了超过70%的血供，骨膜作为一种物理屏障，不仅可以抵抗微环境中炎症细胞的过度浸润，并且可以为骨髓间充质干细胞提供支持性微环境促进骨再生。骨损伤周围严重的软组织损伤和患者本身的基础疾病都会引起骨缺损局部免疫微环境紊乱，分泌过量的炎症因子，造成组织坏死并抑制骨修复。因此，鉴于骨膜在物理阻断、免疫调节、成骨和成血管分化方面的天然优势，制备一种能够主动调控免疫微环境的仿生骨膜，是提高骨缺损愈合率的可靠办法。

骨免疫微环境由各种免疫细胞及其分泌的细胞因子组成，在骨修复过程中发挥重要调控作用。巨噬细胞（Mφ）作为免疫反应的关键介质，因其多相性和异质性在骨修复过程发挥着复杂而又精密的调控作用。传统的观点认为，Mφ在炎症早期局部微环境炎性因子的诱导下极化为M1亚型，分泌IL-β，IL-6,TNF-α，INOS等并促进炎症反应和破骨细胞分化，然而研究发现M1型巨噬细胞可以通过分泌VEGF和OSM调节骨再生，因此M1型巨噬细胞在骨再生的过程中同样不可或缺。在炎症中晚期，M2巨噬细胞则响应局部微环境抗炎因子而被极化产生，并分泌arg-1，IL-10等抗炎因子促进组织修复，同时分泌PDGF-BB,MMP9以及BMP-2等活性因子促进血管新生和新骨形成。M1和M2型巨噬细胞在骨损伤的炎症阶段、血管生成和骨再生的过程中彼此交织，相互调节，但任一亚型长期占主导都会引起不同的恶性后果，因此，单纯抑制M1相关的炎症反应和尽早或最大化的促进M2极化并不能获得理想的骨再生效果，而通过时序性的调控M1/M2的极化，使其在适当的阶段发挥合适的作用对骨再生来说至关重要。通常，生物材料植入体内3天后，骨愈合炎性细胞因子水平开始下降，抗炎相关的免疫细胞在4-7天时出现，但巨噬细胞自发地从促炎转化为抗炎的过程受到微环境的抑制。因此，在炎症早期维持适度的炎症微环境，而在之后（即生物材料植入3天后）促进Mφ向M2亚型极化获得抗炎微环境，是仿生骨膜精准调控免疫微环境设计的关键点。然而，如何赋予仿生骨膜对巨噬细胞亚型的序贯调控仍是一个亟待解决的问题。

目前，国内外对生物材料对机体免疫调控的研究越来越多，但这些研究主要通过对材料特性的改变例如表面结构，固有成分以及孔隙率等去间接调控Mφ的表型。但是，由于材料复杂的生物学性质，材料的特性并不能准确的调节材料与宿主的炎症反应，也无法精确的对炎症反应进行时序性调控。因此，通过对生物材料负载适当的细胞因子并对材料表面进行改性后达到对细胞因子可控释放的功能，是赋予材料精准调控炎症反应功能的一种较为可行的策略。课题组前期开发的微溶胶静电纺丝技术，可以成功的制备载药率高，生物相容性好，机械稳定性强，可操作性高的具有核壳结构的左旋聚乳酸（PLLA）微溶胶静电纺丝纤维膜。IL-4主要是由活化的T细胞产生，在免疫调节中起重要作用，IL-4与细胞表面IL-4Rα受体结合后，一方面激活JAK后直接介导STAT6磷酸化引发Mφ向M2极化，另一方面可以激活PI3K/AKT信号通路诱导Th2型免疫反应，TH2细胞可以与Mφ联合调节Mφ向M2型极化，是经典的M2亚型巨噬细胞的极化因子，因此IL-4被选择作为仿生骨膜所负载的主要活性因子。但是微溶胶电纺纤维疏水性强，表面没有细胞识别序列，不利于细胞的黏附和增殖，并且仍然存在一定的早期突释现象，无法实现M1/M2的序贯调控。在此基础上，引入另一种功能材料对基质材料进行杂化实现双相结合，可能是突破这些限制因素的可行策略。

水凝胶具有可调节的理化性质、可控的降解性而常被用于药物控释系统，一些生物相容性和亲水性良好的水凝胶已被广泛运用于基质材料的涂层，以获得高度可控的药物递送系统。由骨膜基质衍生的水凝胶也可以在骨损伤修复中通过免疫调控促进血管生成和骨再生^[28]。因此，我们设想是否可以构建一层致密的水凝胶涂层附着在微溶胶静电纺丝纤维膜表面作为凝胶相，以期用于短期内捕获、存储早期突释的IL-4,并在炎症修复期大量的释放以促进Mφ向M2极化，实现免疫应答的序贯调控。羧甲基壳聚糖（CMC）是由壳聚糖羧甲基化得到的一种含有可功能化的氨基和羧基的水溶性衍生物，具有良好的生物相容性，亲水性和生物降解性，除此之外，CMC还可以螯合钙离子从而促进成骨活性，但单纯的CMC水凝胶仍存在缺乏有机成分和粘附能力不足的缺点。而I型胶原（Col-I）作为天然来源的类细胞外基质的高分子材料，含有丰富的RGD序列促进细胞的黏附并具有一定的矿化能力，可以弥补单纯CMC水凝胶的不足，此外，Col-1可以与IL-4协同促进M2巨噬细胞极化。京尼平（GP）是一种生物相容性良好的天然交联剂，可以与伯氨基团反应。GP含有杂环，分子间缠绕度高，交联产物的三维网络凝胶结构更加稳定和致密，与其它交联剂相比是一个更有吸引力的选择。然而，将CMC、Col-1和GP联合用于仿生骨膜凝胶相的构建还罕有报道。

发明内容

本发明中，我们以骨免疫微环境的动态变化特征和天然骨膜的功能结构特点为基础，利用微溶胶静电纺丝技术将IL-4包裹于电纺纤维核芯结构中，通过GP将羧甲基壳聚糖和Col-I在电纺纤维上交联形成一层致密的羧甲基壳聚糖-胶原（CMC-Col）水凝胶涂层（图1A）。其中纤维相负载和保护IL-4,并为仿生骨膜提供主要的结构性和机械性支持，凝胶相拦截并存储纤维相突释的IL-4，在炎症早期维持适度的微环境，随着凝胶相的降解，IL-4在炎症修复期大量释放并介导Mφ向M2亚型极化，使得大量的抗炎和骨修复相关细胞因子在局部产生，旁分泌转化型骨免疫微环境得以构建，巨噬细胞来源的TGF-β1和BMP-2协同BMSCs促进了局部的成骨分化，PDGF-BB,MMP9协同血管内皮细胞（HUVEC）促进了局部的血管化(图1B)。利用大鼠颅骨缺损模型进一步证实了双相仿生骨膜协调Mφ亚型的转化，实现了炎性免疫微环境向抗炎修复型的可控转换，并展现了卓越的骨缺损的修复能力(图1C)。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种水坝样双相仿生骨膜的制备方法，包括：利用微溶胶静电纺丝技术将IL-4包裹于电纺纤维核芯结构中，通过京尼平将羧甲基壳聚糖和I型胶原在电纺纤维上交联形成羧甲基壳聚糖-胶原水凝胶涂层，即得到水坝样双相仿生骨膜。

优选的，所述方法包括：

S1、制备微溶胶静电纺织液后，接着制备纺丝得到静电纺丝纤维膜；

S2、将MC溶液和GP溶液混合均匀后将水凝胶溶液均匀滴在水化后的静电纺丝纤维膜上直至覆盖完全，恒温过夜组装得到CMC水凝胶涂层；

S3、将中性稀释后的胶原溶液、CMC溶液和CP溶液均匀的滴在CMC水凝胶涂层，恒温过夜组装得到CMC-Col水凝胶涂层，即得到水坝样双相仿生骨膜。

优选的，在S1中，将IL-4与HA溶液充分混合后得到均一的HA-IL-4水溶液，加入Span80和DCM并在室温下充分搅拌均匀，最后依次加入PLLA和DMF搅拌均匀后得到微溶胶静电纺织液。

优选的，在S1中，将微溶胶静电纺织液加入注射器中，并将其连接到一根钝头注射钢针上后固定在精密推进泵上，直流高压电的一端用金属夹连接在钢针注射器针尖处，另一端用金属夹连接在由铝箔锡纸包裹的圆柱形滚筒接收器上，接收器与针尖平行且距离约为10-20cm，设置推进泵速率为60-80ul/min，滚筒接收器速率为100-150次/min，直流高压电电压约为12-18kv后开始纺丝；制备所得的静电纺丝于真空干燥箱过夜以去除残留的有机溶剂，即得到静电纺丝纤维膜。

优选的，在S2中，将S1得到的静电纺丝纤维膜放置在乙醇中水化20-40min。

优选的，在S3中，将冻干的Col-1溶解在醋酸溶液中形成胶原溶液，将所述胶原溶液与PBS进行混合稀释后将其pH值调成7.0，得到中性胶原溶液；随后将稀释后的中性胶原溶液均匀滴在MS上，恒温完成胶原自组装得到MS@Col；然后将CMC溶液和GP溶液混匀后均匀滴在MS@Col上，恒温过夜组装制得MS@CMC-Col。

更优选的，将冻干的Col-1溶解在醋酸溶液中形成胶原溶液终浓度为2-5mg/mL。

本发明第二个方面公开了上述方法制备得到的水坝样双相仿生骨膜。

本发明第三个方面公开了上述的方法或上述的水坝样双相仿生骨膜在医学领域中的应用。

优选的，所述应用为在骨领域中的应用。

在本发明的一个具体优选实施例中，所述水坝样双相仿生骨膜的制备方法包括以下步骤：

1.不同静电纺丝纤维膜的制备

将0.5gPLLA加入4gDCM中在室温下通过磁力搅拌器完全溶解后得到粘稠均匀的溶液，然后加入2gDMF继续在磁力搅拌器搅拌至透明均一，得到PLLA静电纺丝液。取0.1gHA（透明质酸）粉末加入9.9g去离子水中，在室温下搅拌均匀得到1wt%HA水溶液，将预先分装好的10ul IL-4（100ug/ml）与50ul 1wt%HA溶液充分混合后得到均一的1%HA-IL-4水溶液后加入0.01gSpan80和4gDCM并在室温下充分搅拌均匀，最后依次加入0.5gPLLA和2gDMF搅拌均匀后得到微溶胶静电纺丝液。

将上述制备的电纺液加入10ml无菌注射器中，并将其连接到一根内径为0.9mm的钝头注射钢针上后固定在精密推进泵上，直流高压电的一端用金属夹连接在钢针注射器针尖5mm处，另一端用金属夹连接在由铝箔锡纸包裹的圆柱形滚筒接收器上，接收器与针尖平行且距离约为15cm，设置推进泵速率为70ul/min，滚筒接收器速率为120次/min，直流高压电电压约为15kv后开始纺丝。制备所得的静电纺丝于真空干燥箱过夜以去除残留的有机溶剂并命名为PLLA和MS。

2.CMC水凝胶涂层的构建

首先将PLLA和MS电纺膜在75%的乙醇中水化30min。然后称取0.1gCMC粉末和0.01g京尼平粉末，分别配置成10mg/ml的水溶液，随后取10mlCMC溶液和1mlGP溶液于50°水浴锅混合均匀后将水凝胶溶液均匀滴在PLLA和MS电纺膜上直至覆盖完全，并置于37°恒温箱中过夜组装，上述制备好的纤维膜分别命名为PLLA@CMC和MS@CMC。

3.CMC-Col水凝胶涂层的构建

将冻干的Col-1溶解在0.1M的醋酸溶液中形成终浓度为3mg/ml的胶原溶液后4℃保存备用，将上述胶原溶液按1:6的比例与10×PBS进行混合稀释后使用0.1M的NaOH溶液将PH值调成7.0，随后将适量中性稀释后的胶原溶液均匀滴在MS上，37℃恒温1小时完成胶原自组装得到MS@Col。然后按步骤2同样的方法取10mlCMC溶液和1mlGP溶液混匀后均匀滴在MS@Col上，并将上述纤维膜置于37°恒温箱中过夜组装制得MS@CMC-Col。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：

本发明制备得到的水坝样双相仿生骨膜凭借其程序性释放IL-4调控免疫微环境的功能和模拟天然骨膜的结构特性，在体内实验中展现了卓越的免疫调控功能和成骨成血管活性，也证明了其长期可持续的骨再生能力，为骨损伤患者带来了福音。

附图说明

图1为双相仿生骨膜的制备和应用示意图。(A) 微溶胶静电纺丝纤维膜(MS)和羧甲基壳聚糖-胶原水凝胶涂层的双相仿生骨膜(MS@CMC-Col)的合成。(B) 双相仿生骨膜控释IL-4在炎症早期维持适度的微环境，3天后促进M2巨噬细胞极化获得抗炎微环境。(C) 颅骨缺损模型的构建、仿生骨膜的植入、免疫调控和骨再生的示意图。

图2为纤维膜的形态学和材料学的表征示意图。(A) 不同纤维膜的SEM图片。(B)PLLA和MS电纺纤维的TEM图片。(C) FITC-BSA在电纺纤维内的分布图。(D) 不同纤维膜的EDS元素谱图。(E) 不同纤维膜的傅里叶红外光谱结果图。(F) 不同纤维膜的水接触角结果。 (G) 不同纤维膜力学拉伸试验的结果。(H) 不同纤维膜的溶胀率结果。(I) 不同纤维膜的降解曲线。(J) 不同纤维膜IL-4体外释放曲线。（ns,无统计学意义, ****p <0.0001）。

图3为SEM图像和粒径图.(A)MS@Col的SEM图像。（B）HA微溶胶颗粒的粒径分布。（C）PLLA和MS电纺纤维直径分布图。(D) PLLA和MS电纺纤维直径统计学差异分析。（ns,无统计学意义）。

图4为生物相容性实验示意图。（A）BMSC在不同纤维膜和Control组上培养3天后的细胞活死染色图片。（B）活细胞荧光强度半定量分析。（C）BMSC在不同纤维膜和Control组上培养1、3、5、7天后进行细胞增殖实验的分析。(ns,无统计学意义; *p < 0.05; **p <0.01; ***p < 0.001) 。

图5为细胞黏附的机制示意图。(A) Integrin β1的免疫荧光染色。(B) Integrinβ1荧光强度半定量。(C) Vinculin免疫荧光染色。(D) Vinculin荧光强度半定量。(ns,无统计学意义; *p < 0.05; **p < 0.01) 。

图6为M1巨噬细胞构建的适度免疫微环境促进BMSCs募集示意图；（A）适度炎症微环境促进干细胞迁移；（B）不同纤维膜对BMSC的迁移实验结果。不同纤维膜迁移细胞的定量分析。(ns,无统计学意义; *p < 0.05; ****p < 0.001)。

图7为Mφ极化的流式结果示意图。(A＆D) 共培养3天和7天后使用流式细胞仪检测CD86和CD206在Mφ中的表达比例。(B&C) 共培养3天后FCA的定量分析。(E&F) 共培养7天后FCA的定量分析。(ns,无统计学意义; *p < 0.05)。

图8为Mφ的免疫荧光和基因表达结果分析示意图。(A&C) 共培养3天和7天后F4/80和INOS的免疫荧光染色。(B&D) 共培养3天和7天后F4/80和CD206的免疫荧光染色。(E-F)3天和7天INOS荧光强度半定量分析。 (G-H) 3天和7天CD206荧光强度半定量分析。(I-L)共培养3天和7天后炎性基因INOS、Arg-1、TNF-α和IL-10的表达分析。(ns,无统计学意义; *p < 0.05 ; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001 )。

图9为Mφ极化的机制和HUVECs的成血管实验示意图。(A) 使用western blot检测STAT6、PI3K、AKT、NFκbp65磷酸化水平情况。(B-E) STAT6、PI3K、AKT、NFκbp65磷酸化水平的定量分析。(F-G) ELISA检测Mφ分泌的VEGF和PDGF-BB含量。(H-I) 不同纤维膜/Mφ情况下，HUVEC血管化的荧光染色图片。(J-L) 节点数量、主干数量以及总管长的定量分析。(ns,无统计学意义; *p < 0.05 ; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001) 。

图10为共培养条件下BMSCs的成骨分化评价示意图。(A-B) ELISA检测Mφ分泌的BMP-2和TGF-β1的含量。(C) ALP活性染色的光镜图。(D) ALP活性定量检测。(E) OCN的免疫荧光染色图。(F) OCN荧光强度半定量分析。(G) 茜素红染色的光镜图。(H) 钙结节含量检测。 (I-L) ALP、RUNX2、OCN和OPN成骨相关基因的表达分析。(ns,无统计学意义; *p <0.05 ; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001 )。

图11为体内实验流程示意图。（A）仿生骨膜的实物图。(B)大鼠颅骨缺损模型的构建。(C)仿生骨膜的植入。

图12为双相仿生骨膜体内调控骨免疫微环境示意图。(A) 3天时INOS和Arg-1的免疫荧光染色。(B) 7天时INOS和Arg-1的免疫荧光染色。(C) 3天时TNF-α和IL-10的免疫荧光染色。(D) 7天时TNF-α和IL-10的免疫荧光染色。(E-F) 3天时INOS和Arg-1的荧光强度半定量分析。(G-H) 7天时INOS和Arg-1的荧光强度半定量分析。(I-J) 7天时TNF-α和IL-10的荧光强度半定量分析。(K-L) 7天时TNF-α和IL-10的荧光强度半定量分析。(ns,无统计学意义; *p < 0.05 ; **p < 0.01; ***p < 0.001)。

图13为体内骨修复情况的影像学分析示意图。(A) 不同纤维膜组颅骨缺损区域micro-CT的表面重建分析图片。(B) 骨量在总体积中的占比分析。(C) 骨缺损区域的骨密度值分析。(D) 骨表面积修复比例的分析。(ns,无统计学意义; *p < 0.05 ; **p < 0.01;***p < 0.001; ****p < 0.0001 )。

图14为体内成骨分化的组织学评价示意图。(A) 4w和8w时颅骨缺损区域的H&E染色图片。(B-C) 4w和8w时新生骨面积的定量分析。(D) 4w和8w时颅骨缺损区域的Masson染色图片。(E-F) 4w和8w时Masson染色红染区域的定量分析。 (ns,无统计学意义; *p <0.05 ; **p < 0.01; ***p < 0.001)。

图15为OCN，CD31和Periostin的免疫组化分析示意图。(A) 4w和8w时OCN的免疫组化染色图片。(B) 4w和8w时CD31免疫组化染色图片。(C) 4w和8w时Periostin的免疫组化染色图片。(D) 4w和8w时OCN的免疫组化光密度定量分析。(E) 4w和8w时CD31免疫组化蛋白表达定量分析。(F) 4w和8w时Periostin的免疫组化光密度定量分析。(ns,无统计学意义; *p< 0.05 ; **p < 0.01; ***p < 0.001)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

实施例1 不同静电纺丝纤维膜的制备

将0.5gPLLA加入4gDCM中在室温下通过磁力搅拌器完全溶解后得到粘稠均匀的溶液，然后加入2gDMF继续在磁力搅拌器搅拌至透明均一，得到PLLA静电纺丝液。取0.1gHA粉末加入9.9g去离子水中，在室温下搅拌均匀得到1wt%HA水溶液，将预先分装好的10ul IL-4（100ug/ml）与50ul 1wt%HA溶液充分混合后得到均一的1%HA-IL-4水溶液后加入0.01gSpan80和4gDCM并在室温下充分搅拌均匀，最后按照PLLA静电纺丝液的步骤依次加入0.5gPLLA和2gDMF搅拌均匀后得到微溶胶静电纺丝液。

将上述制备的电纺液加入10ml无菌注射器中，并将其连接到一根内径为0.9mm的钝头注射钢针上后固定在精密推进泵上，直流高压电的一端用金属夹连接在钢针注射器针尖5mm处，另一端用金属夹连接在由铝箔锡纸包裹的圆柱形滚筒接收器上，接收器与针尖平行且距离约为15cm，设置推进泵速率为70ul/min，滚筒接收器速率为120次/min，直流高压电电压约为15kv后开始纺丝。制备所得的静电纺丝于真空干燥箱过夜以去除残留的有机溶剂并命名为PLLA和MS电纺膜。

实施例2 CMC水凝胶涂层的构建

实施例3 CMC-Col水凝胶涂层的构建

将冻干的Col-1溶解在0.1M的醋酸溶液中形成终浓度为3mg/ml的胶原溶液后4℃保存备用，将上述胶原溶液按1:6的比例与10×PBS进行混合稀释后使用0.1M的NaOH溶液将PH值调成7.0，随后将适量中性稀释后的胶原溶液均匀滴在MS上，37℃恒温1小时完成胶原自组装得到MS@Col。然后按上述同样的方法取10mlCMC溶液和1mlGP溶液混匀后均匀滴在MS@Col上，并将上述纤维膜置于37°恒温箱中过夜组装制得MS@CMC-Col。

实施例4 双相仿生骨膜的材料学表征

1.扫描电镜（SEM）

将不同组别的纤维膜裁剪成合适大小后通过导电胶固定于SEM制样铜板上，用离子溅射喷金仪（quorum，英国）完成膜表面喷金后放入SEM（Hitachi，日本），设定加速电压为10kv，随后进行观察拍摄。从拍摄图片中随机选取100根纤维使用ImageJ软件进行纤维直径分析。

2.粒径分析

取少量上述配置的HA-DCM油包水乳液体系通过动态光散射粒度分析仪（DLS）（malven，英国）测量DCM中微溶胶颗粒的尺寸大小。

3.生物活性因子分布

用双联铜网（中镜科仪，河南，中国）在纺丝过程中随机快速收集少量电纺纤维，使用透射电镜（TEM）（FEI，美国）在120kv电压下观察单根纤维的内部结构。使用FITC标记的BSA（Solarbio，北京，中国）代替IL-4包裹于HA微溶胶颗粒中进行纺丝液的配置，随后避光进行纺丝，用载破片收集少量电纺纤维后使用荧光显微镜进行观察拍摄。

4.能量色散X线光谱（EDS）

使用能量色散X线光谱（FEI,美国）将不同纤维膜表面进行表征，比较不同纤维膜表面化学元素的变化。

5.傅里叶变换红外光谱（FTIR）

将各组纤维膜裁剪成合适大小的片状，我们使用ATR-FTIR（Nicolet 6700,Thermo Scientific, USA）扫描样品，扫描次数为128 次，扫描范围为400~4000cm-1，分辨率为4cm-1，分析各组纤维膜化学键的异同。

6.水接触角

使用水接触角分析仪(WCA,德国)测量各组纤维膜表面的静态水接触角，评估经过水凝胶涂层的纤维膜表面亲/疏水性的变化。

7.溶胀率

室温下将干重为M1的各组纤维膜浸没于PBS缓冲液中24h后，用吸水纸拭去表面多余水分后称重，记为M2，溶胀率计算公式为：SR=(M2-M1)/M1。

8.降解曲线

室温下将干重为M0的各组纤维膜浸没于PBS缓冲液中，且每天更换PBS，在固定的时间点（1、3、5、7、10、14d）冻干纤维膜后称重记为Ma，质量损失率计算公式为：Mass loss=(M0-Ma)/M0。

9.力学拉伸实验

使用特定的模具将各组纤维膜制成15×3×0.1mm（长×宽×厚）的长条状样品，随后将样品用夹具固定于力学拉伸仪器（恒益，上海，中国）上，设置力学传感器为50N，并以10mm/min的速度进行拉伸。根据所获得的数据绘制应力-应变曲线。

10.IL-4的体外释放

分别取50mgMS,MS@Col,MS@CMC和MS@CMC-Col（理论上分别包含100ng的IL-4），浸泡于装有10ml含1%BSA的PBS溶液的50ml离心管中，所有离心管放置于37℃恒温摇床中震荡，震荡频率为100圈/min,在特定的时间点（0.5、1、2、3、5、7、10、14d）收集尽释放液并存储于-80℃冰箱备用，随后重新加入新鲜的10mlPBS溶液。使用ELISA试剂盒（联科，杭州，中国）测量释放液中IL-4的含量并绘制累计释放曲线图。

结果提示：

1. SEM

使用SEM(图2A)对各组纤维膜进行了表面形貌的观察，可以看到PLLA和MS纤维呈随机排列，表面光滑且均一性较高。通过ImageJ软件分析可得PLLA和MS单根纤维的平均直径分别为057±0.18μm和0.58±0.17μm，两者无统计学差异(图3C-E)。在覆以CMC凝胶相后，在MS@CMC表面可以看到一层致密且光滑的水凝胶涂层将纤维层包裹于其中。对MS先进行胶原自组装后得到的MS@Col的SEM图(图3A)中可以看到大量胶原纤维束沉积在纤维膜的表面和内部，形成了蜘蛛网样的纤维结构。将Col-1自组装纤维和CMC凝胶涂层结合，构建的MS@CMC-Col，其表面仍覆有一层致密的水凝胶，但是与单纯的CMC凝胶涂层相比，由于沉积在纤维膜孔隙内和表面的胶原纤维和第二次涂层的CMC经过GP交联反应，CMC-Col涂层的表面粗糙度增加，更适合细胞的黏附。

2.粒径分析

使用DLS对包裹IL-4的HA微溶胶颗粒直径进行测量(图3B)，结果显示HA粒子的平均粒径为384.6nm，其直径分布范围为100-1000nm,PDI=0.206，这表明了粒子直径分布较为均匀。将制备好的微溶胶颗粒在室温下静置2h，微溶胶粒子并未发生明显改变，提示粒子稳定性较高，为IL-4的稳定包封提供基础。

3.生物活性因子分布

MS内部核壳结构的特性是仿生骨膜高载药率和稳定释放的前提，使用TEM(图2B)对单根纤维的内部结构进行了观察，可以看到,与PLLA相比，MS内部有明显的HA颗粒拉伸后形成的分布带，直径约为0.16±0.03μm，并且表面光滑，结构均一。随后使用带有荧光标记的BSA蛋白代替IL-4包裹于HA颗粒中并避光进行纺丝，使用倒置荧光显微镜对其进行观察，结果显示荧光标记的BSA均匀稳定的分布在每一根电纺纤维的内部(图2C)，这可以归功于微溶胶静电纺丝稳定的载药率，也是仿生骨膜调控成骨微环境的基础。

4.EDS和傅里叶红外光谱

在完成不同的水凝胶涂层之后，使用EDS(图2D)来明确各纤维膜表面化学元素变化情况，结果显示，相比于PLLA和MS纤维膜单纯的C、O元素组成，具有水凝胶涂层的两种纤维膜表现为C、O、N三种元素的组成。将Col自组装纤维和CMC水凝胶涂层相结合，构建的MS@CMC-Col其N元素含量进一步升高，达到了13.53%。使用FTIR分析不同纤维膜的分子结构(图2E),在1750cm处的峰为PLLA的C=O的特征性振动带。MS和PLLA的红外光谱相同，并未出现HA的特征峰，进一步证实了微溶胶颗粒存在于核结构内。与MS相比，MS@Col在3340cm，1650cm和1550cm处出现了代表酰胺键的特征峰。而使用GP将CMC和MS@Col整合之后，出现了更为强烈的酰胺键的特征峰和代表GP的伸缩振动峰。上述结果都表明了MS@CMC-Col凝胶层的成功构建。

5.水接触角

作为人体植入物的生物材料，良好的亲水性可以提高材料的生物相容性和血液相容性，并且有利于细胞的黏附、增殖和分化。 (图2F)中各组纤维膜的水接触角分别为122.3°±0.86°,121.8°±1.67°，40.45°±2.16°,40.15°±1.27°，42.63°±2.20°。表明经过构建凝胶相后的PLLA@CMC,MS@CMC和MS@CMC-Col的水接触角显著降低，亲水性得到了极大的改善，进一步增强了仿生骨膜细胞募集、黏附的能力。

6.溶胀率和降解曲线

溶胀率的大小直接反应了凝胶材料间的交联程度，交联程度越高，则凝胶的溶胀率越低，对不同材料的溶胀率进行测量，结果绘制成溶胀率柱状图(图2H)，由于京尼平分子间缠绕程度高，形成的水凝胶结构更加复杂和紧凑，三组材料的水凝胶涂层的溶胀率都低于15%，且没有明显的统计学差异。在体外降解实验中同样可以发现(图2I)，由于CMC和CMC-Col凝胶层具有三维稳定而又致密的结构，三组水凝胶涂层的纤维膜在前三天的降解率都低于20%。因此，凝胶相致密稳定的结构更有利于控制纤维相中活性因子的突释。

7.力学拉伸实验

由于骨缺损周围组织较强的牵拉作用，因此优良的机械稳定性对于仿生骨膜来说是必不可少。通过力学拉伸实验对仿生骨膜的力学性能进行研究，并绘制成相应的应力应变曲线。从(图2G)中可以看到，PLLA静电纺丝纤维膜具有较稳定的机械性能，但由于MS内部HA核芯的存在，其力学强度较单纯的PLLA有所下降。但是在胶原纤维的沉积并与CMC在表面交联后，MS@CMC-Col的最大拉伸强度达到了5.01±0.16MPa，相比于单纯的PLLA得到了显著的提升。由此可以说明经过水凝胶涂层后的电纺纤维膜，由于大量的水凝胶结构贯穿并结合于电纺纤维的孔隙内，这一现象在某种程度上不仅抵消了核壳结构带来的影响，而且使具有双相结构的仿生骨膜其机械性能得到了显著的提高，也是构建仿生骨膜凝胶相的另一个重要原因。

8.IL-4体外释放

使用IL-4的ELISA试剂盒对相应纤维膜的体外释放进行研究(图2J)，可以发现，对于单纯的MS和只经过胶原自组装的MS@Col来说，在最初的三天存在明显的突释现象，约44.2%±3.7%和40.6%±2.0%的IL-4从电纺纤维内部释放出来，随后释放速率显著降低。而经过水凝胶涂层的双相凝胶-纤维膜由于其表面覆盖了一层致密的凝胶涂层，使其早期突释现象得到了很好的抑制，两种载生物活性因子的水凝胶涂层纤维膜在前三天的释放量均被控制在了12%以内，而在三天后，IL-4开始大量释放，并随着时间的延长而增加,在第14天释放量达到78.9±2.58%。结合交联剂GP的分子式，因其存在杂环并且分子间缠绕程度较高，导致其与羧甲基壳聚糖和胶原的交联程度更高更紧密，并且在液体中的溶胀能力低，所以凝胶相可以明显抑制IL-4前期的突释，而随着凝胶相的降解，IL-4在三天后从电纺纤维内部快速大量释放，达到对免疫微环境程序性调控的目的。

实施例5 双相仿生骨膜体外调控骨免疫微环境促进骨再生

1.细胞培养的准备

将直径为14mm，厚度为100um的圆形细胞爬片黏贴于包裹有铝箔锡纸的圆柱形滚筒接收器上用于收集纺丝，纺丝结束后将爬片真空干燥过夜后置于75%的乙醇溶液水化和消毒30min，用PBS冲洗三遍去除残留乙醇，然后将纺丝爬片放入24孔细胞培养板内，按上述2.2中的步骤进行水凝胶涂层的组装。酒精浸泡和紫外辐照过夜后加入培养基浸泡备用。

原代大鼠BMSC从大鼠股骨和胫骨分离后培养获得，大鼠Mφ购于武汉普诺赛生命科技有限公司，HUVEC购于上海富衡生物科技有限公司。将细胞从培养皿上消化下来后，光镜下计数3次取平均细胞浓度，随后根据不同的实验分别在不同纤维膜上接种相应的细胞数量，加入合适的培养基后放入细胞培养箱进行培养，每2-3天更换一次培养基。细胞培养箱参数设置为温度37℃，相对湿度95%和5%的CO2分压。

2.细胞增殖实验

按上述方法将1×10⁴个BMSCs种植于含不同分组纤维膜的24孔板中，未放材料的细胞爬片为对照组。每孔加入适量培养基后在共培养的1、3、5、7天用100ulCCK8试剂（dojindo，日本）和900ul培养基的混合溶液取代培养基，在细胞培养箱内培养4小时后吸取100ul混合培养液至96孔细胞培养板中，使用酶标仪测得波长为450nm处的吸光度。

3.活/死染色

使用活/死染色试剂盒（invitrogen,美国），将5ul钙黄绿素和20ul溴乙菲啶二聚体加入到10mlPBS中混合均匀配置成活/死染色工作液。BMSCs在与不同分组材料共培养3天后吸去培养基，用预热的37℃PBS清洗3遍后每孔加入300ul工作液并在室温下避光孵育30min。吸去工作液后于倒置荧光显微镜下观察，发出绿色荧光的为活细胞，发出红色荧光的为死细胞。

4.细胞黏附机制的检测

将BMSCs在不同纤维膜上共培养24h后使用Integrinβ1一抗（novus，美国）和Vinculin一抗（novus，美国）进行免疫荧光染色。简单来说，首先吸尽每孔中的培养基，用4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS冲洗3遍后用0.3%的Triton对细胞破膜打孔30min，再次冲洗三遍后用快速封闭液（碧云天，中国）封闭1h。冲洗三遍后加入相应的一抗4℃过夜孵育。次日冲洗三遍后加入相应二抗（Abcam，美国），37℃避光孵育2h，洗去二抗后加入鬼笔环肽（yearsen，中国）室温避光孵育30min对细胞骨架进行染色，最后洗去鬼笔环肽加入DAPI（yearsen，中国）避光孵育5min对细胞核进行染色。最后使用倒置荧光显微镜对其进行观察和拍摄。

5.细胞迁移实验

使用24孔Transwell迁移板（孔径为8um），在上室中加入150ul用基础培养基重悬的含1×104BMSCs的细胞悬液，下室加入700ul各组收集纤维膜与Mφ共培养3天后的细胞培养液上清。共培养24h后，取出上室并用棉签轻轻擦拭聚碳酸酯膜的上表面以去除粘附在上室膜内侧的细胞。随后用4%多聚甲醛固定上室膜外侧的细胞30min，冲洗三遍后用结晶紫溶液染色30min，待膜干燥后在光镜下观察拍摄，镜下随机记录5个视野所得的细胞数进行组间比较。

6.Mφ表型分析

以5×10⁴/ml的密度将Mφ与各组纤维膜共培养，培养至第7天时使用F4/80（Abcam，美国）、INOS（Abcam，美国）和CD206（Abcam，美国）一抗对细胞进行免疫荧光染色。按上述方法依次对Mφ固定、封闭、孵育一抗、二抗、DAPI后在倒置荧光显微镜下观察拍摄。

同样的方法将Mφ与各组纤维膜共培养至第7天后收集细胞并使用流式细胞仪（BD, Canto II，美国）进行检测。简单来说，将收集的细胞转移至1.5mlEP管后4℃下以2000rpm的速度离心5min，随后依次加入anti-CD45-FITC（BD Pharmingen，美国）,anti-CD11b-PEcy7（BD Pharmingen，美国），anti-CD86-APC（BD Pharmingen，美国）,anti-CD206-PE（BD Pharmingen，美国）,在4℃下避光孵育30min后上机检测并用FlowJo软件分析。分析时首先通过CD45和CD11b圈出髓系细胞，随后依次圈出CD86和CD206阳性细胞。

7.Mφ分泌因子的检测

收集Mφ与各组材料共培养的细胞培养液上清，并用相应的ELISA试剂盒（Elabscience，中国）定量检测培养液上清中PDGF-BB,TGF-β1和BMP-2的含量，具体实验步骤按照每种试剂盒的说明书操作。

8.qRT-PCR检测Mφ相关基因表达

在Mφ与各组纤维膜共培养3天和7天后收集细胞，并使用qRT-PCR的方法对TNF-α,IL10,INOS以及Arg-1等相关基因进行检测。简单的说，首先使用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取细胞总RNA，随后使用TaKaRa逆转录试剂盒（Takara，日本），根据操作说明进行RNA的逆转录，最后使用TaKaRa聚合酶链式反应试剂盒（Takara，日本）进行定量PCR扩增。以GAPDH为内参，引物序列通过PubMed进行设计，上海捷瑞公司进行合成。

9.Western Blot分析

在Mφ与各组纤维膜共培养7天后收集细胞，使用WB对其蛋白水平表达进行检测。简单的说，首先使用RIPA裂解液（碧云天，中国）进行细胞总蛋白的提取，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒（Solarbio，北京，中国）对蛋白裂解产物进行定量。随后将20ug蛋白负载到10%SDS PAGE凝胶（新赛美，苏州，中国）上后进行电泳、转膜、封闭，孵育p-STAT6(CST,美国),STST6(CST,美国),p-PI3K(CST,美国),PI3K(CST,美国),p-AKT(CST,美国),AKT(CST,美国),p-NF-κb(CST,美国)，NF-κb(CST,美国),GAPDH(CST,美国)一抗、HRP-二抗标记液（碧云天，上海，中国），最后使用ECL发光试剂盒（Thermo Fisher，美国）显影并通过凝胶成像系统扫描观察。

10.HUVEC体外成血管实验

首先将Mφ与各组材料共培养7天后收集细胞培养上清液后与培养基按1:1的比例混合制备HUVEC专用培养基。在进行成血管实验前，提前将200ul低生长因子基质胶（Corning，美国）加入24孔板中后放入细胞培养箱中1h以形成凝胶备用。以1×10⁵/ml密度将HUVECs接种于涂覆低生长因子基质胶的24孔板中，加入上述制备的HUVECs专用培养液，分别培养3h、6h后用4%多聚甲醛对其进行固定，按上述方法对HUVECs细胞骨架和细胞核进行染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察和拍摄。

11.体外成骨分化的检测

使用24孔Transwell细胞培养板（Corning，美国）分别将Mφ、BMSCs和各组材料共培养，上室为Mφ+纤维膜，下室为BMSCs+纤维膜。在共培养7天后。使用碱性磷酸酯酶显色液试剂盒（碧云天，中国）和碱性磷酸酯酶活性定量试剂盒（建成，南京，中国）对不同组别的BMSCs进行染色和定量分析。在共培养14天后，使用OCN一抗（SAB，美国）按上述免疫荧光的染色步骤对不同组别BMSCs进行免疫荧光染色。在共培养第21天后，使用细胞茜素红钙染色试剂盒（赛叶，广州，中国）对不同组别的BMSCs进行染色，通过光镜观察和拍摄后使用高氯酸溶解钙结节，并使用酶标仪测量波长为420nm处的吸光度进行定量。

12. qRT-PCR检测成骨相关基因的表达

将按上述方法培养7天的BMSCs收集后按照上述qRT-PCR的方法对细胞进行Osterix和RUNx-2基因表达水平的检测。收集培养14天的BMSCs后对其进行OCN和OPN基因表达水平的检测，以GAPDH为内参基因。

结果提示：

1.生物相容性

生物相容性是组织工程研究中始终贯穿的主题之一，在体外研究中，首先对各组纤维膜进行生物相容性评价。将骨组织中来源最丰富并且具有多相分化潜能的BMSCs种植于各组纤维膜上，进行活/死染色和CCK8实验。从活/死染色结果中(图4A-B)可以看到细胞在各组纤维膜上均可以存活并增殖，提示所有纤维膜对细胞无明显的毒性或抑制作用，但是相比于经过水凝胶涂层的纤维膜，单纯的PLLA上的活细胞数量要明显减少，并且死细胞数量也较多，MS@CMC-Col在各组纤维膜中有着更多的活细胞，并且与空白孔板对照组没有明显的差异，这可能是由于其凝胶相中Col-1的存在可以更好的模拟细胞赖以生存的细胞外基质结构导致的结果。同样的，在CCK8的实验结果上可以看到(图4C)，BMSCs在与各组纤维膜共同培养1,3,5,7天后，细胞总体的增殖都呈上升趋势，但从第5天开始，MS@CMC-Col要明显高于其它各组纤维膜，并与空白孔板对照组无明显统计学差异。MS@CMC-Col凭借其良好的亲水性，粘附性和低免疫原性可以大大提高材料本身的生物相容性，为仿生骨膜植入体内并发挥生物学特性奠定了良好的基础。

2.双相仿生骨膜的促黏附作用

种子细胞与生物支架的相互黏附是组织工程发挥生物学功能的基础，良好的粘附性对于生物支架来说是必不可少的，对后续细胞的增殖，分化具有重要意义。Integrinβ1是细胞黏附分子一族，作为一种跨膜蛋白受体，通过形成局部黏附斑(FAs)的结构介导细胞和细胞外基质的黏附，并且能够介导细胞内外的信号转导^[40]。从(图5A)Integrinβ1的荧光图像和(图B)的荧光强度半定量分析中可以看到，相比于PLLA，经过水凝胶涂层后的纤维膜，BMSC呈现了较强的红色荧光信号，而MS@CMC-Col相比于MS@CMC，其荧光信号进一步增强,这也可能得益于Col-1上的RGD、GEFOGR等Integrin结合位点的存在，显著提高仿生骨膜细胞粘附性的能力。

Vinculin是细胞与细胞及细胞与细胞外基质连接处局部黏着斑的重要组成蛋白，通过与多种黏着斑、细胞骨架和细胞骨架F-肌动蛋白相结合介导细胞的信号传导，在细胞黏附、伸展、增殖和分化过程中起到重要作用^[41]。(图5C)Vinculin的荧光图像和(图5D)的荧光强度半定量分析中可以观察到和Integrinβ1类似的结果，经过水凝胶涂层的三组纤维膜中Vinculin可以更好的锚定细胞内的F-actin，而MS@CMC-Col则发出了最强的红色荧光信号。

综上所述，经过CMC-Col水凝胶涂层的双相仿生骨膜极大地改善了纤维膜的粘附性，是理想的模拟细胞外基质的细胞黏附和增殖的生物材料，为种子细胞后续的增殖，分化和发挥生物学功能提供有利的平台。

3.M1巨噬细胞构建的适度免疫微环境促进BMSCs募集

M1巨噬细胞分泌SDF-1启动BMSCs迁移的过程已经被报道，因此，使用transwell迁移实验对在纤维膜免疫调控作用下构建的炎症早期适度的免疫微环境进行评估。(图6A-B)中可以看到，由于存在早期突释IL-4，MS和MS-Col募集的细胞数量远远低于具有控释作用的纤维膜，MS@CMC-Col凭借最为出色的控释能力极大的促进了MI巨噬细胞的迁移效应，为骨修复过程提供了充分的种子细胞。

4.双相仿生骨膜程序性调控Mφ极化改善成骨微环境

骨生物学的发展揭示了局部免疫微环境对于骨再生过程的程序性调控作用对其结局有着重大影响。骨缺损局部的炎症反应是骨再生重要的调节因素，而Mφ作为炎症反应的重要角色，可以受不同免疫微环境的影响而极化成高表达CD86的致炎亚型M1和高表达CD206的抗炎亚型M2，并通过分泌不同的细胞因子改变免疫微环境而调节骨再生^[42]。为了评估仿生骨膜对Mφ极化的程序性调控作用，收集与各组纤维膜直接共培养的Mφ并对其表型进行评估。通过流式细胞术可以看到在共培养3天后(图7A-C)，接种在各组纤维膜上的Mφ都有着较高比例的CD86+/CD11b+,而CD206+/CD11b+在各组都处于一个较低的表达，在共培养7天后(图7D-F)，CD11b+/CD86+在各组的表达量整体下降，CD11b+/CD206+的表达量整体升高，而接种在MS@CMC和MS@CMC-Col上的Mφ有着更高的CD11b+/CD206+比例，MS@CMC-Col由于表面Col-1的存在与IL-4协同促进Mφ向M2亚型极化，有着最高的CD11b+/CD206+比例，达到了35.2%。在细胞免疫荧光染色中观察到同样的结果，各组纤维膜中几乎所有的细胞都染上了Mφ的表面标志物F4/80的绿色荧光，而在共培养3天后，各组纤维膜上的细胞都染上了较强的代表M1亚型表面标志物INOS的红色荧光(图8A)，而代表M2亚型表面标志物CD206的荧光强度在各组的表达都较低(图8B)。相反，在共培养7天后， MS@CMC-Col的INOS荧光强度要显著低于其它对照组(图8C)，而代表CD206的荧光强度则要显著高于其它对照组(图8D)，细胞的形态也更细长，有着更多的伪足。(图8E-H)为共培养3d和7d后INOS和CD206的荧光强度半定量分析，呈现了同样的趋势。结合上述表型分析，可以说明在3天内，即使有少量的IL-4会从仿生骨膜中释放出来，但并不会影响Mφ从M0亚型-M1亚型的极化，而3天后，通过凝胶相实现程序性释放的IL-4大量释放促进Mφ向更适合组织修复的M2亚型极化。

为了进一步验证Mφ表型和功能的变化情况，从基因组学的角度出发对细胞进行了qRT-PCR检测，(图8I-L)可以发现在接种细胞三天后，各组纤维膜上的致炎基因INOS和TNF-α表达量都明显增加并高于在各组都处于一个低表达状态的抗炎基因Arg-1和IL-10，而在7天后，INOS和TNF-α在各组纤维膜上均降低，Arg-1和IL-10的表达量均上调，尤其是MS@CMC-Col组的表达量较其它对照组显著增加。进一步证明了双相仿生骨膜凭借其程序性释放IL-4的功能可以成功的在抗炎修复期促进Mφ向M2亚型极化。

为了更好的了解双相仿生骨膜促进Mφ向M2亚型极化的分子机制，收集与各组纤维膜共培养7天后的细胞并使用了免疫印记试验（WB）的方法分析了IL-4与其受体相结合而激活Mφ向M2极化的两条主要信号通路，即JAK/STAT-6和PI3K/Akt/NF-κB。从WB结果(图9A)和定量分析(图9B-E)可以看到，MS@CMC和MS@CMC-Col组p-STST6/STAT6的相对表达量较其它对照组增加，这是由于从仿生骨膜纤维相释放的IL-4与Mφ表面的IL-4R受体结合后活化JAK从而介导STAT6磷酸化引发Mφ向M2型极化。另一方面，MS@CMC和MS@CMC-Col组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的相对表达量也较其它对照组明显升高，而p-NF-κBp65/ NF-κBp65的相对表达量较其它对照组显著降低。这也证实了仿生骨膜活化PI3K后通过AKT发出信号抑制其下游致炎信号NF-κBp65的激活从而促进Mφ向M2亚型极化的能力。

综上所述，双相仿生骨膜可以通过程序性释放IL-4对Mφ进行主动调控，在炎症早期维持适度的炎症微环境，而在抗炎修复期促进Mφ极化成更适合组织修复的M2亚型，其旁分泌细胞因子及其衍生的细胞信号极大的改善了局部成骨微环境，从而促进骨再生。

5.双相仿生骨膜体外促进血管化

血管再生在骨愈合过程中的重要性不言而喻，而Mφ通过旁分泌相关细胞因子参与新生血管的萌芽和成熟的过程正不断被研究者们发现。仿生骨膜程序性调控巨噬细胞极化后对血管生成的影响值得研究。使用ELISA对各组纤维膜与Mφ共培养的细胞培养液上清进行血管活性因子表达的检测结果中 (图9F-G)可以看到，对于VEGF来说，各组纤维膜的表达水平在数值上没有明显的差异，PLLA组的分泌量反而要略高于MS@CMC-Col组，而PDGF-BB在MS@CMC-Col组的表达量要显著高于其他对照组。这可能是由于M1亚型巨噬细胞主要分泌VEGF促进早期血管新生，而M2亚型巨噬细胞在此基础上进一步分泌PDGF-BB和MMP-9等促进血管成熟和重构的细胞因子。为了进一步探究这个复杂的过程，使用各组纤维膜与Mφ共培养的培养液上清对HUVEC细胞进行成血管实验。在培养3h(图9H)和6h(图9I)后，PLLA、PLLA@CMC和MS@CMC-Col随着时间的推移只出现少量的管状结构，而MS@CMC-Col组在血管内皮细胞的聚集处向四周扩散形成了大量原始的网状结构的血管网络。通过对管状结构的节点数量(图9J)、主干数量(图9K)和总管长(图9L)进行定量分析后可以看到培养6h后MS@CMC-Col的节点数量、主干数量和总管长分别为524.3±7.0、125.3±6.5和14705.0±391.0μm，显著高于PLLA、PLLA@CMC和MS@CMC。虽然M1亚型巨噬细胞分泌更多的VEGF作用在早期新生血管的萌芽上，但M2亚型巨噬细胞进一步分泌的PDGF-BB等因子促进血管的成熟和重构显然更为重要。

体外成血管实验进一步说明双相仿生骨膜可以通过程序性调控巨噬细胞极化改善局部微环境，促进内皮细胞迁移、血管萌发和成熟，从而促进代谢物的转运和局部组织的新陈代谢，减轻局部缺血缺氧，最终达到加速骨再生的目的。

6.双相仿生骨膜促进骨再生

在骨缺损形成后，机体的免疫应答立即启动，相关的免疫细胞聚集至缺损处并分泌相关细胞因子招募干细胞，而招募的干细胞受局部微环境的调控进一步增殖和分化并促进组织的修复和再生。Mφ作为机体免疫的第一道防线，约占缺损部位所有骨髓细胞的20%，其免疫调节作用对骨再生有着重要的意义，BMSCs的增殖和成骨分化所需要的细胞活性因子均可有Mφ分泌。ELISA被用于与纤维膜共培养的Mφ分泌的成骨相关细胞因子表达水平的检测。结果(图10A-B)表明，MS@CMC-Col可以显著上调Mφ分泌BMP-2和TGF-β1的水平，它们通过与细胞表面受体结合后激活相关信号通路对成骨过程进行正向调节。为了进一步研究Mφ向M2亚型极化后分泌相关成骨细胞因子所形成的局部微环境对BMSCs成骨分化的影响，使用transwell细胞培养板分别将Mφ、BMSCs和各组纤维膜进行共培养以检测其成骨水平。

碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞分泌的酶蛋白，可以直接反应成骨细胞的活性和功能状况，是早期成骨细胞分化和骨矿化的标志物。收集使用transwell小室共培养7天后的BMSCs进行ALP的染色和活性检测，(图10C)可以看到，与其它对照组相比，MS@CMC-Col组的ALP染色明显更深并且有着更好的细胞形态，经过ALP活性定量检测后(图10D)可以发现，虽然MS@CMC组的染色比PLLA和PLLA@CMC组深，但较MS@CMC-Col组仍有不小的差距，这可能是由于MS@CMC-Col表面Col-1的存在对细胞成骨分化和矿化起到了重要的作用。

骨钙蛋白(OCN)是由分化成熟的成骨细胞合成和分泌的钙结合蛋白，是骨非胶原性蛋白的主要成分，因其主要在矿化形成期出现，故被认为是成骨细胞向矿化期分化的标志物。收集使用transwell小室共培养14天后的BMSCs进行OCN的免疫荧光染色，(图10E)可以看到，所有纤维膜组的BMSCs生长情况良好，但出现了不同程度的成骨分化情况，MS@CMC-Col组细胞表达了最为强烈的代表OCN的红色荧光，并且细胞更好的铺展在材料上，(图10F)OCN免疫荧光半定量分析同样印证了上述结果。

钙结节是成骨细胞形成的矿化的细胞外基质，表明细胞成骨分化进入最后阶段，是晚期成骨分化的标志物。收集使用transwell小室共培养21天后的BMSCs进行钙结节的茜素红染色，(图10G)可以看到，MS@CMC-Col的钙结节数量最多并且更加致密紧凑，钙结节定量分析结果(图10H)也与染色结果相一致，由于MS@CMC-Col表面的胶原成分对细胞矿化能力的进一步增强，使钙盐不断沉积于细胞外基质中，使得MS@CMC-Col在成骨晚期展现了卓越的成骨和骨矿化的能力。

为了进一步验证双相仿生骨膜对BMSCs的成骨分化的能力，qRT-PCR被用于检测细胞成骨分化相关基因的表达，代表细胞早期成骨分化的ALP和Runx2,以及代表细胞晚期成骨分化的OCN和OPN分别被检测。(图10I-L)可以看到，在MS@CMC-Col程序性的免疫调控作用下，无论是早期成骨指标，还是晚期成骨指标，接种在该材料上的BMSCs都展现出了最为卓越的成骨能力。

总的来说，MS@CMC-Col首先通过程序性释放纤维相中的IL-4调控Mφ向M2亚型极化，随后凭借其凝胶相优良的矿化能力和成骨活性与M2亚型巨噬细胞旁分泌重构的免疫微环境一起协同促进了BMSCs的成骨分化。

综上所述，程序性释放IL-4的MS@CMC-Col双相仿生骨膜在体外展现了其优良的生物学特性。一方面，凝胶相赋予了仿生骨膜优良生物相容性、粘附性以及矿化能力，进一步增强了仿生骨膜细胞募集的能力，并为种子细胞提供了可长期发挥生物学功能的结构支持，另一方面，纤维相负载的IL-4程序性释放在抗炎修复期促进了Mφ向M2亚型的极化，并协同BMSCs和HUVEC等内源性细胞通过旁分泌作用调控成骨免疫微环境，极大地提高了血管生成和成骨分化的能力。

实施例6 双相仿生骨膜体内调控骨免疫微环境促进骨再生

1.实验动物的准备

本研究中所有实验用大鼠全部购买于昭衍（苏州）新药研究中心有限公司，所有大鼠均为雄性，平均重量为200-220g。实验过程中所有对动物的处置和手术操作均符合苏州大学附属第一医院伦理委员会的规定。

2.大鼠颅骨缺损模型的构建以及仿生骨膜的植入

简单的说，首先使用2%的戊巴比妥按照2.5ml/kg的注射剂量对SD大鼠进行麻醉，待麻醉完全后对大鼠颅骨进行剃毛备皮并用安尔碘进行消毒，沿颅骨纵轴作一长约2.5cm的正中切口，逐层分离皮肤、筋膜直至暴露颅骨，钝性剥离颅骨表面骨膜后使用直径为5mm的牙科环钻在颅骨两侧分别做一圆形缺损，冲洗止血后用消毒灭菌过的各组纤维膜覆盖骨缺损区域，不放置任何材料的作为control组。冲洗后逐层缝合并用安尔碘消毒切口，自手术当日起连续三天肌注青霉素预防感染。

3. 取材

在术后3d、7d和4w、8w，对SD大鼠实行安乐死，处死后收集各组SD大鼠的颅骨标本，并用10%福尔马林浸泡固定24h。术后3d和7d的标本用于分析Mφ极化情况和相关炎性因子分泌情况，术后4w和8w的标本用于骨缺损修复情况的评价。

4.Micro-CT分析

使用MicroCT（SkyScan，SkyScan 1176 Belgium）对4w和8w的颅骨样本进行扫描处理，设置扫描电压为65kv，电流为385mA，分辨率为7um。扫描所得数据用相应软件分析得到骨组织体积与组织总体积之比（BV/TV）、骨密度（BMD）和骨表面积（BS）修复比例。并用Mimic软件对所扫描的颅骨样本进行表面重建。

5.组织学分析

将收集的颅骨样本于10%福尔马林固定24h后，使用EDTA液进行脱钙2w，随后用不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水处理，将脱水后的样本经纯二甲苯溶液浸泡后用石蜡进行包埋。使用切片机从通过骨缺损中心处将包埋好的样本进行切片，厚度为5um。组织学分析分为两部分，第一部分为术后3d和7d从各组随机选取15只大鼠进行处死并检测，按上述方法对其颅骨标本进行脱钙、包埋和切片处理，随后使用免疫荧光的方法对INOS（Servicebio，中国）、TNF-α（Servicebio，中国）、Arg-1（Servicebio，中国）以及IL-10（Servicebio，中国）进行检测，评估Mφ在体内实验中表型以及相关炎性指标的变化情况。第二部分为4w及8w的颅骨样本，分别对其进行H&E染色和Masson染色分析骨缺损处骨再生情况，随后进行OCN（Servicebio，中国）、骨膜蛋白（Abcam，中国）和CD31（Servicebio，中国）的免疫组化染色评估骨缺损处骨组织、骨膜再生以及血管化的情况。

结果提示：

为了研究双相仿生骨膜在体内的骨再生作用，我们构建了5mm临界骨缺损的大鼠颅骨缺损模型并植入了各组纤维膜(图11A-C)。在术后3天和7天收集颅骨标本进行骨缺损局部免疫微环境的评估，在术后4w和8w收集颅骨标本并进行骨缺损修复情况的分析。

1.双相仿生骨膜调控免疫微环境

急性骨损伤形成后的炎症早期，中性粒细胞首先到达损伤部位并分泌相关细胞因子和趋化因子募集Mφ，随后Mφ开始占据主导地位，并在局部损伤和炎症得以控制的过程中，其自身的表型和功能会响应微环境的变化而转换，而Mφ能否响应仿生骨膜程序性释放IL-4成功进行转换，则与骨再生的结局息息相关。在 (图12A) 的免疫荧光图像和(图12E-F)的荧光强度半定量分析中可以看到在植入材料的3天后，代表M1亚型的INOS在各纤维膜组都发出了较强的绿色荧光，而代表M2亚型的Arg-1的红色荧光在各组纤维膜组都较弱，强度明显低于INOS的绿色荧光。而在7天后(图12B&G-H)，MS@CMC-Col组Arg-1的红色荧光较其它纤维膜组明显增强，并显著高于其INOS的荧光强度，而除MS@CMC-Col外，其余各组纤维膜的仍发出了较强的绿色银光但强度较3天时已明显降低。表明MS@CMC-Col在炎症中晚期可以显著促进Mφ向M2亚型极化，并且在炎症早期不会影响Mφ向M1亚型的极化。对术后3天和7天收集的标本进行的TNF-α和IL-10免疫荧光染色，(图12C&I-J)可以看到,术后3天所有纤维膜的TNF-α表达量都较高。而IL-10的表达量都较低，而在术后7天(图12D&K-L),MS@CMC-Col组的炎症因子TNF-α显著降低，而抗炎因子IL-10明显增多。从上述表型和功能的结果可以说明，MS@CMC-Col可以成功的在骨修复过程中的抗炎修复期促进Mφ向抗炎表型M2表型极化，有效改善成骨免疫微环境。

2.骨修复情况的评价

首先对收集的标本进行Micro-CT扫描并进行表面重建，从影像学的角度评估其修复情况。(图13A)骨缺损的表面重建图片可以看到，不管是4w还是8w，MS@CMC-Col的骨修复情况都要显著优于其它对照组。Control组由于缺少支架的保护和骨传导作用，仅在缺损周围处形成了少量的骨组织。PLLA组由于支架的存在，其骨修复情况要略优于control组，但仍与PLLA@CMC有不小差距。而MS@CMC和MS@CMC-Col的骨修复情况均要优于未负载IL-4的纤维膜，MS@CMC-Col由于表面Col-1的存在，在程序性调控免疫微环境的同时又进一步协同促进了细胞的黏附和矿化，在各组纤维膜中展现出了最为卓越的骨修复情况。进一步观察可以发现，与control组和PLLA组从骨缺损边缘至中心的修复模式不同，具有凝胶涂层的纤维膜可以在纤维膜的任意位置直接进行膜内成骨，这一现象也表明经过凝胶涂层后的纤维膜可以极大的模拟天然骨膜的生物学功能而影响骨再生的结局。对Micro-CT所获得的数据进行定量分析后可以发现，在相同的时间点，所有纤维膜组的骨量(图13B)，骨密度(图13C)和骨表面积修复比例(图13D)都要高于control组，而在所有纤维膜组中，MS@CMC-Col则表现的最为突出。

随后从组织学的角度出发对颅骨标本进行微观的分析，(图14A)HE染色结果中可以看到，所有纤维膜组的骨修复情况均好于control组，而在所有纤维膜组中，不管是4w还是8w，MS@CMC-Col组与其它对照组相比，在骨组织的数量、体积和连续性上都呈现了更卓越的骨修复情况。同样的结果也可以在组织学新生骨定量分析(图14B-C)中得到验证。Masson三色对骨组织胶原的染色反应和胶原的成熟度相关，因此可以用来评价新生骨组织的成熟度，特别是骨缺损修复过程中从骨痂新生到成熟重构的过程，即红染越多，骨痂越成熟。(图14D)Masson三色染色结果中可以看到所有骨缺损处都形成了许多红蓝相间的新生骨组织，而MS@CMC-Col组不仅可以看到最大片状的红染区域，而且连续性更好。红染区域的定量分析结果(图14E-F)也与此一致。在细胞成骨分化的晚期指标OCN的免疫组化(图15A&D-E)结果中同样可以看到，MS@CMC-Col组OCN阳性表达量也显著高于其它对照组，展现了卓越的骨修复能力。

新生血管是骨缺损处的营养来源，早期的血管化对骨再生和免疫微环境的调节具有重要意义。骨再生过程中，Mφ通过旁分泌作用分泌血管活性因子促进新生血管的萌芽和成熟，血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）高表达于内皮细胞的免疫球蛋白超家族中的黏附分子，因此常被用于评估血管再生的情况^[47]。术后4周和8周的CD31免疫组织化学染色结果(图15B&F-G)显示，MS@CMC-Col.缺损区可见大量新生血管，CD31抗体标记为棕色、圆形或椭圆形。随着血管生成高峰从术后2周开始逐渐缩小，MS@CMC-Col在4周时表现出较好的早期血管生成能力，而在8周时缺损区血管数量总体呈减少趋势。说明了双相仿生骨膜可以通过调控免疫微环境促进Mφ向M2亚型极化旁分泌VEGF、PDGF-BB等细胞因子促进新生血管形成。

骨膜蛋白是一种细胞外基质蛋白，特异性表达于骨膜和牙周组织中，骨膜中的骨膜蛋白主要由前成骨细胞分泌，调节成骨细胞的黏附，迁移和分化等，因其特异性表达在骨膜中，所以可以作为骨膜的特异性标志物。(图15C&H-I)免疫组化结果中可以看到，相比于其它对照组无序，散在分布的骨膜蛋白组织，MS@CMC-Col组中紧贴于新生骨组织表面形成了一层高表达的骨膜蛋白组织，并沿着骨组织的走向成线性排列，展现了双相仿生骨膜在促进骨再生的同时又能促进骨膜修复的能力。

综上所述，双相仿生骨膜凭借其程序性释放IL-4调控免疫微环境的功能和模拟天然骨膜的结构特性，在体内实验中展现了卓越的免疫调控功能和成骨成血管活性，也证明了其长期可持续的骨再生能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种水坝样双相仿生骨膜的制备方法，其特征在于，包括：利用微溶胶静电纺丝技术将IL-4包裹于电纺纤维核芯结构中，通过京尼平将羧甲基壳聚糖和I型胶原在电纺纤维上交联形成羧甲基壳聚糖-胶原水凝胶涂层，即得到水坝样双相仿生骨膜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S1中，将IL-4与HA溶液充分混合后得到均一的HA-IL-4水溶液，加入Span80和DCM并在室温下充分搅拌均匀，最后依次加入PLLA和DMF搅拌均匀后得到微溶胶静电纺织液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S1中，将微溶胶静电纺织液加入注射器中，并将其连接到一根钝头注射钢针上后固定在精密推进泵上，直流高压电的一端用金属夹连接在钢针注射器针尖处，另一端用金属夹连接在由铝箔锡纸包裹的圆柱形滚筒接收器上，接收器与针尖平行且距离约为10-20cm，设置推进泵速率为60-80ul/min，滚筒接收器速率为100-150次/min，直流高压电电压约为12-18kv后开始纺丝；制备所得的静电纺丝于真空干燥箱过夜以去除残留的有机溶剂，即得到静电纺丝纤维膜。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S2中，将S1得到的静电纺丝纤维膜放置在乙醇中水化20-40min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在S3中，将冻干的Col-1溶解在醋酸溶液中形成胶原溶液，将所述胶原溶液与PBS进行混合稀释后将其pH值调成7.0，得到中性胶原溶液；随后将稀释后的中性胶原溶液均匀滴在MS上，恒温完成胶原自组装得到MS@Col；然后将CMC溶液和GP溶液混匀后均匀滴在MS@Col上，恒温过夜组装制得MS@CMC-Col。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将冻干的Col-1溶解在醋酸溶液中形成胶原溶液终浓度为2-5mg/mL。

8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备得到的水坝样双相仿生骨膜。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法或权利要求8所述的水坝样双相仿生骨膜在医学领域中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为在骨领域中的应用。