CN114317602A - 一种环状rna的高效表达方法及表达载体 - Google Patents
一种环状rna的高效表达方法及表达载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317602A CN114317602A CN202111518785.8A CN202111518785A CN114317602A CN 114317602 A CN114317602 A CN 114317602A CN 202111518785 A CN202111518785 A CN 202111518785A CN 114317602 A CN114317602 A CN 114317602A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- circular rna
- rna
- sequence
- circular
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 140
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims description 3
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 46
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 abstract 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 abstract 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108090000638 Ribonuclease R Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003701 histiocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体，克隆环状RNA全长序列至环状RNA表达载体pCRE5(puromysin筛选标记)或pCRE6(copGFP筛选标记)载体；RNA抽提；逆转录；环化检测PCR体系及引物构建。本发明通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统；将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达；促进了环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种环状RNA的高效表达方法及表达载体。
背景技术
目前，环状RNA是一种普遍存在的首尾共价结合的环状RNA分子，广泛存在于不同物种中。相较于线性RNA分子，环状RNA的环状特殊结构使其具有更高的稳定性。高通量RNA测序(RNA-seq)和环状RNA特异的生物信息学算法的发展，数以万计的环状RNA已经在人类细胞中被鉴定。后续研究表明环状RNA具有较长的序列和复杂的高级结构，能够通过多种途径，如miRNA海绵或诱饵、蛋白海绵或诱饵、蛋白功能增强器、蛋白脚手架、蛋白招募者、编码功能性多肽等，广泛地参与生物学的各个阶段和病理过程，影响细胞染色质重塑、转录、转录后修饰或信号转导等重要细胞活动中，最终调控组织细胞的生物学反应和细胞命运。尽管已经发现环状RNA能够广泛地影响细胞功能，但在细胞内研究环状RNA的生物学功能及机制还有较大难度，其主要体现在环状RNA细胞内的正确剪接环化需要序列依赖性的顺式作用元件以及调控其精确剪接的反式作用因子。同时，普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)在细胞内研究环状RNA的生物学功能及机制还有较大难度，其主要体现在环状RNA细胞内的正确剪接环化需要序列依赖性的顺式作用元件以及调控其精确剪接的反式作用因子。
(2)普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。
解决以上问题及缺陷的难度为：细胞内环状RNA表达丰度较低的主要原因为环状RNA形成过程中上下游形成套索结构的难度较大，同时，在环化位点正确剪接的效率较低，两种因素导致环状RNA表达丰度较线性转录本更低。此外，普通的环状RNA表达载体大多将体内环状RNA的侧翼序列直接克隆至表达载体，形成环状RNA必须的套索结构和准确剪接结构的效率较低，导致环状RNA形成效率较低。本环状RNA过表达载体在环状RNA形成的必须原件基础上，对两种原件进行了深度优化。首先，我们将细胞内表达丰度较高的环状RNACIRS7的上游侧翼序列及其反向互补序列克隆至表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO多克隆位点，使环状RNA在表达过程中能够形成牢固的套索结构。同时，我们将SLC34A2-ROS1来源的环状RNA F-circSR1的上下游50bp内含子序列插入至过表达载体CIRS7互补序列之间，为环状RNA的形成提供了高效的反向剪接序列。针对该设计方法，我们进行了大量的实验，形成了能够高效正确表达环状RNA的表达载体pCRE5。
解决以上问题及缺陷的意义为：为现有的环状RNA细胞功能研究提供了有力的工具，同时该载体不仅能够进行瞬时转染，还能结合慢病毒包装系统，产生能够实现细胞能稳定过表达环状RNA的慢病毒，大大克服了细胞内环状RNA表达效率低，环化不正确，细胞瞬时转染效率低，细胞对转染试剂不耐受等问题，短时或长时研究环状RNA均能通过该载体完成。因此，本载体不仅解决了环状RNA正确高效表达的问题，还降低了环状RNA细胞实验门槛，使用户根据实验目的，拥有多样的实验策略。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体。
本发明是这样实现的，一种环状RNA的高效表达方法，所述环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：
步骤一，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体,命名为pCRE5-circRNA；
步骤二，将pCRE5-circRNA质粒瞬时转染至目标细胞或包装成慢病毒感染目标细胞，并分别对目标细胞进行RNA抽提和逆转录；
步骤三，环化引物设计及检测PCR体系构建。
进一步，步骤一中，所述克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体，包括：
(1)PCR扩增F-circSR1全长；
(2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F-circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5-F-circSR1。
进一步，步骤(1)中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
步骤(2)中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：
进一步，步骤一中，所述PCR产物回收扩增片段，全长1907bp。
进一步，步骤二中，所述RNA抽提，包括：
(1)使用Lipo2000将pCRE5-F-circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，24h后收获RNA；
(2)提取F-circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；
(3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；
(4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g 10min4℃；
(5)弃上清，留沉淀，加入1ml 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；
(6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；
(7)用1μL RNA测浓度。
进一步，步骤二中，所述逆转录，包括：
(1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；
(2)10*RT buffer 2μL，M-Mlv 1μL，inhibitor 1μL，Rnase free water 4μL；
(3)65℃1.3h，80℃10min，stroe at-20℃。
进一步，步骤三中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
进一步，步骤三中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：
PCR反应条件
进一步，步骤三中，1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段长度675bp。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的环状RNA的高效表达方法构建得到的环状RNA的高效表达载体，所述新型环状RNA表达载体上游侧翼序列为SEQ ID NO：3，所述新型环状RNA表达载体下游侧翼序列为SEQ ID NO：4，所述新型环状RNA表达载体核心序列为SEQ ID NO：5。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的环状RNA的高效表达方法及表达载体，提供一种新的环状RNA表达策略，并构建了高效表达环状RNA的载体，通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统。此外，该载体基于慢病毒表达载体构建，能够进行瞬时转染和包装慢病毒后感染细胞实现环状RNA的过表达，拓宽了细胞实验的范围。
本发明的目的在于提供一种利用细胞本身的RNA剪接相关原件实现环状RNA在细胞内准确剪接及过表达的载体，以此提供一种新的环状RNA功能研究工具。本环状RNA过表达载体克隆整合环状RNA生物合成必须的细胞调控原件，并进行优化，使环状RNA前体在细胞内形成套索结构，再借助环状RNA旁侧的人工内含子协助套索结构在环化位点进行剪接，促使环状RNA形成。具体的，本发明首先将细胞内普遍高表达环状RNA CIRS7CIRS7的侧翼上游内含子序列及其反向互补序列克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒的多克隆位点区，促进环状RNA侧翼序列形成互补配对的套索结构，促进环状RNA高效环化。同时，本发明在内含子序列及其反向互补序列间添加来源于F-circSR1环化位点两侧各50bp的人工内含子序列，提供环状RNA环化必需的splice acceptor and donor(SA-SD)序列，协助环状RNA前体在套索结构的正确环化位点剪接，使环状RNA正确成环。
本发明将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达，使用者无需进行其他的改造即可使用，从使用上做到了方便快捷。本发明促进环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的环状RNA的高效表达方法流程图。
图2是本发明实施例提供的使用Vazyme ClonExpressTM II One Step CloningKit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接的示意图。
图3是本发明实施例提供的1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段示意图。
图4和图5是本发明实施例提供的新型环状RNA表达载体图谱。
图6是本发明实施例提供的发现过表达融合基因SLC34A2-ROS1来源的环状RNA F-circSR能够增强肺癌细胞的迁移能力示意图。
图7是本发明实施例提供的发现过表达融合基因EML4-ALK来源的环状RNA能够增强肺癌细胞的迁移能力示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：
S101，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体；
S102，在细胞内对环状RNA进行过表达，并依次进行RNA抽提和逆转录；
S103，环化检测PCR体系及引物构建。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明提供一种新的环状RNA表达策略，并构建了高效表达环状RNA的载体。本发明通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统。
本发明的目的在于提供一种利用细胞本身的RNA剪接相关原件实现环状RNA在细胞内准确剪接及过表达的载体，以此提供一种新的环状RNA功能研究工具。普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。本环状RNA过表达载体克隆整合环状RNA生物合成必须的细胞调控原件，并进行优化，使环状RNA前体在细胞内形成套索结构，再借助环状RNA旁侧的人工内含子协助套索结构在环化位点进行剪接，促使环状RNA形成。具体的，首先将细胞内普遍高表达环状RNA CIRS7CIRS7的侧翼上游内含子序列及其反向互补序列克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO或pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒的多克隆位点区，促进环状RNA侧翼序列形成互补配对的套索结构，促进环状RNA高效环化。同时，在内含子序列及其反向互补序列间添加来源于F-circSR1环化位点两侧各50bp的人工内含子序列，提供环状RNA环化必需的splice acceptor and donor(SA-SD)序列，协助环状RNA前体在套索结构的正确环化位点剪接，使环状RNA正确成环。
该表达方法(实例)包括以下步骤：
细胞内过表达环状RNA，以SLC34A2-ROS1融合基因来源的环状RNA F-CircSR1为例。
1.克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体。
1)PCR扩增F-circSR1全长
PCR引物：
F1:5’-agctgttttctcatccacagACCATGGCTCCCTGGCCTG-3’
R1:5’-ttctgaagaatcaaacttacCTTCAAAGCTTTCATTTATGACTCCAC-3’
使用phana酶反应体系(vazyme)，50μL，PCR反应条件见表1。
表1 PCR反应条件
PCR产物回收扩增片段，全长1907bp；
2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F-circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5-F-circSR1(见图2)。
2.RNA抽提：
1)使用Lipo2000将pCRE5-F-circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，4h后收获RNA；
2)提取F-circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；
3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；
4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g10min4℃；
5)弃上清，留沉淀，加入1ml 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；
6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；
7)用1μL RNA测浓度
3.逆转录：
1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；
2)10*RT buffer 2μL，M-Mlv 1μL，inhibitor 1μL，Rnase free water 4μL；
3)65℃1.3h，80℃10min，stroe at-20℃；
4.环化检测PCR体系及引物：
1)PCR引物：
F1:5’-GTGAAGATTGGAGACTTTGGAC-3’
R1:5’-TCCTGAAGAGTGGGTAGGTT-3’
2)条件：
使用phana酶反应体系(vazyme)，50μL，PCR反应条件见表2。
表2 PCR反应条件
1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段长度675bp(见图3)。
在相同的PCR循环数条件下，可见实验组和对照组中内参ACTIN扩增量相同，而F-circSR1仅在实验组中出现，表明两种细胞内成功表达F-CircSR1。
新型环状RNA表达载体上游侧翼序列：
CTGTAAGAGTAGTCTCATGATGTCTTTTAATTTAATATCTAGGCCCTAATACACAACTCTTTGAATATTGCTACTATCTTTCAGCATGACTTTCCAATACCATTAAGATTAAGCCTTTCTGTTCTTCAGTTTCTCTAACTCAAGTCTTCTAAGCTCCACAGCTTCCAACATCTTTAATTACCAGATCTTCCCAATATTATAACATCCGTGCATTCCAGTCCCTGTCCTGCAGCATCTCCAATGCCCTTGTTTTCTAAACTTCCCAGTATTCAAGTCATTAAAAATTTAGGTCTTCTAATATCTCCAACAACCCATCTTCAAAGTCCAGGTCTTGTCTTTCAGAATCCAGAGTTCTAAATTACAAGTCTTCCATGGTCCTAATCCTCCAATGTCTCCTATATACAGGTCTTCTAGAGGCTATGTATTTCATAGTGTTTAAGTCTAGATTCTTCAATGTCTTCCAGCACTTACATCATTCAGTTTTTACATTTTTAAATGTCTCCTACTTTCTAGTTTTACAGTGTATTTTTATCGCCAATTCCTCCAATGCCCAAGTCTTTAAATACCTGCAAGAACTTTCAGGTACATCAATATCCTCAATGTCTGAATGAATAGACCTCTTAATATCCTGGTCTCATATTGTCCAGGCTGCCAGTATTCTTGACATCCAGCATCTTTAAAATTTAATTCTTCCAAACTGTCTTTTTGACATAAATATGTCAATATCCATGCTTACCAATGTCTCCCAATATCCAGGGCTTCTCATTTTAGGATTTATAAATGTCTACATCTGCTGTTGTTTATATCTGCCAGTATTTAGGAGTTCCAAGGTACAGGACTTACAATATCTCTAATTTCCAGAGATTTCAGTGTCTATGACTTCCAATATTCAATATCCCAATGTTCAGGGCCTCCAGAAATATCAATGTCCAGAGTAACCAAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacag
新型环状RNA表达载体下游侧翼序列：
gtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgaTGGTTACTCTGGACATTGATATTTCTGGAGGCCCTGAACATTGGGATATTGAATATTGGAAGTCATAGACACTGAAATCTCTGGAAATTAGAGATATTGTAAGTCCTGTACCTTGGAACTCCTAAATACTGGCAGATATAAACAACAGCAGATGTAGACATTTATAAATCCTAAAATGAGAAGCCCTGGATATTGGGAGACATTGGTAAGCATGGATATTGACATATTTATGTCAAAAAGACAGTTTGGAAGAATTAAATTTTAAAGATGCTGGATGTCAAGAATACTGGCAGCCTGGACAATATGAGACCAGGATATTAAGAGGTCTATTCATTCAGACATTGAGGATATTGATGTACCTGAAAGTTCTTGCAGGTATTTAAAGACTTGGGCATTGGAGGAATTGGCGATAAAAATACACTGTAAAACTAGAAAGTAGGAGACATTTAAAAATGTAAAAACTGAATGATGTAAGTGCTGGAAGACATTGAAGAATCTAGACTTAAACACTATGAAATACATAGCCTCTAGAAGACCTGTATATAGGAGACATTGGAGGATTAGGACCATGGAAGACTTGTAATTTAGAACTCTGGATTCTGAAAGACAAGACCTGGACTTTGAAGATGGGTTGTTGGAGATATTAGAAGACCTAAATTTTTAATGACTTGAATACTGGGAAGTTTAGAAAACAAGGGCATTGGAGATGCTGCAGGACAGGGACTGGAATGCACGGATGTTATAATATTGGGAAGATCTGGTAATTAAAGATGTTGGAAGCTGTGGAGCTTAGAAGACTTGAGTTAGAGAAACTGAAGAACAGAAAGGCTTAATCTTAATGGTATTGGAAAGTCATGCTGAAAGATAGTAGCAATATTCAAAGAGTTGTGTATTAGGGCCTAGATATTAAATTAAAAGACATCATGAGACTACTCTTACAG
新型环状RNA表达载体核心序列：
CTGTAAGAGTAGTCTCATGATGTCTTTTAATTTAATATCTAGGCCCTAATACACAACTCTTTGAATATTGCTACTATCTTTCAGCATGACTTTCCAATACCATTAAGATTAAGCCTTTCTGTTCTTCAGTTTCTCTAACTCAAGTCTTCTAAGCTCCACAGCTTCCAACATCTTTAATTACCAGATCTTCCCAATATTATAACATCCGTGCATTCCAGTCCCTGTCCTGCAGCATCTCCAATGCCCTTGTTTTCTAAACTTCCCAGTATTCAAGTCATTAAAAATTTAGGTCTTCTAATATCTCCAACAACCCATCTTCAAAGTCCAGGTCTTGTCTTTCAGAATCCAGAGTTCTAAATTACAAGTCTTCCATGGTCCTAATCCTCCAATGTCTCCTATATACAGGTCTTCTAGAGGCTATGTATTTCATAGTGTTTAAGTCTAGATTCTTCAATGTCTTCCAGCACTTACATCATTCAGTTTTTACATTTTTAAATGTCTCCTACTTTCTAGTTTTACAGTGTATTTTTATCGCCAATTCCTCCAATGCCCAAGTCTTTAAATACCTGCAAGAACTTTCAGGTACATCAATATCCTCAATGTCTGAATGAATAGACCTCTTAATATCCTGGTCTCATATTGTCCAGGCTGCCAGTATTCTTGACATCCAGCATCTTTAAAATTTAATTCTTCCAAACTGTCTTTTTGACATAAATATGTCAATATCCATGCTTACCAATGTCTCCCAATATCCAGGGCTTCTCATTTTAGGATTTATAAATGTCTACATCTGCTGTTGTTTATATCTGCCAGTATTTAGGAGTTCCAAGGTACAGGACTTACAATATCTCTAATTTCCAGAGATTTCAGTGTCTATGACTTCCAATATTCAATATCCCAATGTTCAGGGCCTCCAGAAATATCAATGTCCAGAGTAACCAAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacagGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGgtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgaTGGTTACTCTGGACATTGATATTTCTGGAGGCCCTGAACATTGGGATATTGAATATTGGAAGTCATAGACACTGAAATCTCTGGAAATTAGAGATATTGTAAGTCCTGTACCTTGGAACTCCTAAATACTGGCAGATATAAACAACAGCAGATGTAGACATTTATAAATCCTAAAATGAGAAGCCCTGGATATTGGGAGACATTGGTAAGCATGGATATTGACATATTTATGTCAAAAAGACAGTTTGGAAGAATTAAATTTTAAAGATGCTGGATGTCAAGAATACTGGCAGCCTGGACAATATGAGACCAGGATATTAAGAGGTCTATTCATTCAGACATTGAGGATATTGATGTACCTGAAAGTTCTTGCAGGTATTTAAAGACTTGGGCATTGGAGGAATTGGCGATAAAAATACACTGTAAAACTAGAAAGTAGGAGACATTTAAAAATGTAAAAACTGAATGATGTAAGTGCTGGAAGACATTGAAGAATCTAGACTTAAACACTATGAAATACATAGCCTCTAGAAGACCTGTATATAGGAGACATTGGAGGATTAGGACCATGGAAGACTTGTAATTTAGAACTCTGGATTCTGAAAGACAAGACCTGGACTTTGAAGATGGGTTGTTGGAGATATTAGAAGACCTAAATTTTTAATGACTTGAATACTGGGAAGTTTAGAAAACAAGGGCATTGGAGATGCTGCAGGACAGGGACTGGAATGCACGGATGTTATAATATTGGGAAGATCTGGTAATTAAAGATGTTGGAAGCTGTGGAGCTTAGAAGACTTGAGTTAGAGAAACTGAAGAACAGAAAGGCTTAATCTTAATGGTATTGGAAAGTCATGCTGAAAGATAGTAGCAATATTCAAAGAGTTGTGTATTAGGGCCTAGATATTAAATTAAAAGACATCATGAGACTACTCTTACAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
新型环状RNA表达载体图谱如图4和图5所示。
本发明将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达，使用者无需进行其他的改造即可使用，从使用上做到了方便快捷。本发明促进环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。
目前已有相关研究论文利用本发明的载体进行了环状RNA的细胞功能研究。
例1：Mol Cancer.2019 May 22；18(1):98.doi:10.1186/s12943-019-1028-9.发现过表达融合基因SLC34A2-ROS1来源的环状RNA F-circSR能够增强肺癌细胞的迁移能力。
如图6所示，A：过表达F-circEA的载体示意图，此处使用的是pCRE5；B：RNase R消化鉴定F-circSR的过表达；C：F-circSR过表达后增强肺癌细胞H1299及A549的迁移能力。
例2：Cell Res.2018 Jun；28(6):693-695.doi:10.1038/s41422-018-0033-7。发现过表达融合基因EML4-ALK来源的环状RNA能够增强肺癌细胞的迁移能力。
如图7所示，A：过表达F-circEA的载体示意图，此处使用的是pCRE6；B：液相杂交鉴定F-circEA的过表达；C：F-circEA过表达后增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种环状RNA的高效表达方法及表达载体
<160> 5
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctgttttctcatccacagaccatggctccctggcctg
ttctgaagaatcaaacttaccttcaaagctttcatttatgactccac
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgaagattggagactttggac
tcctgaagagtgggtaggtt
<210> 3
<211> 1034
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtaagagtagtctcatgatgtcttttaatttaatatctaggccctaatacacaactctttgaatattgctactatctttcagcatgactttccaataccattaagattaagcctttctgttcttcagtttctctaactcaagtcttctaagctccacagcttccaacatctttaattaccagatcttcccaatattataacatccgtgcattccagtccctgtcctgcagcatctccaatgcccttgttttctaaacttcccagtattcaagtcattaaaaatttaggtcttctaatatctccaacaacccatcttcaaagtccaggtcttgtctttcagaatccagagttctaaattacaagtcttccatggtcctaatcctccaatgtctcctatatacaggtcttctagaggctatgtatttcatagtgtttaagtctagattcttcaatgtcttccagcacttacatcattcagtttttacatttttaaatgtctcctactttctagttttacagtgtatttttatcgccaattcctccaatgcccaagtctttaaatacctgcaagaactttcaggtacatcaatatcctcaatgtctgaatgaatagacctcttaatatcctggtctcatattgtccaggctgccagtattcttgacatccagcatctttaaaatttaattcttccaaactgtctttttgacataaatatgtcaatatccatgcttaccaatgtctcccaatatccagggcttctcattttaggatttataaatgtctacatctgctgttgtttatatctgccagtatttaggagttccaaggtacaggacttacaatatctctaatttccagagatttcagtgtctatgacttccaatattcaatatcccaatgttcagggcctccagaaatatcaatgtccagagtaaccaaatacgactcactatagggagacccaagcttggtaccgagctcgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacag
<210> 4
<211> 991
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgatggttactctggacattgatatttctggaggccctgaacattgggatattgaatattggaagtcatagacactgaaatctctggaaattagagatattgtaagtcctgtaccttggaactcctaaatactggcagatataaacaacagcagatgtagacatttataaatcctaaaatgagaagccctggatattgggagacattggtaagcatggatattgacatatttatgtcaaaaagacagtttggaagaattaaattttaaagatgctggatgtcaagaatactggcagcctggacaatatgagaccaggatattaagaggtctattcattcagacattgaggatattgatgtacctgaaagttcttgcaggtatttaaagacttgggcattggaggaattggcgataaaaatacactgtaaaactagaaagtaggagacatttaaaaatgtaaaaactgaatgatgtaagtgctggaagacattgaagaatctagacttaaacactatgaaatacatagcctctagaagacctgtatataggagacattggaggattaggaccatggaagacttgtaatttagaactctggattctgaaagacaagacctggactttgaagatgggttgttggagatattagaagacctaaatttttaatgacttgaatactgggaagtttagaaaacaagggcattggagatgctgcaggacagggactggaatgcacggatgttataatattgggaagatctggtaattaaagatgttggaagctgtggagcttagaagacttgagttagagaaactgaagaacagaaaggcttaatcttaatggtattggaaagtcatgctgaaagatagtagcaatattcaaagagttgtgtattagggcctagatattaaattaaaagacatcatgagactactcttacag
<210> 5
<211> 2385
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtaagagtagtctcatgatgtcttttaatttaatatctaggccctaatacacaactctttgaatattgctactatctttcagcatgactttccaataccattaagattaagcctttctgttcttcagtttctctaactcaagtcttctaagctccacagcttccaacatctttaattaccagatcttcccaatattataacatccgtgcattccagtccctgtcctgcagcatctccaatgcccttgttttctaaacttcccagtattcaagtcattaaaaatttaggtcttctaatatctccaacaacccatcttcaaagtccaggtcttgtctttcagaatccagagttctaaattacaagtcttccatggtcctaatcctccaatgtctcctatatacaggtcttctagaggctatgtatttcatagtgtttaagtctagattcttcaatgtcttccagcacttacatcattcagtttttacatttttaaatgtctcctactttctagttttacagtgtatttttatcgccaattcctccaatgcccaagtctttaaatacctgcaagaactttcaggtacatcaatatcctcaatgtctgaatgaatagacctcttaatatcctggtctcatattgtccaggctgccagtattcttgacatccagcatctttaaaatttaattcttccaaactgtctttttgacataaatatgtcaatatccatgcttaccaatgtctcccaatatccagggcttctcattttaggatttataaatgtctacatctgctgttgtttatatctgccagtatttaggagttccaaggtacaggacttacaatatctctaatttccagagatttcagtgtctatgacttccaatattcaatatcccaatgttcagggcctccagaaatatcaatgtccagagtaaccaaatacgactcactatagggagacccaagcttggtaccgagctcgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacagggatccactagtaacggccgccagtgtgctggaattctgcagatatccatcacactggcggccgctcgaggtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgatggttactctggacattgatatttctggaggccctgaacattgggatattgaatattggaagtcatagacactgaaatctctggaaattagagatattgtaagtcctgtaccttggaactcctaaatactggcagatataaacaacagcagatgtagacatttataaatcctaaaatgagaagccctggatattgggagacattggtaagcatggatattgacatatttatgtcaaaaagacagtttggaagaattaaattttaaagatgctggatgtcaagaatactggcagcctggacaatatgagaccaggatattaagaggtctattcattcagacattgaggatattgatgtacctgaaagttcttgcaggtatttaaagacttgggcattggaggaattggcgataaaaatacactgtaaaactagaaagtaggagacatttaaaaatgtaaaaactgaatgatgtaagtgctggaagacattgaagaatctagacttaaacactatgaaatacatagcctctagaagacctgtatataggagacattggaggattaggaccatggaagacttgtaatttagaactctggattctgaaagacaagacctggactttgaagatgggttgttggagatattagaagacctaaatttttaatgacttgaatactgggaagtttagaaaacaagggcattggagatgctgcaggacagggactggaatgcacggatgttataatattgggaagatctggtaattaaagatgttggaagctgtggagcttagaagacttgagttagagaaactgaagaacagaaaggcttaatcttaatggtattggaaagtcatgctgaaagatagtagcaatattcaaagagttgtgtattagggcctagatattaaattaaaagacatcatgagactactcttacagcatgcatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg
Claims (10)
1.一种环状RNA的高效表达方法，其特征在于，所述环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：
步骤一，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体,命名为pCRE5-circRNA；
步骤二，将pCRE5-circRNA质粒瞬时转染至目标细胞或包装成慢病毒感染目标细胞，并分别对目标细胞进行RNA抽提和逆转录；
步骤三，环化引物设计及检测PCR体系构建。
2.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体，包括：
(1)PCR扩增F-circSR1全长；
(2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F-circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5-F-circSR1。
3.如权利要求2所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；
步骤(2)中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：
PCR反应条件
4.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述PCR产物回收扩增片段，全长1907bp。
5.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤二中，所述RNA抽提，包括：
(1)使用Lipo2000将pCRE5-F-circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，24h后收获RNA；
(2)提取F-circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；
(3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；
(4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g 10min 4℃；
(5)弃上清，留沉淀，加入1mL 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；
(6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；
(7)用1μL RNA测浓度。
6.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤二中，所述逆转录，包括：
(1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；
(2)10*RT buffer 2μL，M-Mlv 1μL，inhibitor 1μL，RNase free water 4μL；
(3)65℃1.3h，80℃10min，store at-20℃。
7.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
8.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，
PCR反应条件为：
PCR反应条件
9.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段长度675bp。
10.一种应用如权利要求1～9任意一项所述环状RNA的高效表达方法构建得到的环状RNA的高效表达载体，其特征在于，所述新型环状RNA表达载体中环状RNA的上游侧翼序列为SEQ ID NO：3，所述新型环状RNA表达载体环状RNA的下游侧翼序列为SEQ ID NO：4，所述新型环状RNA表达载体核心序列为SEQ ID NO：5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111518785.8A CN114317602A (zh) | 2021-12-13 | 2021-12-13 | 一种环状rna的高效表达方法及表达载体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111518785.8A CN114317602A (zh) | 2021-12-13 | 2021-12-13 | 一种环状rna的高效表达方法及表达载体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317602A true CN114317602A (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=81049876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111518785.8A Pending CN114317602A (zh) | 2021-12-13 | 2021-12-13 | 一种环状rna的高效表达方法及表达载体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317602A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116694630A (zh) * | 2023-08-03 | 2023-09-05 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种促进环状rna过表达的序列组合及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110079551A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-02 | 广州辉园苑医药科技有限公司 | 一种环状rna表达载体及其构建方法和应用 |
| CN111378686A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-07 | 山东维真生物科技有限公司 | 一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG及其构建方法 |
-
2021
- 2021-12-13 CN CN202111518785.8A patent/CN114317602A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110079551A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-02 | 广州辉园苑医药科技有限公司 | 一种环状rna表达载体及其构建方法和应用 |
| CN111378686A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-07-07 | 山东维真生物科技有限公司 | 一种高效形成环状RNA的过表达载体pCircleVG及其构建方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KE WU等: "Circular RNA F-circSR derived from SLC34A2-ROS1 fusion gene promotes cell migration in non-small cell lung cancer", 《MOLECULAR CANCER》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116694630A (zh) * | 2023-08-03 | 2023-09-05 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种促进环状rna过表达的序列组合及其应用 |
| CN116694630B (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-31 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种促进环状rna过表达的序列组合及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107502608B (zh) | 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用 | |
| Krchňáková et al. | Splicing of long non-coding RNAs primarily depends on polypyrimidine tract and 5′ splice-site sequences due to weak interactions with SR proteins | |
| CN106834347A (zh) | 一种山羊cdk2基因敲除载体及其构建方法 | |
| CN109207515A (zh) | 一种设计和构建猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的方法 | |
| Zhao et al. | Gene Codon Composition Determines Differentiation-Dependent Expression of a Viral Capsid Gene in Keratinocytes In Vitro and InVivo | |
| Abere et al. | Merkel cell polyomavirus encodes circular RNAs (circRNAs) enabling a dynamic circRNA/microRNA/mRNA regulatory network | |
| CN105985978B (zh) | 一种新型rna环化表达载体的构建及其应用 | |
| Jones et al. | An evolutionarily conserved RNA structure in the functional core of the lincRNA Cyrano | |
| CN109182562B (zh) | 与蛋鸭卵泡发育相关的miRNA apla-mir-25-42及其检测引物、抑制物和应用 | |
| CN113718035B (zh) | 环状RNA hsa_circ_0003552的应用及检测其的试剂盒 | |
| CN114317602A (zh) | 一种环状rna的高效表达方法及表达载体 | |
| Todd et al. | Secondary structure of bacteriophage T4 gene 60 mRNA: implications for translational bypassing | |
| Wanowska et al. | A chromatin-associated splicing isoform of OIP5-AS1 acts in cis to regulate the OIP5 oncogene | |
| CN112574992A (zh) | 一种circRNA过表达成环载体DNA序列及其构建方法与应用 | |
| Skoko et al. | InTRONs in biotech | |
| CN115927331A (zh) | 一种用于促进circRNA成环和过表达的DNA框架及其构建方法和用途 | |
| CN114990093A (zh) | 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d | |
| CN110684797B (zh) | 基于tcv的同时沉默2个内源基因的vigs载体 | |
| Gao et al. | Merkel cell polyomavirus T-antigens regulate DICER1 mRNA stability and translation through HSC70 | |
| Wang et al. | Regulatory circular RNAs in viral diseases: applications in diagnosis and therapy | |
| CN106834293B (zh) | 一种带有分子标志物的环状rna及其制备方法和应用 | |
| CN108588221B (zh) | Stil基因的用途及其相关药物 | |
| CN108085331B (zh) | 用于环状rna过表达的dna框架及其应用 | |
| CN110964727A (zh) | 特异抑制c-myc基因表达的shRNA慢病毒表达载体构建方法与应用 | |
| CN110724712A (zh) | 一种miRNA海绵表达载体的构建方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220412 |