CN114807138A - 一种植物环状rna过表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用。本发明的植物环状RNA过表达载体，其含有的植物环状RNA成环框架包括上游框架序列、待表达目的基因序列和下游框架序列，所述的上游框架序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游框架序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明构建的植物环状RNA过表达载体能够高效稳定的适用于各种目的基因序列的成环表达，且构建方法操作简单，成环位点准确，为深入研究环状RNA的功能提供了高效简洁的研究手段。

Description

一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

环状RNA(circular RNAs,circRNAs)是一类由特殊前体mRNA选择性剪接产生的封闭环状(3'-5'共价闭合)非编码RNA，普遍存在于真核细胞中。研究表明，植物环状RNA具有高稳定性和保守性以及低表达和时空表达特异性。根据来源，植物环状RNA主要分为内含子、外显子、内含子-外显子、基因间区、反义链五种类型，其中外显子来源的环状RNA比例相对较大。通过生物信息学预测并结合分子生物学验证是当前研究植物环状RNA的主要方法。通常植物环状RNA作为microRNA的海绵，调节宿主基因选择性剪接和表达；此外，植物环状RNA广泛参与生长发育以及生物/非生物胁迫应答等生物学过程。因此，构建高效准确的植物环状RNA过表达载体，对深入研究植物环状RNA的功能十分关键。

目前对于植物环状RNA的研究尚不深入，植物环状RNA的生物学功能和调控机制仍不清楚。正如常规基因功能和机制研究一样，研究植物环状RNA的生物学功能和分子机制的一个重要手段就是在植物细胞内过表达环状RNA，观察其对细胞功能的影响并阐述其参与调控细胞功能的分子机制。因此，想要在植物细胞内引入过表达的环状RNA，就必须有稳定可靠的环状RNA过表达工具。目前植物环状RNA的过表达载体较少，主要是以基因组DNA为模板，扩增一段内含子序列(上游环化序列)及其反向互补序列(下游环化序列)，并通过同源重组技术构建成环框架，随后将目的环状RNA序列连接至上游和下游环化序列之间，将得到的重组成环序列通过酶切连接的方式插入过表达载体中。此方法表达的环状RNA环化位点存在多样性，成环效率低，不能准确的表达目的环状RNA。

发明内容

为了克服现有技术中环状RNA过表达的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种基于植物基因内含子序列构建的环状RNA过表达载体及其构建方法和应用；利用本发明的载体及方法可以表达各种环状RNA，而且表达高效稳定，操作简单，适用于各种植物表达载体系统。

本发明的第一个目的是提供一种基于植物基因内含子序列驱动表达植物环状RNA的成环框架。

本发明的一种植物环状RNA成环框架，包括上游框架序列、待表达目的基因序列和下游框架序列；所述的上游框架序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游框架序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选，在所述的上游框架序列后添加有酶切位点SalI，在所述的下游框架序列前添加有酶切位点BamHI，待表达目的基因序列插入在酶切位点SalI和BamHI之间。本发明的植物环状RNA成环框架的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中第1-230bp为上游框架序列，第231-286bp为无义序列，其中的第231-236bp和第281-286bp分别为酶切位点SalI和BamHI序列，第287-972bp为下游框架序列。

本发明还提供一种植物环状RNA过表达载体，其含有所述的植物环状RNA成环框架。

本发明还提供一种植物环状RNA过表达载体的构建方法，是将所述的植物环状RNA成环框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。

优选，所述的植物表达载体为pLX。

更优选的，扩增用于同源重组的表达载体pLX骨架的引物为pLX-R：GCAAGCTAGAAACGTGACAGTTTCCTCTCCAAATGAAATGAAC和pLX-F：CTCCTACGATCTTTGCACTGTCGATCGTTCAAACATTTGGCAA。实际应用中，所采用的植物表达载体不限于pLX，还可以为其他的适用于植物的表达载体。

本发明还提供所述的植物环状RNA成环框架或所述的植物环状RNA过表达载体在过表达目的基因环状RNA中的应用。

本发明还提供一种目的基因环状RNA过表达载体的构建方法，在待表达目的基因序列两端添加酶切位点SalI和BamHI，然后酶切连接至所述的植物环状RNA过表达载体的酶切位点SalI和BamHI之间。

本发明的优点在于：本发明的环状RNA过表达载体能够有效表达各种目的序列的环状形式，且操作简单，为深入研究环状RNA的功能提供了高效简洁的研究手段。

附图说明

图1为环状RNA成环框架示意图。

图2为构建的环状RNA过表达空载体结构图谱。

图3为目的环状RNA circ-WRKY9、circ-RSMV过表达的荧光定量检测结果。

图4为过表达环状RNA的测序验证。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

本发明的环状RNA过表达载体构建过程具体为：

1、设计环状RNA的成环框架

依据动物环状RNA的内含子配对驱动环化机制，侧翼内含子内丰富的ALU(限制性内切酶Alu I的识别序列AGCT)能够反向互补配对，进而介导环状RNA的形成。分析发现水稻基因OsWRKY9(LOC_Os01g18584)的内含子3和内含子5含有丰富的ALU序列。因此，本发明设计了扩增上述水稻基因中富含ALU的部分内含子3和内含子5序列，作为环状RNA的成环框架。

在设计的成环框架的碱基序列(图1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)中，第1-230bp为上游内含子框架序列(对应为如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列)，第231-286bp为无义序列(对应为如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列)，其中第231-236bp和第281-286bp分别为酶切位点SalI和BamHI序列，第287-972bp为下游内含子框架序列(对应为如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列)。

2、扩增环状RNA的成环框架序列

根据上述环状RNA成环框架的设计方法，以日本晴水稻品种的基因组DNA为模板，设计扩增水稻基因OsWRKY9外显子4和外显子5的部分侧翼内含子序列引物，采用分段PCR扩增技术，分别扩增外显子4的上游部分内含子框架序列和外显子5的下游部分内含子框架序列，随后利用重叠PCR技术获得环状RNA成环框架序列。具体如下：

所述扩增分为三段，其引物序列如下：

1)第一段扩增上游内含子框架序列的引物序列：

(下划线部分为同源臂，斜体部分为SalI酶切位点)；

2)第二段扩增下游内含子框架序列的引物序列：

(下划线部分为同源臂，斜体部分为BamH酶切位点)，R2：GACAGTGCAAAGATCGTAGGAG；

3)第三段扩增成环框架引物序列：F1：CTGTCACGTTTCTAGCTTGC，R2：GACAGTGCAAAGATCGTAGGAG。

所述分段PCR扩增的反应体系如下：第一轮和第二轮PCR均为10μl体系，PCR扩增具体为2×Phanta Max Buffer(Vazyme公司)5.0μl，10μΜ的上下游引物为0.25μl，dNTP Mix(10mM each)为0.25μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase为0.25μl，水稻基因组DNA模板为1.0μl，灭菌水补足至10μl；PCR反应参数为：95℃预变性3min；然后95℃15s，55℃30s，72℃40s，共35个循环；最后在72℃延伸5min，降温至10℃结束反应；将第一段和第二段PCR产物作为第三段重叠PCR模板，进行PCR反应，具体为：2×Phanta Max Buffer 20μl，10μΜ的上下游引物为1.0μl，dNTP Mix(10mM each)为1.0μl，Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase为1.0μl，灭菌水补足至40μl。PCR反应参数为：95℃预变性3min；然后95℃15s，55℃30s，72℃1min，共35个循环；最后在72℃延伸5min，降温至10℃结束反应。

3、环状RNA过表达载体的构建

上述PCR结束后，琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物的片段大小是否正确，随后切胶回收，通过同源重组技术将成环框架构建至植物表达载体pLX中,转化涂板，菌落鉴定后测序验证构建是否成功。具体如下：

1)PCR产物纯化：将第三段成环框架PCR产物进行凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照，将正确大小的条带切下来，用胶回收试剂盒(Axygen)进行回收，具体步骤参照试剂盒说明书进行；

2)扩增植物表达载体pLX骨架及纯化：依据表达载体序列，设计扩增载体骨架的引物为：pLX-R：GCAAGCTAGAAACGTGACAGTTTCCTCTCCAAATGAAATGAAC(下划线部分为上游成环框架序列的同源臂)；pLX-F：CTCCTACGATCTTTGCACTGTCGATCGTTCAA ACATTTGGCAA(下划线部分为下游成环框架序列的同源臂)。根据上述PCR扩增程序，扩增表达载体骨架，具体步骤为：2×Phanta Max Buffer 20μl，10μΜ的上、下游引物为1.0μl，dNTP Mix(10mM each)为1.0μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase为1.0μl，PCR反应参数为：95℃预变性3min；然后95℃15s，55℃30s，72℃4min，共35个循环；最后在72℃延伸5min，降温至10℃结束反应。

PCR产物进行凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照，将正确大小的条带切下来，用胶回收试剂盒(Axygen)进行回收，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

3)同源重组

采用的同源重组试剂盒为

II One Step Cloning Kit(Vazyme公司)，反应体系如下：5×CE II Buffer 2μL，

II 1μL，成环框架产物120ng，载体骨架80ng，灭菌水补足至10μl。反应参数为：37℃30min；然后4℃保存或直接转化大肠杆菌。

4)大肠杆菌感受态细胞的热击转化

将同源重组产物转化大肠杆菌感受态DH5α(上海维地生物有限公司)，转化步骤参照产品说明书进行。

5)阳性转化子的筛选鉴定和重组质粒抽提

挑取平板上的单克隆进行菌落PCR，进行琼脂糖凝胶电泳后，确认阳性转化子。确定为阳性克隆的菌落接种至4mL含有相应抗生素的液体LB培养基中，置于37℃摇床上，180rpm振荡培养8h-12h，随后抽提质粒(环状RNA过表达空载体，图2)并进行测序。

4、对所构建的环状RNA过表达载体进行验证

为了验证所构建的载体能够准确的形成环状RNA，分别构建了水稻基因和水稻病毒(水稻条纹花叶病毒)基因的环状RNA表达载体，并进行了验证。具体构建过程为：将上述构建好的环状RNA过表达空载体进行SalI和BamHI酶切，得到线性化骨架载体；随后分别扩增水稻基因OsWRKY9(LOC_Os01g18584)部分序列(序列长度为450nt，位置为607-1056)和水稻条纹花叶病毒(Rice stripe mosaic cytorhabdovirus,RSMV)基因组(登录号：KX525586)的一段序列(序列长度为125nt，位置为8147-8271)并在目的序列上、下游两端分别添加酶切位点SalI和BamHI，酶切后连接至线性化骨架载体，分别得到含有目的基因的过表达载体。随后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105菌株(上海维地生物有限公司)，菌落PCR验证后挑取阳性菌落进行烟草叶片的瞬时转化。将含重组载体的农杆菌通过1ml注射器浸润烟草叶片，注射后50-60h后检测目的环状RNA的表达情况，并将PCR产物克隆测序，验证其环化位点。

具体操作方法如下：

1)农杆菌感受态为EHA105，具体操作步骤如下：从-80℃冰箱中取出感受态，握在手心至成冰水混合状态时，置于冰上待彻底融化；加入10μL重组质粒轻弹混匀；冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰上静置5min；加入700μL无抗生素的液体YEP培养基，放置于28℃摇床200rpm震荡培养2h；取100μL菌液涂布于含有Kan+Rif的固体YEP平板培养基上，倒置于28℃培养箱培养48h-96h；挑取单菌落进行菌落PCR，筛选阳性转化子，阳性菌落使用相应抗性的液体YEP培养基(含Kan 50mg/mL、Rif25mg/mL在28℃摇床220rpm震荡培养12h-24h，将菌液保存甘油菌至-80℃备用。

2)农杆菌浸润烟草，具体操作步骤如下：将保存的农杆菌吸取200μL接种于4mLYEP液体培养基(含相应抗生素)在28℃、220rpm震荡培养12h-24h，至OD600值为1.0时，室温5000rpm离心3min收集菌体，用浸润buffer(10mM MgCl₂，10Mm MES(pH 5.6)，200μM乙酰丁香酮)重悬菌体。调整菌液OD600值至0.8-1.0左右，室温静置1h，用1mL注射器(取掉针头)于叶片背部进行浸润注射，每株本氏烟植株浸润约3片叶片，每个处理3-6株。接种后黑暗处理12h，后置人工气候箱内25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养。48-96小时收集浸润过的烟草叶片。

3)烟草叶片总RNA的提取，具体操作步骤如下：收集注射过的烟草叶片约0.2g，液氮研磨后加入800μl Trizol和400μl的氯仿：异戊醇(24:1)后转入2.0ml离心管涡旋混匀；4℃下12000rpm离心15min，取上清液于新的1.5ml离心管中加入等体积的预冷的异丙醇，轻轻混匀后置于-20℃下20min；然后4℃下12000rpm离心10min，弃上清；加入预冷的体积分数75％乙醇水溶液(DEPC处理)，4℃下7500rpm离心5min，室温晾干沉淀后加入50μl无RNase的水溶解，-20℃保存备用或继续下游实验。

4)将RNA反转录成cDNA，具体操作步骤如下：按照逆转录试剂盒(TaKaRa)说明书，PCR反应体系为：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2μl，PrimeScript RT EnzymeMix I 0.5μl，Oligo dT Primer(50μM)0.5μl，RNA模板500ng，灭菌水补足至10μl。RT反应参数为：37℃反转录15min，85℃5s，降温至10℃结束反应。5)检测目的环状RNA的表达量，具体操作步骤如下：以上述反转录产物为模板，PCR反应体系为：2×TB Green Premix Ex TaqII5μl，上、下游引物各0.25μl(目的环状RNA circ-WRKY9扩增引物为：OsWRKY9-F：CGGATGCCCAGTCAGGAAGC，OsWRKY9-F：GCTCGCGGCTCCAGGAATTG；目的环状RNA circ-RSMV序列扩增引物为：RSMV-F:CCAACATGACCGGTGTATGCG；RSMV-R：GGGGTTTGAGGGATTGAGGC)，反转录产物2μl(稀释5倍)，最后补水至10μl。PCR反应参数为：95℃预变性30s；然后95℃5s，60℃30s，收集荧光，共40个循环。荧光定量结果显示，在注射过目的环状RNA表达载体的本氏烟中，能够检测到目的环状RNA的高效表达。其中，circ-WRKY9的表达量是对照组的18倍，而circ-RSMV的表达量是对照组的684倍(图3)。进一步将PCR产物进行Sanger测序，验证了目的基因环化位点的准确(图4)。

以上结果证实了本发明的环状RNA表达载体能够高效准确的表达各种环状RNA，而且表达高效稳定，操作简单，适用于各种植物表达载体系统。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种植物环状RNA过表达载体及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtcacgtt tctagcttgc cttctatata taacactaac acgagagcta gctagctagc 60

taacaaagct aactactact gctacttata actgtaggag tagtagttag cgtgtgctaa 120

tctcatgcac gtaattttca tttgcccctg ctcgctttcg cccttccttt tgactaacga 180

acacaccacg tactaactac gtacttgttg atcctaccaa acatcgacgc 230

<210> 2

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactaaatta atatatatgc attctcataa tatgcgtttt cttgtgtagc tttaattagc 60

atggcgctat atataaaaac cagctgaaat tggaattcat atatttttta aaaaaaaatt 120

aaagatgttg acatagtaat tatattgatg tgatccattt ttttggaaca ttgagacgca 180

agttaaattt atattagtta tatatatctt ccgttcgatc tccctttttt taaaaaaaaa 240

attgtggtcg atctcactat attaatggcg ctcaccacac gcaatcttca aaaggaaaaa 300

gaattccttg ggattttctt actccattaa tatgtgtctt gactctttgt taacggattt 360

ctcatcttat cgataaatta acaaatcgtt agctctcccc gtcaaaaaag aaaacaaatt 420

attagctctg gttacgtgtt ttcattgccc ctcacaaact atatatctgc atatcgatcg 480

gttattcaaa ctggaaaata taacaagcta gctagggacg tcctctttga ccggccggtt 540

aagcttaacc gatctcacta catgaaaaac ggatagctga tttgatatgt gtttgcccga 600

taaccgatct caacacacat gcaaactgga ggaccaactg attataaatt gcctttaatt 660

tgatctccta cgatctttgc actgtc 686

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtcgactaat acttcagtcg atcagcgtga acgtctatgt aagaacaact ggatcc 56

<210> 4

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtcacgtt tctagcttgc cttctatata taacactaac acgagagcta gctagctagc 60

taacaaagct aactactact gctacttata actgtaggag tagtagttag cgtgtgctaa 120

tctcatgcac gtaattttca tttgcccctg ctcgctttcg cccttccttt tgactaacga 180

acacaccacg tactaactac gtacttgttg atcctaccaa acatcgacgc aactaaatta 240

atatatatgc attctcataa tatgcgtttt cttgtgtagc tttaattagc atggcgctat 300

atataaaaac cagctgaaat tggaattcat atatttttta aaaaaaaatt aaagatgttg 360

acatagtaat tatattgatg tgatccattt ttttggaaca ttgagacgca agttaaattt 420

atattagtta tatatatctt ccgttcgatc tccctttttt taaaaaaaaa attgtggtcg 480

atctcactat attaatggcg ctcaccacac gcaatcttca aaaggaaaaa gaattccttg 540

ggattttctt actccattaa tatgtgtctt gactctttgt taacggattt ctcatcttat 600

cgataaatta acaaatcgtt agctctcccc gtcaaaaaag aaaacaaatt attagctctg 660

gttacgtgtt ttcattgccc ctcacaaact atatatctgc atatcgatcg gttattcaaa 720

ctggaaaata taacaagcta gctagggacg tcctctttga ccggccggtt aagcttaacc 780

gatctcacta catgaaaaac ggatagctga tttgatatgt gtttgcccga taaccgatct 840

caacacacat gcaaactgga ggaccaactg attataaatt gcctttaatt tgatctccta 900

cgatctttgc actgtcgtcg actaatactt cagtcgatca gcgtgaacgt ctatgtaaga 960

acaactggat cc 972

Claims (8)

1.一种植物环状RNA成环框架，其特征在于，包括上游框架序列、待表达目的基因序列和下游框架序列；所述的上游框架序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游框架序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的植物环状RNA成环框架，其特征在于，在所述的上游框架序列后添加有酶切位点SalI，在所述的下游框架序列前添加有酶切位点BamHI，待表达目的基因序列插入在酶切位点SalI和BamHI之间。

3.一种植物环状RNA过表达载体，其特征在于，含有权利要求1或2所述的植物环状RNA成环框架。

4.一种植物环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，是将权利要求1或2所述的植物环状RNA成环框架通过同源重组的方法构建到植物表达载体中。

5.根据权利要求4所述的植物环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，所述的植物表达载体为pLX。

6.根据权利要求5所述的植物环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，扩增用于同源重组的表达载体pLX骨架的引物为pLX-R：GCAAGCTAGAAACGTGACAGTTTCCTCTCCAAATGAAATGAAC和pLX-F：CTCCTACGATCTTTGCACTGTCGATCGTTCAAACATTTGGCAA。

7.权利要求1所述的植物环状RNA成环框架或权利要求3所述的植物环状RNA过表达载体在过表达目的基因环状RNA中的应用。

8.一种目的基因环状RNA过表达载体的构建方法，其特征在于，在待表达目的基因序列两端添加酶切位点SalI和BamHI，然后酶切连接至权利要求3所述的植物环状RNA过表达载体的酶切位点SalI和BamHI之间。

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