CN115044611A - 一种便于操作的烟草瞬时转化方法 - Google Patents

一种便于操作的烟草瞬时转化方法 Download PDF

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CN115044611A CN202210757125.3A CN202210757125A CN115044611A CN 115044611 A CN115044611 A CN 115044611A CN 202210757125 A CN202210757125 A CN 202210757125A CN 115044611 A CN115044611 A CN 115044611A
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赵璇
程莎莎
赵梓璇
刘志国
杨猛
韩寿坤
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Abstract

本发明公开了一种便于操作的烟草瞬时转化方法，步骤如下：S1、构建转录因子过表达载体；S2、构建靶标基因在自身启动子驱动下的表达载体；S3、将步骤S1、S2得到的表达载体进行烟草瞬时转化。本发明采用上述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，方法更加简单易行，大大减少了仪器的购置成本。

Description

一种便于操作的烟草瞬时转化方法
技术领域
本发明涉及生物试验技术领域，尤其是涉及一种便于操作的烟草瞬时转化方法。
背景技术
将外源基因转入到植物体内，是研究基因功能的主要手段。植物遗传转化包括稳定转化和瞬时转化，利用农杆菌介导的稳定转化技术已经应用到很多作物物种中，是目前研究基因体内功能的常用方法。
瞬时表达(transienent geneexpression)是指将外源基因导入到植物细胞后，作为一种基因组外的遗传物质在一定时间内实现转录和翻译并积累相应表达产物的技术。瞬时表达方法较稳定表达方法具有操作简单、周期短、反应植物体内工作环境、表达效率高、安全高效等诸多突出优点。
目前，农杆菌介导的瞬时表达转基因转化方法，其中采用农杆菌进行介导，常选择LUC蛋白作为标记，在操作过程中需要多台设备进行检测，不仅增加了检测成本，并且操作复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种便于操作的烟草瞬时转化方法，方法更加简单易行，大大减少了仪器的购置成本。
为实现上述目的，本发明提供了一种便于操作的烟草瞬时转化方法，步骤如下：
S1、构建转录因子过表达载体；
S2、构建靶标基因在自身启动子驱动下的表达载体；
S3、将步骤S1、S2得到的表达载体进行烟草瞬时转化。
优选的，步骤S1中，构建转录因子过表达载体的流程如下：
(1)根据目的转录因子基因序列与载体序列设计引物，并在PCR反应体系中扩增目的基因CDS全长序列，通过琼脂糖凝胶电泳胶回收得到目的基因胶回收产物；将空载体的质粒进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳胶回收得到载体胶回收产物；
(2)将步骤(1)得到胶回收的转录因子基因、载体、无缝克隆酶混合均匀后，50℃水浴连接30min，反应结束后置于冰上冷却得到重组产物，再经过转化进入大肠杆菌中；
(3)挑取将大肠杆菌培养后的单克隆，进行摇菌、菌液PCR，挑取阳性菌落，摇菌后提取质粒测序；
(4)将转录因子过表达载体质粒转化农杆菌，挑取单克隆进行摇菌，菌液PCR挑取阳性菌落，摇菌保存，以备后续浸染试验。
优选的，步骤S2中，载体构建的方法如下：
a、根据靶标基因启动子序列与载体序列，设计带载体序列的引物，PCR扩增靶标基因启动子全长，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后胶回收；将启动子序列与载体连接转化，将载体酶切后进行琼脂糖凝胶电泳后胶回收；
b、将步骤a得到的胶回收的启动子、载体、无缝克隆酶混合均匀后，50℃水浴连接30min，反应结束后置于冰上冷却得到重组产物，转化大肠杆菌；
c、挑取单克隆进行摇菌以及菌液PCR，挑取阳性菌落，摇菌后提取质粒测序，测序正确则成功构建表达载体；
d、根据靶标基因序列与步骤c获得的表达载体序列，设计带载体序列的引物，PCR扩增靶标基因全长序列，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳胶回收；将靶标基因与载体连接转化；
e.自身启动子驱动表达的质粒转化农杆菌，再挑取单克隆进行摇菌，菌液PCR挑取阳性菌落，摇菌保存，以备后续浸染试验。
优选的，步骤d中，靶标基因与载体连接转化的操作如下：提取步骤c的重组载体质粒，将该质粒用BamH I酶切开，之后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到载体胶回收产物；
将靶标基因、载体、无缝克隆酶混合均匀后，50℃水浴连接30min，反应结束后置于冰上冷却得到重组产物；转化大肠杆菌后，次日，挑取单克隆进行摇菌以及菌液PCR检测靶标基因条带，挑取阳性菌落提取质粒测序。
优选的，步骤S3中，瞬时转化的操作如下：
取50mL农杆菌液于离心机5000rpm，室温10min，去上清，加5mL注射缓冲液重悬；离心洗涤2次后用注射缓冲液调OD值；
将烟草从光照室取出，放在日光灯下培养50-90min，使叶片气孔张开，选取已将长出四片子叶的烟草；将各载体质粒浓度均为一比一进行混合，在室温下静置2h后进行烟草叶片注射，将注射好的烟草放置于暗培养箱培养72h即可。
优选的，注射缓冲液的成分和浓度为MES 0.5mol/L、Na3PO4·12H2O 0.002mol/L和AS 1mol/L。
优选的，大肠杆菌转化的操作为在冰上融化大肠杆菌感受态细胞，于50μL的细胞中加入全部重组产物，轻轻弹动离心管壁后，在冰上放置30min；
加入450μL的没有抗性的LB液体培养基，之后37℃摇床中250rpm培养1h；取200μL的菌液在含有Kana的LB固体培养基上涂板，37℃培养箱培养过夜。
优选的，农杆菌转化的操作如下：取-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞于冰浴中融化，将5μL重组质粒加入50μL的农杆菌感受态质粒中，之后置于冰上30min；
将菌液置于液氮中冷冻1.5min，37℃水浴3min后加入500μL无抗LB液体培养基，28℃摇床培养4h；6000rpm离心5min，除去部分上清，剩余200μL的菌液在含有Kana、利福平的LB固体培养基上涂板，28℃培养箱培养过夜。
因此，本发明采用上述一种便于操作的烟草瞬时转化方法，靶标基因在自身启动子的驱动下进行表达，通过转录因子对靶标基因的转录调控，检测结果不借助于Luc荧光探测成像仪，仅需一台实时定量PCR仪即可进行实验。本发明的方法更加简单易执行，大大减少了仪器的购置成本。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是WRKY23的琼脂糖凝胶图；
图2是WRKY40的琼脂糖凝胶图；
图3是35S::WRKY23-GFP、35S::WRKY40-GFP的琼脂糖凝胶图；
图4是ZjCKX5CDS的琼脂糖凝胶图；
图5是ZjCKX5-pro-pCAMBIA1391的琼脂糖凝胶图；
图6是构建载体结构示意图；
图7是RT-qPCR检测的相关蛋白激活的ZjCKX5的相对表达量。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
实施例一
构建转录因子过表达载体35S::WRKY23-GFP和35S::WRKY40-GFP
一、转录因子的基因序列扩增
(1)根据目的转录因子基因序列与35S::GFP载体序列，设计含有Sam I酶切位点的引物序列。
引物设计如下：
WRKY40-F：CGAGCTCGGGTACCCATGGATTTTTCTTCATAT(SEQ ID.NO 1)
WRKY40-R：CTCTAGAGGATCCCCCGTACGGTTTTGGTAAA(SEQ ID.NO 2)
WRKY23-F：CGAGCTCGGGTACCCATGGAGGAGAATTAC(SEQ ID.NO 3)
WRKY23-R：CTCTAGAGGATCCCCTATATCTCTCTCTCTACT(SEQ ID.NO 4)
(2)配置PCR反应体系，扩增目的基因CDS全长序列，之后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到基因胶回收产物。
(3)将35S::GFP空载体的质粒进行酶切，之后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到载体胶回收产物。
其中，WRKY23的长度为1000bp、WRKY40的长度为951bp，图1、2分别是WRKY23、WRKY40的凝胶图。
二、转录因子基因与35S::GFP载体连接转化
(1)连接体系：转录因子基因胶回收5μL，载体胶回收3μL，无缝克隆酶5μL。
(2)混合均匀后，50℃水浴连接30min。反应结束后置于冰上冷却数秒。得到重组产物。
(3)大肠杆菌转化：在冰上融化大肠杆菌感受态细胞，在50μL的细胞中加入全部重组产物，轻轻弹动离心管壁(禁止涡旋)后，在冰上放置30min。加入450μL的没有抗性的LB液体培养基，之后37℃摇床中250rpm培养1h。取200μL的菌液在含有Kana的LB固体培养基上涂板，37℃培养箱培养过夜。次日，挑取单克隆进行摇菌以及菌液PCR，挑取阳性菌落，摇菌后提取质粒测序。测序正确则为成功构建35S::WRKY23-GFP和35S::WRKY40-GFP过表达载体。图3、4分别是WRKY23、WRKY40分别与35S::GFP连接后的凝胶图，泳道2、3是35S::WRKY23-GFP，泳道5、6是35S::WRKY40-GFP。
三、转录因子过表达载体质粒转化农杆菌
(1)取-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞于冰浴中融化。
(2)将5μL的35S::WRKY23-GFP和35S::WRKY40-GFP过表达载体质粒分别加入50μL的农杆菌感受态质粒中，之后置于冰上30min。
(3)将菌液置于液氮中冷冻1.5min。
(4)37℃水浴3min。
(5)加入500μL无抗LB液体培养基，28℃摇床培养4h。
(6)6000rpm离心5min，除去部分上清，剩余200μL的菌液在含有Kana和利福平的LB固体培养基上涂板，28℃培养箱培养过夜。
(7)挑取单克隆进行摇菌，菌液PCR挑取阳性菌落。摇菌保存，以备后续浸染试验。
实施例二
靶标基因在自身启动子驱动下表达ZjCKX5pro::ZjCKX5的载体构建
一、靶标基因ZjCKX5启动子序列扩增
(1)根据ZjCKX5启动子序列与pCAMBIA1391载体序列，设计带载体序列的引物，PCR扩增ZjCKX5启动子全长。
引物设计如下：
ZjCKX5pro-pCAMBIA1391-F：CGGCGCGCCAAGCTTTTCACTTCAGC(SEQ ID.NO 5)
ZjCKX5pro-pCAMBIA1391-R：CCTGCAGCCAAGCTTCTCAATCACCAC(SEQ ID.NO 6)
得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到产物，如图4。其中，ZjCKX5启动子的长度为2kb。
二、ZjCKX5启动子序列与pCAMBIA1391载体连接转化
(1)将pCAMBIA1391载体Hind III酶切开，之后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到载体胶回收产物。
(2)连接体系：启动子胶回收5μL，载体胶回收3μL，无缝克隆酶5μL。
(3)混合均匀后，50℃水浴连接30min。反应结束后置于冰上冷却数秒。得到重组产物。
(4)大肠杆菌转化：在冰上融化大肠杆菌感受态细胞，在50μL的细胞中加入全部重组产物，轻轻弹动离心管壁(禁止涡旋)后，在冰上放置30min。加入450μL的没有抗性的LB液体培养基，之后37℃摇床中250rpm培养1h。取200μL的菌液在含有Kana的LB固体培养基上涂板，37℃培养箱培养过夜。次日，挑取单克隆进行摇菌以及菌液PCR，挑取阳性菌落，摇菌后提取质粒测序。测序正确则成功构建ZjCKX5-pro-pCAMBIA1391表达载体，如图5。
三、靶标基因ZjCKX5基因序列扩增
根据ZjCKX5CDS基因序列与ZjCKX5-pro-pCAMBIA1391表达载体序列，设计带载体序列的引物，PCR扩增ZjCKX5CDS全长序列。ZjCKX5CDS长度为1023bp。
引物设计如下：
ZjCKX5-pCAMBIA1391-F：CAGGTCGACGGATCCATGAGCGGCT(SEQ ID.NO 7)
ZjCKX5-pCAMBIA1391-R：AATTCCCGGGGATCCCCATGAAGCTAAT(SEQ ID.NO 8)
得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到回收产物。
四、靶标基因ZjCKX5CDS序列与ZjCKX5-pro-pCAMBIA1391载体连接转化
(1)提取ZjCKX5-pro-pCAMBIA1391载体质粒，将该质粒用BamH I酶切开，之后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到载体胶回收产物。
(2)连接体系：ZjCKX5CDS胶回收产物5μL，ZjCKX5-pro-pCAMBIA1391载体胶回收产物3μL，无缝克隆酶5μL。
(3)混合均匀后，50℃水浴连接30min。反应结束后置于冰上冷却数秒。得到重组产物。
(4)大肠杆菌转化：在冰上融化大肠杆菌感受态细胞，在50μL的细胞中加入全部重组产物，轻轻弹动离心管壁(禁止涡旋)后，在冰上放置30min。加入450μL的没有抗性的LB液体培养基，之后37℃摇床中250rpm培养1h。取200μL的菌液在含有Kana的LB固体培养基上涂板，37℃培养箱培养过夜。
次日，挑取单克隆进行摇菌以及菌液PCR检测ZjCKX5CDS条带，挑取阳性菌落，摇菌后提取质粒测序。测序正确则成功构建ZjCKX5pro::ZjCKX5表达载体。
五、自身启动子驱动表达的ZjCKX5pro::ZjCKX5质粒转化农杆菌
(1)取-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞于冰浴中融化。
(2)将5μL的ZjCKX5pro::ZjCKX5质粒分别加入50μL的农杆菌感受态质粒中，之后置于冰上30min。
(3)将菌液置于液氮中冷冻1.5min。
(4)37℃水浴3min。
(5)加入500μL无抗LB液体培养基，28℃摇床培养4h。
(6)6000rpm离心5min，除去部分上清，剩余200μL的菌液在含有Kana和利福平的LB固体培养基上涂板，28℃培养箱培养过夜。
(7)挑取单克隆进行摇菌，菌液PCR挑取阳性菌落。摇菌保存，以备后续浸染试验。
实施例三
烟草瞬时转化
一、注射缓冲液配制
MES 0.5mol/L
Na3PO4·12H2O 0.002mol/L
AS 1mol/L
二、操作方法
(1)取50mL农杆菌液于离心机，5000rpm，室温，10min，去上清，加5mL注射缓冲液重悬。
(2)离心洗涤2次后用注射缓冲液将OD值调至0.8。
(3)将烟草从光照室取出，放在日光灯下培养1小时，使叶片气孔张开。选取已将长出四片子叶的烟草进行注射。
实验组：35S::WRKY23-GFP+ZjCKX5pro::ZjCKX5、
35S::WRKY40-GFP+ZjCKX5pro::ZjCKX5；
对照组：35S::GFP+ZjCKX5pro::ZjCKX5。
将各载体质粒浓度均为一比一进行混合，在室温下静置2h后进行烟草叶片注射，实验组与对照组注射到同一片叶片上。将注射好的烟草放置于暗培养箱培养72h后，分实验组和对照组采样，提取RNA。
三、实时定量RT-qPCR检测转录因子WRKY23和WRKY40调控下的ZjCKX5表达水平。
以反转录后的烟草cDNA为模板，实时定量RT-qPCR检测ZjCKX5表达水平。内参基因选择烟草Actin基因。所用引物如下：
Actin-F：ATGGCGGATGGGGAGGACAT(SEQ ID.NO 9)
Actin-R：TTAGAAGCATTTGCGGTG(SEQ ID.NO 10)
ZjCKX5-F：TGGATTCCGGGGATGAGACT(SEQ ID.NO 11)
ZjCKX5-R：CCACTTATCGCCGAAGTGGT(SEQ ID.NO 12)
根据实验组：对照组中ZjCKX5表达水平的比值即可判断转录因子WRKY23和WRKY40对靶标基因ZjCKX5转录水平的调控作用。
实验组：对照组＞1 转录因子正向调控靶标基因转录表达
实验组：对照组＝1 转录因子不调控靶标基因转录表达
实验组：对照组＜1 转录因子负向调控靶标基因转录表达
烟草瞬时转化实验表明转录因子WRKY23和WRKY40负调控ZjCKX5的表达。图中6所示在烟草瞬时转化实验中使用的构建。35S Promoter后的箭头表示的是转录起始位点。-1和-2000表示的是与ZjCKX5启动子区的长度。其中，35S::GFP载体作为负对照。
图7所示为RT-qPCR检测的相关蛋白激活的ZjCKX5的相对表达量。数据显示为平均值±标准差(n＝3)，**p<0.01，t检验。
因此，本发明采用上述一种便于操作的烟草瞬时转化方法，方法更加简单易行，大大减少了仪器的购置成本。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一种便于操作的烟草瞬时转化方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
cgagctcggg tacccatgga tttttcttca tat 33
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ctctagagga tcccccgtac ggttttggta aa 32
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
cgagctcggg tacccatgga ggagaattac 30
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
ctctagagga tcccctatat ctctctctct act 33
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
cggcgcgcca agcttttcac ttcagc 26
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
cctgcagcca agcttctcaa tcaccac 27
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
caggtcgacg gatccatgag cggct 25
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
aattcccggg gatccccatg aagctaat 28
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
atggcggatg gggaggacat 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
ttagaagcat ttgcggtg 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
tggattccgg ggatgagact 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 12
ccacttatcg ccgaagtggt 20

Claims (8)

1.一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于，步骤如下：
S1、构建转录因子过表达载体；
S2、构建靶标基因在自身启动子驱动下的表达载体；
S3、将步骤S1、S2得到的表达载体进行烟草瞬时转化。
2.根据权利要求1所述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于，步骤S1中，构建转录因子过表达载体的流程如下：
(1)根据目的转录因子基因序列与载体序列设计引物，并在PCR反应体系中扩增目的基因CDS全长序列，通过琼脂糖凝胶电泳胶回收得到目的基因胶回收产物；将空载体的质粒进行酶切，再通过琼脂糖凝胶电泳胶回收得到载体胶回收产物；
(2)将步骤(1)得到胶回收的转录因子基因、载体、无缝克隆酶混合均匀后，50℃水浴连接30min，反应结束后置于冰上冷却得到重组产物，再经过转化进入大肠杆菌中；
(3)挑取将大肠杆菌培养后的单克隆，进行摇菌、菌液PCR，挑取阳性菌落，摇菌后提取质粒测序；
(4)将转录因子过表达载体质粒转化农杆菌，挑取单克隆进行摇菌，菌液PCR挑取阳性菌落，摇菌保存，以备后续浸染试验。
3.根据权利要求1所述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于，步骤S2中，载体构建的方法如下：
a、根据靶标基因启动子序列与载体序列，设计带载体序列的引物，PCR扩增靶标基因启动子全长，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后胶回收；将启动子序列与载体连接转化，将载体酶切后进行琼脂糖凝胶电泳后胶回收；
b、将步骤a得到的胶回收的启动子、载体、无缝克隆酶混合均匀后，50℃水浴连接30min，反应结束后置于冰上冷却得到重组产物，转化大肠杆菌；
c、挑取单克隆进行摇菌以及菌液PCR，挑取阳性菌落，摇菌后提取质粒测序，测序正确则成功构建表达载体；
d、根据靶标基因序列与步骤c获得的表达载体序列，设计带载体序列的引物，PCR扩增靶标基因全长序列，得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳胶回收；将靶标基因与载体连接转化；
e.自身启动子驱动表达的质粒转化农杆菌，再挑取单克隆进行摇菌，菌液PCR挑取阳性菌落，摇菌保存，以备后续浸染试验。
4.根据权利要求1所述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于，步骤d中，靶标基因与载体连接转化的操作如下：提取步骤c的重组载体质粒，将该质粒用BamH I酶切开，之后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到载体胶回收产物；
将靶标基因、载体、无缝克隆酶混合均匀后，50℃水浴连接30min，反应结束后置于冰上冷却得到重组产物；转化大肠杆菌后，次日，挑取单克隆进行摇菌以及菌液PCR检测靶标基因条带，挑取阳性菌落提取质粒测序。
5.根据权利要求1所述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于，步骤S3中，瞬时转化的操作如下：
取50mL农杆菌液于离心机5000rpm，室温10min，去上清，加5mL注射缓冲液重悬；离心洗涤2次后用注射缓冲液调OD值；
将烟草从光照室取出，放在日光灯下培养50-90min，使叶片气孔张开，选取已将长出四片子叶的烟草；将各载体质粒浓度均为一比一进行混合，在室温下静置2h后进行烟草叶片注射，将注射好的烟草放置于暗培养箱培养72h即可。
6.根据权利要求5所述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于：注射缓冲液的成分和浓度为MES 0.5mol/L、Na3PO4·12H2O 0.002mol/L和AS 1mol/L。
7.根据权利要求2、3或4所述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于：大肠杆菌转化的操作为在冰上融化大肠杆菌感受态细胞，于50μL的细胞中加入全部重组产物，轻轻弹动离心管壁后，在冰上放置30min；
加入450μL的没有抗性的LB液体培养基，之后37℃摇床中250rpm培养1h；取200μL的菌液在含有Kana的LB固体培养基上涂板，37℃培养箱培养过夜。
8.根据权利要求2或3所述的一种便于操作的烟草瞬时转化方法，其特征在于，农杆菌转化的操作如下：取-80℃保存的农杆菌GV3101感受态细胞于冰浴中融化，将5μL重组质粒加入50μL的农杆菌感受态质粒中，之后置于冰上30min；
将菌液置于液氮中冷冻1.5min，37℃水浴3min后加入500μL无抗LB液体培养基，28℃摇床培养4h；6000rpm离心5min，除去部分上清，剩余200μL的菌液在含有Kana、利福平的LB固体培养基上涂板，28℃培养箱培养过夜。
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