CN108478298B - 一种含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有可结合血小板衍生化生长因子的多糖涂层的种植体及其制备方法。所述含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体包括：锚定了氨基的基体；和接枝到所述基体表面上的且具有可结合生长因子的多糖涂层。

Description

一种含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体及其制备方法，具体而言，本发明涉及一种具有可结合血小板衍生化生长因子的杜仲多糖涂层的钛金属种植体及其制备方法。

背景技术

目前临床种植手术中经常使用的钛金属种植体机械强度高，生物相容性较好，但要求患者身体健康，种植区域骨密度足够等条件。然而众多患者因为系统疾病，引发骨密度不足或者骨品质下降，导致骨质缺损无法接受骨种植手术，或者植入的种植体不能形成稳定的骨整合导致手术失败。因此需开发符合更高要求的骨种植体，其具有主动活化和诱导骨组织黏附，形成足够的骨量从而促进整合的生物学活性。为改善病理状态下的骨整合状况，众多研究者尝试提高成骨细胞在种植体表面的黏附力和形成组织的能力，比如通过喷砂或酸蚀等化学手段改变种植体的表面，再喷涂羟基磷灰石或者胶原蛋白促进成骨细胞的黏附或者采用加载生长因子的等方法。这些方法取得了一定的实验效果，但是和临床需求仍有较大的差距且这些方法制备工艺复杂，周期长，性价比低，比如现有技术无法可控释放生长因子存在生物安全风险。因此种植体表面涂层必须可以提供一个具有特定生物学活性的界面，生物相容性好同时可以促进种植体的骨结合。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明开发了一种含有可结合生长因子涂层的种植体，其包括基体和可结合生长因子涂层，其中，将多糖材料作为可结合生长因子涂层覆盖在基体的表面上，并与基体紧密结合，以及所述多糖涂层具有很好的结合生长因子的能力，能够促进间质干细胞的募集及增殖，促进病变区域骨生成，种植体的长期稳定。此外，本发明还提供了所述含有可结合生长因子涂层的种植体的制备方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体，其包括：

锚定了氨基的基体；和

接枝到所述基体表面上的且具有可结合生长因子的多糖涂层。

优选地，所述多糖可以是天然多糖，更优选地，所述多糖可以为杜仲多糖，例如，从杜仲树皮中得到的杜仲多糖。

作为一个具体的实例，可以使用具有如下结构的杜仲多糖，其中包含可与氨基脱水发生缩合反应形成酰胺键的羧基。在本文中，其被称作杜仲3号多糖，编号为EUP3。

分子量为Mw 126.5KDa

优选地，所述杜仲多糖EUP3采用以下方法制备：取杜仲树皮，粉碎，加入原料质量的5～20倍(优选10倍)去离子水进行提取，温度90～100℃，搅拌浸提3～4h，过滤分离滤渣，滤液中加入2～10倍(优选4倍)体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置沉淀过夜，过滤；savage法除去蛋白质，透析，冻干后获得杜仲多糖粗糖；采用DEAE离子交换树脂和凝胶色谱柱对所获的杜仲多糖粗糖进行纯化，收集馏出液，冻干后获得均一的杜仲多糖EUP3。

所述生长因子为血小板衍生化生长因子，其优势就在于可以与所述多糖涂层特异性结合。

本发明中，在所述基体表面上锚定氨基是通过，例如，等离子体处理法锚定氨基法，多巴胺共聚膜固定氨基法和硅烷偶联剂锚定法来实施的。

本发明中，市场上使用的牙科金属材料都可以被用作本发明的基体。更优选地，所述基体为钛金属、铁、铬、镍或者它们的合金，因为其具有良好的生物相容性及适宜的硬度。

根据本发明的另一方面，提供了一种含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)在基体上锚定氨基；

2)通过酰胺反应将可结合生长因子的多糖固定在基体表面上来形成可结合生长因子的多糖涂层。

具体反应条件如下：配制2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)的DMSO缓冲液使pH值控制为5.0，将过量的多糖充分溶解于所制备的MES的DMSO缓冲液溶液中，向所得的混合液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)搅拌至均匀分散，使多糖上的羧基充分被活化。将此混合溶液加入到盛放氨基锚定的钛片基体的反应容器(12孔细胞培养板)中充分浸没，于室温在摇床上反应过夜。取出反应后得到的种植体用单蒸水冲洗，干燥保存。

优选地，所述步骤1)通过如下选自如下任意一种方法实施：

a利用等离子体增强化学气相沉积设备在基体表面上锚定纳米厚度的含氨基的聚合物，

优选地，其包括如下步骤

a1)在真空环境下使用Ar气等离子体清洗，然后在等离子体增强化学气相沉积设备沉积形成丙烯胺的聚合物，优选厚度为5nm至50nm；

b多巴胺共聚膜固定氨基

优选地，其包括如下步骤：

b1)将清洗过的基体浸入碱性多巴胺溶液，使多巴胺自发氧化共聚，随后，向溶液中加入多巴胺和聚乙烯亚胺的混合液，并反应；

c硅烷偶联剂锚定法，

优选地，其包括如下步骤：

c1)通过氧气组分进行等离子体处理基体使其表面锚定羟基，然后使基体与含氨基的硅烷偶联剂反应。

所述含氨基的硅烷偶联剂不受特别限定，只要其包含氨基即可，其实例为，例如(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷或N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷等。

优选地，所述多糖可以是天然多糖，更优选地，所述多糖可以为杜仲多糖，例如，从杜仲树皮中得到的杜仲多糖。

作为一个具体的实例，可以使用具有如下结构的杜仲多糖，其中包含可与氨基脱水发生缩合反应形成酰胺键的羧基。在本文中，其被称作杜仲3号多糖，编号为EUP3。

分子量为Mw 126.5KDa

优选地，所述杜仲多糖EUP3采用以下方法制备：取杜仲树皮，粉碎，加入原料质量的5～20倍(优选10倍)去离子水进行提取，温度90～100℃，搅拌浸提3～4h，过滤分离滤渣，滤液中加入2～10倍(优选4倍)体积的无水乙醇，于4℃冰箱静置沉淀过夜，过滤；savage法除去蛋白质，透析，冻干后获得杜仲多糖粗糖；采用DEAE离子交换树脂和凝胶色谱柱对所获的杜仲多糖粗糖进行纯化，收集馏出液，冻干后获得均一的杜仲多糖EUP3。

所述生长因子为血小板衍生化生长因子。

本发明中，市场上使用的牙科金属材料都可以被用作本发明的基体。更优选地，所述基体为钛、铁、铬、镍或者它们的合金，因为其具有良好的生物相容性及适宜的硬度。本发明所述的含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体具有如下效果：将可结合生长因子的多糖覆盖到经过一定处理的基体表面，所述多糖涂层可以结合血小板衍生化生长因子，富集骨缺损区域的生长因子并保持其生理活性和功能，从而实现种植体的早期骨整合，缩短骨缺损修复时间；该发明具有制备过程成熟可控，方便实现，能够达到显著优于目前临床广泛使用的种植体的成骨效果。

附图说明

图1显示细胞培养板、空白钛片和根据本发明的实施例1制备的可结合生长因子的多糖涂层的种植体对不同细胞毒性实验结果；

图2显示对人骨髓来源间充质干细胞在空白钛片和根据本发明的实施例2制备的种植体(多糖涂层钛片)中的增殖实验结果，其中，*代表P<0.05；

图3显示空白钛片、根据实施例1制备的种植体(多糖涂层钛片)、PDGF-BB孵育结合的空白钛片和PDGF-BB孵育结合的根据本发明实施例1制备的种植体(PDGF-BB孵育结合的多糖涂层钛片)对巨噬细胞诱导极化实验结果，其中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，以及***代表P<0.001；

图4显示空白钛片、根据实施例1制备的种植体(多糖涂层钛片)、PDGF-BB孵育结合的空白钛片和PDGF-BB孵育结合的根据本发明实施例1制备的种植体(PDGF-BB孵育结合的多糖涂层钛片)对间质干细胞的细胞分化实验检测结果，其中，*代表P<0.05；

图5显示空白钛片、根据实施例1制备的种植体(多糖涂层钛片)、PDGF-BB孵育结合的空白钛片和PDGF-BB孵育结合的根据本发明实施例1制备的种植体(PDGF-BB孵育结合的多糖涂层钛片)对人成骨细胞(MC3T3-E1)钙沉积实验的检测结果；

图6显示成骨细胞在根据实施例1的种植体的表面粘附情况。

具体实施方式

下面将详细描述本发明，需要注意的是，提供如下的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，而不是限制本发明的范围。

为实现上述内容，本发明以如下的实例加以说明：首先分别通过以下三种方法进行氨基锚定，固定到钛片表面。

制备实施例1

等离子体处理法锚定氨基：利用等离子体增强化学气相沉积设备在钛片表面锚定一层纳米厚度的氨基。

首先将真空室抽至10Pa，通入氩气，在功率为100W条件下对钛片(基体)进行Ar气等离子体清洗10min；然后重新将腔体抽至10Pa，打开单体进气阀，使真空室气压达到21KPa；以纯度为99wt％丙烯胺(ALA)作为组分蒸汽使钛金属基体表面形成胺聚合物沉积层，接通电源，调整放电功率为150W、频率200kHz，初始蒸汽压力0.200mbar。处理30秒，使其在表面形成厚度约30nm的无针孔的氨基聚合物薄膜，关闭电源停止放电，继续通单体5min后，再取出样品待用。

制备实施例2

多巴胺共聚膜固定氨基：利用多巴胺对大部分材料表面的超强粘附性使其形成表面富含氨基的多巴胺-聚乙烯亚胺(PEI)共聚膜。

将超声清洗过的钛片基体浸入碱性多巴胺溶液(0.12mg/ml 10mM的Tris溶液，pH8.5)中30分钟，使多巴胺自发氧化共聚。随后向溶液中加入多巴胺与PEI的混合液，使溶液中PEI终浓度为2mg/ml，其中，多巴胺共聚损失掉的大量游离氨基由共聚膜中的PEI提供。浸泡一小时，去离子水冲洗，真空干燥待用。

制备实施例3

硅烷偶联剂锚定法：使用通用的硅烷偶联剂(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)在钛片表面形成硅烷基层。

首先，利用双氧水与浓硫酸(1:1)混合溶液于室温浸泡钛片基体40分钟，使其表面活化出羟基，用于与2％APTES的化学连接。将所得的钛片浸入2％APTES甲苯溶液中静置1小时。反应结束后用丙酮中超声清洗钛片，氮吹干，将钛片置于烘箱中110℃加热1小时后冷却待用。

实施例1至3

配制10mg/ml 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)的DMSO缓冲液使pH值控制为5.0，将过量的杜仲3号多糖充分溶解于20ml的MES溶液中，向混合液中加入200mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及200mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)搅拌1小时，使多糖上的羧基充分被活化。将此混合溶液加入到盛放氨基锚定的钛片基体的反应容器(12孔细胞培养板)中充分浸没，于室温在摇床上反应过夜。取出反应后得到的种植体，用单蒸水冲洗，干燥保存，分别得到根据实施例1至3制备的种植体。

实验实施例1

利用X射线光电子能谱(XPS)对制备实施例1至3中得到的锚定了氨基的钛片的表面进行元素分析，通过计算氮元素含量来确定锚定于表面的氨基量量，结果如表格1所示。

表1：制备实施例1至3中的不同方法处理钛片表面氨基含量

实验实施例2

利用在实施例1中制备的种植体(多糖涂层钛片)对人单核细胞(THP1，AmericanType Culture Collection,ATCC，美国)，人血管内皮细胞(HUVEC，American Type CultureCollection,ATCC，美国)和人骨髓来源间质干细胞(hMSC，中科院干细胞库)的生长影响进行实验，采用CCK-8法进行实验，培养板中提前放入空白钛片(Ti)，以及在实施例1中制备的种植体(Ti-EUP3)，与普通细胞培养板分别设置平行组，取单细胞悬液，调整细胞浓度为THP-1：1×10⁵个/ml；HUVEC：2×10⁴个/ml；hMSC：2×10⁴个/ml，以500μl/孔接种于24孔培养板中，后置入37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。24h后，CCK-8法检测，计算细胞存活率，结果如图1所示：三种细胞在培养板、空白钛片和在实施例1中制备的种植体(多糖涂层钛片)三组中存活率基本为100％。

实验实施例3

利用在实施例2中制备的种植体对人骨髓来源间充质干细胞(hMSC)进行细胞增殖实验评价；在24孔培养板内分别放入空白钛片(Ti slide)，及在实施例2中制备的种植体(多糖涂层钛片)分别设置平行组，调整细胞浓度为2×10⁴个/ml，以500μl/孔接种于24孔培养板中，后置入37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。48h后，CCK8法检测，并计算细胞增殖率，结果如图2所示：Ti-EUP3组于培养的第48小时，出现明显的细胞增殖。

实验实施例4

利用在实施例1制备的种植体对小鼠来源的骨髓巨噬细胞(mBMDM，实验室方法从C57小鼠体内提取原代细胞)进行诱导极化实验检测；在24孔培养板内分别放入空白钛片(Ti)、EUP3多糖涂层钛片(在实施例1制备的种植体)及与500ng/ml PDGF-BB生长因子溶液共孵育6h的空白钛片(PDGF-BB孵育结合的空白钛片)，和与500ng/ml PDGF-BB生长因子溶液共孵育6h的多糖涂层钛片(PDGF-BB孵育结合的多糖涂层钛片)，分别设置三组平行，将小鼠骨髓巨噬细胞(1×10⁵个/孔)接种于24孔板中，培养于RPMI-1640培养基中，置入37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时，用实时定量PCR法检测细胞极化前后修复相关细胞因子及炎症因子的水平，结果如图3所示：在转录水平，结合了PDGF-BB的多糖涂层钛片组中巨噬细胞表达的血小板衍化生长因子、血管内皮生长因子及抑瘤素M(促进成骨细胞成熟或干细胞成骨分化的直接相关蛋白)均有一定程度的增加；同时炎症相关细胞因子肿瘤坏死因子-胞的表达量相比于空白钛片组变化不大。表明结合生长因子的种植体具有很强的修复潜能，同时可避免剧烈的炎症反应。

实验实施例5

对人骨髓来源间质干细胞(hMSC)进行细胞分化实验检测；在24孔培养板内分别放入空白钛片，在实施例1中制备的种植体(多糖涂层钛片)，与500ng/ml PDGF-BB生长因子溶液共孵育6h的空白钛片(PDGF-BB孵育结合的空白钛片)，以及与500ng/ml PDGF-BB生长因子溶液共孵育6h的在实施例1中制备的种植体(PDGF-BB孵育结合的多糖涂层钛片)，分别设置平行组，将人骨髓来源间质干细胞(5×10⁴/孔)接种于24孔板中，培养于添加BMP2(50ng/ml)弱分化的条件培养基中，后置入37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，分别培养七天，十四天，实时定量PCR法检测细胞分化情况，观察碱性磷酸酶以及骨钙蛋白水平的表达，结果如图4所示：培养的第14天，成骨中期标志物——碱性磷酸酶(ALP)和骨钙蛋白(OCN)于转录水平的表达量均有明显的提升，表明其出色的成骨促进潜能。

实验实施例6

对人成骨细胞(MC3T3-E1)钙沉积实验检测；在24孔培养板内分别放入空白钛片，在实施例1中制备的种植体(多糖涂层钛片)，与500ng/ml PDGF-BB生长因子溶液共孵育6h的空白钛片(PDGF-BB孵育结合的空白钛片)，以及与500ng/ml PDGF-BB生长因子溶液共孵育6h的在实施例1中制备的种植体(PDGF-BB孵育结合的多糖涂层钛片)，分别设置平行组，将人骨髓来源间质干细胞(5×10⁴/孔)接种于24孔板中，置入37℃，5％CO₂培养箱中待细胞汇合抑制增殖后(约24h)继续培养二十一天，利用茜素红染料对钛片表面成骨细胞的钙沉积进行染色观察，结果如图5所示：相比于其它三组，结合了生长因子PDGF-BB的多糖涂层钛片表面成骨细胞在第二十一天产生了更多的钙沉积(红色更明显)。

实验实施例7

考察了人成骨细胞(MC3T3-E1，中科院上海生物化学与细胞生物学研究所)在实施例1的种植体表面的粘附生长情况；在24孔培养板内分别放入空白钛片、多糖涂层钛片(在实施例1中制备的种植体)，分别设置三组平行，将人成骨细胞(2×10⁴/孔)接种于24孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时，用F-actin(微观蛋白)、Tubulin(肌动蛋白)荧光探针对细胞骨架进行染色，用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色后，利用共聚焦显微镜观察成骨细胞在种植体表面的展开情况，结果如图6所示：成骨细胞在未处理的钛片表面及多糖涂层钛片表面均能良好的粘附，细胞骨架展开情况清晰可见。

Claims (8)

1.一种含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体，其包括：

锚定了氨基的基体；和

接枝到所述基体表面上的且具有可结合生长因子的多糖涂层，

其中，所述多糖为杜仲多糖，

其中，所述多糖涂层可以富集骨缺损区域的血小板衍生化生长因子并保持其生理活性和功能。

2.根据权利要求1所述的种植体，其中，所述基体为钛、铁、铬、镍或者它们的合金。

3.一种用于制备根据权利要求1所述的含有可结合生长因子的多糖涂层的种植体的方法，所述方法包括如下步骤：

1)在基体上锚定氨基；

2)通过酰胺反应将可结合生长因子的多糖固定在基体表面上来形成可结合生长因子的多糖涂层。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述基体为钛、铁、铬、镍或者它们的合金。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤1)通过选自如下任意一种方法实施：

a利用等离子体增强化学气相沉积设备在基体表面上锚定纳米厚度的含氨基的聚合物；

b多巴胺共聚膜固定氨基；

c硅烷偶联剂锚定法。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤1)通过选自如下任意一种方法实施：

a1)在真空环境下使用Ar气等离子体清洗，然后在等离子体增强化学气相沉积设备沉积形成丙烯胺的聚合物，厚度为5nm至50nm；

b1)将清洗过的基体浸入碱性多巴胺溶液，使多巴胺自发氧化共聚，随后，向溶液中加入多巴胺和聚乙烯亚胺的混合液，并反应；

c1)通过氧气组分进行等离子体处理基体使其表面锚定羟基，然后使基体与含氨基的硅烷偶联剂反应。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述硅烷偶联剂选自(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷和N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种或两种以上的混合物。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，通过如下方式实施步骤2)：

配制2-(N-吗啉)乙磺酸的二甲基亚砜缓冲液使pH值控制为5.0，将过量的多糖充分溶解于所制备的2-(N-吗啉)乙磺酸的二甲基亚砜缓冲液中，向所得的混合液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基丁二酰亚胺搅拌至均匀分散，使多糖上的羧基充分被活化；然后将所得的混合溶液加入到盛放氨基锚定的钛片基体的反应容器中充分浸没，于室温在摇床上反应过夜。

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