CN109097395A - 一种人类环状rna过表达载体框架、过表达载体及其制备方法 - Google Patents

一种人类环状rna过表达载体框架、过表达载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人类环状RNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法。所述人类环状RNA过表达载体框架及载体，能够作为通用的环状RNA过表达载体，取得了环状RNA过表达领域的突破；同时，所述环状RNA过表达载体解决了circRNA体内前期RNA成环效率低的问题，将成环率提高到95％，弥补circRNA前体不成环主要以线状形式存在的缺陷，避免了线状circRNA前体对环状circRNA功能引发的假阳性问题；且大大提高了circRNA过表达效率，将过表达效率提到500‑2000倍。

Description

一种人类环状RNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类环状RNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法。
背景技术
环状RNA(Circular RNAs)是广泛且多样地存在于多种生物细胞中，具有调控基因表达作用的一类内源性ncRNA分子。最早于20世纪70年代在RNA病毒中被发现。之后几十年，人们在一些转录本中也发现了一些由外显子构成的circRNA，如结肠直肠癌缺失基因转录本、人类Ets-1基因转录本等，但当时它们被认为是转录的“噪音”，未引起人们太多的关注。而近年来，随着生物信息学技术的快速发展，Salzman等、Jeck等、Memczak等及Guo等分别在人类和小鼠的多种细胞中发现了成千上万种circRNA。
近年来，随着高通量测序技术及基因芯片技术的高速发展，研究者们在真核生物体内发现了越来越多的circRNA。如Salzman等发现了数以百计的与人类基因表达相关的circRNA。Jeck等在人类成纤维细胞中检测到了高达25000多种circRNA。
目前发现的circRNA，根据其在基因组中的来源及其构成序列的不同，可以分为3类：外显子来源的环形RNA分子，内含子来源的环形RNA分子和由外显子和内含子共同组成的环形RNA分子。
CircRNA具有以下特征：表达水平差异较大；具有序列保守性；偏好于细胞浆中；不易被核酸外切酶RNase R降解；外显子来源为主；属于ncRNA；可充当ceRNA的角色调控靶基因的表达；在转录或转录后水平发挥调控作用。这些特征使得circRNA在研究疾病发生机制、干预靶点和生物学标志物等方面显示显著优势。
研究表明，circRNA参与诸多生理及病理过程包括肿瘤、神经系统疾病、动脉粥样硬化、糖尿病及病毒性肝炎等有关。这其中与circRNA在转录及转录后水平具有非常重要的基因表达调控作用相关。发挥功能的分子机制主要包括：miRNA海绵作用、调控基因转录、调控RNA结合蛋、参与部分蛋白质翻译等方面；同时，circRNA其不易被核酸外切酶RNase R降解的优势，使其在作为分子标记物的诊断价值在疾病的发现和治疗中发挥着巨大作用。
现有的研究中，仅有某个基因的环状RNA过表达载体，如pCDNA3-CIRS-7过表达载体、laccase 2基因的过表达载体等，并没有一个通用载体表达人类的所有circRNA。并且，目前还存在circRNA体内前期RNA成环效率低的问题，从而导致线状circRNA前体对环状circRNA功能引发的假阳性问题，也影响了circRNA过表达效率。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种人类环状RNA过表达载体框架、过表达载体及其制备方法。所述人类环状RNA过表达载体框架及载体，能够作为通用的环状RNA过表达载体，取得了环状RNA过表达领域的突破；同时，所述环状RNA过表达载体解决了circRNA体内前期RNA成环效率低的问题，将成环率提高到95％，弥补circRNA前体不成环主要以线状形式存在的缺陷，避免了线状circRNA前体对环状circRNA功能引发的假阳性问题；且大大提高了circRNA过表达效率，将过表达效率提到500-2000倍。
本发明的目的是提供一种人类环状RNA过表达载体框架；
本发明的再一目的是提供一种人类环状RNA过表达载体；
本发明的再一目的是提供所述人类环状RNA过表达载体框架和载体的制备方法
根据本发明的人类环状RNA过表达载体框架，其包含启动子-Alu环化元件-多克隆位点-反向互补Alu环化元件-终止子，所述Alu环化元件的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向互补Alu环化元件的序列如SEQ ID NO:2所示。
所述SEQ ID NO:1的序列为：
GGTGGACTGCCTGAGGTCAGGAGTTCGTGACCAGACTGACCAACATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAAATTAGCCAGGTGCGGTGGCATGCACCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTAAGGCAGGGGAATTGCTTGAACCAGGGAGGTGGAGGTCGCAGTGAGCCGAGATGGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGAGAGACTCTATCTTAAAAAAAAAAAAAAAAATTATTCTGGTAGGCTCAGGCCCCATGTGGCCT。
所述SEQ ID NO:2的序列为：
AGGCCACATGGGGCCTGAGCCTACCAGAATAATTTTTTTTTTTTTTTTTAAGATAGAGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCCATCTCGGCTCACTGCGACCTCCACCTCCCTGGTTCAAGCAATTCCCCTGCCTTAGCCTCCCGAGTAGCTGGGATTACAGGTGCATGCCACCGCACCTGGCTAATTTTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCACCATGTTGGTCAGTCTGGTCACGAACTCCTGACCTCAGGCAGTCCACCGCTCGTGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGAGTATCACCCTGTCACCCAGG。
根据本发明的人类环状RNA过表达载体框架，其中，所述Alu环化元件还包含内含子AG受体序列，所述内含子AG受体序列如SEQ ID NO:3所示。
所述SEQ ID NO:3的序列为：
TCCAGGAAAGCAGCTGGCCCTTCTCAAGAC。
根据本发明的人类环状RNA过表达载体框架，其中，所述反向互补Alu环化元件还包含内含子GT供体序列，所述内含子GT供体序列如SEQ ID NO:4所示。
所述SEQ ID NO:4的序列为：
GAGTGGAGAGCTCAACCAGTATAGTGCCAAGGTAAG。
根据本发明的人类环状RNA过表达载体框架，其中，所述启动子为pCMV启动子。
根据本发明的人类环状RNA过表达载体框架，其中，所述终止子为BGH pA终止子。
根据本发明的人类环状RNA过表达载体框架，其中，所述多克隆位点依此包含第一酶切位点、填充序列和第二酶切位点。
根据本发明的人类环状RNA过表达载体框架，其中，所述第一酶切位点为BamH I，第二酶切位点为EcoR I。
根据本发明的人类环状RNA过表达载体，包括所述人类环状RNA过表达载体框架，且所述多克隆位点依此包含第一酶切位点、目的环状RNA序列和第二酶切位点。也就是说，将目的环状RNA序列导入所述人类环状RNA过表达载体框架中，即可得到所述人类环状RNA过表达载体。
根据本发明的所述人类环状RNA过表达载体框架的制备方法，包括以下步骤：
A、采用基因合成的方式合成包括Alu环化元件-多克隆位点-反向互补Alu环化元件的核心元件，并在所述核心元件的上游和下游分别添加酶切位点；
B、使用与所述核心元件上游和下游匹配的连接酶，将启动子和终止子分别连入所述核心元件的上游和下游，得到所述人类环状RNA过表达载体框架。
根据本发明的制备方法，其中，所述核心元件上游添加的酶切位点为HindⅢ，所述核心元件下游添加的酶切位点为xhol。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种人类环状RNA过表达载体框架及载体，所述人类环状RNA过表达载体框架及载体，能够作为通用的环状RNA过表达载体，极大地增加了载体的适用范围，取得了环状RNA过表达领域的突破。
2、所述环状RNA过表达载体中，特别设计了反向互补Alu环化元件的序列，从而使circRNA体内前期RNA更容易成环，解决了circRNA体内前期RNA成环效率低的问题，将成环率提高到95％，弥补circRNA前体不成环主要以线状形式存在的缺陷，避免了线状circRNA前体对环状circRNA功能引发的假阳性问题；且大大提高了circRNA过表达效率，将过表达效率提到500-2000倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是pcircRNA 2.2hsa表达载体模式图；
图2是pcircRNA 2.1hsa表达载体模式图；
图3是hsa_circ_0001982的PCR鉴定图；
图4是hsa_circ_0001982的circRNA过表达载体菌落PCR鉴定图；
图5是hsa_circ_0001982的qPCR相对定量图；
图6是hsa_circ_0001982的测序结果图；
图7是pcircRNA2.2-CircRNA-14的PCR鉴定图；
图8是pcircRNA2.2-CircRNA-14的circRNA过表达载体菌落PCR鉴定图；
图9是pcircRNA2.2-CircRNA-14的qPCR相对定量图；
图10是pcircRNA2.2-CircRNA-14的测序结果图；
图11是pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441的PCR鉴定图；
图12是pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441的circRNA过表达载体菌落PCR鉴定图；
图13是pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441的qPCR相对定量图；
图14是pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441的测序结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本发明构建了含pCMV启动子-Alu环化元件(Alu cyclization components
-up)-多克隆位点-反向互补Alu环化元件(Alu cyclization components-down)-BGH pA为主体架构的人类环状RNA过表达载体框架，并经过测序验证。该质粒载体及慢病毒载体分别命名为pcircRNA 2.2hsa和pcircRNA 2.1hsa。
pcircRNA 2.2hsa和pcircRNA 2.1hsa的表达载体模式图分别如图1和图2所示。
所述人类环状RNA过表达载体框架载体核心元件序列如下：
所述Alu环化元件(Alu cyclization components-up)的序列如SEQ ID NO:1所示；
所述内含子AG受体的序列如SEQ ID NO:3所示；
所述多克隆位点的序列如SEQ ID NO:5所示；
SEQ ID NO:5的序列为：GGATCCGCGCAGGACCGGAATTC；
所述内含子GT供体的序列如SEQ ID NO:4所示；
所述反向互补Alu环化元件的序列如SEQ ID NO:2所示。
所述环状RNA过表达载体中，特别设计了反向互补Alu环化元件的序列，从而使circRNA体内前期RNA更容易成环，解决了circRNA体内前期RNA成环效率低的问题，将成环率提高到95％，弥补circRNA前体不成环主要以线状形式存在的缺陷，避免了线状circRNA前体对环状circRNA功能引发的假阳性问题。
实施例2
pcircRNA2.2-hsa_circ_0001982的构建
使用实施例1中的所示人类环状RNA过表达载体框架，构建了pcircRNA 2.1-hsa_circ_0001982过表达载体(pCMV启动子-反向互补反应上游元件-hsa_circ_0001982-反向互补Alu环化元件-BGH pA)。所述pcircRNA2.2-hsa_circ_0001982的序列如SEQ ID NO:6所示。
将构建成功的表达载体转染293T细胞，48h后使用qPCR技术以GAPDH为内参，以空载转染组为空白对照检测hsa_circ_0001982表达上调比例；然后对qPCR扩增片段结果测序验证hsa_circ_0001982表达定量分析及序列拼接定性分析的正确性；
circRNA PCR鉴定图及circRNA过表达载体菌落PCR鉴定图(899bp)如图3和图4所示。
其中，图3对应的实验参数为：maker：DL2000 DNA marker；a：hsa_circ_0001982；
图4对应的实验参数为：maker：DL2000maker；a、b、c、d、e：pcircRNA 2.2-hsa_circ_0001982。
circRNA qPCR引物为：上游引物AAACCTCGGACTTTGCTGAA，下游引物ACAGTTTTGGTGCTGCTGTG；内参基因GAPDH qPCR引物为：上游引物AACGGATTTGGTCGTATTGGG，下游引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT。
qPCR及测序结果如图5和图6所示，表明pcircRNA 2.2-hsa_circ_0001982可以过表达circRNA，上调倍数为19.6范围。
实施例3
pcircRNA2.2-CircRNA-14的构建
使用实施例1中的所示人类环状RNA过表达载体框架，构建了pcircRNA2.2-CircRNA-14过表达载体(pCMV启动子-反向互补反应上游元件-CircRNA-14-反向互补Alu环化元件-BGH pA)。所述pcircRNA2.2-CircRNA-14序列如SEQ ID NO:7所示。
将构建成功的表达载体转染293T细胞，48h后使用qPCR技术以GAPDH为内参，以空载转染组为空白对照检测CircRNA-14表达上调比例；然后对qPCR扩增片段结果测序验证CircRNA-14表达定量分析及序列拼接定性分析的正确性；
circRNA PCR鉴定图及circRNA过表达载体菌落PCR鉴定图(1599bp)如图7和图8所示。
其中，图7对应的实验参数为：maker：DL2000 DNA marker；a：CircRNA-14；
图8对应的实验参数为：maker：DL2000 DNA marker；a、b、c、d、e：pcircRNA2.2-CircRNA-14。
circRNA qPCR引物为：上游引物ccaccatccccagctcag，下游引物acagtgctggtatccggttc；内参基因GAPDH qPCR引物为：上游引物AACGGATTTGGTCGTATTGGG，下游引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT。
qPCR及测序结果如图9和图10所示，表明pcircRNA2.2-CircRNA-14可以过表达circRNA，上调倍数为32.2范围。
实施例4
pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441的构建
使用实施例1中的所示人类环状RNA过表达载体框架，构建了pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441过表达载体(pCMV启动子-反向互补反应上游元件-hsa_circ_0053441反向互补Alu环化元件-BGH pA)；所述pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441的序列如SEQ ID NO:8所示。
将构建成功的表达载体转染293T细胞，48h后使用qPCR技术以GAPDH为内参，以空载转染组为空白对照检测hsa_circ_0053441表达上调比例；然后对qPCR扩增片段结果测序验证hsa_circ_0053441表达定量分析及序列拼接定性分析的正确性；
circRNA PCR鉴定图及circRNA过表达载体菌落PCR鉴定图(709bp)如图11和图12所示。
其中，图11对应的实验参数为：maker：DL2000 DNA marker；a：hsa_circ_0053441；
图12对应的实验参数为：maker：DL2000 DNA marker；a、b、c、d、e：pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441。
circRNA qPCR引物为：上游引物CAGAGCCTGGAATTTTACCG，下游引物ACCACAAACTGGGAAGAACG；内参基因GAPDH qPCR引物为：上游引物AACGGATTTGGTCGTATTGGG，下游引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT。
qPCR及测序结果如图13和图14所示，表明pcircRNA2.2-hsa_circ_0053441可以过表达circRNA，上调倍数为29.3范围。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种人类环状RNA过表达载体框架，其特征在于，包含启动子-Alu环化元件-多克隆位点-反向互补Alu环化元件-终止子，所述Alu环化元件的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向互补Alu环化元件的序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的人类环状RNA过表达载体框架，其特征在于，所述Alu环化元件还包含内含子AG受体序列，所述内含子AG受体序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的人类环状RNA过表达载体框架，其特征在于，所述反向互补Alu环化元件还包含内含子GT供体序列，所述内含子GT供体序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的人类环状RNA过表达载体框架，其特征在于，所述启动子为pCMV启动子。
5.根据权利要求1所述的人类环状RNA过表达载体框架，其特征在于，所述终止子为BGHpA终止子。
6.根据权利要求1所述的人类环状RNA过表达载体框架，其特征在于，所述多克隆位点依此包含第一酶切位点、填充序列和第二酶切位点。
7.根据权利要求6所述的人类环状RNA过表达载体框架，其特征在于，所述第一酶切位点为BamH I，第二酶切位点为EcoR I。
8.一种人类环状RNA过表达载体，其特征在于，所述人类环状RNA过表达载体包括权利要求1-7任一所述人类环状RNA过表达载体框架，且所述多克隆位点依此包含第一酶切位点、目的环状RNA序列和第二酶切位点。
9.权利要求1-7任一所述人类环状RNA过表达载体框架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、采用基因合成的方式合成包括Alu环化元件-多克隆位点-反向互补Alu环化元件的核心元件，并在所述核心元件的上游和下游分别添加酶切位点；
B、使用与所述核心元件上游和下游匹配的连接酶，将启动子和终止子分别连入所述核心元件的上游和下游，得到所述人类环状RNA过表达载体框架。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述核心元件上游添加的酶切位点为HindⅢ，所述核心元件下游添加的酶切位点为xhol。
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