CN111471685B

CN111471685B - 一种喇叭虫rna干扰表达载体与构建方法及其应用

Info

Publication number: CN111471685B
Application number: CN202010434356.1A
Authority: CN
Inventors: 缪炜; 韦薇; 柴小翠; 张巨源; 张承才
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: CN111471685A

Abstract

本发明公开了一种喇叭虫RNA干扰表达载体与构建方法及其应用。步骤包括：1)利用质粒pSCTGA的已知序列，获得pSCTGA质粒骨架；2)利用集胞藻PCC6803基因组DNA，通过PCR扩增C‑藻蓝蛋白β亚基的启动子；3)利用质粒L4440，通过PCR扩增质粒的多克隆位点；4)利用PCR扩增获得的DNA片段，通过同源重组的融合PCR和一步克隆法最终构建得到RNAi表达载体pSCT3C。本发明首先利用氯化钙法将含有目的基因的RNAi表达载体转染进大肠杆菌DH10B菌株，然后再采用接合转移方法将其转染进集胞藻PCC6803中，成功获得阳性单克隆藻株后，可通过喂食方式用于干扰天蓝喇叭虫中目的基因的表达。综上所述，本发明方法易行，操作方便，具有应用于其他纤毛虫基因干扰的可行性。

Description

一种喇叭虫RNA干扰表达载体与构建方法及其应用

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，涉及一种喇叭虫RNAi表达载体的构建方法及应用。

【背景技术】

天蓝喇叭虫是我国较为常见的一种纤毛虫，隶属于原生动物中的纤毛门多膜纲异毛目，广泛分布于全球各地的淡水环境中。细胞形态呈圆锥状或者喇叭状；有一条链珠状大核和许多与大核邻近的小核；细胞前部较宽，有口器；附着器位于狭窄的后部。虫体伸展时体长可达1-2mm，表面的动体条索之间、沿纵轴方向分布着成排的蓝绿色色素颗粒，是淡水水体浮游生物的重要组成部分。不同于模式生物四膜虫，天蓝喇叭虫并不能利用基因枪技术进行基因的转移，也就无法进一步研究基因的功能。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi现象是dsRNA干扰与其互补序列的基因表达的过程，通过给予单细胞生物或多细胞生物特定的dsRNA，可以诱导RNAi选择性降低目的基因在细胞或有机体中的表达。此现象已经发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫和斑马鱼等多种真核生物中，人们也基于这一现象研究了一种反向调控基因表达的遗传学机制。其中，RNAi现象已经在秀丽隐杆线虫中取得良好的研究结果：首先将含有目的基因的RNAi质粒(L4440质粒)转染进大肠杆菌HT115(DE3)，通过IPTG诱导目的基因dsRNA的表达；然后将大肠杆菌喂食于线虫，目的基因的dsRNA可以通过肠道被转移到线虫中；最后发生RNAi过程,抑制目的基因的表达，并且发现RNAi基因表达的表型是可遗传的。1998年，Ruiz等人发现草履虫中存在依赖于同源识别的基因干扰现象，这是首次在纤毛虫中报道了以dsRNA介导的特异性降解mRNA现象。直到2002年，借鉴于秀丽隐杆线虫的RNAi实验方法和结果，Galvani等在草履虫中成功研究了适用于纤毛虫的RNAi实验方法。此后，人们基于大肠杆菌HT115(DE3)的表达系统，构建了不同的RNAi表达载体，应用于其他纤毛虫的基因功能研究，包括游仆虫、尖毛虫、棘尾虫和天蓝喇叭虫。Slabodnick等基于大肠杆菌HT115表达系统，构建了Mob1的RNAi表达载体，最后根据RNAi的细胞表型，成功证明Mob1是一种非对称定位的模式蛋白，在天蓝喇叭虫的发育和再生过程中起到重要作用。RNAi实验方法的可行性解决了喇叭虫基因功能的研究问题。

基于大肠杆菌表达系统，外源基因需要诱导物的诱导才能进行表达，导致表达外源基因dsRNA时间较长、过程复杂。然而，我们发现的另一种模式生物——集胞藻PCC6803。基于集胞藻PCC6803的表达系统，外源基因无需诱导物诱导即可进行表达，可以持续表达外源基因dsRNA。

集胞藻PCC6803是一种单细胞原核生物，隶属于蓝藻门、蓝藻纲、色球藻目，广泛分布在淡水生态环境中。集胞藻PCC6803于1968年从一个淡水湖中分离出来，为多种水生生物为食。集胞藻PCC6803是研究蓝藻基因工程的模式生物：在实验室条件下，集胞藻PCC6803可以进行无菌纯培养，既可以利用光能营自养生长、又能利用葡萄糖等有机化合物进行异养生长，以多细胞聚集的群体形式存在；1996年，集胞藻PCC6803成为第一个基因组全序列被测定的蓝藻藻株，遗传背景相对于其他蓝藻较为清晰，是目前研究最深入的蓝藻种类之一；集胞藻PCC6803可以通过外源基因表达载体(穿梭载体)将目的基因导入细胞内进行表达，这种穿梭载体通过接合转移的方法导入集胞藻PCC6803细胞内并在细胞质中进行自主复制，并且具有在多个藻株内穿梭表达的优势。

C-藻蓝蛋白(cpc)是一种主要存在于蓝藻中的捕光色素类蛋白，由α和β亚基组成的异二聚体。cpc在光合作用中具有重要的吸收和传递能量的功能，还是细胞中的存储蛋白，可以在蓝藻缺乏氮源的时候，保持蓝藻的正常生存。由于cpc启动子是控制着光合系统相关基因转录的强启动子，并且几乎存在于所有的蓝藻中，因此它成为蓝藻中常用的一个组成型启动子。cpc启动子控制cpc操纵子的表达，通常操纵子的第一个基因是cpc-β亚基(cpcB)，因此启动子也通常被称为cpcB启动子(P_cpcB)。P_cpcB已经成功适用于多种集胞藻株系，并且获得高产量的蛋白表达。因此，基于集胞藻PCC6803的表达系统，P_cpcB作为调控外源基因表达的内源的、强启动子，可以持续性、高效性启动外源基因的表达。

实验还发现天蓝喇叭虫偏爱食用集胞藻PCC6803，有利于RNAi效应的积累，进而干扰目的基因的表达。因此，集胞藻PCC6803可以代替大肠杆菌作为天蓝喇叭虫RNAi基因表达的表达系统，同时也具有应用于其他纤毛虫基因干扰的可行性。

目前还没有基于集胞藻PCC6803的表达系统调控外源基因表达的研究，用于喇叭虫RNAi表达载体、并抑制天蓝喇叭虫中目的基因的表达方面的运用。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种喇叭虫RNA干扰表达载体与构建方法，并将其应用于抑制天蓝喇叭虫中目的基因的表达。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C的构建方法，具体如下：

一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C的构建方法，包括如下步骤：

S1.根据质粒pSCTGA核苷酸序列，获得pSCTGA质粒骨架；

其中，质粒pSCTGA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

进一步地，所述pSCTGA质粒骨架由质粒pSL2680、质粒pTara、质粒RSF1010、质粒pDU1通过同源重组方式连接得到；

进一步地，所述质粒骨架包含复制元件、诱动基因和卡那霉素抗性基因；

进一步地，得到回收纯化的DNA片段大小为7300bp。

S2.利用引物，以集胞藻PCC6803的DNA为模板，PCR扩增FP_cpcB；

其中，上游引物FP_cpcB-F：5′-GGGGTTTTTTTTTGG acctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatgg-3′，下游引物FP_cpcB-R：5′-TGAATTAATCTCCTA cttgactttatgagttgggattttcttaaacacaatt-3′，其中上、下游引物大写碱基均为同源重组序列；

进一步地，回收纯化的DNA片段大小为560bp，DNA测序结果表明扩增序列正确。

S3.利用引物，以集胞藻PCC6803 DNA为模板，PCR扩增RP_cpcB；

其中，上游引物RP_cpcB-F：5′-TGAATTAATCTCCTA cttgactttatgagttgggattttcttaaacacaa-3′，下游引物RP_cpcB-R：5′-ACCGACGCTAGTGCT acctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatgg-3′，其中上、下游引物大写碱基均为同源重组序列；

进一步地，得到回收纯化的DNA片段大小为560bp，DNA测序结果表明扩增序列正确。

S4.利用引物，以质粒L4440为模板，PCR扩增MCS；

上游引物MCS-F：5′-TAGGAGATTAATTCA gagaccggcagatctgatatcatcgatg-3′，下游引物MCS-R：5′-TAGGAGATTAATTCA gcgaattgggtaccgggccc-3′，其中上、下游引物大写碱基均为同源重组序列；

进一步地，得到回收纯化的DNA片段大小为185bp，DNA测序结果表明扩增序列正确。

S5.利用引物，将步骤S2和步骤S4中分别回收纯化DNA片段共同作为模板，基于同源重组的方法，融合PCR连接FP_cpcB和MCS；

其中，上游引物为FP_cpcB-F，下游引物为MCS-R；

进一步地，得到回收纯化的745bp DNA片段FP_cpcB-MCS，DNA测序结果表明序列连接正确。

S6.利用引物，将步骤S5和步骤S3中分别回收纯化的DNA片段共同作为模板，基于同源重组的方法，融合PCR连接FP_cpcB-MCS和RP_cpcB；

其中上游引物为FP_cpcB-F，下游引物为RP_cpcB-R；

进一步地，得到回收纯化的1305bp DNA片段FP_cpcB-MCS-RP_cpcB，DNA测序结果表明序列连接正确。

S7.将步骤S6中回收纯化的DNA小片段同步骤S1中回收纯化的DNA大片段进行连接，基于一步克隆的方法，得到8605bp长度的RNAi表达载体pSCT3C，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。将质粒pSCT3C进行全长DNA测序，测序结果表明载体构建正确。保存含有正确质粒的大肠杆菌DH10B，用于其增殖和加甘油冻存于-80℃。

本发明提供了一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C，该载体利用集胞藻PCC6803系统表达，将集胞藻PCC6803 cpcB基因启动子和质粒L4440的MCS进行连接，然后整合到pSCTGA质粒骨架上，最后构建成RNAi表达载体pSCT3C，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。基于集胞藻PCC6803表达系统的RNAi表达载体pSCT3C线性化全长为8605bp，具体位置信息描述如下：

卡那霉素抗性基因(Npt)：92-907；

复制起始点(OriV)：1501-1925；

诱动基因(Mob)：1921-4533；

复制起始蛋白(Rep)：5044-6721；

正向cpcB基因启动子：6971-7530；

多克隆位点：7531-7715；

反向cpcB基因启动子：7716-8275。

本发明所用质粒L4440信息参考Kamath等，购买于BioVector NTCC保藏中心。本发明中所有限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购买于TaKaRa公司、高纯度质粒小提试剂盒购买于北京康为世纪生物科技有限公司、Biospin胶回收试剂盒购买于Axygen公司、ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒购买于南京诺唯赞生物科技有限公司、BioReadyePfu MiX DNA聚合酶购买于武汉上沅科技有限公司、DNA分子量标记Marker购买于北京擎科新业生物技术有限公司、卡那霉素购买于国药集团化学试剂有限公司、琼脂糖购买于Biowest公司、离心管和枪头购买于Axygen公司和国药集团化学试剂有限公司、所有引物合成和测序均由武汉艾康健生物科技有限公司完成。

本发明另一方面提供了一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C在天蓝喇叭虫基因干扰(目的基因为激酶共激活因子(Mob1))中的应用基本操作步骤如下：

S8.构建含有目的基因的RNAi表达载体pSCT3C-Mob1：

1)利用引物，以天蓝喇叭虫DNA为模板，PCR扩增天蓝喇叭虫Mob1基因的不同区段；

进一步地，所述引物为：

上游引物Mob1-633-F：5′-ggaAGATCT aagaagcgaattgaaaaaggccagc-3′；

下游引物Mob1-633-R：5′-cggGGTACC gttaccagaagcttctctttccattctttcc-3′；

上游引物Mob1-317-F：5′-ggaAGATCT aagaagcgaattgaaaaaggccagc-3′；

下游引物Mob1-317-R：5′-cggGGTACC caggtcatgagaaaatcaatgtactctgatgc-3′；

上游引物Mob1-347-F：5′-ggaAGATCT catcagagtacattgattttctcatgacctggg-3′；

下游引物Mob1-347-R：5′-cggGGTACC gttaccagaagcttctctttccattctttcc-3′；

进一步地，上游引物下划线部分为Bgl II酶切位点和保护碱基，下游引物下划线部分为Kpn I酶切位点和保护碱基；

进一步地，对应所述引物分别得到回收纯化的DNA片段分别为633bp、317bp和347bp，DNA测序结果表明扩增序列正确；

2)上述引物扩增得到的Mob1基因不同区段，经过Bgl II和Kpn I双酶切，直接溶液回收酶切产物；

3)质粒pSCT3C经过Bgl II和Kpn I双酶切，然后回收纯化长度为8437bp的DNA片段；

4)将步骤2)中回收纯化的DNA小片段分别与步骤3)中回收纯化的DNA大片段进行连接，得到质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347；

进一步地，对三个质粒上Mob1基因的不同区段进行测序，DNA测序结果表明Mob1基因不同区段的DNA序列无突变且载体构建正确。将重组后质粒导入大肠杆菌DH10B，并鉴定后用于其增殖和加甘油冻存于-80℃。

S9.含分别有目的基因的RNAi表达质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的DH10B菌株经接合转移方法转染到集胞藻PCC6803体内：

1)将集胞藻PCC6803培养于10mL BG11培养基，直至藻液浓度生长到OD₅₈₀＝1；将大肠杆菌DH10B培养于10mL LB培养基，直至菌液浓度生长到OD₆₀₀＝1；

2)用无菌Milli-Q水分别清洗集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B 2次，离心后分别收集藻体和菌体沉淀，吸弃上清液；

3)用新鲜的、无菌的BG11培养基重悬集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B的藻体和菌体沉淀，充分悬浮均匀；

4)将步骤3)中的集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B等体积混匀，静置于30℃、40μmol photons m^-2s^-1连续光照的培养箱，孵育4-6h。

S10.转染后集胞藻PCC6803的培养、筛选和鉴定

1)集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B混合液孵育后，涂布于不含有抗性的BG11固体培养基平板上，并置于温度30℃和40μmol photons m^-2s^-1连续光照的条件下进行转化子的诱导；

2)再24h后，向步骤1)中固体平板加入终浓度为25μg/mL的Km，并置于温度30℃和40μmol photons m^-2s^-1连续光照的条件下进行转化子的筛选；

3)再2-3周后，大量转化子出现在平板上，挑取单克隆藻落转移至新鲜的含有终浓度25μg/mL Km的BG11固体培养基平板上，进一步纯化转化子；

4)再1-2周后，挑取单克隆藻落转移至新鲜的含有终浓度50μg/mL Km的BG11液体培养基中，再一次纯化转化子并且扩大培养藻种；

5)再3-5天后，转化子大量生长，为下一步的分子鉴定作前期准备；

6)利用引物，分别以含有空载体pSCT3C的集胞藻PCC6803(对照组)和步骤4)中获得的转化子为模板，藻落PCR扩增Mob1基因的不同区段；

进一步地，所述引物为：

上游引物Mob1-633-F，下游引物Mob1-633-R；

上游引物Mob1-317-F，下游引物Mob1-317-R；

上游引物Mob1-347-F，下游引物Mob1-347-R；

进一步地，对获得的DNA片段进行测序，测序结果与Mob1基因不同区段的DNA序列比对上，则认为转化子正确，成功获得分别含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的集胞藻PCC6803藻株；

7)提取步骤6)中集胞藻PCC6803的RNA，然后进行逆转录合成cDNA；

8)利用引物，以步骤7)中cDNA为模板，逆转录PCR扩增Mob1基因的不同区段；

进一步地，所述引物为：

上游引物Mob1-633-F，下游引物Mob1-633-R；

上游引物Mob1-317-F，下游引物Mob1-317-R；

上游引物Mob1-347-F，下游引物Mob1-347-R；

进一步地，对获得的DNA片段进行测序，测序结果与Mob1基因不同区段的DNA序列比对上，则认为分别含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的集胞藻PCC6803成功表达目的基因dsRNA。

S11.步骤S10中集胞藻PCC6803在天蓝喇叭虫Mob1基因干扰中的应用

1)天蓝喇叭虫培养于30mL MSM培养基，直至细胞个数大于300个；集胞藻PCC6803培养于30mL BG11培养基，直至藻液浓度生长到OD₅₈₀＝1；

2)将天蓝喇叭虫分装于6孔板(NEST)，每个孔板放置30个细胞于6mL无菌Milli-Q水，共10个孔板；用无菌Milli-Q水清洗集胞藻PCC6803 2次，离心后收集藻体沉淀；

3)以喂食野生型集胞藻PCC6803和含有空载体pSCT3C的集胞藻PCC6803为对照组，以喂食步骤3中集胞藻PCC6803为实验组，共两组平行样品。用无菌Milli-Q水调整藻液浓度为OD₅₈₀＝0.4，每三天适量喂食天蓝喇叭虫，并且用Zeiss解剖镜初步观察细胞表型；

4)天蓝喇叭虫被喂食15天后，收集各个孔板的细胞进行脱口器实验，并且观察口器再生过程中的细胞表型；

5)用荧光显微镜进一步观察形态异常的细胞，并用显微镜配套的数码成像系统拍照记录。

经过多次重复实验，细胞表型相似于Slabodnick等基于大肠杆菌表达系统进行的RNA干扰天蓝喇叭虫Mob1基因表达的结果，说明本发明中基于集胞藻PCC6803表达系统的RNAi表达载体pSCT3C在天蓝喇叭虫基因干扰中的应用是可行的、有效的，由此可以通过RNAi表达载体pSCT3C对天蓝喇叭虫的基因干扰，探究天蓝喇叭虫的基因功能。

综上所述，本发明中基于集胞藻PCC6803表达系统的喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C上含有双向的集胞藻PCC6803 cpcB基因启动子、多克隆位点、抗性基因、诱动基因和复制元件，具体如下特征：

1、基于集胞藻PCC6803表达系统的喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C上含有双向cpcB基因的启动子。蓝藻cpcB基因的启动子是一个强启动子，能高效启动下游基因的表达。因此，本发明中的双向cpcB基因启动子能够有效的表达外源基因dsRNA；

2、基于集胞藻PCC6803表达系统的喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C上含有可替换外源基因的MCS。通过替换不同的外源基因，以实现集胞藻PCC6803成为一个外源基因表达系统；

3、基于集胞藻PCC6803表达系统的喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C上含有抗性基因。在卡那霉素药物筛选作用下，使含有外源基因的质粒在大肠杆菌DH10B和集胞藻PCC6803体内大量倍增，实现外源基因的遗传转化；

4、基于集胞藻PCC6803表达系统的喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C上含有诱动基因，可以被带有转移基因的转移性质粒(大肠杆菌DH10B中的质粒pRL443和pRL623)诱动而发生接合转移；

5、基于集胞藻PCC6803表达系统的喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C上含有一般质粒的复制起始位点和复制起始蛋白，可以在多个宿主中进行复制。

本发明中喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C用于天蓝喇叭虫基因干扰的方法与现有技术相比具有以下优点：

1、相较于大肠杆菌，天蓝喇叭虫更喜爱食用集胞藻PCC6803，有利于RNAi效应的积累，进而抑制目的基因的表达，并且发现集胞藻PCC6803可以被多种纤毛虫食用；

2、只需将含有外源基因的表达载体pSCT3C重组到大肠杆菌DH10B中，然后经接合转移法转染到集胞藻PCC6803体内即可，操作方法简单和转化率高；

3、相较于大肠杆菌表达系统，集胞藻PCC6803表达系统不需要诱导物的诱导，便可持续表达外源基因dsRNA；

4、只需要利用显微镜便可观察天蓝喇叭虫的细胞表型，该法操作简便和快速，因此使用该法可对细胞进行实时追踪。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为质粒pSCTGA结构示意图。

图2为质粒L4440结构示意图。

图3为质粒pSCT3C构建示意图。

图4为PCR扩增cpcB基因启动子、多克隆位点和pSCTGA质粒骨架的结果电泳图。

图5为PCR连接cpcB基因启动子、多克隆位点和pSCTGA质粒骨架合成质粒pSCT3C的结果电泳图。

图6为质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347构建示意图。

图7为PCR扩增天蓝喇叭虫Mob1基因不同区段的结果电泳图。

图8为质粒pSCT3C用Bgl II和Kpn I双酶切的结果电泳图。

图9为大肠杆菌DH10B转化子中质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-347和pSCT3C-Mob1-317的鉴定结果电泳图。

图10为藻落PCR鉴定集胞藻PCC6803中Mob1基因不同区段的结果电泳图。

图11：逆转录PCR鉴定集胞藻PCC6803中Mob1基因不同区段dsRNA的表达结果电泳图。

图12：天蓝喇叭虫摄食于体内的集胞藻PCC6803图像。

图13：RNAi天蓝喇叭虫中Mob1基因表达导致细胞表型异常。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。

实施例一：质粒pSCT3C的构建

1、CTAB方法提取集胞藻PCC6803 DNA

(1)将1mL OD₅₈₀＝1的集胞藻PCC6803转移至适量的BG11培养基，置于温度30℃、转速100rpm震荡以及40μmol photons m^-2s^-1连续光照条件下培养3天；

(2)取2mL集胞藻PCC6803于离心管中，Eppendorf离心机12000rpm离心2min(室温)，收集藻体沉淀，用1mL移液器(Eppendorf公司产品)吸弃上清液；

(3)制备CTAB提取缓冲液：2％CTAB+100mM Tris-HCl+20mM EDTA(pH 8.0)+1.4MNaCl+2％β-巯基乙醇(现配现用)；

(4)向藻体沉淀中加入567μL的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μL 10％SDS和15μL蛋白酶K，充分混匀，置于37℃孵育1h；

(5)向离心管中加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入200μL CTAB/NaCl溶液，混匀后置于65℃孵育10min；

(6)向离心管中加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇(25:24:1)的混合液，充分混匀，离心4-5min将上清液转入新离心管中；

(7)向离心管中加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀直至DNA沉淀；

(8)DNA沉淀用1mL的70％乙醇清洗后，12000rpm离心1min(4℃)，吸弃乙醇，无菌Milli-Q水溶解DNA，冻存于-20℃。

2、试剂盒方法提取质粒RSF1010和质粒L4440

提取质粒RSF1010和质粒L4440(结构示意图如图2)的过程参考北京康为高纯度质粒小提试剂盒说明书，无菌Milli-Q水溶解质粒，冻存于-20℃。

3、PCR扩增正向cpcB基因启动子、多克隆位点和反向cpcB基因启动子

(1)根据中国科学院水生生物研究所藻类生长与发育学科组张承才研究员和张巨源助理研究员提供的质粒pSCTGA(结构示意图如图1)序列(SEQ ID NO.2)和集胞藻PCC6803cpcB基因启动子序列，以及BioVector NTCC保藏中心提供的质粒L4440序列，用软件GeneTool 1.0Lite设计引物；

(2)所用引物如下(引物中大写碱基为同源重组序列)：

上游引物FP_cpcB-F：5′-GGGGTTTTTTTTTGG acctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatgg-3′；下游引物FP_cpcB-R：5′-TGAATTAATCTCCTA cttgactttatgagttgggattttcttaaacacaatt-3′；

上游引物RP_cpcB-F：5′-TGAATTAATCTCCTA cttgactttatgagttgggattttcttaaacacaa-3′；下游引物RP_cpcB-R：5′-ACCGACGCTAGTGCT acctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatgg-3′；

上游引物MCS-F：5′-TAGGAGATTAATTCA gagaccggcagatctgatatcatcgatg-3′；下游引物MCS-R：5′-TAGGAGATTAATTCA gcgaattgggtaccgggccc-3′；

根据已知的质粒pSCTGA序列用修改抗性基因方法合成pSCTGA质粒骨架(含复制元件、诱动基因和卡那霉素抗性基因)，pSCTGA质粒骨架各区来源为：

1-1080来源于质粒pSL2680，包含卡那霉素抗性基因(Npt)、linker；

1081-1190来源于质粒pTara，包含linker；

1191-6970来源于质粒RSF1010，包含复制元件(OriV)、诱动基因(Mob)、复制起始蛋白(Rep)、linker；

7301-7630来源于质粒pDU1，包含linker；

将以上各区域以同源重组方式进行连接可以得到质粒pSCTGA骨架(含复制元件、诱动基因和卡那霉素抗性基因)。

以集胞藻PCC6803 DNA为模板，用Eppendorf PCR仪扩增出560bp长度的正向cpcB基因启动子序列和560bp长度的反向cpcB基因启动子序列；以质粒L4440为模板，用Eppendorf PCR仪扩增出185bp长度的MCS序列，电泳图如图4所示，其中M：DNA分子标记，条带从大到小分别为19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925和421bp；1：正向cpcB基因启动子；2：多克隆位点；3：反向cpcB基因启动子；4：pSCTGA质粒骨架。

(3)PCR反应体系组分：1×ePfu Mix 38μL,2μL正向引物(10μmol/L)，2μL反向引物(10μmol/L)，加入8μL DNA模板,最后用双蒸水配成50μL PCR反应体系；

(4)加样过程在冰上操作，加完样品后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪器；

(5)PCR反应程序如下：94℃5min预变性，94℃30s，60℃30s，72℃延伸(时间参考扩增DNA片段大小)，共29个循环反应，最后于72℃再延伸10min；

(6)PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳回收后，目的DNA片段用Biospin胶回收试剂盒回收纯化，纯化过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书；

(7)回收纯化的DNA片段进行测序，测序结果与原始DNA序列比对上，则获得扩增序列正确的DNA片段。

4、基于同源重组的融合PCR连接正向cpcB基因启动子、多克隆位点和反向cpcB基因启动子

(1)所用引物如下：

上游引物FP_cpcB-F：5′-GGGGTTTTTTTTTGG acctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatgg-3′(大写碱基为同源重组序列)；

下游引物MCS-R：5′-TAGGAGATTAATTCA gcgaattgggtaccgggccc-3′(大写碱基为同源重组序列)；

下游引物RP_cpcB-R：5′-ACCGACGCTAGTGCT acctgtagagaagagtccctgaatatcaaaatgg-3′(大写碱基为同源重组序列)；

将回收纯化的FP_cpcB和MCS DNA片段共同作为模板，用Eppendorf PCR仪连接FP_cpcB和MCS，得到745bp长度的DNA片段FP_cpcB-MCS；将回收纯化的745bp和560bp DNA片段共同作为模板，用Eppendorf PCR仪连接FP_cpcB-MCS和RP_cpcB，得到1305bp长度的DNA片段FP_cpcB-MCS-RP_cpcB；图5为电泳图，M：DNA分子标记，条带从大到小分别为19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489和925bp。1：正向cpcB基因启动子连接多克隆位点合成FP_cpcB-MCS；2：FP_cpcB-MCS连接反向cpcB基因启动子合成FP_cpcB-MCS-RP_cpcB；

(2)PCR反应体系组分：1×ePfu Mix 38μL,2μL正向引物(10μmol/L)，2μL反向引物(10μmol/L)，各加入4μL DNA模板,共8μL DNA模板，最后用双蒸水配成50μL PCR反应体系；

(3)加样过程在冰上操作，加完样品后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于PCR仪器；

(4)PCR反应程序如下：94℃5min预变性，94℃30s，60℃30s，72℃延伸(时间参考扩增DNA片段大小)，共29个循环反应，最后于72℃再延伸10min；

(5)PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳回收后，目的DNA片段用Biospin胶回收试剂盒回收纯化，纯化过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书；

(6)回收纯化的DNA片段进行测序，测序结果与原始DNA序列比对上，则获得连接序列正确的DNA片段。

5、基于同源重组的一步克隆法构建质粒pSCT3C

(1)用Eppendorf PCR仪连接步骤4中1305bp DNA小片段和步骤3中7300bp DNA大片段，得到8605bp长度的质粒pSCT3C；图5电泳图中，3：FP_cpcB-MCS-RP_cpcB连接复制元件、诱动基因和抗性基因合成质粒pSCT3C；

(2)PCR反应体系组分：1μL DNA大片段(7300bp)，8μL DNA小片段(1305bp)，5×CEMultiS Buffer 4μL，2μL Exnase MultiS，最后用双蒸水配成20μL反应体系；

(4)PCR反应程序如下：37℃反应30min，降至4℃冷却待用。

6、重组产物转化和重组质粒鉴定

(1)在冰上解冻大肠杆菌DH10B的化学感受态细胞；

(2)取10μL步骤5的重组产物加入100μL感受态细胞中，弹匀管内液体，冰上静置30min；

(3)42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min；

(4)加入900μL的LB培养基(不添加抗生素)，然后置于温度37℃和转速200rpm的培养箱，孵育1h；

(5)提前将含有终浓度50μg/mL羧苄青霉素(Car)、25μg/mL氯霉素(Cm)和50μg/mLKm的LB固体培养基在37℃培养箱中预热；

(6)5000rpm离心5min(室温)，弃掉上清800μL，然后用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在步骤(5)中LB固体培养基平板上轻轻涂匀；

(7)37℃培养箱中倒置培养12-16h后，重组反应转化平板上形成单克隆菌株；

(8)挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到如图5大小的质粒进行全长DNA测序，测序结果与原始DNA序列比对上，则获得正确的质粒pSCT3C；

(9)保存步骤(8)中含有正确质粒pSCT3C的大肠杆菌DH10B，用于其增殖和加甘油冻存于-80℃。

具体克隆过程见图3。

实施例二：质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的构建

1、试剂盒方法提取天蓝喇叭虫DNA

(1)天蓝喇叭虫培养于含有30mL MSM培养基的培养皿(直径90mm)、温度20℃、黑暗环境和补充长绿梭藻为食的条件下，生长2-3天；

(2)培养皿置于解剖镜下，用口吸管吸取10只天蓝喇叭虫细胞于PCR管中待用，吸弃多余液体；

(3)提取天蓝喇叭虫DNA的过程参考上海贝曼REDExtract-Amp Tissue PCR Kit试剂盒说明书，无菌Milli-Q水溶解DNA，冻存于-20℃。

2、PCR扩增天蓝喇叭虫Mob1基因的不同区段

(1)根据本发明所用的天蓝喇叭虫株系的全基因组序列(未发表)，用软件GeneTool 1.0Lite设计引物；

(2)所用引物如下：

上游引物Mob1-633-F：5′-ggaAGATCT aagaagcgaattgaaaaaggccagc-3′(下划线为Bgl II酶切位点和保护碱基)；

下游引物Mob1-633-R：5′-cggGGTACC gttaccagaagcttctctttccattctttcc-3′(下划线为Kpn I酶切位点和保护碱基)；

上游引物Mob1-317-F：5′-ggaAGATCT aagaagcgaattgaaaaaggccagc-3′(下划线为Bgl II酶切位点和保护碱基)；

下游引物Mob1-317-R：5′-cggGGTACC caggtcatgagaaaatcaatgtactctgatgc-3′(下划线为Kpn I酶切位点和保护碱基)；

上游引物Mob1-347-F：5′-ggaAGATCT catcagagtacattgattttctcatgacctggg-3′(下划线为Bgl II酶切位点和保护碱基)；

下游引物Mob1-347-R：5′-cggGGTACC gttaccagaagcttctctttccattctttcc-3′(下划线为Kpn I酶切位点和保护碱基)；

以天蓝喇叭虫DNA为模板，用Eppendorf PCR仪扩增出633bp、317bp和347bp长度的Mob1基因不同区段序列，图7为PCR扩增天蓝喇叭虫Mob1基因不同区段的结果电泳图。1：Mob1基因全长序列633bp；2：Mob1基因3′端下半部分序列347bp；3：Mob1基因5′端上半部分序列317bp。

(5)PCR反应程序如下：94℃5min预变性，94℃30s，60℃30s，72℃延伸1min，共29个循环反应，最后于72℃再延伸10min；

3、步骤2中天蓝喇叭虫Mob1基因不同区段的酶切

(1)回收纯化的天蓝喇叭虫Mob1基因不同区段经过Bgl II和Kpn I双酶切；

(2)双酶切体系组分：适量体积目的片段，1μL 10×S Bgl II，1μL 10×Kpn I，1μL10×L Buffer，最后用双蒸水配成10μL双酶切体系；

(3)加样过程在冰上操作，加完样品后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于37℃培养箱，酶切过夜；

(4)酶切产物不经过1％琼脂糖凝胶电泳回收，直接用Biospin胶回收试剂盒回收纯化，纯化过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书；

4、质粒pSCT3C的酶切

(1)质粒pSCT3C经过Bgl II和Kpn I双酶切，得到8437bp长度的DNA大片段，图8为质粒pSCT3C用Bgl II和Kpn I双酶切的结果电泳图。M：DNA分子标记，条带从大到小分别为19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489和925bp。1：质粒pSCT3C为对照；2：质粒pSCT3C被Bgl II和Kpn I双酶切，回收DNA大片段8437bp；

(2)双酶切体系组分：适量体积的质粒，1μL 10×Bgl II，1μL 10×Kpn I，1μL 10×L Buffer，最后用双蒸水配成10μL双酶切体系；

(3)加样过程在冰上操作，加完样品后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于37℃培养箱，酶切至少3h；

(4)酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，与未酶切质粒pSCT3C进行比较后，确定质粒酶切完全，然后用Biospin胶回收试剂盒回收纯化，纯化过程参考Biospin胶回收试剂盒说明书。

5、重组质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347及质粒鉴定

(1)将步骤3和步骤4的酶切产物经过T4 DNA连接酶进行重组，分别得到9082bp、8766bp和8796bp长度的质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347；

(2)连接体系如下：0.5μL质粒酶切产物，7μL目的片段酶切产物，1μL 10×T4 DNALigase Buffer，1μL T4 DNA Ligase，最后用双蒸水配成10μL反应体系；

(3)加样过程在冰上操作，加完样品后弹匀管内液体，并短暂离心，然后置于16℃金属浴，连接过夜；

(4)连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，具体实验方法参考实施例1中的步骤6；

(5)挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到如图9大小的质粒进行Mob1基因不同区段的DNA测序，测序结果与原始DNA序列100％比对上，则获得正确的质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347；

(6)保存步骤(5)中含有正确质粒的大肠杆菌DH10B，用于其增殖和加甘油冻存于-80℃。

具体克隆过程见图6。

实施例三：质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347转染进入集胞藻PCC6803

1、细胞培养

(1)将集胞藻PCC6803培养于10mL BG11培养基、温度30℃、转速100rpm震荡以及40μmol photons m^-2s^-1连续光照条件下，直至藻液浓度生长到OD₅₈₀＝1；

(2)将分别含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的大肠杆菌DH10B培养于10mL LB培养基(含有终浓度50μg/mL Car、25μg/mL Cm和50μg/mL Km)、温度37℃、转速200rpm震荡以及无光照条件下，直至菌液浓度生长到OD₆₀₀＝1。

2、接合转移

(1)分别收集2mL对数生长期的集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B于离心管中，13000rpm离心2min(室温)，分别收集藻体和菌体沉淀，吸弃上清液；

(2)用无菌Milli-Q水分别清洗集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B 2次，13000rpm离心2min(室温)，离心后收集藻体和菌体沉淀，吸弃上清液；

(3)用1mL新鲜的、无菌的BG11培养基重悬集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B的藻体和菌体沉淀，充分悬浮均匀；

(4)将集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B等体积(1mL)混匀，静置于温度30℃和连续光照40μmol photons m^-2s^-1的培养箱，孵育4-6h。

实施例四：转染后集胞藻PCC6803的培养、筛选和鉴定

1、转化子的培养和筛选

(1)再集胞藻PCC6803和大肠杆菌DH10B混合液孵育后，分别吸取不同混合液的200μL和400μL体积，涂布于两个不含有抗性的BG11固体培养基平板上(90mm培养皿)，并置于温度30℃和40μmol photons m^-2s^-1连续光照的条件下进行转化子的诱导；

(2)再24h后，向步骤(1)中固体平板加入终浓度为25μg/mL的Km，并置于温度30℃和40μmol photons m^-2s^-1连续光照的条件下进行转化子的筛选；

(3)再2-3周后，大量转化子出现在平板上，无菌枪头挑取单克隆藻落，然后涂布于另一个新鲜的BG11固体培养基平板上(含有终浓度25μg/mL Km)，置于温度30℃和40μmolphotons m^-2s^-1连续光照的条件下进一步纯化转化子；

(4)再1-2周后，无菌枪头挑取单克隆藻落转移至新鲜的10mL BG11液体培养基中(含有终浓度50μg/mL Km)，置于温度30℃、转速100rpm震荡以及40μmol photons m^-2s^-1连续光照的条件下，再一次纯化转化子并且扩大培养藻种；

(5)再3-5天后，转化子大量生长，直至藻液浓度生长到OD₅₈₀＝1，为下一步的分子鉴定作前期准备。

2、转化子的鉴定

(1)利用引物：

下游引物Mob1-347-R：5′-cggGGTACC gttaccagaagcttctctttccattctttcc-3′(下划线为Kpn I酶切位点和保护碱基)。

分别以含有空载体pSCT3C的集胞藻PCC6803(对照组)和步骤1中获得的转化子(对照组)为模板，藻落PCR扩增Mob1基因的不同区段；

(2)PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳后，如图10所示(M：DNA分子标记，条带从大到小分别为2000、1500、1000、750、500和250bp。1-3：对照组：以含有质粒pSCT3C的集胞藻PCC6803为模板，分别扩增Mob1基因全长序列633bp、Mob1基因3′端下半部分序列347bp和Mob1基因5′端上半部分序列317bp；4-6：实验组：分别以图9中含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-347和pSCT3C-Mob1-317的集胞藻PCC6803为模板，对应扩增Mob1基因全长序列633bp、Mob1基因3′端下半部分序列347bp和Mob1基因5′端上半部分序列317bp)；

得到的DNA片段进行测序，测序结果与原始DNA序列比对上，则获得分别含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的集胞藻PCC6803藻株；

(3)用1mL移液器吸取步骤(2)中含有正确质粒的集胞藻PCC6803于离心管中，然后添加DMSO至浓度为8％，混匀后冻存于-80℃。

实施例五：实施例四中转化子Mob1基因不同区段dsRNA的表达鉴定

1、试剂盒方法分别提取含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的集胞藻PCC6803 RNA；

(1)转接1mL集胞藻PCC6803培养于30mL BG11培养基(含有终浓度50μg/mL Km)、温度30℃、转速100rpm震荡以及40μmol photons m^-2s^-1连续光照条件下，直至藻液浓度生长为OD₅₈₀＝1；

(2)分别收集30mL集胞藻PCC6803于无菌RNA离心管中，5,000rpm离心10min(室温)，收集藻体沉淀，吸弃上清液；

(3)用无菌Milli-Q水清洗集胞藻PCC6803 2次，5000rpm离心10min(室温)，收集藻体沉淀，吸弃上清液；

(4)向集胞藻PCC6803中加入液氮，用玻璃管充分研磨直至成粉末状，其间可以补加液氮；

(5)向粉末状的集胞藻PCC6803中加入1mL TransZol Up，用枪反复吹吸混匀后转至新的无菌RNA离心管中；

(6)每使用1mL TransZol Up，加0.2mL氯仿，剧烈振荡30s，室温孵育3min；

(7)剩余步骤参考北京全式金的TransZol Up Plus RNA kit试剂盒说明书；

(8)提取的RNA立即用于cDNA合成或者冻存于-80℃。

2、试剂盒方法分别合成含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的集胞藻PCC6803 cDNA

集胞藻PCC6803 RNA立即采用M-MLV逆转录酶试剂盒合成cDNA，合成过程参考M-MLV逆转录试剂盒说明书。

3、Mob1基因不同区段dsRNA的表达鉴定

(1)利用引物：

以步骤2中cDNA为模板，逆转录PCR扩增出633bp、317bp和347bp长度的Mob1基因不同区段序列，如图11；

(2)PCR反应体系组分：1×ePfu Mix 38μL,2μL正向引物(10μmol/L)，2μL反向引物(10μmol/L)，加入8μL cDNA模板,最后用双蒸水配成50μL PCR反应体系；

(4)PCR反应程序如下：94℃5min预变性，94℃30s，60℃30s，72℃延伸1min，共29个循环反应，最后于72℃再延伸10min；

(5)PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳后，如图11所示(逆转录PCR鉴定集胞藻PCC6803中Mob1基因不同区段dsRNA的表达结果电泳图。1：以含有质粒pSCT3C-Mob1-633的集胞藻PCC6803 cDNA为模板，扩增Mob1基因全长序列633bp；2：以含有质粒pSCT3C-Mob1-317的集胞藻PCC6803 cDNA为模板，扩增Mob1基因5′端上半部分序列317bp；3：以含有质粒pSCT3C-Mob1-347的集胞藻PCC6803 cDNA为模板，扩增Mob1基因3′端下半部分序列347bp)。

得到的DNA片段进行测序，测序结果与原始DNA序列比对上，则认为分别含有质粒pSCT3C-Mob1-633、pSCT3C-Mob1-317和pSCT3C-Mob1-347的集胞藻PCC6803成功表达Mob1基因的不同区段dsRNA。

实施例6：集胞藻PCC6803在天蓝喇叭虫Mob1基因干扰中的应用

1、集胞藻PCC6803喂食于天蓝喇叭虫

(1)天蓝喇叭虫培养于含有30mL MSM培养基的培养皿(直径90mm)、温度20℃、黑暗环境和补充长绿梭藻为食的条件下，直至细胞个数大于300个；集胞藻PCC6803培养于30mLBG11培养基(含有终浓度50μg/mL Km)、温度30℃、转速100rpm震荡以及40μmol photons m^- ²s^-1连续光照条件下，直至藻液浓度生长到OD₅₈₀＝1；

(2)天蓝喇叭虫置于无菌Milli-Q水中饥饿2-3天，然后在解剖镜下用口吸管吸取天蓝喇叭虫细胞，将其分装于6孔板(NEST)，每个孔板放置30个细胞于6mL无菌Milli-Q水，共10个孔板；用无菌Milli-Q水清洗集胞藻PCC6803 2次，13000rpm离心2min(室温)，收集藻体沉淀，吸弃上清液；

(3)以喂食野生型集胞藻PCC6803和含有空载体pSCT3C的集胞藻PCC6803为对照组，以喂食实施例5中集胞藻PCC6803为实验组，共两组平行样品。用无菌Milli-Q水调整藻液浓度为OD₅₈₀＝0.4，每三天适量喂食天蓝喇叭虫。

2、喂食后天蓝喇叭虫细胞表型的观察

(1)如图12所示，a：白光显微镜下活体天蓝喇叭虫及其摄食于体内的集胞藻PCC6803；b：荧光显微镜下活体集胞藻PCC6803；c:荧光显微镜下天蓝喇叭虫摄食于体内的集胞藻PCC6803，天蓝喇叭虫能够很好地以集胞藻PCC6803为食物，并且生长状况良好；

(2)集胞藻PCC6803喂食天蓝喇叭虫后，每天用Zeiss解剖镜初步观察正常生长时期的细胞表型；

(3)经过多次重复实验，如图13所示，正常生长时期，与对照组a相比，发现实验组b在有细胞形成两个异常的后极(箭头方向)，然后用口吸管挑取该细胞置于载玻片上，用Olympus BX51荧光显微镜进一步观察表型异常的细胞，并用显微镜配套的数码成像系统拍照记录，照片保存格式选用TIF；

(4)集胞藻PCC6803喂食天蓝喇叭虫15天后，为了诱导口器再生，用口吸管将每组细胞收集于1.5mL离心管，加入4％尿素，处理1min，室温条件下处理，这种处理方法会引起细胞的口膜带脱落，随后在8个小时内更换整个摄食细胞器，完成口器再生；然后，群体细胞(无口器)经过3200rpm，30s，4℃离心去除尿素，预冷MSM培养基清洗2次；最后，群体细胞转入新鲜MSM培养基，置于正常的培养条件下完成口器再生；

(5)每一小时用Zeiss解剖镜初步观察对照组和实验组口器再生时期的细胞表型；

(6)经过多次重复实验，如图13所示，与正常生长对照组a相比，发现实验组c、d在口器再生时期有细胞形成一个异常的后极(箭头方向)，然后用口吸管挑取该细胞置于载玻片上，用Olympus BX51荧光显微镜进一步观察形态异常的细胞，并用显微镜配套的数码成像系统拍照记录，照片保存格式选用TIF。

综上所述，本发明中喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C应用于干扰天蓝喇叭虫Mob1基因的表达，发现细胞表型相似于Slabodnick等基于大肠杆菌表达系统进行的RNA干扰天蓝喇叭虫Mob1基因表达的结果，说明本发明中喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C在天蓝喇叭虫基因干扰中的应用是可行的、有效的。由此可以通过RNAi表达载体pSCT3C对天蓝喇叭虫的基因干扰，探究天蓝喇叭虫的基因功能。本发明方法易行，操作方便，具有应用于其他纤毛虫基因干扰的可行性。

本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改善，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的实验方案和这里示出与描述的图示示例。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一种喇叭虫RNA干扰表达载体与构建方法及其应用

<141> 2020-05-21

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc 60

tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg 120

ctcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg 180

cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc 240

agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt 300

cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac 360

tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat tccaggtatt 420

agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg 480

gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc 540

tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg 600

taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc cattctcacc 660

ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa 720

attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc 780

catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa 840

atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt 900

tttctaatca gaattggtta attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg 960

ggacggcggc tttgttgaat aaatcgaact tttgctgagt tgaaggatca gatcacgcat 1020

cttcccgaca acgcagaccg ttccgtggca aagcaaaagt tcaaaatcac caactggtcc 1080

ggtcgtcggt tcagggcagg gtcgttaaat agccgcttat gtctattgct ggtttaccgg 1140

tttattgact accggaagca gtgtgaccgt gtgcttctca aatgcctgac ttcaaattcc 1200

cgttgcacat agcccggcaa ttcctttccc tgctctgcca taagcgcagc gaatgccggg 1260

taatactcgt caacgatctg atagagaagg gtttgctcgg gtcggtggct ctggtaacga 1320

ccagtatccc gatcccggct ggccgtcctg gccgccacat gaggcatgtc ccgcgtcctt 1380

gcaatactgt gtttacatac agtctatcgc ttagcggaaa gttcttttac cctcagccga 1440

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gaacccctgc aataactgtc acgcccccct gcaataactg tcacgaaccc ctgcaataac 1560

tgtcacgccc ccaaacctgc aaacccagca ggggcggggg ctggcggggt gttggaaaaa 1620

tccatccatg attatctaag aataatccac taggcgcggt tatcagcgcc cttgtggggc 1680

gctgctgccc ttgcccaata tgcccggcca gaggccggat agctggtcta ttcgctgcgc 1740

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ccccacacca aaccccgcag aaatacgctg gagcgctttt agccgcttta gcggcctttc 1860

cccctacccg aagggtgggg gcgcgtgtgc agccccgcag ggcctgtctc ggtcgatcat 1920

tcagcccggc tcatccttct ggcgtggcgg cagaccgaac aaggcgcggt cgtggtcgcg 1980

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gacttacagg aataccggga ggcaatagac catgaacgca atcgacagag tgaagaaatc 3180

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cctgttccgt gccctcaagc ggggcgagcg caagcgcagc aagctggacg tgacgtatga 6000

ctacggcgac ggcaagcgga tcgagttcag cggcccggag ccgctgggcg ctgatgatct 6060

gcgcatcctg caagggctgg tggccatggc tgggcctaat ggcctagtgc ttggcccgga 6120

acccaagacc gaaggcggac ggcagctccg gctgttcctg gaacccaagt gggaggccgt 6180

caccgctgaa tgccatgtgg tcaaaggtag ctatcgggcg ctggcaaagg aaatcggggc 6240

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cctgctaatt ggtaatacca tgaaaaatac catgctcaga aaaggcttaa caatattttg 6840

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cagatgtatg ctcttctgct cctgagatta tcaaaaagga tctccccgct tcggcggggt 6960

ttttttttgg acctgtagag aagagtccct gaatatcaaa atggtgggat aaaaagctca 7020

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actcataaag tcaagtagga gattaattca gagaccggca gatctgatat catcgatgaa 7560

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gagatattac ctaaataaat ccagggagaa acacggaggc agcgacaagg gccaccggga 7920

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caacggtgat gggacttatg tctgttacat cttgttaatt ttattcctgc ttttttgtta 8040

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ctttttgagc tttttatccc accattttga tattcaggga ctcttctcta caggtagcac 8280

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tagcggtggt agcgcttggt ctcacccaca attcgaaaag tgacaccacc accaccacca 8400

ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa gaggaagctg agttggctgc tgccaccgct 8460

gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg 8520

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gatgacaaag ccacgttgtg tctca 8605

<210> 2

<211> 7630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc 60

tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg 120

ctcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg 180

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cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac 360

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taatactcgt caacgatctg atagagaagg gtttgctcgg gtcggtggct ctggtaacga 1320

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tccatccatg attatctaag aataatccac taggcgcggt tatcagcgcc cttgtggggc 1680

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tcggtactgg tcgataacat ccgctggcag tcctacctgt cgagcatgac cagcgccgag 5700

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caaggcttcc atagatacct tgtgcggcta tgtctggccg tcagaggcca gtggttcgac 6600

catgcgcaag cgccgccagc gggtgcgcga ggcgttgccg gagctggtcg cgctgggctg 6660

gacggtaacc gagttcgcgg cgggcaagta cgacatcacc cggcccaagg cggcaggctg 6720

acccccccca ctctattgta aacaagacat ttttatcttt tatattcaat ggcttatttt 6780

cctgctaatt ggtaatacca tgaaaaatac catgctcaga aaaggcttaa caatattttg 6840

aaaaattgcc tactgagcgc tgccgcacag ctccataggc cgctttcctg gctttgcttc 6900

cagatgtatg ctcttctgct cctgagatta tcaaaaagga tctccccgct tcggcggggt 6960

ttttttttgg attttgggga atgttggcat tgtagatagc aacaatagaa tctaaatccg 7020

taatggtggc atcccgtagg aaaaggtcag atgggatcac agcaatattt tagtacttgc 7080

gggttgggta tggtcactga tctaaatgtt aatgggattt gcgatggttt ccgtcatttc 7140

taggcgatcg ccagaatgga gccgcaaaaa atggtagcga aaaatacatt ttctaactac 7200

ttgactcttt acgatggata gtcgacgcag cgcaaaatcg taatttatct gactgcacta 7260

aggagaaaaa ctcgagagtc ccgggggttc tggtggtggt agcactagcg tcggtagcgc 7320

ttggagccat ccccaatttg aaaaaggtgg tggcagcggc ggtggtagcg gtggtagcgc 7380

ttggtctcac ccacaattcg aaaagtgaca ccaccaccac caccactgag atccggctgc 7440

taacaaagcc cgaaagagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca 7500

taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata 7560

tccggcggcc gcaagcccaa gcgttttgtt attgggctga ctcaagatga caaagccacg 7620

ttgtgtctca 7630

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggtttttt tttggacctg tagagaagag tccctgaata tcaaaatgg 49

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgaattaatc tcctacttga ctttatgagt tgggattttc ttaaacacaa tt 52

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgaattaatc tcctacttga ctttatgagt tgggattttc ttaaacacaa 50

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accgacgcta gtgctacctg tagagaagag tccctgaata tcaaaatgg 49

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taggagatta attcagagac cggcagatct gatatcatcg atg 43

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taggagatta attcagcgaa ttgggtaccg ggccc 35

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaagatcta agaagcgaat tgaaaaaggc cagc 34

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggggtaccg ttaccagaag cttctctttc cattctttcc 40

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaagatcta agaagcgaat tgaaaaaggc cagc 34

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggggtaccc aggtcatgag aaaatcaatg tactctgatg c 41

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggaagatctc atcagagtac attgattttc tcatgacctg gg 42

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cggggtaccg ttaccagaag cttctctttc cattctttcc 40

Claims

1.一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C，其特征在于，包含在序列SEQ ID NO：1中如下位置的元件：

卡那霉素抗性基因：第92-907位；

复制起始点：第1501-1925位；

诱动基因：第1921-4533bp位；

复制起始蛋白：第5044-6721bp位；

正向cpcB基因启动子：第6971-7530位；

多克隆位点：第7531-7715位；

反向cpcB基因启动子：第7716-8275位。

3.权利要求1所述的一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A. 利用质粒pSCTGA的核苷酸序列，合成pSCTGA 质粒骨架；

其中，所述质粒pSCTGA 核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

B. 利用引物，以集胞藻PCC6803的DNA为模板，PCR扩增FP_cpcB；

其中，上游引物FP_cpcB- F核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物FP_cpcB- R核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

C. 利用引物，以集胞藻PCC6803 DNA为模板，PCR扩增RP_cpcB；

其中，上游引物RP_cpcB- F核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物RP_cpcB- R核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

D. 利用引物，以质粒L4440为模板，PCR扩增MCS；

其中，上游引物MCS- F核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物MCS- R核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

E. 分别回收纯化步骤B和步骤D中的DNA片段，共同作为模板，利用上游引物FP_cpcB- F和下游引物MCS- R，通过融合PCR连接FP_cpcB和MCS，得到FP_cpcB -MCS；

F. 分别回收纯化步骤E和步骤C中的 DNA片段，共同作为模板，利用上游引物FP_cpcB- F和下游引物RP_cpcB- R，通过融合PCR连接FP_cpcB -MCS和RP_cpcB，得到FP_cpcB -MCS- RP_cpcB；

G. 分别回收纯化步骤F和步骤A中的DNA片段，通过一步克隆法进行连接，得到RNAi表达载体pSCT3C。

4.根据权利要求3所述的一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C的制备方法，其特征在于：

所述步骤A中的pSCTGA 质粒骨架包含复制元件、诱动基因和抗性基因；

所述步骤A中pSCTGA质粒骨架通过质粒pSL2680、质粒pTara、质粒RSF1010及质粒pDU1同源重组连接得到。

5.根据权利要求3所述的一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C的制备方法，其特征在于：

所述步骤E中，回收步骤B中的DNA片段为560bp，回收步骤D中的DNA片段为185bp，所得回收纯化的FP_cpcB -MCS为745 bp；

所述步骤F中，回收步骤E中的DNA片段为745bp，回收步骤C中的DNA片段为560bp，所得回收纯化的FP_cpcB -MCS- RP_cpcB为1305bp；

所述步骤G中，回收步骤A的DNA片段为7300bp，表达载体pSCT3C为8605 bp。

6.权利要求1所述的喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C在天蓝喇叭虫基因干扰中的应用，其特征在于，所述应用为，通过表达载体pSCT3C构建含有目的基因干扰片段的表达质粒，并转染至集胞藻PCC6803后喂食天蓝喇叭虫。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：

1)构建含有目的基因Mob1干扰片段的RNAi表达载体pSCT3C-Mob1；

2)将表达载体pSCT3C-Mob1转染到大肠杆菌DH10B中，再经接合转移方法将载体pSCT3C-Mob1转染到集胞藻PCC6803体内；

3)对转染后的集胞藻PCC6803进行培养、筛选和鉴定；

4)用步骤3）所得集胞藻PCC6803喂食天蓝喇叭虫实现Mob1基因干扰。