KR101240075B1

KR101240075B1 - 의료용 임플란트 및 그의 제조방법

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Publication number: KR101240075B1
Application number: KR1020110043525A
Authority: KR
Inventors: 서영권; 김성현; 박정극; 한미정; 홍국선; 정현석; 이상욱; 이종호; 방강미
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2013-03-07
Also published as: KR20120125838A

Abstract

본 발명은 임플란트 기재 및 기재의 표면에 형성되는 코팅층으로 이루어지고, 상기 기재의 표면에 형성되는 코팅층은 기재 표면으로부터 차례로 형성된 탄소층; L-dopa 층; 성장인자 층을 포함하는 것인 의료용 임플란트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 탄소코팅과 성장인자를 매개하는 L-dopa로 인해 성장인자가 효율적으로 고정화되게 되고, 이를 통해 임플란트의 생체적합성을 향상시키고 세포의 부착과 분화효율이 향상된다. 따라서, 임플란트 식립 후 임플란트와 골조직 간의 유착이 신속하고 견고하게 이루어질 수 있게 된다.

Description

의료용 임플란트 및 그의 제조방법{Medical Implant and Method for Manufacturing the Same}

본 발명은 의료용 임플란트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인체의 뼈에 식립되는 임플란트 기재 표면에 생체 친화성 및 생체 활성 특성을 최대화시키기 위한 골조직 유착 및 성장 조력 물질을 견고하고 안정적으로 코팅시킴으로써, 임플란트 식립 후 임플란트가 골조직과 신속하고 견고하게 유착될 수 있도록 한 의료용 임플란트에 관한 것이다.

금속재료가 생체용으로 사용되기 위해서는 독성이나 발암성이 없고 부작용이나 인체 거부반응이 없는 생체적합성(biocompatibility)이 우수해야 하며, 인장강도, 탄성률, 내마모성 등 기계적 성질이 양호해야 할 뿐만 아니라 인체 내에서 조성되는 부식 환경을 견딜 수 있는 강력한 내식성을 갖추어야 한다. 따라서 이러한 요건을 고려할 때, 적당한 생체용 금속재료는 스테인리스 강, 코발트계 합금, 티타늄 및 그 합금계 등이 사용되고 있다.

특히, 이 중에서도 기계적 강도 및 부식 저항성 등을 감안하여 임플란트의 재료로 티타늄이 널리 사용되고 있는데, 티타늄은 임플란트로 가공되는 과정에서 표면이 공기 중에 노출되면 산소와 반응하여 수천분의 일초 내에 수나노미터 두께의 티타늄 산화막이 형성된다. 그러나 이러한 산화막은 두께가 얇고 가끔씩 파괴되는 경향이 있어서 표면 강도 및 마모 저항성이 감소되고 내식성 또한 영향을 받아 결국 생체재료로서의 기능을 상실하는 경우가 발생하기도 한다.

따라서 최근에는 이러한 문제점을 개선하기 위해 임플란트 재료의 표면을 개질처리 하여 내식성 및 내마모성이 우수할 뿐만 아니라 동시에 생체안정성을 개선할 수 있는 기술들이 개발 중에 있으며, 나아가 생체기능을 가지고 있는 박막 합성기술, 생체적합성 증진을 위한 표면처리기술 및 생체적합한 조직공학용 지지체의 개발에 대한 연구도 활발히 진행 중에 있다. 이 중에서도 특히 생체 적합한 임플란트의 제공을 위해 임플란트의 표면을 개질하는 방법에 대한 기술들이 높은 관심을 받고 있다.

이미 여러 세계적인 논문에서 이미 밝혀진 바와 같이 재조합 골형성 촉진 단백질(recombinant human bone morphogenic proteins, BMPs)은 주변과 멀리 떨어진 부위에 있는 성체 미분화 세포(adult stem cell)를 화학 주성으로 이식부위로 이동시켜 골아 세포로 분화되도록 함으로써 골형성을 촉진시키는 기능을 한다. 이와 같이 재조합 골형성 촉진 단백질(BMPs)을 이용한 의료 시술의 적용 방법은 매우 다양하게 적용되고 있으며, 그 중 한 분야로써 임플란트의 시술방법에도 적용되고 있다. 본 발명은 이와 같은 재조합 골형성 촉진 단백질(BMPs)을 임플란트 표면에 코팅하는 방법을 개발함으로써 시술부위 주변의 성체 미분화세포를 빠르게 골세포로 분화되도록 하여 골유도성 치유가 일어나도록 하여 치유기간을 단축시키고자 하는 것이다.

한편 임플란트의 표면에 성장-촉진 특성을 포함시킨 특허로서, 대한민국 공개특허공보 제2005-58452호(2005. 6. 15 공개)에 골조직 또는 골대체재로 보충된 골조직 내에 이식하기 위한 임플란트가 알려져 있다. 상기 특허의 경우에는 골조직과 접촉되거나 또는, 골조직 옆의 주위에서 성장하거나 또는 골조직과 상호 성장하는 임플란트의 표면은 제 1 유형의 영역과 상기 제 1 유형의 표면 영역과 상이한 제 2 유형의 영역을 포함하고 있으며, 상기 제 1 유형의 표면 영역은 골-통합, 염증-억제, 감염-치료, 성장-촉진 효과들을 갖는 화합물들이 골조직의 내성장에 적합한 구조를 가지도록 형성된 것으로, 상기 제 1 유형의 표면 영역은, 예를 들면, 생물학적으로 양립가능한 표면(예컨대, 티타늄으로 제조됨)이며, 이것들은 골조직의 내성장에 적합한 구조를 가지도록 형성될 수 있다. 이러한 표면들은 또한 칼슘 포스페이트를 포함하는 재료로 추가적으로 코팅될 수 있고, 이것들은, 예를 들면, 포스페이트 또는 펩티드 서열에 의해 변성될 수 있고 및/또는 이것들은, 예를 들면, 성장 인자를 포함하는 겔 또는 폴리머를 포함할 수 있는 것으로 되어 있기 때문에 임플란트의 표면에 성장-촉진인자를 도포하기 위해서는 전처리로서 임플란트의 표면에 상기 성장-촉진인자를 고정시키기 위한 칼슘 포스페이트를 포함하는 재료나 또는 성장-촉진 인자를 포함하는 겔 또는 폴리머와 같은 고정체를 반드시 이용하여 코팅하여야 하고, 성장-촉진인자의 고정률이 낮다는 문제점이 있었다.

따라서 본 발명은 성장인자의 고정률을 높게 유지하며, 생체적합성이 향상되어 임플란트 식립 후 골조직과의 유착이 촉진될 수 있는 의료용 임플란트를 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 임플란트 기재 및 기재의 표면에 형성되는 코팅층으로 이루어지고, 상기 기재의 표면에 형성되는 코팅층은 기재 표면으로부터 차례로 형성된 탄소층; L-dopa 층; 성장인자 층을 포함하는 것인 의료용 임플란트를 제공한다.

또한 본 발명은 임플란트 기재 표면에 탄소층을 코팅하는 단계;

코팅된 탄소층 표면에 L-dopa를 고정화하는 단계; 및

L-dopa의 아민기에 성장인자를 공유결합시키는 단계를 포함하는 의료용 임플란트의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 탄소코팅과 성장인자를 매개하는 L-dopa로 인해 성장인자가 효율적으로 고정화되게 되고, 이를 통해 임플란트의 생체적합성을 향상시키고 세포의 부착과 분화효율이 향상된다. 따라서, 임플란트 식립 후 임플란트와 골조직 간의 유착이 신속하고 견고하게 이루어질 수 있게 된다.

도 1은 산에칭 처리한 티타늄(좌)과 탄소층 형성된 티타늄(우) 디스크의 외형사진이다.
도 2는 시험예 1의 탄소층 형성된 임플란트 표면의 원자현미경 측정 사진이다. 순수 티타늄표면(A, B), 산에칭만을 실시한 티타늄 표면(C, D), 탄소코팅된 군 (E, F).
도 3은 시험예 1의 탄소층 형성된 임플란트 표면의 전자현미경 사진(5000배)이다.
도 4는 탄소코팅된 표면의 L-dopa 고정화 효율 분석 그래프이다.
도 5는 탄소코팅된 표면의 BMP 고정화 효율 분석 그래프이다.
도 6은 좌측부터 차례로 대조군 임플란트; 탄소코팅층만 보유하는 임플란트; 및 본 발명인 탄소 코팅층; L-dopa 층 성장인자(BMP)층이 차례로 코팅된 임플란트; 의 외형사진이다.
도 7은 시험예 3의 대조군 임플란트 및 탄소코팅층만 보유하는 임플란트에 대한 실험 결과 사진이다 (a: 대조군 임플란트, b: 탄소코팅층만 보유하는 임플란트).
도 8은 시험예 3의 탄소코팅층만 보유하는 임플란트 및 본 발명인 탄소 코팅층; L-dopa 층 성장인자(BMP)층이 차례로 코팅된 임플란트에 대한 실험 결과 사진이다 (a: 탄소코팅층만 보유하는 임플란트, b: 본 발명 임플란트).

본 발명은 임플란트 기재 및 기재의 표면에 형성되는 코팅층으로 이루어지고, 상기 기재의 표면에 형성되는 코팅층은 기재 표면으로부터 차례로 형성된 탄소층; L-dopa 층; 성장인자 층을 포함하는 것인 의료용 임플란트를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 임플란트 표면에의 성장인자의 안정적인 고정 방법에 대한 연구를 계속하던 중, 신생골형성 면적을 향상시키는 탄소층 위에 L-dopa 층을 고정하고, 이에 성장인자를 공유결합시키면 골-임플란트 접촉률이 향상되며 생체적합성도 높게 유지되어 면역 반응이 최소화되며 임플란트와 골조직 간의 유착이 신속하고 견고하게 이루어질 수 있게 된다는 점을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 “의료용 임플란트”란 인체의 조직이 상실되었을 때 이를 회복시켜 주는 대체물을 포함하는 것으로서, 의학적 이상을 예방 또는 치료하기 위하여 일시적 또는 영구적으로 포유 동물에 도입되는 의료용 장치 또는 기구들도 모두 포함될 수 있다. 또한, 상기 임플란트에는 피하, 경피 또는 외과적으로 도입되어 동맥, 정맥, 심실 및 심방과 같은 장기, 장기의 조직 또는 내강 내에 남겨지는 임의의 것들도 모두 포함될 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 의료용 임플란트는 치과용 임플란트 또는 정형외과용 임플란트 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 임플란트 기재는 티타늄, 티타늄 합금, 코발트 합금, 스테인리스 스틸, 니티놀, 플래티늄, 이리듐, 나오븀, 탄탈륨, 금, 은, UHMWPE(Ultra High Molecular Weight Polyethylene), PEEK(poly ether ether ketone), 폴리우레탄, 실리콘 엘라스토머, 생체흡수형 폴리머, 산화알루미늄, 지르코늄, 생리적 활성 유리섬유, 실리콘 질소화합물, 칼슘 인산염 및 카본으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 생체흡수형 폴리머는 고분자 분열에 의해 생리학적 환경에서 분해되는 생체 적합성이 우수한 폴리머로서, 이의 구체적인 예로는 폴리락틱산(poly lactic acid; PLA), 폴리글리콜산(poly glycolic acid; PGA) 및 폴리카플로락톤(poly capro lactone), 폴리메틸메타아크릴레이트(poly methyl metha acrylate) 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 성장인자는 L-dopa의 아민기에 공유결합 될 수 있으며, 이러한 결합은 가교시약을 통해 이루어질 수 있다. L-dopa는 L-3,4-dihydroxyphenylalanine으로, 하나의 아민기를 가진다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 성장인자는 골형성유도단백질, 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 상피세포 성장인자(EGF)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서 사용하는 골형성유도단백질인 BMP-2는 골아세포에서 만들어져 세포외 기질로 방출되어 자신과 주변의 세포를 자극하여 뼈형성을 촉진시킨다. 동물실험에서 BMP-2를 정제하여 골이 아닌 부분에 이식하였을 때 그 주위의 세포를 골화되도록 자극하여 이식된 부분에 새로운 골조직이 형성되는 것을 볼 수 있다. BMP는 감수성이 있는 세포의 세포막에 있는 BMP 수용체와 결합하여 세포외에서 자극하여 세포내로 신호를 전달하는 시스템으로 활동한다. 여러 가지 연구를 통하여 BMP-2는 세포를 성장시키는 특성보다는 골세포로 분화시키는 능력이 주를 이룬다.

세포에서의 BMP-2의 작용기전을 간단하게 살펴보면 다음과 같다. BMP가 세포막에 있는 BMP수용체(BMPR-II, BMPRI) 단백질과 결합하면 세포질에 있는 신호단백질인 Smad1, Smad5와 Smad8이 인산화 되어 Smad4와 복합체를 형성한다. 이 복합체는 핵 내로 이동하여 RunX2와 같은 전사조절인자와 결합한다. 이렇게 활성화 된 전사조절인자는 골 형성에 관계된 여러 가지 유전자들을 활성화 시켜 골 형성을 시작한다. BMP-2의 골 유도능에 대해서는 이미 전임상적 모델에서 증명되어졌고 임상적 시도에서 평가되었다. 그리고 조건에 따라서는 골 융합에 있어서 BMP-2의 효과가 골 자가이식(Autogenous bone graft)보다 월등함을 보여주기도 한다.

본 발명에서 적용하는 재조합 골형성 촉진 단백질(Bone morphogenetic protein)인 BMP-2를 이용한 임플란트의 치유과정에서 rhBMP-2(recombinant human bone morphogenic protein-2)의 작용을 살펴보면, 임플란트 수술로 인한 손상으로 출혈 후 치유되는 과정 중에서 미분화세포가 골아세포로 분화되고 골세포들이 모여서 골을 형성하는 과정이 rhBMP-2의 작용을 직접적으로 받게 된다.

또한 본 발명은 임플란트 기재 표면에 탄소층을 코팅하는 단계; 코팅된 탄소층 표면에 L-dopa를 고정화하는 단계; 및 L-dopa의 아민기에 성장인자를 공유결합시키는 단계를 포함하는 의료용 임플란트의 제조방법을 제공한다.

이하 각 단계의 구체적인 내용은 다음과 같다.

임플란트 기재 표면에 탄소층을 코팅하는 단계에서의 탄소층 코팅은 탄소막대가 삽입된 스퍼터링 방식 또는 플라즈마처리를 통한 화학기상증착법을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 탄소막대가 삽입된 스퍼터링 방식으로 탄소를 코팅할 때에는, 진공 1*10^-6mbar 에서 10 내지 30A로 10 내지 60초 또는 15 내지 30초 수행하는 것이 좋다.

또한, 플라즈마 처리를 통한 화학기상증착법을 실시하는 경우에는, 탄소함유가스(메탄, 에틸렌, 아세틸렌 등)을 이용하여 100mTorr에서 50 내지 200W 또는 75 내지 150W 으로 1 내지 10분간 또는 3 내지 7분간 실시하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

탄소 코팅 후에는, 3차 증류수로 초음파세척기를 통해 5 내지 30분간 세척할 수 있다.

코팅된 탄소층 표면에 L-dopa를 고정화하는 단계에서의 L-dopa의 고정화는, 빛이 차단된 상태에서 1 내지 10mg/ml 또는 1 내지 5 mg/ml의 L-dopa에 상기 탄소층 코팅 단계를 거친 임플란트를 침지시켜 실온에서 1 내지 10시간, 2 내지 6시간 교반하는 단계를 통해 이루어 질 수 있다. 그 후, 3차 증류수로 2 내지 5회 세척하여, 미부착된 L-dopa를 제거한 후 진공오븐에서 수분을 모두 건조시키는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같이 고정화된 L-dopa의 아민기에 성장인자를 공유결합시키는 단계의 공유결합은 성장인자와 가교시약의 혼합액을 L-dopa와 반응시키는 방법을 통해 형성될 수 있으며, 이때 상기 가교시약은 상기 가교시약은 디페닐포스포릴아자이드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드, 카보디이미드, 글루타르알데하이드, 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide), 포도종자추출물(grape seed extract; GSE) 및 Genipin 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 상기 성장인자로는 골형성유도단백질, 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 상피세포 성장인자(EGF)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 사용될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 골융합을 촉진시키는 골형성유도단백질이 사용될 수 있으며, 이 중 BMP-2, BMP-4 또는 BMP-12를 사용할 수 있고, 바람직하게는 BMP-2를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 성장인자는 0.1 내지 10μg/ml의 농도로 생리식염 인산 완충액(PBS)에 희석되어 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 성장인자 용액과 상기 가교시약을 1:1 내지 1:1.5로 10분 내지 1시간동안 혼합하여 혼합액을 제조한 후, 이를 탄소층 위에 고정된 L-dopa 위에 적정할 수 있다. 이때 반응은 4℃ 내지 상온에서 12시간 내지 48시간, 또는 20 내지 30시간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 후 3차 증류수로 3 내지 5회 세척하여 고정되지 않은 잔존하는 성장인자 및 가교시약을 제거한 후 실온, 냉장 또는 진공오븐에서 건조하여 체내 또는 세포 배양시에 잔존하는 가교시약으로 인해 발생할 수 있는 염증반응의 가능성을 배제시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 스퍼터링 방법에 의한 탄소 코팅

티타늄(grade 4)으로 이루어진 임플란트 기재 표면의 탄소코팅을 위하여 탄소코팅장비(Polaron, 영국)를 이용하여 티타늄 표면에 탄소코팅을 실시하였다.

티타늄으로 이루어진 임플란트 기재(지름이 14 mm인 디스크 타입과 식립와 형태)에 산에칭을 5분간 실시한 뒤 이를 세척 후 이용하였으며, 탄소막대가 삽입된 스퍼터링방식으로 이용하여 진공 1 × 10^-6 mbar에서 20A에서 20초간 실시하였고, 3차 증류수로 초음파세척기를 통해 10분간 세척한 후 진공오븐에서 건조한 뒤 사용전까지 진공보관하였다.

< 실시예 2> 메탄가스와 플라즈마를 이용한 탄소층 형성

티타늄(grade 4)으로 이루어진 임플란트 기재 표면에 탄소층을 형성하기 위하여 플라즈마장비(올포시스템, 한국)를 이용하여 티타늄 표면에 탄소코팅을 실시하였다.

티타늄으로 이루어진 임플란트 기재(지름이 14 mm 디스크 타입과 식립와 형태)에 산에칭을 5분간 실시한 뒤 이를 세척 후 이용하였으며, 메탄가스를 주입하고 플라즈마기기를 이용하여 진공 100mTorr, 100W에서 5분간 실시하였고, 3차 증류수로 초음파세척기를 통해 10분간 세척한 후 진공오븐에서 건조한 뒤 사용전까지 진공보관하였다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 탄소층 형성군(우)은 산 에칭만 이루어진 대조군(좌)에 비해 흑갈색의 색을 띄고 있음을 확인할 수 있었다.

< 시험예 1> 탄소층 형성된 임플란트 표면의 특성 분석

탄소 코팅된 표면의 특성을 알아보기 위하여 표면의 원자현미경(AFM) 분석 및 전자현미경분석을 실시하였다. 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2에서 나타낸 바와 같이, 원자현미경(Neos, Brukernano, 독일)을 이용하여 1μm × 1μm의 스케일로 분석한 결과, 각각의 표면은 탄소코팅을 실시함으로써 약 200 nm의 탄소가 관찰되었고(E, F), 순수 티타늄표면(A, B) 및 산에칭만을 실시한 티타늄 표면(C, D) 보다는 거칠기가 7.95 nm에서 19.25 nm로 증가하였음을 확인하였다.

도 3에서 나타낸 바와 같이, 전자현미경으로 5000배 확대 분석결과, 표면에 탄소층(우)이 형성되어 있는 것을 관찰할 수 있으며, DEX측정결과 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 탄소의 양이 2.34%에서 3.58%로 향상되었는 바, 티타늄 표면에 탄소층이 형성되어 있음을 알 수 있었다.

	Ti(비교군, 순수 티타늄)		Ti +C(실시예, 탄소층 형성)
Element	Weight%	Atomic%	Weight%	Atomic%
C	0.59	2.34	0.92	3.58
O	-0.58	-1.73	-0.26	-0.75
P	0.03	0.05	0.02	0.03
Ar	0.01	0.01	0.01	0.01
Ca	0.00	0.00	0.00	0.00
Ti	99.95	99.33	99.31	97.12
Total	100.00		100.00

< 실시예 3> 탄소층 상에 L- dopa 고정 및 이에 성장인자 층 코팅

단백질고정을 위해 먼저 L-dopa를 2 mg/ml 농도로 준비한 뒤 이에 실시예 1 및 2를 통해 제조된 표면에 탄소층이 형성된 티타늄 임플란트를 4시간동안 침지시켰다. 그 후 10분간 3차 증류수로 세척한 뒤 건조하여 보관하였다.

성장인자 코팅을 위해 골형성유도단백질을 1 μg/ml의 농도로 생리식염 인산 완충액(PBS)에 희석하여 준비한 뒤, 상기 용액을 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드 가교시약과 1 : 1로 5분 동안 혼합하였다. 상기 혼합액을 L-dopa가 고정된 표면위에 30ul를 각각 적정하여 실온에서 24시간 동안 수행하였다. 10μl의 혼합액 안에는 5ng의 골형성유도단백질이 함유되어 있다. 그 후, 3차 증류수로 5회 세척하여 고정되지 않은 잔존하는 골형성유도단백질을 모두 제거하였고, 실온에서 남은 습기를 완전히 건조시켰다.

< 시험예 2> 임플란트 표면의 아민기와 골형성유도단백질의 정량분석

아민기의 정량분석은 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS)를 이용한 방법으로, 지름이 8mm인 티타늄 디스크들(표면에 에칭만 이루어진 티타늄 디스크; 에칭 후 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크; 및 에칭 후 탄소 코팅층 형성 후 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크)을 3% 소듐 보레이트에 0.1%로 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산을 희석시킨 용액에 완전히 담지시킨 후, 70℃로 5분간 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 3차 증류수로 3회 세척하고 1N NaOH 용액에 완전히 담지시켜 70℃로 10분간 가수분해를 실시하였다. 이 과정에서 아민기에 의해 형성된 트리니트로페닐기가 용출되어 정량에 따른 노란색이 발현되었으며, 색이 발현된 1N NaOH 용액을 410nm로 흡광도를 측정하였다. 스탠다드 곡선은 엘-도파(Sigma Aldrich Chemical, 미국)를 3% 소듐 보레이트에 0.1%로 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산을 희석시킨 용액에 직접 용해시켜 1N NaOH 용액에 가수분해를 실시하여 만들어졌다. 결과 그래프를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 아민기가 에칭 후 바로 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크의 경우보다 에칭 후 탄소 코팅층 형성 후 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크에서 더 많이 존재하는 것을 알 수 있었다. 따라서 L-dopa의 고정화는 탄소층을 매개로 한 경우 더 잘 일어나는 것을 알 수 있었다.

골형성유도단백질의 정량분석은 ‘Human BMP-2 Super X-ELISA’ 키트(Antigenix, 미국)를 이용한 방법으로, 지름이 8mm인 티타늄 디스크들(표면에 에칭만 이루어진 티타늄 디스크; 에칭 후 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크; 에칭 후 L-dopa 코팅 후 BMP가 코팅된 디스크; 에칭 후 탄소 코팅층 형성 후 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크; 및 본 발명인 에칭 후 탄소 코팅층; L-dopa 층 성장인자(BMP)층이 차례로 코팅된 티타늄 디스크)을 48웰 플레이트에 넣고 0.1mg/ml의 소 혈청 알부민(BSA)을 1ml씩 부어 완전히 담지시킨 후, 실온에서 2시간 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 세척 용액으로 4회 세척하였다. 세척이 끝나고, 키트 안에 내재되어 있는 0.5μg/ml의 트레이서 안티바디(biotin-Labeled tracer)를 각각의 티타늄 표면 위에 20μl씩 적정한 후, 2시간 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 실온에서 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 세척 용액으로 다시 4회 세척하였다. 세척이 끝나고, 키트 안에 내제되어 있는 컨쥬게이트 용액(streptavidin-HRP)을 0.1% 소 혈청 알부민에 0.05%의 트윈-20(Uniqema, 미국)을 희석시킨 용액과 1:500으로 희석시켜, 각각의 티타늄 표면 위에 20μl씩 적정한 후, 30분 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 실온에서 인큐베이션을 시켰다. 그 다음, 키트 안에 내재되어 있는 세척 용액으로 다시 4회 세척하여, 다른 48웰 플레이트에 티타늄 코팅 표면을 바닥으로 향하게 하여 옮겼다. 키트 안에 내재되어 있는 티엠비 서브스트레이트 용액 에이와 티엠비 서브스트레이트 용액 비를 1:1로 혼합하여 웰당 100μl씩 넣어 주었으며, 30분 동안 빛으로부터 차단한 상태에서 실온에서 인큐베이션을 시켰다. 인큐베이션이 끝난 후, 스톱 솔루션(2N sulfuric acid)을 웰당 100μl씩 넣어 발색을 중지시키고 450nm로 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, BMP가 에칭 후 탄소코팅층 없이 바로 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크에 코팅된 경우보다 에칭 후 탄소 코팅층 형성 후 L-dopa가 코팅된 티타늄 디스크에 코팅된 경우에 더 많이 존재하는 것을 알 수 있었다. 따라서 L-dopa에 BMP의 고정화는 L-dopa가 탄소층 위에 존재하는 경우 더 잘 일어나는 것을 알 수 있었다.

< 시험예 3> 임플란트의 신생골 형성능 평가

탄소코팅된 임플란트의 식립후 골융합 효능을 평가하기 위하여 평균체중 3.0kg의 성숙한 웅성가토를 사용하여 좌우측 경골 근심단에 각각 두 개의 임플란트를 식립하였으며, 실험동물군간의 차이를 줄이기 위해 좌우측에는 에칭만 이루어진 임플란트를 이식한 뒤 4주후 평가를 실시하였다 (n = 6).

1 mg/kg Zoletil^?(VirbacSA, Carroscedex, France)과 럼푼(23 mg/ml, Bayer Korea Ltd., Seoul,Korea)을 1 : 1비율로 혼합한 뒤 2 ml을 근육주사하여 전신마취를 유지시킨 뒤 양측 경골근심돌기부를 리도카인으로 국소마취하고 경골단을 노출시켰다. 경골결절에 평행되는 부위와 10mm 떨어진 곳에 각각 Lance Drill로 표기하고 직경 2.0 mm twist drill->2.8 twist drill 의 순서에 따라(각 임플란트의 가이드라인 따름) 800 rpm으로 충분한 생리식염수 냉각하에 임플란트 식립 홀을 형성한 뒤 15 NCm의 식립토크로 모든 임플란트를 식립하고 덮개나사를 덮었다. 수술후 4주에 가토를 CO₂ 가스로 질식시킨 뒤 임플란트를 주위골과 함께 채취한 뒤 경골상부에 식립된 임플란트를 10μm두께의 비탈회 절편을 제작하고 H&E 염색하여 나사선 내의 신생골면적(Bone Area inside the thread; BA)를 측정하였다.

도 6은 좌측부터 차례로 대조군 임플란트; 탄소코팅층만 보유하는 임플란트; 및 본 발명인 탄소 코팅층; L-dopa 층 성장인자(BMP)층이 차례로 코팅된 임플란트; 의 외형사진이다. 탄소코팅후 회색에서 흑갈색으로 표면색이 변화된 것을 관찰할 수 있다.

도 7은 비탈회 연마표본으로 가토 경골에 식립한 4주 후의 결과로서 우측 2개의 그림은 측정 이미지이다. 임플란트 thread를 따라 형성된 신생골(붉은색)이 관찰되고 있으며, BIC와 신생골 형성능은 임플란트 나사산과 골이 접촉한 최초 3개의 thread에서 측정하였다. 측정결과 대조군 임플란트(도 7a)에서는 신생골면적이 38.01 ± 17.68%이며 탄소코팅층만 형성된 임플란트(도 7b)에서의 신생골면적은 66.5 ± 10.09%로서 비교군보다 약 2배 많은 신생골면적이 측정되었다. 따라서 탄소코팅층만 보유하는 임플란트도 대조군 임플란트에 비해 골형성능을 향상시킴을 알 수 있었다.

도 8은 탄소코팅층만 보유하는 임플란트 및 본 발명인 탄소 코팅층; L-dopa 층 성장인자(BMP-2)층이 차례로 코팅된 임플란트를 가토 경골에 식립하고 4주 후 마이크로 CT로 촬영하여 삼차원으로 재구성한 영상으로, 탄소코팅층만 형성된 임플란트(도 8a)는 약 30%의 골접촐률이 측정되었고, 본 발명의 탄소 코팅층; L-dopa 층 성장인자(BMP-2)층이 차례로 코팅된 의료용 임플란트(도 8b)는 약 56%의 골접촉률이 측정되었다. 이로써 본 발명의 의료용 임플란트는 골접촉률(BIC)을 향상시키는 효과가 있음을 보여주었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

임플란트 기재 및 기재의 표면에 형성되는 코팅층으로 이루어지고, 상기 기재의 표면에 형성되는 코팅층은 기재 표면으로부터 차례로 형성된 탄소층; L-dopa 층; 성장인자 층을 포함하는 것인 의료용 임플란트.
제1항에 있어서,
임플란트 기재는 티타늄, 티타늄 합금, 코발트 합금, 스테인리스 스틸, 니티놀, 플래티늄, 이리듐, 나오븀, 탄탈륨, 금, 은, UHMWPE(Ultra High Molecular Weight Polyethylene), PEEK(poly ether ether ketone), 폴리우레탄, 실리콘 엘라스토머, 생체흡수형 폴리머, 산화알루미늄, 지르코늄, 생리적 활성 유리섬유, 실리콘 질소화합물, 칼슘 인산염 및 카본으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것인 의료용 임플란트.
제2항에 있어서,
상기 생체흡수형 폴리머는 폴리락틱산(poly lactic acid; PLA), 폴리글리콜산(poly glycolic acid; PGA), 폴리카플로락톤(poly capro lactone) 및 폴리메틸메타아크릴레이트(poly methyl metha acrylate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 의료용 임플란트.
제1항에 있어서,
상기 성장인자는 L-dopa의 아민기에 공유결합 되는 것인 의료용 임플란트.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 성장인자는 골형성유도단백질, 섬유모세포 성장인자(bFGF) 및 상피세포 성장인자(EGF)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 의료용 임플란트.
임플란트 기재 표면에 탄소층을 코팅하는 단계;
코팅된 탄소층 표면에 L-dopa를 고정화하는 단계; 및
L-dopa의 아민기에 성장인자를 공유결합시키는 단계를 포함하는 의료용 임플란트의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 탄소층을 코팅하는 단계는 탄소막대가 삽입된 스퍼터링 방식 또는 플라즈마처리를 통한 화학기상증착법을 통해 수행되는 것인 의료용 임플란트의 제조방법.
제6항에 있어서,
L-dopa의 아민기에 성장인자를 공유결합시키는 단계는,
성장인자와 가교시약의 혼합액을 L-dopa와 반응시키는 단계를 포함하는 것인 의료용 임플란트의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 가교시약은 디페닐포스포릴아자이드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드, 카보디이미드, 글루타르알데하이드, 에틸디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide), 포도종자추출물(grape seed extract; GSE) 및 Genipin 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 의료용 임플란트의 제조방법.