CN114317602A - 一种环状rna的高效表达方法及表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体，克隆环状RNA全长序列至环状RNA表达载体pCRE5(puromysin筛选标记)或pCRE6(copGFP筛选标记)载体；RNA抽提；逆转录；环化检测PCR体系及引物构建。本发明通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统；将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达；促进了环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种环状RNA的高效表达方法及表达载体。
背景技术
目前，环状RNA是一种普遍存在的首尾共价结合的环状RNA分子，广泛存在于不同物种中。相较于线性RNA分子，环状RNA的环状特殊结构使其具有更高的稳定性。高通量RNA测序(RNA-seq)和环状RNA特异的生物信息学算法的发展，数以万计的环状RNA已经在人类细胞中被鉴定。后续研究表明环状RNA具有较长的序列和复杂的高级结构，能够通过多种途径，如miRNA海绵或诱饵、蛋白海绵或诱饵、蛋白功能增强器、蛋白脚手架、蛋白招募者、编码功能性多肽等，广泛地参与生物学的各个阶段和病理过程，影响细胞染色质重塑、转录、转录后修饰或信号转导等重要细胞活动中，最终调控组织细胞的生物学反应和细胞命运。尽管已经发现环状RNA能够广泛地影响细胞功能，但在细胞内研究环状RNA的生物学功能及机制还有较大难度，其主要体现在环状RNA细胞内的正确剪接环化需要序列依赖性的顺式作用元件以及调控其精确剪接的反式作用因子。同时，普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)在细胞内研究环状RNA的生物学功能及机制还有较大难度，其主要体现在环状RNA细胞内的正确剪接环化需要序列依赖性的顺式作用元件以及调控其精确剪接的反式作用因子。
(2)普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。
解决以上问题及缺陷的难度为：细胞内环状RNA表达丰度较低的主要原因为环状RNA形成过程中上下游形成套索结构的难度较大，同时，在环化位点正确剪接的效率较低，两种因素导致环状RNA表达丰度较线性转录本更低。此外，普通的环状RNA表达载体大多将体内环状RNA的侧翼序列直接克隆至表达载体，形成环状RNA必须的套索结构和准确剪接结构的效率较低，导致环状RNA形成效率较低。本环状RNA过表达载体在环状RNA形成的必须原件基础上，对两种原件进行了深度优化。首先，我们将细胞内表达丰度较高的环状RNACIRS7的上游侧翼序列及其反向互补序列克隆至表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO多克隆位点，使环状RNA在表达过程中能够形成牢固的套索结构。同时，我们将SLC34A2-ROS1来源的环状RNA F-circSR1的上下游50bp内含子序列插入至过表达载体CIRS7互补序列之间，为环状RNA的形成提供了高效的反向剪接序列。针对该设计方法，我们进行了大量的实验，形成了能够高效正确表达环状RNA的表达载体pCRE5。
解决以上问题及缺陷的意义为：为现有的环状RNA细胞功能研究提供了有力的工具，同时该载体不仅能够进行瞬时转染，还能结合慢病毒包装系统，产生能够实现细胞能稳定过表达环状RNA的慢病毒，大大克服了细胞内环状RNA表达效率低，环化不正确，细胞瞬时转染效率低，细胞对转染试剂不耐受等问题，短时或长时研究环状RNA均能通过该载体完成。因此，本载体不仅解决了环状RNA正确高效表达的问题，还降低了环状RNA细胞实验门槛，使用户根据实验目的，拥有多样的实验策略。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体。
本发明是这样实现的，一种环状RNA的高效表达方法，所述环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：
步骤一，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体,命名为pCRE5-circRNA；
步骤二，将pCRE5-circRNA质粒瞬时转染至目标细胞或包装成慢病毒感染目标细胞，并分别对目标细胞进行RNA抽提和逆转录；
步骤三，环化引物设计及检测PCR体系构建。
进一步，步骤一中，所述克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体，包括：
(1)PCR扩增F-circSR1全长；
(2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F-circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5-F-circSR1。
进一步，步骤(1)中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
步骤(2)中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：
进一步，步骤一中，所述PCR产物回收扩增片段，全长1907bp。
进一步，步骤二中，所述RNA抽提，包括：
(1)使用Lipo2000将pCRE5-F-circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，24h后收获RNA；
(2)提取F-circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；
(3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；
(4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g 10min4℃；
(5)弃上清，留沉淀，加入1ml 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；
(6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；
(7)用1μL RNA测浓度。
进一步，步骤二中，所述逆转录，包括：
(1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；
(2)10*RT buffer 2μL，M-Mlv 1μL，inhibitor 1μL，Rnase free water 4μL；
(3)65℃1.3h，80℃10min，stroe at-20℃。
进一步，步骤三中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
进一步，步骤三中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：
PCR反应条件
进一步，步骤三中，1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段长度675bp。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的环状RNA的高效表达方法构建得到的环状RNA的高效表达载体，所述新型环状RNA表达载体上游侧翼序列为SEQ ID NO：3，所述新型环状RNA表达载体下游侧翼序列为SEQ ID NO：4，所述新型环状RNA表达载体核心序列为SEQ ID NO：5。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的环状RNA的高效表达方法及表达载体，提供一种新的环状RNA表达策略，并构建了高效表达环状RNA的载体，通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统。此外，该载体基于慢病毒表达载体构建，能够进行瞬时转染和包装慢病毒后感染细胞实现环状RNA的过表达，拓宽了细胞实验的范围。
本发明的目的在于提供一种利用细胞本身的RNA剪接相关原件实现环状RNA在细胞内准确剪接及过表达的载体，以此提供一种新的环状RNA功能研究工具。本环状RNA过表达载体克隆整合环状RNA生物合成必须的细胞调控原件，并进行优化，使环状RNA前体在细胞内形成套索结构，再借助环状RNA旁侧的人工内含子协助套索结构在环化位点进行剪接，促使环状RNA形成。具体的，本发明首先将细胞内普遍高表达环状RNA CIRS7CIRS7的侧翼上游内含子序列及其反向互补序列克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒的多克隆位点区，促进环状RNA侧翼序列形成互补配对的套索结构，促进环状RNA高效环化。同时，本发明在内含子序列及其反向互补序列间添加来源于F-circSR1环化位点两侧各50bp的人工内含子序列，提供环状RNA环化必需的splice acceptor and donor(SA-SD)序列，协助环状RNA前体在套索结构的正确环化位点剪接，使环状RNA正确成环。
本发明将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达，使用者无需进行其他的改造即可使用，从使用上做到了方便快捷。本发明促进环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的环状RNA的高效表达方法流程图。
图2是本发明实施例提供的使用Vazyme ClonExpressTM II One Step CloningKit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接的示意图。
图3是本发明实施例提供的1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段示意图。
图4和图5是本发明实施例提供的新型环状RNA表达载体图谱。
图6是本发明实施例提供的发现过表达融合基因SLC34A2-ROS1来源的环状RNA F-circSR能够增强肺癌细胞的迁移能力示意图。
图7是本发明实施例提供的发现过表达融合基因EML4-ALK来源的环状RNA能够增强肺癌细胞的迁移能力示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种环状RNA的高效表达方法及表达载体，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：
S101，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体；
S102，在细胞内对环状RNA进行过表达，并依次进行RNA抽提和逆转录；
S103，环化检测PCR体系及引物构建。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明提供一种新的环状RNA表达策略，并构建了高效表达环状RNA的载体。本发明通过前期的实验验证，构建出能够利用细胞内的相关作用原件实现细胞内环状RNA的准确环化的过表达系统。
本发明的目的在于提供一种利用细胞本身的RNA剪接相关原件实现环状RNA在细胞内准确剪接及过表达的载体，以此提供一种新的环状RNA功能研究工具。普通环状RNA的过表达系统存在剪接不准确，以及环化效率低等问题，影响环状RNA的细胞功能研究。本环状RNA过表达载体克隆整合环状RNA生物合成必须的细胞调控原件，并进行优化，使环状RNA前体在细胞内形成套索结构，再借助环状RNA旁侧的人工内含子协助套索结构在环化位点进行剪接，促使环状RNA形成。具体的，首先将细胞内普遍高表达环状RNA CIRS7CIRS7的侧翼上游内含子序列及其反向互补序列克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-PURO或pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒的多克隆位点区，促进环状RNA侧翼序列形成互补配对的套索结构，促进环状RNA高效环化。同时，在内含子序列及其反向互补序列间添加来源于F-circSR1环化位点两侧各50bp的人工内含子序列，提供环状RNA环化必需的splice acceptor and donor(SA-SD)序列，协助环状RNA前体在套索结构的正确环化位点剪接，使环状RNA正确成环。
该表达方法(实例)包括以下步骤：
细胞内过表达环状RNA，以SLC34A2-ROS1融合基因来源的环状RNA F-CircSR1为例。
1.克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体。
1)PCR扩增F-circSR1全长
PCR引物：
F1:5’-agctgttttctcatccacagACCATGGCTCCCTGGCCTG-3’
R1:5’-ttctgaagaatcaaacttacCTTCAAAGCTTTCATTTATGACTCCAC-3’
使用phana酶反应体系(vazyme)，50μL，PCR反应条件见表1。
表1 PCR反应条件
PCR产物回收扩增片段，全长1907bp；
2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F-circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5-F-circSR1(见图2)。
2.RNA抽提：
1)使用Lipo2000将pCRE5-F-circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，4h后收获RNA；
2)提取F-circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；
3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；
4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g10min4℃；
5)弃上清，留沉淀，加入1ml 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；
6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；
7)用1μL RNA测浓度
3.逆转录：
1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；
2)10*RT buffer 2μL，M-Mlv 1μL，inhibitor 1μL，Rnase free water 4μL；
3)65℃1.3h，80℃10min，stroe at-20℃；
4.环化检测PCR体系及引物：
1)PCR引物：
F1:5’-GTGAAGATTGGAGACTTTGGAC-3’
R1:5’-TCCTGAAGAGTGGGTAGGTT-3’
2)条件：
使用phana酶反应体系(vazyme)，50μL，PCR反应条件见表2。
表2 PCR反应条件
1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段长度675bp(见图3)。
在相同的PCR循环数条件下，可见实验组和对照组中内参ACTIN扩增量相同，而F-circSR1仅在实验组中出现，表明两种细胞内成功表达F-CircSR1。
新型环状RNA表达载体上游侧翼序列：
CTGTAAGAGTAGTCTCATGATGTCTTTTAATTTAATATCTAGGCCCTAATACACAACTCTTTGAATATTGCTACTATCTTTCAGCATGACTTTCCAATACCATTAAGATTAAGCCTTTCTGTTCTTCAGTTTCTCTAACTCAAGTCTTCTAAGCTCCACAGCTTCCAACATCTTTAATTACCAGATCTTCCCAATATTATAACATCCGTGCATTCCAGTCCCTGTCCTGCAGCATCTCCAATGCCCTTGTTTTCTAAACTTCCCAGTATTCAAGTCATTAAAAATTTAGGTCTTCTAATATCTCCAACAACCCATCTTCAAAGTCCAGGTCTTGTCTTTCAGAATCCAGAGTTCTAAATTACAAGTCTTCCATGGTCCTAATCCTCCAATGTCTCCTATATACAGGTCTTCTAGAGGCTATGTATTTCATAGTGTTTAAGTCTAGATTCTTCAATGTCTTCCAGCACTTACATCATTCAGTTTTTACATTTTTAAATGTCTCCTACTTTCTAGTTTTACAGTGTATTTTTATCGCCAATTCCTCCAATGCCCAAGTCTTTAAATACCTGCAAGAACTTTCAGGTACATCAATATCCTCAATGTCTGAATGAATAGACCTCTTAATATCCTGGTCTCATATTGTCCAGGCTGCCAGTATTCTTGACATCCAGCATCTTTAAAATTTAATTCTTCCAAACTGTCTTTTTGACATAAATATGTCAATATCCATGCTTACCAATGTCTCCCAATATCCAGGGCTTCTCATTTTAGGATTTATAAATGTCTACATCTGCTGTTGTTTATATCTGCCAGTATTTAGGAGTTCCAAGGTACAGGACTTACAATATCTCTAATTTCCAGAGATTTCAGTGTCTATGACTTCCAATATTCAATATCCCAATGTTCAGGGCCTCCAGAAATATCAATGTCCAGAGTAACCAAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacag
新型环状RNA表达载体下游侧翼序列：
gtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgaTGGTTACTCTGGACATTGATATTTCTGGAGGCCCTGAACATTGGGATATTGAATATTGGAAGTCATAGACACTGAAATCTCTGGAAATTAGAGATATTGTAAGTCCTGTACCTTGGAACTCCTAAATACTGGCAGATATAAACAACAGCAGATGTAGACATTTATAAATCCTAAAATGAGAAGCCCTGGATATTGGGAGACATTGGTAAGCATGGATATTGACATATTTATGTCAAAAAGACAGTTTGGAAGAATTAAATTTTAAAGATGCTGGATGTCAAGAATACTGGCAGCCTGGACAATATGAGACCAGGATATTAAGAGGTCTATTCATTCAGACATTGAGGATATTGATGTACCTGAAAGTTCTTGCAGGTATTTAAAGACTTGGGCATTGGAGGAATTGGCGATAAAAATACACTGTAAAACTAGAAAGTAGGAGACATTTAAAAATGTAAAAACTGAATGATGTAAGTGCTGGAAGACATTGAAGAATCTAGACTTAAACACTATGAAATACATAGCCTCTAGAAGACCTGTATATAGGAGACATTGGAGGATTAGGACCATGGAAGACTTGTAATTTAGAACTCTGGATTCTGAAAGACAAGACCTGGACTTTGAAGATGGGTTGTTGGAGATATTAGAAGACCTAAATTTTTAATGACTTGAATACTGGGAAGTTTAGAAAACAAGGGCATTGGAGATGCTGCAGGACAGGGACTGGAATGCACGGATGTTATAATATTGGGAAGATCTGGTAATTAAAGATGTTGGAAGCTGTGGAGCTTAGAAGACTTGAGTTAGAGAAACTGAAGAACAGAAAGGCTTAATCTTAATGGTATTGGAAAGTCATGCTGAAAGATAGTAGCAATATTCAAAGAGTTGTGTATTAGGGCCTAGATATTAAATTAAAAGACATCATGAGACTACTCTTACAG
新型环状RNA表达载体核心序列：
CTGTAAGAGTAGTCTCATGATGTCTTTTAATTTAATATCTAGGCCCTAATACACAACTCTTTGAATATTGCTACTATCTTTCAGCATGACTTTCCAATACCATTAAGATTAAGCCTTTCTGTTCTTCAGTTTCTCTAACTCAAGTCTTCTAAGCTCCACAGCTTCCAACATCTTTAATTACCAGATCTTCCCAATATTATAACATCCGTGCATTCCAGTCCCTGTCCTGCAGCATCTCCAATGCCCTTGTTTTCTAAACTTCCCAGTATTCAAGTCATTAAAAATTTAGGTCTTCTAATATCTCCAACAACCCATCTTCAAAGTCCAGGTCTTGTCTTTCAGAATCCAGAGTTCTAAATTACAAGTCTTCCATGGTCCTAATCCTCCAATGTCTCCTATATACAGGTCTTCTAGAGGCTATGTATTTCATAGTGTTTAAGTCTAGATTCTTCAATGTCTTCCAGCACTTACATCATTCAGTTTTTACATTTTTAAATGTCTCCTACTTTCTAGTTTTACAGTGTATTTTTATCGCCAATTCCTCCAATGCCCAAGTCTTTAAATACCTGCAAGAACTTTCAGGTACATCAATATCCTCAATGTCTGAATGAATAGACCTCTTAATATCCTGGTCTCATATTGTCCAGGCTGCCAGTATTCTTGACATCCAGCATCTTTAAAATTTAATTCTTCCAAACTGTCTTTTTGACATAAATATGTCAATATCCATGCTTACCAATGTCTCCCAATATCCAGGGCTTCTCATTTTAGGATTTATAAATGTCTACATCTGCTGTTGTTTATATCTGCCAGTATTTAGGAGTTCCAAGGTACAGGACTTACAATATCTCTAATTTCCAGAGATTTCAGTGTCTATGACTTCCAATATTCAATATCCCAATGTTCAGGGCCTCCAGAAATATCAATGTCCAGAGTAACCAAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacagGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGgtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgaTGGTTACTCTGGACATTGATATTTCTGGAGGCCCTGAACATTGGGATATTGAATATTGGAAGTCATAGACACTGAAATCTCTGGAAATTAGAGATATTGTAAGTCCTGTACCTTGGAACTCCTAAATACTGGCAGATATAAACAACAGCAGATGTAGACATTTATAAATCCTAAAATGAGAAGCCCTGGATATTGGGAGACATTGGTAAGCATGGATATTGACATATTTATGTCAAAAAGACAGTTTGGAAGAATTAAATTTTAAAGATGCTGGATGTCAAGAATACTGGCAGCCTGGACAATATGAGACCAGGATATTAAGAGGTCTATTCATTCAGACATTGAGGATATTGATGTACCTGAAAGTTCTTGCAGGTATTTAAAGACTTGGGCATTGGAGGAATTGGCGATAAAAATACACTGTAAAACTAGAAAGTAGGAGACATTTAAAAATGTAAAAACTGAATGATGTAAGTGCTGGAAGACATTGAAGAATCTAGACTTAAACACTATGAAATACATAGCCTCTAGAAGACCTGTATATAGGAGACATTGGAGGATTAGGACCATGGAAGACTTGTAATTTAGAACTCTGGATTCTGAAAGACAAGACCTGGACTTTGAAGATGGGTTGTTGGAGATATTAGAAGACCTAAATTTTTAATGACTTGAATACTGGGAAGTTTAGAAAACAAGGGCATTGGAGATGCTGCAGGACAGGGACTGGAATGCACGGATGTTATAATATTGGGAAGATCTGGTAATTAAAGATGTTGGAAGCTGTGGAGCTTAGAAGACTTGAGTTAGAGAAACTGAAGAACAGAAAGGCTTAATCTTAATGGTATTGGAAAGTCATGCTGAAAGATAGTAGCAATATTCAAAGAGTTGTGTATTAGGGCCTAGATATTAAATTAAAAGACATCATGAGACTACTCTTACAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG
新型环状RNA表达载体图谱如图4和图5所示。
本发明将环状RNA形成所需的序列原件整合，能够用于多数环状RNA的表达。本发明仅需要将环状RNA的序列克隆至表达区中就能实现大部分环状RNA的表达，使用者无需进行其他的改造即可使用，从使用上做到了方便快捷。本发明促进环状RNA形成的序列均来自于人源细胞RNA序列，避免形成的RNA结构被识别为外源序列而被清除。
目前已有相关研究论文利用本发明的载体进行了环状RNA的细胞功能研究。
例1：Mol Cancer.2019 May 22；18(1):98.doi:10.1186/s12943-019-1028-9.发现过表达融合基因SLC34A2-ROS1来源的环状RNA F-circSR能够增强肺癌细胞的迁移能力。
如图6所示，A：过表达F-circEA的载体示意图，此处使用的是pCRE5；B：RNase R消化鉴定F-circSR的过表达；C：F-circSR过表达后增强肺癌细胞H1299及A549的迁移能力。
例2：Cell Res.2018 Jun；28(6):693-695.doi:10.1038/s41422-018-0033-7。发现过表达融合基因EML4-ALK来源的环状RNA能够增强肺癌细胞的迁移能力。
如图7所示，A：过表达F-circEA的载体示意图，此处使用的是pCRE6；B：液相杂交鉴定F-circEA的过表达；C：F-circEA过表达后增强肺癌细胞的迁移和侵袭能力。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种环状RNA的高效表达方法及表达载体
<160> 5
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agctgttttctcatccacagaccatggctccctggcctg
ttctgaagaatcaaacttaccttcaaagctttcatttatgactccac
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgaagattggagactttggac
tcctgaagagtgggtaggtt
<210> 3
<211> 1034
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgtaagagtagtctcatgatgtcttttaatttaatatctaggccctaatacacaactctttgaatattgctactatctttcagcatgactttccaataccattaagattaagcctttctgttcttcagtttctctaactcaagtcttctaagctccacagcttccaacatctttaattaccagatcttcccaatattataacatccgtgcattccagtccctgtcctgcagcatctccaatgcccttgttttctaaacttcccagtattcaagtcattaaaaatttaggtcttctaatatctccaacaacccatcttcaaagtccaggtcttgtctttcagaatccagagttctaaattacaagtcttccatggtcctaatcctccaatgtctcctatatacaggtcttctagaggctatgtatttcatagtgtttaagtctagattcttcaatgtcttccagcacttacatcattcagtttttacatttttaaatgtctcctactttctagttttacagtgtatttttatcgccaattcctccaatgcccaagtctttaaatacctgcaagaactttcaggtacatcaatatcctcaatgtctgaatgaatagacctcttaatatcctggtctcatattgtccaggctgccagtattcttgacatccagcatctttaaaatttaattcttccaaactgtctttttgacataaatatgtcaatatccatgcttaccaatgtctcccaatatccagggcttctcattttaggatttataaatgtctacatctgctgttgtttatatctgccagtatttaggagttccaaggtacaggacttacaatatctctaatttccagagatttcagtgtctatgacttccaatattcaatatcccaatgttcagggcctccagaaatatcaatgtccagagtaaccaaatacgactcactatagggagacccaagcttggtaccgagctcgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacag
<210> 4
<211> 991
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgatggttactctggacattgatatttctggaggccctgaacattgggatattgaatattggaagtcatagacactgaaatctctggaaattagagatattgtaagtcctgtaccttggaactcctaaatactggcagatataaacaacagcagatgtagacatttataaatcctaaaatgagaagccctggatattgggagacattggtaagcatggatattgacatatttatgtcaaaaagacagtttggaagaattaaattttaaagatgctggatgtcaagaatactggcagcctggacaatatgagaccaggatattaagaggtctattcattcagacattgaggatattgatgtacctgaaagttcttgcaggtatttaaagacttgggcattggaggaattggcgataaaaatacactgtaaaactagaaagtaggagacatttaaaaatgtaaaaactgaatgatgtaagtgctggaagacattgaagaatctagacttaaacactatgaaatacatagcctctagaagacctgtatataggagacattggaggattaggaccatggaagacttgtaatttagaactctggattctgaaagacaagacctggactttgaagatgggttgttggagatattagaagacctaaatttttaatgacttgaatactgggaagtttagaaaacaagggcattggagatgctgcaggacagggactggaatgcacggatgttataatattgggaagatctggtaattaaagatgttggaagctgtggagcttagaagacttgagttagagaaactgaagaacagaaaggcttaatcttaatggtattggaaagtcatgctgaaagatagtagcaatattcaaagagttgtgtattagggcctagatattaaattaaaagacatcatgagactactcttacag
<210> 5
<211> 2385
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtaagagtagtctcatgatgtcttttaatttaatatctaggccctaatacacaactctttgaatattgctactatctttcagcatgactttccaataccattaagattaagcctttctgttcttcagtttctctaactcaagtcttctaagctccacagcttccaacatctttaattaccagatcttcccaatattataacatccgtgcattccagtccctgtcctgcagcatctccaatgcccttgttttctaaacttcccagtattcaagtcattaaaaatttaggtcttctaatatctccaacaacccatcttcaaagtccaggtcttgtctttcagaatccagagttctaaattacaagtcttccatggtcctaatcctccaatgtctcctatatacaggtcttctagaggctatgtatttcatagtgtttaagtctagattcttcaatgtcttccagcacttacatcattcagtttttacatttttaaatgtctcctactttctagttttacagtgtatttttatcgccaattcctccaatgcccaagtctttaaatacctgcaagaactttcaggtacatcaatatcctcaatgtctgaatgaatagacctcttaatatcctggtctcatattgtccaggctgccagtattcttgacatccagcatctttaaaatttaattcttccaaactgtctttttgacataaatatgtcaatatccatgcttaccaatgtctcccaatatccagggcttctcattttaggatttataaatgtctacatctgctgttgtttatatctgccagtatttaggagttccaaggtacaggacttacaatatctctaatttccagagatttcagtgtctatgacttccaatattcaatatcccaatgttcagggcctccagaaatatcaatgtccagagtaaccaaatacgactcactatagggagacccaagcttggtaccgagctcgtgtgcctcctttccatgactgctgctttaagctgttttctcatccacagggatccactagtaacggccgccagtgtgctggaattctgcagatatccatcacactggcggccgctcgaggtaagtttgattcttcagaattttctagttttcgctgcactgtgaactgatggttactctggacattgatatttctggaggccctgaacattgggatattgaatattggaagtcatagacactgaaatctctggaaattagagatattgtaagtcctgtaccttggaactcctaaatactggcagatataaacaacagcagatgtagacatttataaatcctaaaatgagaagccctggatattgggagacattggtaagcatggatattgacatatttatgtcaaaaagacagtttggaagaattaaattttaaagatgctggatgtcaagaatactggcagcctggacaatatgagaccaggatattaagaggtctattcattcagacattgaggatattgatgtacctgaaagttcttgcaggtatttaaagacttgggcattggaggaattggcgataaaaatacactgtaaaactagaaagtaggagacatttaaaaatgtaaaaactgaatgatgtaagtgctggaagacattgaagaatctagacttaaacactatgaaatacatagcctctagaagacctgtatataggagacattggaggattaggaccatggaagacttgtaatttagaactctggattctgaaagacaagacctggactttgaagatgggttgttggagatattagaagacctaaatttttaatgacttgaatactgggaagtttagaaaacaagggcattggagatgctgcaggacagggactggaatgcacggatgttataatattgggaagatctggtaattaaagatgttggaagctgtggagcttagaagacttgagttagagaaactgaagaacagaaaggcttaatcttaatggtattggaaagtcatgctgaaagatagtagcaatattcaaagagttgtgtattagggcctagatattaaattaaaagacatcatgagactactcttacagcatgcatctagagggccctattctatagtgtcacctaaatgctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg
Claims (10)
1.一种环状RNA的高效表达方法，其特征在于，所述环状RNA的高效表达方法包括以下步骤：
步骤一，克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体,命名为pCRE5-circRNA；
步骤二，将pCRE5-circRNA质粒瞬时转染至目标细胞或包装成慢病毒感染目标细胞，并分别对目标细胞进行RNA抽提和逆转录；
步骤三，环化引物设计及检测PCR体系构建。
2.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述克隆环状RNA全长序列至pCRE5载体，包括：
(1)PCR扩增F-circSR1全长；
(2)使用Vazyme ClonExpressTM II One Step Cloning Kit将获取的片段与PCRE5载体进行重组连接，将F-circSR1克隆至环状RNA过表达区之间，命名为pCRE5-F-circSR1。
3.如权利要求2所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；
步骤(2)中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，PCR反应条件为：
PCR反应条件
4.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤一中，所述PCR产物回收扩增片段，全长1907bp。
5.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤二中，所述RNA抽提，包括：
(1)使用Lipo2000将pCRE5-F-circSR1质粒瞬时转染至H1299或A549或其他细胞，24h后收获RNA；
(2)提取F-circSR1过表达细胞RNA：在6孔板细胞中加入Trizol 1mL裂解细胞，充分混匀，室温静置5min；
(3)加200μL氯仿，充分混匀，室温静置3min，1200g 15min 4℃；
(4)取上清约500μL，加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10min，12000g 10min 4℃；
(5)弃上清，留沉淀，加入1mL 75％的乙醇，混匀，7500g 5min 4℃；
(6)弃乙醇，晾干沉淀，加入DEPC水混匀，立即放冰上；
(7)用1μL RNA测浓度。
6.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤二中，所述逆转录，包括：
(1)10μL RNA，2μL Random Primer，85℃，3min；
(2)10*RT buffer 2μL，M-Mlv 1μL，inhibitor 1μL，RNase free water 4μL；
(3)65℃1.3h，80℃10min，store at-20℃。
7.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，所述PCR引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
8.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，使用Phana酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，50μL反应体系，
PCR反应条件为：
PCR反应条件
9.如权利要求1所述环状RNA的高效表达方法，其特征在于，步骤三中，1.5％琼脂糖胶电泳PCR片段长度675bp。
10.一种应用如权利要求1～9任意一项所述环状RNA的高效表达方法构建得到的环状RNA的高效表达载体，其特征在于，所述新型环状RNA表达载体中环状RNA的上游侧翼序列为SEQ ID NO：3，所述新型环状RNA表达载体环状RNA的下游侧翼序列为SEQ ID NO：4，所述新型环状RNA表达载体核心序列为SEQ ID NO：5。
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