CN111304195A - 一种低背景线性副产物的环形rna过表达框架及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，通过在环形RNA过表达框架中加入shRNA‑NC靶标序列和U6‑shRNA‑NC序列，使环形RNA高效准确剪切成环不受影响，并降解未成环的上下游框架序列（线性副产物pre‑mRNA）使其丰度降低2‑5个数量级，即在环形RNA高效准确过表达的前提下保持无或极低的背景副产物，从而避免线性副产物pre‑mRNA可能对circRNA行使功能造成的干扰或影响，使实验设置更严谨，结果更可靠，为环形RNA的功能研究提供一种更有优势的技术方法。

Description

一种低背景线性副产物的环形RNA过表达框架及其构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种低背景线性副产物的环形RNA过表达框架及其构建方法。

背景技术

环形RNA（circular RNAs, circRNAs）是一类具有闭合环状结构的RNA分子，在多物种中广泛存在，比线性RNA更稳定。circRNAs的形成需要侧翼内含子中的反向互补序列（reverse complementary matches, RCMs）。有分析表明外显子来源的circRNAs侧翼内含子中含有Alu重复元件，侧翼序列越长，含有Alu重复元件的频率越高，且在Alu重复元件反向互补时明显形成circRNAs（Jeck WR et al., 2013），表明Alu重复元件可以促进外显子反向成环。

对于circRNAs的瞬时过表达，现有技术中常使用含有上下游反向互补序列（如Alu元件）的质粒为载体，插入circRNA的序列，将质粒转染细胞后由质粒携带的启动子启动转录pre-mRNA，再经反向互补配对后剪切加工，使插入序列首尾相接成环，从而实现对特定circRNA的表达。利用该质粒包装慢病毒或AAV后感染细胞系或动物体，可以实现在体内对特定circRNA的稳定过表达。但以质粒为载体表达circRNAs时需要经过转录pre-mRNA、反向互补配对和剪切成环多个环节，虽然目的circRNA能成功剪切成环，但同时积累了大量的线性副产物pre-mRNA，且该副产物含有和circRNA相同的一段序列，因此极容易干扰或影响circRNA本身的功能，导致实验结论存疑。

另外也有利用体外转录和T4 RNA ligase连接得到circRNAs，可以排除质粒来源的背景副产物。但转录引入的多余RNA序列无法去除，得不到序列准确的circRNAs，且RNA的制备与纯化难度大，转染难度大效率低，同时不能用于稳定细胞系或动物体内实验，因此使用场景有限。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中表达环形RNA所存在的背景副产物过高、稳定性差、功能研究存疑的问题，研究出一种能应用于稳定细胞系或动物体内实验、显著降低甚至消除背景线性副产物的环形RNA表达技术。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了一种低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，包括环形RNA骨架、一个或多个环化辅助序列、一个或多个剪切介导序列、一个或多个shRNA-NC靶标序列、一个或多个U6-shRNA-NC序列。

作为优选地，所述环形RNA骨架包括一个或多个环形RNA序列、一个或多个框架序列、一个或多个剪切受体序列、一个或多个剪切供体序列、一个或多个酶切位点。

作为优选地，所述酶切位点选自BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI、ApaI、BglII、KpnI、NcoI、NotI、XbaI中的一种或多种。

作为优选地，所述酶切位点为BamHI和EcoRI双酶切位点。

作为优选地，所述环形RNA骨架包括上游框架序列和下游框架序列，在所述上游框架序列和下游框架序列中分别插入有一个shRNA-NC靶标序列。

作为优选地，所述U6-shRNA-NC序列插入于低背景线性副产物的环形RNA过表达框架的末尾。

作为优选地，所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架具有1029nt，其中1-200nt为上游框架序列（Frame1），201-219nt为上游shRNA-NC靶标序列，220-245nt为上游环化辅助序列（CS1），246-251nt为EcoRI内切酶位点序列，252-269nt为上游剪切介导序列（5’IS），270-271nt为剪切受体AG序列，272-431nt为circRNA序列，432-433nt为剪切供体GT序列，434-451nt为下游剪切介导序列（3’ IS），452-457为BamHI内切酶位点序列，458-476nt为下游环化辅助序列（CS2），477-701nt为下游框架序列（Frame2），702-720nt为下游shRNA-NC靶标序列，721-1029nt为U6-shRNA-NC序列。

作为优选地，所述上游剪切介导序列（5’IS）和下游剪切介导序列（3’IS）的核苷酸序列选自IS-L18、IS-S10和IS-Y10中的一种，其中IS-L18、IS-S10和IS-Y10的序列分别如下：

IS-L18：

上游剪切介导序列：5’-TGAAATATGCTATCTTAC-3’

下游剪切介导序列：5’-TCAAGAAAAAATATATTC-3’；

IS-S10：

上游剪切介导序列：5’-ATCTTACTTC-3’

下游剪切介导序列：5’-ATAAGTTCAT-3’；

IS-Y10：

上游剪切介导序列：5’-TAATACTTTC-3’

下游剪切介导序列：5’-AGTTGTTCTT-3’。

作为优选地，所述上游剪切介导序列（5’IS）和下游剪切介导序列（3’IS）的核苷酸序列选自IS-L18。

作为优选地，所述上游环化辅助序列（CS1）如SEQ ID NO:1所示；所述下游环化辅助序列（CS2）如SEQ ID NO:2所示。

作为优选地，所述上游shRNA-NC靶标序列和下游shRNA-NC靶标序列如SEQ ID NO:3所示。

作为优选地，所述U6-shRNA-NC序列如SEQ ID NO:4所示。

作为优选地，所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明第二方面提供了一种低背景线性副产物的环形RNA过表达框架的构建方法，包括如下步骤：

（1）在环形RNA骨架上添加一个或多个环化辅助序列和一个或多个剪切介导序列；

（2）再插入一个或多个shRNA-NC靶标序列和一个或多个U6-shRNA-NC序列。

作为优选地，所述环形RNA骨架包括一个或多个环形RNA序列、一个或多个框架序列、一个或多个剪切受体序列、一个或多个剪切供体序列、一个或多个酶切位点。

作为优选地，所述酶切位点选自BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI、ApaI、BglII、KpnI、NcoI、NotI、XbaI中的一种或多种。

作为优选地，所述酶切位点为BamHI和EcoRI双酶切位点。

作为优选地，所述环形RNA骨架包括上游框架序列和下游框架序列，在所述上游框架序列和下游框架序列中分别插入有一个shRNA-NC靶标序列。

作为优选地，所述U6-shRNA-NC序列插入于低背景线性副产物的环形RNA过表达框架的末尾。

作为优选地，所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架具有1029nt，其中1-200nt为上游框架序列（Frame1），201-219nt为上游shRNA-NC靶标序列，220-245nt为上游环化辅助序列（CS1），246-251nt为EcoRI内切酶位点序列，252-269nt为上游剪切介导序列（5’IS），270-271nt为剪切受体AG序列，272-431nt为circRNA序列，432-433nt为剪切供体GT序列，434-451nt为下游剪切介导序列（3’ IS），452-457为BamHI内切酶位点序列，458-476nt为下游环化辅助序列（CS2），477-701nt为下游框架序列（Frame2），702-720nt为下游shRNA-NC靶标序列，721-1029nt为U6-shRNA-NC序列。

作为优选地，所述上游剪切介导序列（5’IS）和下游剪切介导序列（3’IS）的核苷酸序列选自IS-L18、IS-S10和IS-Y10中的一种，其中IS-L18、IS-S10和IS-Y10的序列分别如下：

IS-L18：

上游剪切介导序列：5’-TGAAATATGCTATCTTAC-3’

下游剪切介导序列：5’-TCAAGAAAAAATATATTC-3’；

IS-S10：

上游剪切介导序列：5’-ATCTTACTTC-3’

下游剪切介导序列：5’-ATAAGTTCAT-3’；

IS-Y10：

上游剪切介导序列：5’-TAATACTTTC-3’

下游剪切介导序列：5’-AGTTGTTCTT-3’。

作为优选地，所述上游剪切介导序列（5’IS）和下游剪切介导序列（3’IS）的核苷酸序列选自IS-L18。

作为优选地，所述上游环化辅助序列（CS1）如SEQ ID NO:1所示；所述下游环化辅助序列（CS2）如SEQ ID NO:2所示。

作为优选地，所述上游shRNA-NC靶标序列和下游shRNA-NC靶标序列如SEQ ID NO:3所示。

作为优选地，所述U6-shRNA-NC序列如SEQ ID NO:4所示。

作为优选地，所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明第三方面提供了一种由所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架构建的载体。

作为优选地，所述载体利用选自瞬时真核表达、慢病毒、AAV载体骨架中的一种或多种构建得到。

本发明使用现有技术中的环形RNA过表达框架为骨架，首先设计添加环化辅助序列和剪切介导序列，使新的过表达框架能更高效和准确表达环形RNA。再在上下游框架序列中加入shRNA-NC靶标序列，在框架末尾加入U6-shRNA-NC序列，利用U6启动子转录出shRNA-NC并在体内加工成熟后形成siRNA-NC序列，然后特异靶向上下游框架中的shRNA-NC靶标序列，使未成环的上下游框架序列（线性副产物pre-mRNA）被降解。因此获得一种新的能更高效准确表达环形RNA，并保持低背景线性副产物的环形RNA体内表达技术，命名为LinZERO技术，其中LinZERO表达框架如图1所示。

本发明相对于现有技术具有如下技术效果：

（1）本发明所构建的环形RNA过表达框架包含骨架序列、环化辅助序列和剪切介导序列，使环形RNA的过表达效率更高，并保证环形RNA序列在设定的位置剪切成环，避免错误剪切成环，比现有技术效果更优。

（2）本发明所构建的环形RNA过表达框架中加入的shRNA-NC靶标序列和U6-shRNA-NC序列，能使环形RNA高效准确剪切成环不受影响，并降解未成环的上下游框架序列（线性副产物pre-mRNA）使其丰度降低2-5个数量级，即在环形RNA高效准确过表达的前提下保持无或极低的背景副产物，另外使用经验证的shRNA-NC序列保证siRNA-NC不会脱靶，保持技术设计的高特异性。

（3）本发明可以高效准确表达环形RNA，并避免线性副产物pre-mRNA可能对circRNA行使功能造成的干扰或影响，使实验设置更严谨，结果更可靠，这种技术效果在已有技术或专利中都不能实现，因此为环形RNA的功能研究提供一种更有优势的技术方法。

（4）使用本发明的LinZERO表达框架所构建的载体，预留EcoRI和BamHI两个内切酶位点用于插入待研究的环形RNA序列，载体适用于细胞瞬时表达、细胞稳定表达和动物体表达等多种需求，并有GFP和嘌呤霉素抗性基因可供标记和筛选。

附图说明

图1为本发明LinZERO表达框架示意图。

图2为LZ-pLCDH-ciR载体序列示意图。

图3为LZ-pLCDH-ciR载体图谱示意图。

图4为LZ-pCD-ciR载体图谱示意图。

图5为LZ-pCD2.1-ciR载体图谱示意图。

图6为LZ-pLO-ciR载体图谱示意图。

图7为LZ-pK4ssAAV-ciR载体图谱示意图。

图8为LZ-pK24ssAAV-ciR载体图谱示意图。

图9为检测线性副产物片段示意图。

图10为实施例2四组样品中S1的相对丰度示意图。

图11为实施例2四组样品中S2的相对丰度示意图。

图12为实施例2四组样品中C5836的相对丰度示意图。

图13为实施例2四组样品中S4的相对丰度示意图。

图14为实施例2四组样品中S5的相对丰度示意图。

图15为实施例2 pCD-C5836样品中相对丰度示意图。

图16为实施例2 LZ-C5836样品中相对丰度示意图。

图17为实施例2 LZ-C5836和pCD-C5836两组样品间归一化后相对丰度示意图。

图18为实施例2 C5836的PCR产物电泳结果示意图。

图19为实施例2 LZ-C5836的PCR产物sanger测序结果示意图。

图20为实施例3四组样品中S1的相对丰度示意图。

图21为实施例3四组样品中S2的相对丰度示意图。

图22为实施例3四组样品中C6404的相对丰度示意图。

图23为实施例3四组样品中S4的相对丰度示意图。

图24为实施例3四组样品中S5的相对丰度示意图。

图25为实施例3 pCD-C6404样品中相对丰度示意图。

图26为实施例3 LZ-C6404样品中相对丰度示意图。

图27为实施例3 LZ-C6404和pCD-C6404两组样品间归一化后相对丰度示意图。

图28为实施例3 C6404的PCR产物电泳结果示意图。

图29为实施例3 LZ-C6404的PCR产物sanger测序结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

LZ-pLCDH-ciR载体的构建，包括如下步骤：

（1）目的片段PCR扩增

以pCD-ciR质粒为模板，使用D1-unF、D1-inR和D1-R进行巢式PCR扩增271bp，标记为D1。

D1-unF:acgctgttttgacctccatagaagatGAGTTCTAAAATTAAACTAT；

D1-inR:TACGTGACACGTTCGGAGAAGCCAAAACAGGTTCAAGGCG；

D1-R:GTTAATTGAACAGATTTTATTTTAGTACGTGACACGTTCGGAGAA。

以pCD-ciR质粒为模板，使用D2-F、D2-inR和D2-R进行巢式PCR扩增250bp，标记为D2。

D2-F:CTAAAATAAAATCTGTTCAATTAACGAATTCTGAAATATGCTATCTTACag；

D2-inF:GAATTCTGAAATATGCTATCTTACagTGCTGTGGCGCTGAGCATAG；

D2-R:ATCCCAAATTAGTGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCacAGGCGTTGACGTGTGAACCA。

以pCD-ciR质粒为模板，使用D3-F和D3-R进行PCR扩增272bp，标记为D3。

D3-F:GAGGATCCACTAATTTGGGATGATAACGCCAAAACAGGTTCAAGGCGA；

D3-R:cACGTGACACGTTCGGAGAACTCTAAAATTATTCGTTCATG。

以pLKO.1质粒为模板，使用D4-F、D4-inR和D4-R进行巢式PCR扩增347bp，标记为D4。

D4-F:TTCTCCGAACGTGTCACGTggagggcctatttcccatgatt

D4-inR:CACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAAggtaccGGTGTTTCGTCCTTTCCACaag；

D4-R: ggagcgatcgcagatccttccAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCTTGAACGTGA。

PCR扩增反应程序：95℃ 5 min，38个循环（98℃ 10 s，58℃ 30 s，68℃ 30 s ），68℃ 5 min，4℃保存。反应体系如表1所示。

表1 PCR扩增反应体系

（2）PCR扩增产物回收

按照E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit（Omega）说明书进行凝胶回收，PCR产物-20℃保存。

（3）空载体双酶切

向空载体PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro(CD513B-1)中加入XbaI和NotI进行双酶切。反应体系如表2所示，37℃温育1 h。然后灌制1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带。

表2 双酶切反应体系

（4）In-Fusion连接

参考In-Fusion® HD Cloning Kit (TaKaRa)说明书配置连接反应液，50℃温育15min，然后进行转化或于-20℃保存，反应条件如表3所示。

表3 连接反应体系

（5）转化感受态细胞Trans1 T1

①从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上融化；

②无菌状态下取50 μL的感受态细胞置于灭菌后的1.5 mL 的离心管中；

③加入10 μL连接产物，冰中放置30分钟；

④42℃ 放置30秒（热休克），不要摇动离心管；

⑤快速转移离心管于冰中放置2～3 min；

⑥加入200 μL LB液体培养基，吹打混匀，涂布于LA琼脂平板培养基上，37℃倒置培养12～16 h。

（6）鉴定

阳性菌落的PCR鉴定：挑取单个菌落接种于LA培养液中，37℃摇床220 rpm培养4h后取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。然后灌制1.5%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物进行电泳检测。

阳性菌液测序鉴定：将通过菌液PCR检测的阳性菌液进行测序，将得到的结果进行BLAST序列对比分析，确定其是否为目的基因。

（7）无内毒素质粒抽提

按照E.Z.N.A.® Endo-free Plasmid Mini Kit I（Omega）试剂盒说明书进行无内毒素质粒抽提，-20℃保存。

所构建的的LZ-pLCDH-ciR载体序列如图2所示，LZ-pLCDH-ciR载体图谱如图3所示。此外，也可采用上述方法利用例如真核表达、慢病毒和AAV载体骨架技术构建LZ-pCD-ciR、LZ-pCD2.1-ciR、LZ-pLO-ciR、LZ-pK4ssAAV-ciR和LZ-pK24ssAAV-ciR等5个载体，各载体的图谱分别如图4-图8所示。

实施例2

使用实施例1 LZ-pLCDH-ciR构建circRNA5836的过表达载体，转染293T细胞后进行RT-qPCR检测，分别计算circRNA、上游框架副产物pre-mRNA、下游框架副产物pre-mRNA、上游pre-mRNA+circRNA副产物和下游pre-mRNA+circRNA副产物的过表达倍数，验证是否能准确环化过表达并保持无或极低的背景副产物。同时构建pCD-circRNA5836过表达载体作为对照。

采用的引物如下：

LZ-5836-F:

ggGAATTCTGAAATATGCTATCTTACAGGTTTACAAAAGATACTGCAAGG；

LZ-5836-R:

cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCTTAGATGCATGTTCTAAATAC。

构建方法和检测验证包括如下步骤：

（1）目的片段PCR扩增

PCR扩增反应程序：95℃ 5 min，38个循环（98℃ 10 s，58℃ 30 s，68℃ 60 s ），68℃5 min，4℃保存。反应体系如表4所示。

表4 PCR扩增反应体系

（2）PCR扩增产物回收

按照E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit（Omega）说明书进行凝胶回收，PCR产物-20℃保存。

（3）目的片段与空载体双酶切

分别向目的片段和空载体中加入两种内切酶进行双酶切。反应体系如表5所示，37℃温育1 h。然后灌制1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带。

表5 双酶切反应体系

（4）目的片段与载体连接

双酶切后用T4 DNA 连接酶连接目的片段和载体质粒，在0.2 mL的离心管中配置连接反应液，用移液器吹打混匀连接反应物，常温反应30 min。反应体系如表6所示。

表6 连接反应体系

（5）转化感受态细胞Trans1 T1

①从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上融化；

②无菌状态下取50 μL的感受态细胞置于灭菌后的1.5 mL 的离心管中；

③加入10 μL连接产物，冰中放置30分钟；

④42℃ 放置30秒（热休克），不要摇动离心管；

⑤快速转移离心管于冰中放置2～3 min；

⑥加入200 μL LB液体培养基，吹打混匀，涂布于LA琼脂平板培养基上，37℃倒置培养12～16 h。

（6）鉴定

阳性菌落的PCR鉴定：挑取单个菌落接种于LA培养液中，37℃摇床220 rpm培养4h后取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。然后灌制1.5%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR产物进行电泳检测。

阳性菌液测序鉴定：将通过菌液PCR检测的阳性菌液进行测序，将得到的结果进行BLAST序列对比分析，确定其是否为目的基因。

（7）无内毒素质粒抽提

按照E.Z.N.A.® Endo-free Plasmid Mini Kit I（Omega）试剂盒说明书进行无内毒素质粒抽提，-20℃保存。

（8）细胞瞬时转染

①转染前一天，5*105个细胞接种在6孔板上，2 ml完全培养基，转染前细胞汇合达到70-90%。

②在100 μL无血清培养基加入3 μg质粒，柔和混匀。

③混匀lipofectamine试剂，用100 μL无血清培养基稀释4 μL lipofectamine试剂，轻轻混匀，室温放置5 min。

④将稀释好的质粒和lipofectamine试剂混合，轻柔混匀，室温放置20 min，以便形成质粒-lipofectamine复合物。

⑤将200 μL质粒-lipofectamine复合物加到含800 μL无血清培养基的细胞孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。

⑥细胞在37℃，5% CO2培养箱中，培养5-6 h后吸去转染培养基，更换完全培养基。

⑦40 h后收样。

（8）样品RNA抽提

①细胞加1mL Trizol 后，室温放置 5min，使其充分裂解；

②按 200ul 氯仿/mL Trizol 加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置5min；

③4℃，12,000g离心15min；

④吸取上层水相，移至另一离心管中；

⑤按0.5ml异丙醇/mL Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置10min；

⑥4℃，12,000g 离心 10min，弃上清；

⑦4℃，12,000g 离心 10min，弃上清；

⑧按 1 mL 75%乙醇/mL Trizol 加入 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

⑨4℃ 7,500g 离心 5 min，尽量弃上清。

⑩室温晾干5-10min，加入20μL DEPC水溶解沉淀；对RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测并测量浓度。

（11）逆转录

①配制第一链cDNA合成反应液，用移液器轻轻吹打混匀。反应体系如表7所示。

表7 第一链cDNA合成反应液

②按表8体系进行第一链cDNA合成反应。

表8 第一链cDNA合成反应体系

（11）qPCR实验

①按表9进行qPCR反应体系配制

表9 qPCR反应体系

②按表10进行qPCR反应设置

表10 qPCR反应程序

分别计算circRNA5836(C5836)、上游框架副产物pre-mRNA(S1)、下游框架副产物pre-mRNA(S5)、上游pre-mRNA+circRNA副产物(S2)和下游pre-mRNA+circRNA副产物(S4)的过表达倍数。检测线性副产物片段示意图如图9所示。

引物如下：

S1-PZ-qD1-F: CAGGGATCTATACTTTTCTGA；

S1-PZ-qD1-R: TCTTAAGGGTCAAATTCACA；

扩增大小112bp。

S2-PZ-qD1-F: CAGGGATCTATACTTTTCTGA；

S2-C5836-LinR: CTTGAACCTTGCAGTATCTT；

扩增大小218bp。

S4-C5836-LinF: TTCGCCTGCTTACTCAGATGTC；

S4-PZ-qD3-R: CGGCTGTATATCTGAATCTTCC；

扩增大小226bp。

S5-PZ-qD3-F: CTAGCTAACAACTCCATACTT；

S5-PZ-qD3-R: CGGCTGTATATCTGAATCTTCC；

扩增大小153bp。

C5836-KF: GAACATGCATCTAAGGTTTACA；

C5836-KR: TGTCCTGAAGTACATAGATG；

扩增大小155bp。

β-actin-F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC；

β-actin-R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

扩增大小250bp。

（12）qPCR数据处理

根据2^-△△Ct公式计算目标基因进行表达情况：

设定CtA1为1号样本目标基因Ct值，CtB1为1号样本内参基因Ct值；CtA2为2号样本目标基因Ct值，CtB2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为(2^-△△Ct法)：

△△Ct =(CtA2-CtB2)-(CtA1-CtB1)= X

则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2^-X倍。

（13）实验结果-qPCR数据

分别检测S1、S2、C5836、S4和S5的相对丰度，检测结果如图10-图14所示。结果显示：C5836在pCD和LZ两组样品中都能高效过表达。与pCD组样品相比，LZ样品中S1的相对丰度降低14.37倍，S2的相对丰度降低10.63倍，S4的相对丰度降低6.47倍，S5的相对丰度降低7.53倍，表明本发明构建的LZ-C5836能高效过表达circRNA5836，并明显降低线性副产物的丰度。

将pCD-C5836样品中C5836的丰度设为1，分别计算S1/S2/S4和S5的相对丰度，结果如图15所示。结果显示：线性副产物S1/S2/S4和S5的相对丰度远高于C5836的丰度。将LZ-C5836样品中C5836的丰度设为1，分别计算S1/S2/S4和S5的相对丰度，结果如图16所示。结果显示S1/S2的相对丰度远低于C5836的丰度，S4的相对丰度略高于C5836的丰度，S5的丰度与C5836的丰度基本相等。

将LZ-C5836和pCD-C5836样品间C5836的丰度归一化设为1，分别计算S1/S2/S4和S5的相对丰度，结果如图17所示。结果显示：与pCD组样品相比，LZ样品中S1的相对丰度降低12.91倍，S2的相对丰度降低9.55倍，S4的相对丰度降低5.81倍，S5的相对丰度降低6.77倍，表明本发明构建的LZ-C5836能高效过表达circRNA5836，并明显降低线性副产物的丰度。

（14）实验结果-PCR产物电泳检测

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断条带大小是否正确，结果如图18所示。结果显示：过表达组中LZ-C5836和pCD-C5836的条带大小都正确，且能明显看到条带加亮。

（15）实验结果-PCR产物sanger测序

将PCR产物进行sanger测序，结果如图19所示。结果显示：过表达组中LZ-C5836的环化序列是准确的。

实施例3

使用实施例1 LZ-pLCDH-ciR构建circRNA6404的过表达载体，转染293T细胞后进行RT-qPCR检测，分别计算circRNA、上游框架副产物pre-mRNA、下游框架副产物pre-mRNA、上游pre-mRNA+circRNA副产物和下游pre-mRNA+circRNA副产物的过表达倍数，验证是否能准确环化过表达并保持无或极低的背景副产物。同时构建pCD-circRNA6404过表达载体作为对照。

采用的引物如下：

LZ-6404-F:

ggGAATTCTGAAATATGCTATCTTACAGAACTCCATCCGGCACAACCT；

LZ-6404-R:

cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCTGCTTTGCCCACTTCCCCT。

实验步骤与实施例2相同。

分别计算circRNA6404(C6404)、上游框架副产物pre-mRNA(S1)、下游框架副产物pre-mRNA(S5)、上游pre-mRNA+circRNA副产物(S2)和下游pre-mRNA+circRNA副产物(S4)的过表达倍数。

引物：

S1-PZ-qD1-F: CAGGGATCTATACTTTTCTGA；

S1-PZ-qD1-R: TCTTAAGGGTCAAATTCACA；

扩增大小112bp。

S2-PZ-qD1-F: CAGGGATCTATACTTTTCTGA；

S2-C6404-R5: GCTATTGTCCATGGAGACAGC；

扩增大小340bp。

S4-C6404-F7: GATTCCCTCATCTCCACACAG；

S4-PZ-qD3-R: CGGCTGTATATCTGAATCTTCC；

扩增大小300bp。

S5-PZ-qD3-F: CTAGCTAACAACTCCATACTT；

S5-PZ-qD3-R: CGGCTGTATATCTGAATCTTCC；

扩增大小153bp。

C6404-F7: GATTCCCTCATCTCCACACAG；

C6404-R7: GCCGGATGGAGTTCTGCTTT；

扩增大小143bp。

β-actin-F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC；

β-actin-R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

扩增大小250bp。

（1）qPCR数据

分别检测S1、S2、C6404、S4和S5的相对丰度，结果如图20-图24所示。结果显示：C6404在pCD和LZ两组样品中都能高效过表达。与pCD组样品相比，LZ样品中S1的相对丰度降低25.77倍，S2的相对丰度降低20.90倍，S4的相对丰度降低28.77倍，S5的相对丰度降低11.83倍，表明本发明构建的LZ-C6404能高效过表达circRNA6404，并明显降低线性副产物的丰度。

将pCD-C6404样品中C6404的丰度设为1，分别计算S1/S2/S4和S5的相对丰度，结果如图25所示。结果显示：线性副产物S1/S2/S4和S5的相对丰度远高于C6404的丰度。将LZ-C6404样品中C6404的丰度设为1，分别计算S1/S2/S4和S5的相对丰度，结果如图26所示。结果显示S1/S2/S4的相对丰度略高于C6404的丰度，S5的丰度高于C6404的丰度。

将LZ-C6404和pCD-C6404样品间C6404的丰度归一化设为1，分别计算S1/S2/S4和S5的相对丰度，结果如图27所示。结果显示：与pCD组样品相比，LZ样品中S1的相对丰度降低34.61倍，S2的相对丰度降低28.07倍，S4的相对丰度降低38.64倍，S5的相对丰度降低15.89倍，表明本发明构建的LZ-C6404能高效过表达circRNA6404，并明显降低线性副产物的丰度。

（2）PCR产物电泳检测

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断条带大小是否正确，结果如图28所示。结果显示：过表达组中LZ-C6404和pCD-C6404的条带大小都正确，且能明显看到条带加亮。

（3）PCR产物sanger测序

将PCR产物进行sanger测序，结果如图29所示。结果显示：过表达组中LZ-C6404的环化序列是准确的。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州吉赛生物科技股份有限公司

<120> 一种低背景线性副产物的环形RNA过表达框架及其构建方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actaaaataa aatctgttca attaac 26

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actaatttgg gatgataac 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttctccgaac gtgtcacgt 19

<210> 4

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga 60

gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag 120

aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca 180

tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg 240

acgaaacacc ggtaccttct ccgaacgtgt cacgttcaag agacgtgaca cgttcggaga 300

attttttgg 309

<210> 5

<211> 1029

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagttctaaa attaaactat gtggagtcat gtccaaccgc acaatgcatc tttatgtgaa 60

acttgctaga gtttttgttt tccttctatg taaaagtcca gttgggaagc tttatttctg 120

atagattaaa tggtataggt ctttcagttt tctcttcatt tctgacaact gaactgctct 180

cgccttgaac ctgttttggc ttctccgaac gtgtcacgta ctaaaataaa atctgttcaa 240

ttaacgaatt ctgaaatatg ctatcttaca gtgctgtggc gctgagcata gttcctcgtt 300

tggaattgta ccatgcttta tgccgaggac attttcaaac acggagggag gggatgtctg 360

attcattcgt gagtaatgta ccagcttcct ctccaacttg tctcccttca gtggttcaca 420

cgtcaacgcc tgtgaatata ttttttcttg aggatccact aatttgggat gataacgcca 480

aaacaggttc aaggcgagag cagttcagtt gtcagaaatg aagagaaaac tgaaagacct 540

ataccattta atctatcaga aataaagctt cccaactgga cttttacata gaaggaaaac 600

aaaaactcta gcaagtttca cataaagatg cattgtgcgg ttggacatga ctccacatag 660

tttaatttta gaactcaagc catgaacgaa taattttaga gttctccgaa cgtgtcacgt 720

ggagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga 780

gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag 840

aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca 900

tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg 960

acgaaacacc ggtaccttct ccgaacgtgt cacgttcaag agacgtgaca cgttcggaga 1020

attttttgg 1029

Claims (10)

1.一种低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，包括环形RNA骨架、一个或多个环化辅助序列、一个或多个剪切介导序列、一个或多个shRNA-NC靶标序列、一个或多个U6-shRNA-NC序列。

2.根据权利要求1所述的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，所述环形RNA骨架包括一个或多个环形RNA序列、一个或多个框架序列、一个或多个剪切受体序列、一个或多个剪切供体序列、一个或多个酶切位点。

3.根据权利要求2所述的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，所述酶切位点选自BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI、ApaI、BglII、KpnI、NcoI、NotI、XbaI中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架具有1029nt，其中1-200nt为上游框架序列，201-219nt为上游shRNA-NC靶标序列，220-245nt为上游环化辅助序列，246-251nt为EcoRI内切酶位点序列，252-269nt为上游剪切介导序列，270-271nt为剪切受体AG序列，272-431nt为circRNA序列，432-433nt为剪切供体GT序列，434-451nt为下游剪切介导序列，452-457为BamHI内切酶位点序列，458-476nt为下游环化辅助序列，477-701nt为下游框架序列，702-720nt为下游shRNA-NC靶标序列，721-1029nt为U6-shRNA-NC序列。

5.根据权利要求4所述的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，所述上游剪切介导序列（5’IS）和下游剪切介导序列（3’IS）的核苷酸序列选自IS-L18、IS-S10和IS-Y10中的一种，其中IS-L18、IS-S10和IS-Y10的序列分别如下：

IS-L18：

上游剪切介导序列：5’-TGAAATATGCTATCTTAC-3’

下游剪切介导序列：5’-TCAAGAAAAAATATATTC-3’；

IS-S10：

上游剪切介导序列：5’-ATCTTACTTC-3’

下游剪切介导序列：5’-ATAAGTTCAT-3’；

IS-Y10：

上游剪切介导序列：5’-TAATACTTTC-3’

下游剪切介导序列：5’-AGTTGTTCTT-3’。

6.根据权利要求4所述的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，所述上游环化辅助序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游环化辅助序列如SEQ ID NO:2所示。

7.根据权利要求4所述的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，所述上游shRNA-NC靶标序列和下游shRNA-NC靶标序列如SEQ ID NO:3所示。

8.根据权利要求4所述的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架，其特征在于，所述U6-shRNA-NC序列如SEQ ID NO:4所示。

9.根据权利要求1-8任一项所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架的构建方法，包括如下步骤：

（1）在环形RNA骨架上添加一个或多个环化辅助序列和一个或多个剪切介导序列；

（2）再插入一个或多个shRNA-NC靶标序列和一个或多个U6-shRNA-NC序列。

10.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1-8任一项所述低背景线性副产物的环形RNA过表达框架或根据权利要求9制备得到的低背景线性副产物的环形RNA过表达框架。

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