CN109706172B

CN109706172B - 一种基于Alu元件的精准型环形RNA表达框架和载体及其应用

Info

Publication number: CN109706172B
Application number: CN201910005036.1A
Authority: CN
Inventors: 李自强; 黄宁宁; 谢芳梅; 车水云; 刘明
Original assignee: Guangzhou Bio Polytron Technologies Inc
Current assignee: Guangzhou Bio Polytron Technologies Inc
Priority date: 2019-01-03
Filing date: 2019-01-03
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2039-01-03
Also published as: CN109706172A

Abstract

本发明涉及一种基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，包括一个或多个Alu元件、一个或多个酶切位点、一个或多个剪切识别序列、一个或多个环化介导序列、剪切受体序列、剪切供体序列、一个或多个环形RNA序列。其通用性更高：能通用于不同物种的不同环形RNA，能通用于天然和人工设计的环形RNA序列，对200nt‑2500nt范围内的环形RNA都能实现准确环化过表达；环化准确性高：过表达后成环剪切准确，SRS和IS配套组合使成环时在AG‑GT处精确剪切，成环的环形RNA无碱基添加或缺失；过表达效率高：成环过表达效果稳定，在准确环化的前提下能使环形RNA显著过表达50倍到上万倍；应用广泛：适用于细胞瞬时表达、细胞稳定表达和动物体表达等多种需求，并有GFP和嘌呤霉素抗性基因可供标记和筛选。

Description

一种基于Alu元件的精准型环形RNA表达框架和载体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及基于Alu重复元件的精准型环形RNA表达框架和其载体构建方法及其应用。

背景技术

环形RNA(circular RNAs,circRNA)是一类具有闭合环状结构的RNA分子，在古生菌、线虫、小鼠、大鼠和人类等物种中广泛存在，其表达具有一定的组织、时序特异性，且不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。大量研究表明环形RNA可以miRNA sponge、与聚合酶II(RNA polymerase II，Pol II)相互作用调控宿主转录活性、直接翻译蛋白质等多种功能途径在脑发育、帕金森、阿尔兹海默病和肿瘤发生中发挥重要作用，提示环形RNA作为疾病诊断标志物或治疗靶标的潜能。

大量的生物信息学分析和实验表明环形RNA的形成需要侧翼内含子中的反向互补序列(reverse complementary matches,RCMs)，进一步分析表明外显子来源的环形RNA侧翼内含子中含有Alu重复元件，侧翼序列越长，含有Alu重复元件的频率越高，且在Alu重复元件反向互补时明显形成环形RNA(Jeck WR et al.,2013)，表明Alu重复元件可以促进外显子反向成环。

体内外显子反向成环后的剪切依靠于剪切体(spliceosome)，具体涉及U1、U2、U4、U5和U6snRNP(小核核糖核蛋白)，剪切体正确识别内含子和外显子界限，在外显子5’端的AG受体(splice acceptor)和3’端的GT供体(splice donor)处剪切去除侧翼内含子，保留外显子，以使成熟的外显子反向剪切连接成环。

对于环形RNA的功能性过表达(Gain of function)研究，文献报道研究者多基于环形RNAs的侧翼序列特征，以PCR分段扩增目标环形RNA的侧翼有Alu重复元件的内含子序列，拼接上游内含子序列加环形RNA序列加下游内含子序列三段同时构建在真核表达载体上。这种方法需要分别以基因组DNA为模板扩增上下游内含子序列和以cDNA为模板扩增环形RNA序列，并以重叠PCR或同源重组等方法进行后续载体构建，其分段扩增步骤复杂，构建周期长，且因侧翼内含子序列长度无界定标准、序列特征未知等导致结果难以预测。另外该方法只能针对特定环形RNA扩增其对应的上下游侧翼内含子序列，构建方法为环形RNA特异性的，无通用性。

一种通用型的方法(Liang et al.,2014)基于circ-ZKSCAN1的侧翼序列，分析特征并简化Alu序列，保留上游环化序列长87nt，下游环化序列长59nt，最终使用pcDNA3.1(+)构建一个通用载体pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector，载体预留多克隆酶切位点供替换克隆环形RNA。使用该载体构建环形RNA过表达载体，部分环形RNA未能有过表达，也有部分环形RNA环化出错，在环化位点处错误地添加了多余的酶切位点等序列。

另一种通用型的方法为使用人工过表达框架pCD-ciR，通过预留的KpnI和BamHI两个酶切位点，克隆连接环形RNA序列进pCD-ciR载体中。本方法能对大部分环形RNA准确高效率过表达，但也有少数环形RNA会环化出错，在环化位点处错误地添加了多余的酶切位点等序列。

此外，现有技术中已经有公司提供环形RNA过表达载体构建，但也不能保证准确高效率环化，普遍存在不能成功过表达或过表达后环化错误的情况，因此设计一种能够高效率并且准确环化的环形RNA过表达技术迫在眉睫。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，获得一种高效、准确环化的环形RNA，本发明对现有技术进行了改进。

具体的，本发明目的之一在于提供一种基于Alu元件的环形RNA表达框架，所述基于Alu元件的环形RNA表达框架包括一个或多个Alu元件、一个或多个酶切位点、一个或多个剪切识别序列(Splice recognition sequence，SRS)、一个或多个环化介导序列(Interaction sequence,IS)、剪切受体序列、剪切供体序列、一个或多个环形RNA序列；

作为优选地，所述酶切位点选自BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI、ApaI、BglII、KpnI、NcoI中的一种或多种；最优选为BamHI和EcoRI；

作为优选地，所述基于Alu元件的环形RNA表达框架具有773nt，其中第1-200nt为第一Alu元件序列(Alu1)，第201-368nt为第一剪切识别序列(SRS1)，第369-374nt为EcoRI内切酶位点序列，第375-384nt为5’环化介导序列，第385-386nt为剪切受体序列，第387-407nt为环形RNA序列，第408-409nt为剪切供体序列，第410-419nt为3’环化介导序列，第420-425nt为BamHI内切酶位点序列，第426-573nt为第二剪切识别序列(SRS2)，第574-773nt为第二Alu元件序列(Alu2)；

作为优选地，所述第一Alu元件核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第一剪切识别序列核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第二剪切识别序列核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述第二Alu元件核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

作为优选地，所述5’环化介导序列和3’环化介导序列的核苷酸序列选自IS-L18、IS-S10和IS-Y10中的一种，其中IS-L18、IS-S10和IS-Y10序列分别如下：

IS-L18：

5’IS序列：5’-TGAAATATGCTATCTTAC-3’，

3’IS序列：5’-TCAAGAAAAAATATATTC-3’；

IS-S10：

5’IS序列：5’-ATCTTACTTC-3’，

3’IS序列：5’-ATAAGTTCAT-3’；

IS-Y10：

5’IS序列：5’-TAATACTTTC-3’，

3’IS序列：5’-AGTTGTTCTT-3’；

最优选地，所述5’环化介导序列和3’环化介导序列的核苷酸序列选自IS-Y10；

作为优选地，所述基于Alu元件的环形RNA表达框架序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的第二个目的在于提供一种含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的载体，所述基于Alu元件的环形RNA表达框架包括一个或多个Alu元件、一个或多个酶切位点、一个或多个剪切识别序列(Splice recognition sequence，SRS)、一个或多个环化介导序列(Interaction sequence,IS)、剪切受体序列、剪切供体序列、一个或多个环形RNA序列；

作为优选地，所述基于Alu元件的环形RNA表达框架中，第1-200nt为第一Alu元件序列，第201-368nt为第一剪切识别序列，第369-374nt为EcoRI内切酶位点序列，第375-384nt为5’环化介导序列，第385-386nt为剪切受体序列，第387-407nt为环形RNA序列，第408-409nt为剪切供体序列，第410-419nt为3’环化介导序列，第420-425nt为BamHI内切酶位点序列，第426-573nt为第二剪切识别序列，第574-773nt为第二Alu元件序列；

IS-L18：

5’IS序列：5’-TGAAATATGCTATCTTAC-3’,

3’IS序列：5’-TCAAGAAAAAATATATTC-3’；

IS-S10：

5’IS序列：5’-ATCTTACTTC-3’,

3’IS序列：5’-ATAAGTTCAT-3’；

IS-Y10：

5’IS序列：5’-TAATACTTTC-3’,

3’IS序列：5’-AGTTGTTCTT-3’；

最优选地，所述5’环化介导序列和3’环化介导序列的核苷酸序列选自IS-Y10。

本发明的第三个目的在于提供一种制备含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的载体的方法，所述方法包括如下步骤：(1)目的片段PCR扩增：以全基因合成法合成环形RNA表达框架序列，用作PCR扩增的模板；(2)将PCR扩增产物回收；(3)向空载体中加入限制性内切酶进行酶切；(4)进行In-Fusion连接；(5)转化感受态细胞，并进行测序鉴定；(6)无内毒素质粒抽提保存，即得。

本发明基于Alu重复元件促进侧翼序列内含子互补配对以拉近外显子两端，配以剪切体能准确识别的内含子序列SRS(Splice recognition sequence，SRS)和辅助的环化介导序列IS(Interaction sequence,IS)，预留单一内切酶位点，设计发明一种精准型(准确环化)的通用环形RNA表达框架。并分别使用瞬时真核表达、慢病毒和AAV载体骨架，构建pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR共六个载体，预留EcoRI和BamHI两个内切酶位点用于插入待研究的环形RNA序列，载体适用于细胞瞬时表达、细胞稳定表达和动物体表达等多种需求，并有GFP和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因可供标记和筛选。本发明中环形RNA表达框架对RNA转录、转录后加工和编码翻译蛋白质水平都能准确环化高效率过表达，蛋白质能正常准确翻译，并能对非天然(人工设计)的环形RNA准确环化高效率过表达，且成功率明显高于前有技术方案。该表达框架和载体可以应用于天然的环形RNA体内过表达和人工设计的环形RNA体内过表达，也可以表达人工设计的多miRNA结合位点环形RNA以用于miRNA sponge研究或者表达IRES-GFP/环形RNA以用于环形RNA翻译蛋白质研究。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

(1)通用性高：能通用于人、小鼠、大鼠、家鸡和家猪等物种的不同环形RNA，能通用于天然的和人工设计的环形RNA序列，对200nt-2500nt范围内的环形RNA都能实现准确环化过表达；六种载体使用同一酶切位点，载体之间移植方便，有利于细胞瞬时表达、细胞稳定表达和动物体表达等多种需求互相切换；

(2)环化准确性高：过表达后成环剪切准确，SRS和IS配套组合使成环时在AG-GT处精确剪切，成环的环形RNA无碱基添加或缺失；

(3)过表达效率高：成环过表达效果稳定，在准确环化的前提下能使环形RNA显著过表达50倍到上万倍；

(4)应用广泛：适用于细胞瞬时表达、细胞稳定表达和动物体表达等多种需求，并有GFP和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因可供标记和筛选。该表达框架和载体可以应用于天然的环形RNA体内过表达和人工设计的环形RNA体内过表达，也可以表达人工设计的多miRNA结合位点环形RNA以用于miRNA sponge研究或者表达IRES-GFP/环形RNA以用于环形RNA翻译蛋白质研究。

附图说明

图1为本发明所述基于Alu元件的环形RNA表达框架示意图；

图2为本发明含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的pCD5-ciR载体示意图；

图3为本发明含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的pCD25-ciR载体示意图；

图4为本发明含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的pLO5-ciR载体示意图；

图5为本发明含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的pLC5-ciR载体示意图；

图6为本发明含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的pK5ssAAV-ciR载体示意图；

图7为本发明含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的pK25ssAAV-ciR载体示意图；

图8为本发明Alu1的二级结构示意图；

图9为本发明Alu2的二级结构示意图；

图10为本发明SRS1的二级结构示意图；

图11为本发明SRS2的二级结构示意图；

图12为本发明环形RNA表达框架的二级结构示意图；

图13为以环化介导序列IS-L18、IS-S10和IS-Y10构建的三个pCD5-ciR载体circRNA82002的qPCR实验结果；

图14为以环化介导序列IS-L18、IS-S10和IS-Y10构建的三个pCD5-ciR载体circRNA82002的PCR产物电泳检测结果；

图15为以环化介导序列IS-L18、IS-S10和IS-Y10构建的三个pCD5-ciR载体circRNA82002的PCR产物sanger测序结果；

图16为过表达50倍的成功比例结果示意图；

图17为环化准确的成功比例结果示意图；

图18为circRNA82002的qPCR实验结果；

图19为circRNA00284的qPCR实验结果；

图20为circRNA05836的qPCR实验结果；

图21为rnocircRNA00978的qPCR实验结果；

图22为circRNA82002过表达后PCR产物电泳结果；

图23为circRNA00284过表达后PCR产物电泳结果；

图24为circRNA05836过表达后PCR产物电泳结果；

图25为rnocircRNA00978过表达后PCR产物电泳结果；

图26为circRNA82002的PCR产物sanger测序结果；

图27为circRNA00284的PCR产物sanger测序结果；

图28为circRNA05836的PCR产物sanger测序结果；

图29为rnocircRNA00978的PCR产物sanger测序结果；

图30为以pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector、pCD-ciR和pCD5-ciR构建IRES介导翻译的GFP报告载体荧光显微镜检测结果。

具体实施方式

下面将结合说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所示，其为本发明所述基于Alu元件的环形RNA表达框架示意图。参考RepeatMasker数据库注释的Alu元件信息，基于Alu元件的保守序列约40nt，设计长度300nt的Alu1和Alu2,再基于snRNP的剪切模式，设计200nt的内含子剪切识别序列SRS1和SRS2。使用RNAfold预测序列的二级结构，修改调整碱基以使Alu1和Alu2反向互补形成稳定的发夹结构，保持最小自由能小于-350.00kcal/mol，调整修改碱基以使SRS1和SRS2形成颈环结构，且不与Alu序列配对，保持最小自由能大于-50kcal/mol。最终得到Alu1长度200nt如SEQID NO:1，得到Alu2长度200nt如SEQ ID NO:5，得到SRS1长度153nt如SEQ ID NO:2，得到SRS2长度148nt如SEQ ID NO:4,环形RNA表达框架全长773nt如SEQ ID NO:3；其中Alu1、Alu2、SRS1、SRS2、环形RNA表达框架的二级结构分别如图8-图12所示。

以该表达框架序列，分别用不同的载体骨架构建环形RNA表达载体，所得的pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR的载体图谱分别如图2-图7所示。

具体步骤如下：(1)目的片段PCR扩增：以全基因合成法合成环形RNA表达框架序列，用作PCR扩增的模板；(2)将PCR扩增产物回收；(3)向空载体中加入限制性内切酶进行酶切；(4)进行In-Fusion连接；(5)转化感受态细胞，并进行测序鉴定；(6)无内毒素质粒抽提保存，即得。

实施例2

分别使用环化介导序列IS-L18、IS-S10和IS-Y10，以pCD5-ciR构建circRNA82002的载体，转染293T细胞后进行RT-qPCR检测过表达倍数(RNA水平)，并将PCR产物进行sanger测序，验证IS-L18、IS-S10和IS-Y10是否能介导circRNA82002准确环化过表达。

使用引物：

IS-L18-pCD-ciR-circRNA82002-F:

ggGGTACCTGAAATATGCTATCTTACAGATAAACCTCTCATAATGAAG；

IS-L18-pCD-ciR-circRNA82002-R:

cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCCTATTAAAGCAGTGCTCAT；

IS-S10-pCD5-ciR-circRNA82002-F:

cgGAATTCCATCTTACTTCAGATAAACCTCTCATAATGAAG；

IS-S10-pCD5-ciR-circRNA82002-R:

cgGGATCCATGAACTTATACCCTATTAAAGCAGTGCTCAT；

IS-Y10-pCD5-ciR-circRNA82002-F:

cgGAATTCCTAATACTTTCAGATAAACCTCTCATAATGAAG；

IS-Y10-pCD5-ciR-circRNA82002-R:

cgGGATCCAGTTGTTCTTACCCTATTAAAGCAGTGCTCAT。

其中制备步骤如下：

(1)目的片段PCR扩增；(2)将PCR扩增产物回收；(3)目的片段与空载体双酶切；(4)将目的片段与载体连接；(5)转化感受态细胞Trans1T1，并进行测序鉴定；(6)无内毒素质粒抽提；(7)将细胞瞬时转染；(8)对细胞进行样品RNA抽提；(9)逆转录：配制第一链cDNA合成反应液，反应条件如下表1所示：

表1

用移液器轻轻吹打混匀，按表2条件进行第一链cDNA合成反应：

表2

25℃	10min
		42℃	15min
85℃	5min

(10)qPCR实验：qPCR反应体系配制，反应条件如下表3所示：

表3

qPCR反应程序设置如表4所示：

表4

引物：

circRNA82002-F1:GCACTGCTTTAATAGGATAA，

circRNA82002-R1:AGCTGATACTTCATATTCACA；

扩增大小158bp；

β-actin-F:CATGTACGTTGCTATCCAGGC，

β-actin-R:CTCCTTAATGTCACGCACGAT；

扩增大小250bp；

(11)qPCR数据处理

根据2^{-△△C t}公式计算目标基因进行表达情况：

设定Ct_A1为1号样本目标基因Ct值，Ct_B1为1号样本内参基因Ct值；Ct_A2为2号样本目标基因Ct值，Ct_B2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为(2-△△Ct法)：

△△Ct＝(Ct_A2-Ct_B2)-(Ct_A1-Ct_B1)＝X

则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2^-X倍。

实验结果如图13所示：qPCR检测显示pCD5-ciR以环化介导序列IS-L18、IS-S10和IS-Y10构建的三个载体都能使circRNA82002高效率过表达。表明基于RNA转录和转录后加工水平检测环形RNA有过表达。

(12)PCR产物电泳检测

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，引物：

circRNA82002-BKF:5'-CCAGATTCTGCCGAACCAATG-3'，

circRNA82002-BKR:5'-CTCTTTACACTCCCCATTGCT-3'；

扩增大小248bp；

β-actin-F:5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，

β-actin-R:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'；

扩增大小250bp；

结果如图14所示：pCD5-ciR载体以环化介导序列IS-L18、IS-S10和IS-Y10构建的三个载体过表达后PCR产物大小都正确。表明基于RNA转录和转录后加工水平检测环形RNA过表达后能准确环化。

(13)PCR产物sanger测序

将PCR产物进行snager测序，测序结果如图15所示：结果显示pCD5-ciR载体以环化介导序列IS-L18、IS-S10和IS-Y10构建的三个载体过表达后circRNA82002的PCR产物测序序列都正确。表明基于RNA转录和转录后加工水平检测环形RNA过表达后能准确环化。

实施例3

以本发明中pCD5-ciR、pLC5-ciR和pK25ssAAV-ciR构建人、小鼠和大鼠的共326个环形RNA表达载体，瞬时转染后基于RNA水平进行RT-qPCR检测，结果如图16-17所示，显示过表达50倍和准确剪切成环的成功比例接近100％，比前有技术有大幅度的提升。下面以4个基因的详细结果示例。

分别使用pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector、pCD-ciR和pCD5-ciR构建circRNA82002,circRNA00284,circRNA05836,rnocircRNA00978的过表达载体，转染293T细胞后进行RT-qPCR检测过表达倍数，并将PCR产物进行sanger测序，验证是否能准确环化过表达。

使用引物：

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-circRNA82002-F:

ggGGTACCaaagtgctgagattacaggcgtgagccaccacccccggccCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGATAAACCTCTCATAATGAAG；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-circRNA82002-R:

cgGGATCCtgctgggattacaggtgtgagctaccgtgccgagccTAATTCTTTTCCTTGCTTCTTACCCTATTAAAGCAGTGCTCAT；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-circRNA00284-F:

ggGGTACCaaagtgctgagattacaggcgtgagccaccacccccggccCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGGTATGGCCTCACAAGTCTT；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-circRNA00284-R:

cgGGATCCtgctgggattacaggtgtgagctaccgtgccgagccTAATTCTTTTCCTTGCTTCTTACCTGTAGTACCGAGATTGTA；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-circRNA05836-F:

ggGGTACCaaagtgctgagattacaggcgtgagccaccacccccggccCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGGTTTACAAAAGATACTGCAAGG；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-circRNA05836-R:

cgGGATCCtgctgggattacaggtgtgagctaccgtgccgagccTAATTCTTTTCCTTGCTTCTTACCTTAGATGCATGTTCTAAATAC；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-rnocircRNA00978-F:

ggGGTACCaaagtgctgagattacaggcgtgagccaccacccccggccCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGCTTCCAATAAAAACAGGACA；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-rnocircRNA00978-R:

cgGGATCCtgctgggattacaggtgtgagctaccgtgccgagccTAATTCTTTTCCTTGCTTCTTACCTTGTAGAAATTCGACTAAA；

pCD-ciR-circRNA82002-F:ggGGTACCTGAAATATGCTATCTTACAGATAAACCTCTCATAATGAAG；

pCD-ciR-circRNA82002-R:cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCCTATTAAAGCAGTGCTCAT；

pCD-ciR-circRNA00284-F:ggGGTACCTGAAATATGCTATCTTACAGGTATGGCCTCACAAGTCTT；

pCD-ciR-circRNA00284-R：cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCTGTAGTACCGAGATTGTA；

pCD-ciR-circRNA05836-F:ggGGTACCTGAAATATGCTATCTTACAGGTTTACAAAAGATACTGCAAGG；

pCD-ciR-circRNA05836-R:cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCTTAGATGCATGTTCTAAATAC；

pCD-ciR-rnocircRNA00978-F：ggGGTACCTGAAATATGCTATCTTACAGCTTCCAATAAAAACAGGACA；

pCD-ciR-rnocircRNA00978-R：cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCTTGTAGAAATTCGACTAAA；

pCD5-ciR-circRNA82002-F:cgGAATTCCTAATACTTTCAGATAAACCTCTCATAATGAAG；

pCD5-ciR-circRNA82002-R:cgGGATCCAGTTGTTCTTACCCTATTAAAGCAGTGCTCAT；

pCD5-ciR-circRNA00284-F:cgGAATTCCTAATACTTTCAGGTATGGCCTCACAAGTCTT；

pCD5-ciR-circRNA00284-R：cgGGATCCAGTTGTTCTTACCTGTAGTACCGAGATTGTA；

pCD5-ciR-circRNA05836-F:cgGAATTCCTAATACTTTCAGGTTTACAAAAGATACTGCAAGG；

pCD5-ciR-circRNA05836-R:cgGGATCCAGTTGTTCTTACCTTAGATGCATGTTCTAAATAC；

pCD5-ciR-rnocircRNA00978-F:cgGAATTCCTAATACTTTCAGCTTCCAATAAAAACAGGACA；

pCD5-ciR-rnocircRNA00978-R:cgGGATCCAGTTGTTCTTACCTTGTAGAAATTCGACTAAA。

其中制备步骤如下：(1)目的片段PCR扩增；(2)PCR扩增产物回收；(3)目的片段与空载体双酶切；(4)将目的片段与载体连接；(5)转化感受态细胞Trans1T1，并进行测序鉴定；(6)无内毒素质粒抽提；(7)将细胞瞬时转染；(8)对细胞进行样品RNA抽提；(9)逆转录：配制第一链cDNA合成反应液，组分及含量如下表5所示：

表5

用移液器轻轻吹打混匀；按下表6条件进行第一链cDNA合成反应：

表6

25℃	10min
		42℃	15min
85℃	5min

(10)qPCR实验：qPCR反应体系配制，反应条件如下表7所示：

表7

qPCR反应程序设置，条件如下表8所示：

表8

引物：

circRNA82002-F1:5'-GCACTGCTTTAATAGGATAA-3'，

circRNA82002-R1:5'-AGCTGATACTTCATATTCACA-3'；

扩增大小158bp；

circRNA00284-KF:5'-CAATCTCGGTACTACAGGTATG-3'，

circRNA00284-R:5'-TCACATAGGTCCGTGGATAG-3'；

扩增大小155bp；

circRNA05836-F1:5'-gaacatgcatctaaggtttaca-3'，

circRNA05836-R1:5'-tgtcctgaagtacatagatg-3'；

扩增大小155bp；

rnocircRNA00978-F2:5'-gtcgaatttctacaagcttc-3'，

rnocircRNA00978-R2:5'-cttctccaaatatcctcatattg-3'；

扩增大小176bp；

β-actin-F:5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，

β-actin-R:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'；

扩增大小250bp；

(11)qPCR数据处理：根据2^{-△△C t}公式计算目标基因进行表达情况：

△△Ct＝(Ct_A2-Ct_B2)-(Ct_A1-Ct_B1)＝X

则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2^-X倍。

实验结果如图8-11所示：由图18可知，pCD-ciR和pCD5-ciR可使circRNA82002高效率过表达，而pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector不能；由图19可知，pCD5-ciR能使circRNA00284高效率过表达，而pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector和pCD-ciR不能；由图20可知，pCD-ciR和pCD5-ciR能使circRNA05836高效率过表达，而pcDNA3.1(+)CircRNA MiniVector不能；由图21可知，pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector、pCD-ciR和pCD5-ciR都能使rnocircRNA00978高效率过表达。以上结果表明本发明中的pCD5-ciR载体基于RNA转录和转录后加工水平检测环形RNA有过表达，且成功率明显高于前有技术方案。

(12)PCR产物电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，判断条带大小是否正确。

引物：

circRNA82002-BKF:5'-CCAGATTCTGCCGAACCAATG-3'，

circRNA82002-BKR:5'-CTCTTTACACTCCCCATTGCT-3'；

扩增大小248bp；

circRNA00284-F:5'-TGTTGGTGGATCCTGTTCGG-3'，

circRNA00284-R:5'-TCACATAGGTCCGTGGATAG-3'；

扩增大小250bp；

hsa_circ_0005836-F2:5'-AGGACAACAAATTTCGCCTGC-3'，

hsa_circ_0005836-R1:5'-tgtcctgaagtacatagatg-3'；

扩增大小208bp；

rnocircRNA00978-F1:5'-GGGGTTTTATTTTCTCTCAGC-3'，

rnocircRNA00978-R2:5'-cttctccaaatatcctcatattg-3'；

扩增大小222bp；

β-actin-F:5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，

β-actin-R:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'；

扩增大小250bp；

其中circRNA82002、circRNA00284、circRNA05836、circRNA00978过表达后PCR产物电泳结果分别如图22-图25所示：结果显示pCD5-ciR组中4个基因条带大小都正确，pCD-ciR组中有3个基因条带大小正确，而pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector组中只有1个基因条带大小是正确的。以上表明本发明中的pCD5-ciR载体基于RNA转录和转录后加工水平检测环形RNA过表达后能准确环化，且成功率明显高于前有技术方案。

(13)PCR产物sanger测序：将PCR产物进行snager测序，其中circRNA82002、circRNA00284、circRNA05836、circRNA00978的PCR产物sanger测序结果分别如图26-图29所示；结果显示pCD5-ciR组中4个基因环化序列都准确，pCD-ciR组中有3个基因环化序列准确，而pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector组中只有1个基因环化序列是准确的。以上结果表明本发明中的pCD5-ciR载体基于RNA转录和转录后加工水平检测环形RNA过表达后能准确环化，且成功率明显高于前有技术方案。

实施例4

除基于RNA转录和转录后加工水平的检测外，本发明也基于RNA转录和转录后调控的下游即编码翻译蛋白质水平进行检测，另外测试非天然环形RNA能否准确环化过表达，设计验证实施例如下。

分别使用pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector、pCD-ciR和pCD5-ciR构建IRES(内部核糖体进入位点)介导翻译的GFP(绿色荧光蛋白)报告载体，其中IRES-GFP设计序列如SEQID NO:6所示。在该序列中，1-359nt为GFP的后半段，360-929nt为IRES序列，930-1290nt为GFP的前半段。该GFP报告载体只有在准确环化时才可以准确转录翻译GFP蛋白，使用荧光显微镜可以检测到绿色荧光，若不能环化或环化错误，则不能准确转录翻译GFP蛋白，即荧光显微镜检测不到绿色荧光。

使用引物：

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-IRES-GFP-F:

ggGGTACCaaagtgctgagattacaggcgtgagccaccacccccggccCACTTTTTGTAAAGGTACGTACTAATGACTTTTTTTTTATACTTCAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGG；

pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector-IRES-GFP-R:

cgGGATCCtgctgggattacaggtgtgagctaccgtgccgagccTAATTCTTTTCCTTGCTTCTTACCCAGGGTGTCGCCCTCGAACT；

pCD-ciR-IRES-GFP-F:ggGGTACCTGAAATATGCTATCTTACAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGG；

pCD-ciR-IRES-GFP-R:cgGGATCCTCAAGAAAAAATATATTCACCCAGGGTGTCGCCCTCGAACT；

pCD5-ciR-IRES-GFP-F:cgGAATTCCTAATACTTTCAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGG；

pCD5-ciR-IRES-GFP-R:cgGGATCCAGTTGTTCTTACCCAGGGTGTCGCCCTCGAACT；

其中制备步骤如下：(1)目的片段PCR扩增；(2)PCR扩增产物回收；(3)目的片段与空载体双酶切；(4)将目的片段与载体连接；(5)转化感受态细胞Trans1T1，并进行测序鉴定；(6)无内毒素质粒抽提；(7)将细胞瞬时转染；(8)荧光显微镜检测结果：结果如图30a-30f所示；荧光显微镜检测显示pCD5-ciR-IRES-GFP组有绿色荧光，而pcDNA3.1(+)CircRNAMini Vector-IRES-GFP和pCD-ciR-IRES-GFP未检测到绿色荧光。表明本专利构建的pCD5-ciR能使IRES-GFP准确环化过表达，而pcDNA3.1(+)CircRNA Mini Vector和pCD-ciR不能使IRES-GFP准确环化过表达。

以上结果表明本发明中的pCD5-ciR载体基于RNA转录、转录后加工和编码翻译蛋白质水平检测环形RNA有过表达，蛋白质能正常准确翻译，并能对非天然(人工设计)的环形RNA准确环化高效率过表达，且成功率明显高于前有技术方案。

本发明基于Alu重复元件促进侧翼序列内含子互补配对以拉近外显子两端，配以剪切体能准确识别的内含子序列SRS(Splice recognition sequence，SRS)和辅助的环化介导序列IS(Interaction sequence,IS)，预留单一内切酶位点，设计发明一种精准型(准确环化)的通用环形RNA表达框架。其相对于现有技术通用性更高：能通用于人、小鼠、大鼠、家鸡和家猪等物种的不同环形RNA，能通用于天然的和人工设计的环形RNA序列，对200nt-2500nt范围内的环形RNA都能实现准确环化过表达；六种载体使用同一酶切位点，载体之间移植方便，有利于细胞瞬时表达、细胞稳定表达和动物体表达等多种需求互相切换；环化准确性高：过表达后成环剪切准确，SRS和IS配套组合使成环时在AG-GT处精确剪切，成环的环形RNA无碱基添加或缺失；过表达效率高：成环过表达效果稳定，在准确环化的前提下能使环形RNA显著过表达50倍到上万倍；应用广泛：适用于细胞瞬时表达、细胞稳定表达和动物体表达等多种需求，并有GFP和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因可供标记和筛选。本发明中环形RNA表达框架对RNA转录、转录后加工和编码翻译蛋白质水平都能准确环化高效率过表达，蛋白质能正常准确翻译，并能对非天然(人工设计)的环形RNA准确环化高效率过表达，且成功率明显高于前有技术方案。该表达框架和载体可以应用于天然的环形RNA体内过表达和人工设计的环形RNA体内过表达，也可以表达人工设计的多miRNA结合位点环形RNA以用于miRNA sponge研究或者表达IRES-GFP/环形RNA以用于环形RNA翻译蛋白质研究。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州吉赛生物科技股份有限公司

<120> 一种基于Alu元件的精准型环形RNA表达框架和载体及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctccacctcc caggttcaag cgattctcct ccctcagcct cccgagtagc tgggaccaca 60

ggcatgcacc accatcccca gctaattttt gcattattag tagagttggg atttcttcac 120

cgtgttggcc aggccggtct tggactcctg acctcaagtg atccaactgc ctcagcctct 180

caaagtgcta ggattacagg 200

<210> 2

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gatctatact tttctgatat tataaagata gttatcttct ccaagggaaa aaatcatctt 60

catggaaatt aattactttt ttacaaattg tgaatttgac ccttaagagt tttcttcctg 120

atatttaaaa ttgaaaaaaa aattgttgac attaatattt cttctttc 168

<210> 3

<211> 773

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctccacctcc caggttcaag cgattctcct ccctcagcct cccgagtagc tgggaccaca 60

ggcatgcacc accatcccca gctaattttt gcattattag tagagttggg atttcttcac 120

cgtgttggcc aggccggtct tggactcctg acctcaagtg atccaactgc ctcagcctct 180

caaagtgcta ggattacagg gatctatact tttctgatat tataaagata gttatcttct 240

ccaagggaaa aaatcatctt catggaaatt aattactttt ttacaaattg tgaatttgac 300

ccttaagagt tttcttcctg atatttaaaa ttgaaaaaaa aattgttgac attaatattt 360

cttctttcga attctaatac tttcagtgct gtggcgcgtc aacgcctgta agaacaactg 420

gatcctagct aacaactcca tactttttgg ttgtttatta atgtgaaatt tctgctaaat 480

gaaatacttt tgtgtgtgtt tgtggtagaa gagaccactt cagttaaata aggaaatcaa 540

gagaggatca atttaggaag attcagatat acagccgggt gcagtggctc atgcctgtaa 600

tccctgcact tagggaggct gaggcgggtg gatgacctga ggttaggagt tcaagaccag 660

cctggccaac atggcgaaac ccccatctct actaaaaata acaaaaatta gctgggtgtg 720

gtggtgggtg tctataatcc cagcaacttg ggaggctgag gcaggagaat cac 773

<210> 4

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tagctaacaa ctccatactt tttggttgtt tattaatgtg aaatttctgc taaatgaaat 60

acttttgtgt gtgtttgtgg tagaagagac cacttcagtt aaataaggaa atcaagagag 120

gatcaattta ggaagattca gatataca 148

<210> 5

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gccgggtgca gtggctcatg cctgtaatcc ctgcacttag ggaggctgag gcgggtggat 60

gacctgaggt taggagttca agaccagcct ggccaacatg gcgaaacccc catctctact 120

aaaaataaca aaaattagct gggtgtggtg gtgggtgtct ataatcccag caacttggga 180

ggctgaggca ggagaatcac 200

<210> 6

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 60

agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg 120

gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 180

accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 240

acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 300

tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaag 360

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 420

tgcgtttgtc tatatgtgat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 480

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 540

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 600

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 660

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 720

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 780

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 840

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 900

ggacgtggtt ttcctttgaa aaagccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 960

gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 1020

ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 1080

ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 1140

gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 1200

aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 1260

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 1290

Claims

1.一种基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，包括一个或多个Alu元件、一个或多个酶切位点、一个或多个剪切识别序列、一个或多个环化介导序列、剪切受体序列、剪切供体序列、一个或多个环形RNA序列；

所述环形RNA表达框架包括按顺序连接的第一Alu元件序列，第一剪切识别序列，内切酶位点序列，5’环化介导序列，剪切受体序列，环形RNA序列，剪切供体序列，3’环化介导序列，内切酶位点序列，第二剪切识别序列，第二Alu元件序列；

其中，所述5’环化介导序列和3’环化介导序列的核苷酸序列选自IS-L18、IS-S10和IS-Y10序列中的一种，所述IS-L18、IS-S10和IS-Y10序列分别如下：

IS-L18：

5’环化介导序列：5’-TGAAATATGCTATCTTAC-3’

3’环化介导序列：5’-TCAAGAAAAAATATATTC-3’；

IS-S10：

5’环化介导序列：5’-ATCTTACTTC-3’

3’环化介导序列：5’-ATAAGTTCAT-3’；

IS-Y10：

5’环化介导序列：5’-TAATACTTTC-3’

3’环化介导序列：5’-AGTTGTTCTT-3’。

2.根据权利要求1所述的基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，所述酶切位点选自BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI、ApaI、BglII、KpnI、NcoI中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，所述酶切位点为BamHI和EcoRI双酶切位点。

4.根据权利要求1所述的基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，所述基于Alu元件的环形RNA表达框架具有773nt，其中第1-200nt为第一Alu元件序列，第201-368nt为第一剪切识别序列，第369-374nt为EcoRI内切酶位点序列，第375-384nt为5’环化介导序列，第385-386nt为剪切受体序列，第387-407nt为环形RNA序列，第408-409nt为剪切供体序列，第410-419nt为3’环化介导序列，第420-425nt为BamHI内切酶位点序列，第426-573nt为第二剪切识别序列，第574-773nt为第二Alu元件序列。

5.根据权利要求4所述的基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，所述第一Alu元件序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二Alu元件序列如SEQ ID NO:5所示。

6.根据权利要求4所述的基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，所述第一剪切识别序列核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述第二剪切识别序列核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

7.根据权利要求1所述的基于Alu元件的环形RNA表达框架，其特征在于，所述基于Alu元件的环形RNA表达框架序列如SEQ ID NO:3所示。

8.一种含有如权利要求1-7中任一项所述的基于Alu元件的环形RNA表达框架的载体。

9.一种制备如权利要求8所述含有基于Alu元件的环形RNA表达框架的载体的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）目的片段PCR扩增：以全基因合成法合成环形RNA表达框架序列，用作PCR扩增的模板；

（2）将PCR扩增产物回收；

（3）向空载体中加入限制性内切酶进行酶切；

（4）进行In-Fusion连接；

（5）转化感受态细胞，并进行测序鉴定；

（6）无内毒素质粒抽提保存，即得。