CN109364291B - 有机无机复合花状涂层及其制备方法 - Google Patents

有机无机复合花状涂层及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物材料表面改性领域，具体而言，涉及一种有机无机复合花状涂层及其制备方法。该制备方法包括将金属基层浸没在磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液的混合溶液中，在36‑38℃液相沉积2.5‑4小时。通过将磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液混合后，再采用液相沉积的方法在金属基层上制备复合涂层，通过化学配位原理，有机分子和无机组分复合杂化形成了特殊的花状拓扑结构，不仅保证了有机分子的活性和稳定性，而且在无机组分，有机活性分子和特殊花状结构的协同作用下提高了涂层的生物活性、生物相容性，能够诱导活性钙磷盐的沉积，促进成骨细胞的生长、增殖和粘附。此外，还能有效的抑制锌基体腐蚀降解速度，调控锌离子的释放。

Description

有机无机复合花状涂层及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体而言，涉及一种有机无机复合花状涂层及其制备方法。
背景技术
锌作为新型可降解金属生物材料，受到越来越多的关注。
但是，目前锌的表面改性还是处于一个刚起步的阶段。现有技术中，锌的表面改性研究较少，仅仅只是停留在单一控制锌的腐蚀降解速度或是提高其生物相容性，很难达到腐蚀降解和生物相容性同时兼顾，且极少涉及生物功能复合杂化表面改性策略。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种有机无机复合花状涂层的制备方法，采用该方法制得的有机无机复合花状涂层，通过化学配位驱动生长特殊的花状结构，在表面形貌结构和有机无机组分的协同作用下，提高了生物相容性和生物活性；同时还抑制了锌基体的腐蚀降解速度，调控锌离子的释放。
本发明的第二目的在于提供一种有机无机复合花状涂层，该有机无机复合花状涂层化学成分、表面形貌结构特殊，耐腐蚀性能好，且生物相容性和生物活性好。
为了实现上述目的，本发明实施例采用的技术方案如下：
一种有机无机复合花状涂层的制备方法，包括：将金属基层浸没在磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液的混合溶液中，在36-38℃液相沉积2.5-4小时。
在本发明较佳的实施例中，磷酸锌溶液是将含有锌离子的溶液和含有磷酸二氢根离子的溶液混合后制得。
在本发明较佳的实施例中，含有锌离子的溶液选自硝酸锌溶液；含有磷酸二氢根离子的溶液选自磷酸二氢钠溶液。
在本发明较佳的实施例中，硝酸锌溶液的浓度6-7g/L；磷酸二氢钠溶液的浓度27-29g/L。
在本发明较佳的实施例中，制备磷酸锌溶液时还加入活化溶液。
在本发明较佳的实施例中，活化溶液选自硝酸钙溶液；硝酸钙溶液的浓度8-12g/L。
在本发明较佳的实施例中，生物活性有机分子溶液选自氨基酸溶液、蛋白质溶液或者糖类溶液中的至少一种；其中，氨基酸溶液包括苯丙氨酸溶液和半胱氨酸溶液中的至少一种；蛋白质溶液包括选自牛血清白蛋白溶液；糖类溶液选自壳聚糖溶液。
在本发明较佳的实施例中，苯丙氨酸溶液的浓度1-2mg/mL；半胱氨酸溶液的浓度0.5-1mg/mL；牛血清白蛋白溶液的浓度2-4mg/mL；壳聚糖溶液的浓度0.5-1mg/mL。
在本发明较佳的实施例中，金属基层为锌基层。
一种有机无机复合花状涂层，采用如上述的有机无机复合花状涂层的制备方法制成。
本发明的有益效果是：
本发明提供的一种有机无机复合花状涂层的制备方法，包括：将金属基层浸没在磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液的混合溶液中，在36-38℃液相沉积2.5-4小时。通过将磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液混合后，再采用液相沉积的方法在金属基层上制备复合涂层，通过化学配位原理，有机分子和无机组分复合杂化形成了特殊的花状拓扑结构，不仅保证了有机分子活性和稳定性，而且在无机组分，有机活性分子和特殊花状结构的协同作用下提高了涂层的生物活性、生物相容性，能够诱导活性钙磷盐的沉积，促进成骨细胞的生长、增殖和粘附，且相对于传统的表面光滑涂层而言，我们涂层表面的拓扑结构更有利于细胞的铺展，有利于细胞的三维生长和分化。此外，还能有效的抑制锌基体腐蚀降解速度，调控锌离子的释放。
本发明提供的一种有机无机复合花状涂层，采用如上述的有机无机复合花状涂层的制备方法制成。该有机无机复合杂化的特殊花状涂层结构，具有密度低、高比表面积、表面亲水等优异性能，且在随着涂层的动态降解过程，外层的无机相逐渐降解，暴露出被包裹的有机组分，释放有机分子的活性官能团，能够提高生物相容性，促进组织和细胞的生长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的扫描电镜图；
图2为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的XPS全谱图；
图3为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的XPS图谱Zn元素的高分辨图；
图4为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的XPS图谱O元素的高分辨图；
图5为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的XPS图谱N元素的高分辨图；
图6为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的极化曲线图；
图7为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的体外诱导性—磷酸钙沉积扫描电镜图；
图8为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的成骨细胞实验细胞计数情况图；
图9为本发明实施例提供的有机无机复合花状涂层的成骨细胞实验细胞荧光图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
下面对本发明实施例的有机无机复合花状涂层及其制备方法进行具体说明。
本发明实施例提供的一种有机无机复合花状涂层的制备方法，包括：
S1、金属基层的预处理。
在本实施例中，金属基层选择锌基层。锌是可降解生物材料，选择锌基层在其上制备有机无机复合花状涂层，能够获得良好的生物相容性。进一步地，在锌基层表面制备涂层时，锌基层表面能够原位释放锌离子，这种原位释放的锌离子能够与后续溶液中的磷酸根结合，使得涂层更加稳定。
需要说明的是，在本发明其他可选的实施例中，上述的金属基层也可以选择本领域其他可降解的金属生物材料作为基层。
进一步地，对金属基层进行抛光，抛光至镜面。
通过对金属基层进行抛光，能够将地金属表面的粗糙度，获得光亮、平整的表面。进而能够保证后续在金属基层上制备良好的涂层，提高涂层与金属基层的连接强度。
进一步地，在对金属基层进行抛光前还用砂纸对金属基层进行打磨。可选地，采用水磨砂纸打磨金属基层表面打磨至2000#。
进一步地，对金属基层抛光后还进行超声清洗，进一步地提高金属基层表面的光亮度。
可选地，采用去离子水和无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干。
S2、制备磷酸锌溶液。
进一步地，磷酸锌溶液是将含有锌离子的溶液和含有磷酸二氢根离子的溶液混合后制得。从而锌离子能够与磷酸根结合获得稳定的涂层。
进一步可选地，含有锌离子的溶液选自硝酸锌溶液；含有磷酸二氢根离子的溶液选自磷酸二氢钠溶液。
进一步可选地，硝酸锌溶液的浓度6-7g/L；磷酸二氢钠溶液的浓度27-29g/L。
通过选择硝酸锌溶液能够在后续制备涂层时，起到补充锌离子的作用，与锌基层原位释放的锌离子一起，形成具有花状结构的涂层。进一步地，通过在溶液中补充锌离子，进一步地使得获得的花状结构的涂层具有密度低、高比表面积等优异性能。
进一步可选地，制备磷酸锌溶液时还加入活化溶液。
通过在制备磷酸锌溶液时加入活化溶液，进一步地促进了锌离子与磷酸根的结合，进而获得稳定的涂层。
进一步可选地，活化溶液选自硝酸钙溶液；硝酸钙溶液的浓度8-12g/L。硝酸钙中的钙离子能够细化表面结构，增加表面的形核位点，在形核生长的过程中使得晶粒更加均匀和细小，进而改善耐腐蚀性能。
在本发明其他可选的实施例中，上述的硝酸锌可以替换为氧化锌。上述的磷酸二氢钠可以替换为磷酸二氢钾。
进一步地，还对制得的磷酸锌溶液的pH值进行调节。
进一步可选地，采用碱溶液将制得的磷酸锌溶液的pH值调节至4-5。可选的，采用NaOH或者KOH进行调节。
通过调节磷酸锌溶液的pH值，进一步地保证了涂层反应的环境。
S3、制备生物活性有机分子溶液。
进一步地，生物活性有机分子溶液选自氨基酸溶液、蛋白质溶液或者糖类溶液中的至少一种。
进一步可选地，氨基酸溶液包括苯丙氨酸溶液和半胱氨酸溶液中的至少一种。
进一步可选地，蛋白质溶液选自牛血清白蛋白溶液。
进一步可选地，糖类溶液选自壳聚糖溶液。具体地，上述的壳聚糖溶液采用稀盐酸进行溶解。
进一步可选地，苯丙氨酸溶液的浓度1-2mg/mL；半胱氨酸溶液的浓度0.5-1mg/mL；牛血清白蛋白溶液的浓度2-4mg/mL；壳聚糖溶液的浓度0.5-1mg/mL。
上述的苯丙氨酸溶液和半胱氨酸溶液以及牛血清白蛋白溶液和壳聚糖溶液均对成骨细胞的增殖和生长有一定的促进作用。通过选用上述的各个氨基酸和蛋白质，能够有效地增加后续获得的涂层的生物相容性。
需要说明的是，在本发明其他可选的实施例中，上述的氨基酸溶液和蛋白质溶液也可以选择本领域其他常见的能够对成骨细胞的增殖和生长有一定的促进作用的氨基酸和蛋白质。
S4、将磷酸锌溶液和生物活性分子溶液混合。
通过将磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液混合，使得后续获得的涂层中包裹了有机分子。相对于现有技术中直接在基层上制备生物涂层的方法，这种方法能够有效地保证有机分子的活性，避免了生物分子活性的缺失，极大地增加了后续制得的复合涂层的生物相容性。
进一步地，通过将磷酸锌溶液和生物有机活性分子溶液混合，有机分子能够对锌离子的释放起到一定的控制作用，有效的达到抑制腐蚀速度、控制基底材料缓慢降解的目的。进一步地保证后续获得的涂层具有花状结构。花状拓扑结构使得细胞三维式的生长，且有效的解决了生物小分子装载难、装载量小、释放过快、难以长期发挥作用难题，极大地促进成骨细胞的增殖和生长。
S5、将锌基层放置于混合溶液中于36-38℃液相沉积2.5-4小时。
采用液相沉积的方法，锌表面在溶液中受到一系列的物理、化学作用，在磷酸锌晶体生长部位，生物活性有机分子通过化学配位与晶体结合，随后其他的磷酸锌晶体结合到该有机分子，通过多层次的结合，磷酸锌晶体生长成为花状结构，且这种结构之中包裹着生物活性有机分子，达到了保持有机分子活性、稳定性的作用。
具体地，将金属基层浸没在前述制得的磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液的混合溶液中，在36-38℃液相沉积2.5-4小时。
进一步地，液相沉积结束后，还对制得的产物进行干燥。可选地，采用真空干燥的方式进行干燥。
进一步地，采用液相沉积的方法在锌金属表面沉积磷酸锌复合涂层，能够保证获得具有花状结构的涂层，且该方法步骤简单，操作简便，有利于推广应用。
本发明的一些实施方式还提供一种有机无机复合花状涂层。该复合涂层，不仅对锌的腐蚀降解速度起到了一个调控的作用，在一定程度上减缓锌的腐蚀速度，并且具有良好的生物活性和生物相容性，对成骨细胞的增殖和生长有一定的促进作用。
通过化学配位原理，将有机组分和无机磷酸锌结合在一起，有机组分不仅起到一个“胶水”的角色，将片晶状的无机磷酸锌结合到了一起，调控其结构生长，而且提高了生物相容性，在表面层长期的腐蚀降解过程中，逐渐暴露出有机组分，一定程度上控制了锌离子的释放，而且对成骨细胞的生长有很好的促进作用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，10g/L Ca(NO3)2·4H2O,6g/L Zn(NO3)·6H2O,28g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至4.5，分别加入1mg/mL的苯丙氨酸、0.5mg/mL半胱氨酸、2mg/mL牛血清白蛋白、0.5mg/mL壳聚糖(用稀盐酸溶解)，备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于37.5℃的水浴环境下，放置3h；取出吹干，放置备用。
实施例2
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，10g/L Ca(NO3)2·4H2O,7g/L Zn(NO3)·6H2O,28g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至4.5，加入1mg/mL的苯丙氨酸备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于37.5℃的水浴环境下，放置3h；取出吹干，放置备用。
实施例3
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，10g/L Ca(NO3)2·4H2O,6.5g/L Zn(NO3)·6H2O,28g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至4.5，加入0.5mg/mL半胱氨酸备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于37.5℃的水浴环境下，放置3h；取出吹干，放置备用。
实施例4
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，10g/L Ca(NO3)2·4H2O,6.6g/L Zn(NO3)·6H2O,28g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至4.5，分别加入2mg/mL牛血清白蛋白，备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于37.5℃的水浴环境下，放置3h；取出吹干，放置备用。
实施例5
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，10g/L Ca(NO3)2·4H2O,7g/L Zn(NO3)·6H2O,28g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至4.5，加入0.5mg/mL壳聚糖(用稀盐酸溶解)，备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于37.5℃的水浴环境下，放置3h；取出吹干，放置备用。
实施例6
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，8g/L Ca(NO3)2·4H2O,6g/L Zn(NO3)·6H2O,27g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至4，分别加入1.5mg/mL的苯丙氨酸、0.7mg/mL半胱氨酸、3mg/mL牛血清白蛋白、0.8mg/mL壳聚糖(用稀盐酸溶解)备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于36℃的水浴环境下，放置2.5h；取出吹干，放置备用。
实施例7
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，12g/L Ca(NO3)2·4H2O,6g/L Zn(NO3)·6H2O,29g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至5，分别加入2mg/mL的苯丙氨酸、1mg/mL半胱氨酸、4mg/mL牛血清白蛋白、1mg/mL壳聚糖(用稀盐酸溶解)，备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于38℃的水浴环境下，放置4h；取出吹干，放置备用。
实施例8
本实施例提供的一种有机无机复合花状涂层，采用以下步骤制得：
A.将锌金属经水磨砂纸打磨至2000#后进行抛光，抛光完成后用去离子水及无水乙醇在超声条件下清洗各3次，每次5min，取出吹干；
B.配置溶液，9g/L Ca(NO3)2·4H2O,6.8g/L Zn(NO3)·6H2O,27.5g/L NaH2PO4·2H2O，用NaOH将pH调至4.5，分别加入1.6mg/mL的苯丙氨酸、0.8mg/mL半胱氨酸、3.5mg/mL牛血清白蛋白、0.7mg/mL壳聚糖(用稀盐酸溶解)，备用；
C.将A步得到的样品浸没在B配好的溶液中，并置于37℃的水浴环境下，放置3.5h；取出吹干，放置备用。
下面对实施例1-8制得的有机无机复合花状涂层考察其微观结构以及性能。具体地，对锌基层(Zn)、磷酸锌化学转化涂层(Zn-PCC)、磷酸锌-苯丙氨酸复合涂层(Zn-PCC@Phe)、磷酸锌-半胱氨酸复合涂层(Zn-PCC@Cys)、磷酸锌-牛血清白蛋白复合涂层(Zn-PCC@BSA)涂层以及磷酸锌-壳聚糖复合涂层(Zn-PCC@CS)涂层进行了检测。
实验例1
采用扫描电镜对实施例1-8制得的有机无机复合花状涂层的微观结构进行观察。
结果如图1所示。从图1可以看出，从扫描结果对比可以看出，没有经过改性的纯锌表面光滑，有少许划痕，而经过磷酸转化涂层改性的表面有一层不规则的片状结构；而加入了苯丙氨酸后的表面更加致密均匀，而且表面出现细小的花状的结构；加入了半胱氨酸的表面相对于磷酸改性层而言，表面的结构改变更为明显，出现了一些较大的花骨朵状的结构；加入了蛋白的表面同样出现了花状结构；加入壳聚糖的表面层也是出现了较大的花状结构。扫描结果说明了磷酸转化涂层成功的构建在了锌金属的表面，而且加入了有机组分成功的构建出了不同的表面花状拓扑结构。
实验例2
采用XPS全谱图对实施例1-8制得的有机无机复合花状涂层的微观结构进行观察。
结果如图2-5所示。参照图2，XPS全谱图的对比可以看出，表面改性过后的涂层表面都出现了P元素的波峰，而加入了有机组分的样品中都出现了较为微弱的N元素峰，其中Zn-PCC@Cys试样和Zn-PCC@BSA试样还出现了其特有的S元素波峰，这充分说明了成功在锌的表面构建了无机磷酸锌-有机分子混合涂层。
从Zn的高分辨可以看出，经过改性之后的Zn元素的结合能相比于纯锌有了不同程度的漂移，这说明出现了键的断裂或是生成。此外，加入了有机组分的涂层和无机磷酸转化涂层相比，也有一定的偏移，这有可能是因为发生了锌和无机组分的配位，形成了新的键，改变了其结合能。
从O元素的高分辨可以看出，加入了有机组分的试样中出现了其含有的波峰，这也充分说明了我们成功构建了无机磷酸-有机混合涂层。
从N的高分辨图谱中可以看出，加入了有机组分的试样中除了出现有机分子本身的特征峰，还出现了新的波峰(399eV)，这很可能是因为有机组分中的N与Zn配位形成的新键。
以上XPS结果充分说明了我们通过配位化学的原理在锌基底上成功构建了有机-无机混合涂层。
实验例3
考察实施例1-8制得的有机无机复合花状涂层的耐腐蚀性。
具体的实验步骤：
1.将样品准备好，背面用2000#砂纸打磨光滑，用导电胶将焊有铜片的导线与打磨光滑的样品表面平稳的粘接，用硅橡胶将样品背面密封；
2.将样品放置于装有SBF(缓冲液)的三通管中，在37.5℃的条件下在IM6电化学工作站进行测量。
实验结果如图6所示。从极化曲线可以看出，没有经过任何处理的裸锌和经过处理之后的样品相比，所有涂层样品的自腐蚀电流密度(icorr)均减少，并且加入了有机组分的相比于无机涂层其自腐蚀电流密度(icorr)更小，其中加入了苯丙氨酸(Phe)的样品表现出了最低的自腐蚀电流密度。这些结果表明了有机无机混合涂层对锌基底有优异的腐蚀保护作用。
实验例4
考察实施例1-8制得的有机无机复合花状涂层的生物活性。
具体步骤：首先准备饱和磷酸钙溶液，Ca、P离子浓度比为1.67，和生物体内羟基磷灰石(HA)相似，配方如下：2.32mmol/L的NH4H2PO4，3.87mmol/L的CaCl2，150mmol/L的NaCl，用Tris调节pH至7.2±0.1，溶液的配制在25℃条件下进行。
配好后静置24小时。大概步骤为：在37±0.5℃下，首先用将样品放入上述准备的溶液中浸泡10s，然后取出放入真空干燥箱干燥30分钟，为了提高表面钙磷盐沉积形核位点，重复上述两个步骤10个循环。然后在同样温度下，将所有样品浸入新的钙磷盐溶液中保温10小时，取出后清洗干净，真空干燥后备用。
钙磷盐(CaP)沉积后，用扫描电镜观察形貌。图7为样品CaP盐沉积后样品的表面形貌结果。从扫描电镜图可直观看出，未经任何处理的纯锌表面沉积了少量的CaP，而且比较稀疏、酥松,这可能因为锌基层在腐蚀降解中释放出的锌离子促进了CaP的沉积。相比于纯锌，改性之后的表面明显促进了CaP的沉积，而且在加入了有机组分的样品表面的CaP较多且厚。这主要是无机组分和有机组分的共同作用，增加更多的CaP沉积的形核位点。
实验例5
考察实施例1-8制得的有机无机复合花状涂层的生物相容性。
本实施例所用的成骨细胞购买于武汉塞维尔生物科技有限公司。成骨细胞培养使用的培养基为添加10％FBS的DMEM(赛默飞世尔仪器有限公司，苏州)培养基培养。待成骨细胞培养至单层铺满约80％后，可进行细胞接种。成骨细胞的接种步骤如下：
1.实验前准备：样品及实验器材灭菌处理(样品采用紫外及酒精灭菌，
实验器材采用高温高压灭菌)；
2.将灭菌离心管、镊子、玻璃吸管和蓝色枪头，1mL移液枪提前放入超净工作台紫外辐照；
3.将生长状况良好的并铺满成骨细胞的培养瓶去除，用生理盐水清洗3遍，用玻璃吸管吸出剩余盐水，防止残余的生理盐水稀释胰酶浓度，减弱消化效果；
4.用吸管吸出胰酶加入培养基内，大约7滴/瓶，拧紧培养瓶瓶盖，放于光镜下观察，若细胞已经皱缩变亮，且有少量细胞悬浮，则迅速加入培养基终止消化，用吸管将细胞吹打均匀；
5.细胞书，将的吹打均匀的细胞悬液加入培养基稀释，在光镜下观察细胞计数板进行计数，本实验成骨细胞的种植密度为5×104cells/mL；
6.移液枪将稀释好的细胞悬液缓慢滴加到样品表面，每孔1mL，之后放入CO2孵箱中进行培养(孵箱参数：37℃，5％CO2)。
本实用性通过罗丹明123(Rhodamine-phalloidin)染色细胞骨架以分析成骨细胞在样品表面的生长形态，以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核以了解成骨细胞在样品表面的粘附数量，并在荧光显微镜下进行观察分析。成骨细胞染色步骤如下：
1.将接种成骨细胞的样品取出，吸除培养基，用生理盐水缓慢清晰三遍，加入2.5％戊二醛溶液固定12小时；
2.吸除戊二醛，用生理盐水清洗三遍，吹干，避光条件下表面滴加罗丹明60μL，反应15min；
3.用生理盐水逐个清洗样品三遍，避光条件下滴加DAPI 60μL，反应5min；
4.用PBS逐个清洗样品三遍，避光保存，然后通过荧光显微镜获取图片及观察分析。
实验结果如图8-9所示。从图8-9可以看出，培养1天结果发现，各样品表面粘附的成骨细胞初步表现出数量及形态有较大的不同，有机无机混合涂层的表面成骨细胞铺展良好，细胞为正常的“楔子”态，数量也多于纯锌样品，其次是磷酸改性层，数量稍少于有机无机混合涂层，细胞形态铺展较好，而纯锌样品细胞少，皱缩也非常严重；培养至第3天时，纯锌表面细胞数量减少，其他样品细胞粘附数量明显增加，而且细胞的形态铺展更自然、更良好；培养至5天时，改性之后的各样品表面的细胞数量同样有所增加，但有机无机混合涂层与磷酸涂层相比细胞数量无明显差别，这可能是因为无机磷酸改性之后的涂层随时间增加诱导大量的钙磷盐沉积，提高其生物相容性。
根据统计学计数结果图8所示，除纯锌外，随着培养时间的延长成骨细胞数量明显增加，这一结果与图9荧光染色结果相一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，包括：
将金属基层浸没在磷酸锌溶液和生物活性有机分子溶液的混合溶液中，在36-38℃液相沉积2.5-4小时。
2.如权利要求1所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
所述磷酸锌溶液是将含有锌离子的溶液和含有磷酸二氢根离子的溶液混合后制得。
3.如权利要求2所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
所述含有锌离子的溶液选自硝酸锌溶液；所述含有磷酸二氢根离子的溶液选自磷酸二氢钠溶液。
4.如权利要求3所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
所述硝酸锌溶液的浓度6-7g/L；所述磷酸二氢钠溶液的浓度27-29g/L。
5.如权利要求2所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
制备所述磷酸锌溶液时还加入活化溶液。
6.如权利要求5所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
所述活化溶液选自硝酸钙溶液；所述硝酸钙溶液的浓度8-12g/L。
7.如权利要求1所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
所述生物活性有机分子溶液选自氨基酸溶液、蛋白质溶液或者糖类溶液中的至少一种；
其中，所述氨基酸溶液包括苯丙氨酸溶液和半胱氨酸溶液中的至少一种；
所述蛋白质溶液选自牛血清白蛋白溶液；
所述糖类溶液选自壳聚糖溶液。
8.如权利要求7所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
所述苯丙氨酸溶液的浓度1-2mg/mL；所述半胱氨酸溶液的浓度0.5-1mg/mL；所述牛血清白蛋白溶液的浓度2-4mg/mL；所述壳聚糖溶液的浓度0.5-1mg/mL。
9.如权利要求1-8任一项所述的有机无机复合花状涂层的制备方法，其特征在于，
所述金属基层为锌基层。
10.一种有机无机复合花状涂层，其特征在于，采用如权利要求1-9所述的有机无机复合花状涂层的制备方法制成。
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