CN113278635A

CN113278635A - 一种促进环状rna成环的序列组合及其应用

Info

Publication number: CN113278635A
Application number: CN202110572263.XA
Authority: CN
Inventors: 张明航; 魏丽君; 苏雪峰; 曾瑜祥
Original assignee: Guangzhou Jintai Biotechnology Co ltd; Guangzhou Ige Biotechnology Ltd
Current assignee: Guangzhou Jintai Biotechnology Co ltd; Guangzhou Ige Biotechnology Ltd
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113278635B

Abstract

本发明提供了一种促进环状RNA成环的序列组合及其应用，所述促进环状RNA成环的序列组合包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列组合或SEQ IDNo.3～4所示的核苷酸序列组合。本发明还提供了一种促进环状RNA成环的载体及其制备方法以及一种促进环状RNA成环并过表达的方法。本发明所述促进环状RNA成环的序列组合可以提高环状RNA的成环效率，连接入骨架载体中，制成促进环状RNA成环的载体，配合促进环状RNA成环并过表达的方法，实现了环状RNA在体外的高成环率、高表达量表达，操作简单，技术成熟，应用价值极高。

Description

一种促进环状RNA成环的序列组合及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种促进环状RNA成环的序列组合及其应用。

背景技术

环状RNA(Circular RNAs，circRNAs)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。不同于传统的RNA，circRNAs是以环状转录的方式产生的，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA稳定，序列高度保守并具有组织表达差异性，因而被认为可以成为新的肿瘤检测标志物。2012年，Salzman通过RNA-Seq方法首次报道了约80个环状RNA，此后，大量的circRNAs分子被相继发现，在科研界掀起一股研究热潮。

目前，科学家们已发现circRNAs的多种生物功能：

1、促进靶基因表达：circRNAs可作为miRNA海绵，抑制miRNA与靶基因结合，从而间接地上调靶基因的表达；

2、调控亲本基因的转录：仅由内含子形成的ciRNAs可促进RNA聚合酶II对亲本基因的转录；

3、circRNAs的生物合成过程影响基因剪接：circRNAs和线性RNA从同一个pre-mRNA转录得到，circRNAs的表达量上调，相应线性mRNA的量会相对减少；

4、作为疾病的生物标志物：circRNA具有组织特异性，其在疾病中的表达也与正常组织有异，为其作为生物标志物奠定了很好的基础，已有相关报道证明了circRNAs的含量与肿瘤组织的大小直接相关。

目前，可以利用高通量测序检测出circRNAs分子，并对表达量进行分析，但对新发现的circRNAs的分子机制及其作为生物标记物的可行性进行研究需要借助分子实验手段。如何在体外表达出特定的环状RNA分子，成为了研究circRNAs的首要难题。CN112574992A公开了一种circRNA过表达成环载体DNA序列及其构建方法与应用，其能够普遍适用于各种circRNA的成环表达，表达效率高效、稳定，且该序列能应用于多种表达系统，操作简单易行，易于推广，但其成环效率偏低，仍有进一步改进的空间。现有的环状RNA表达载体大多是基于反向互补的RNA序列(如Alu元件)来诱导目的基因在细胞内的环化拼接，虽然可以实现环化表达的目的，但表达效率不是非常稳定，无法进行广泛的应用。

因此，如何提供一种表达效率稳定、环化效率高的环状RNA分子表达方法，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种促进环状RNA成环的序列组合及其应用，所述促进环状RNA成环的序列组合具有促进环状RNA成环的作用，配合相应的表达载体，可以实现环状RNA在体外的高效表达，成环效率及表达效率均很高，为相应的理论研究创造了条件。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种促进环状RNA成环的序列组合，所述促进环状RNA成环的序列组合包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列组合或SEQ ID No.3～4所示的核苷酸序列组合。

SEQ ID No.1：

agggcgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataataataagctaaatcgagactaagttttattgttatatatattttttttattttatgcag；

SEQ ID No.2：

gtaagtattcaaaattccaaaattttttactagaaatattcgattttttaataggcagtttctatactattgtatactattgtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattattttattaccgccgagacatcaggaactataaaagctagaaggatga；

SEQ ID No.3：

aaacaagagagaatgctatagtcgtatagtatagtttcccgactatctgatacccattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgatagatattggggaataaatttaaataaataaattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaatttacaagacttataaaattatgaaaaaatacaacaaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttgggcggttttagggcgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataataataagctaaatcgagactaagttttattgttatatatattttttttattttatgcag；

SEQ ID No.4：

gtaagtattcaaaattccaaaattttttactagaaatattcgattttttaataggcagtttctatactattgtatactattgtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattattttattaccgccgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttgttgatccatgctgccacgctttaactttctcaaattgcccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaattttttcataattgtattactcgtgtaaatttccatcaatttgccaaaaaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccgccaatttggtcacgcccacactattgagcaattatcaaattttttctcattttattccccaatatctatcgatatccccgattatgaaattattaaatttcgcgttcgcattcacactagctgagtaacgagtatctgatagttggggaaatcgacttattttttatatacaatgaaaatgaatttaatcatatgaatatcgattatagctttttatttaatatgaatatttatttgggcttaaggtgtaacctcct。

本发明中，所述促进环状RNA成环的序列组合根据果蝇Laccase2基因外显子的成环机理，同时结合真核生物RNA剪切法则、环状RNA内含子序列的重复特点及真核生物基因组中ALU重复序列的特点，获得了环状RNA可普遍适用的序列组合，成环效果好，可显著提升环状RNA在体外的成环效率，具有极高的应用价值。

第二方面，本发明提供了一种促进环状RNA成环的载体，所述促进环状RNA成环的载体含有第一方面所述的促进环状RNA成环的序列组合；

所述促进环状RNA成环的载体还包括骨架载体。

本发明中，将所述促进环状RNA成环的序列组合连接到现有的载体中，即可用于环状RNA的体外成环表达中，适用性强，制备方法简单，生产成本低，应用范围广。

优选地，所述骨架载体包括克隆载体或表达载体。

本发明中，所述骨架载体可根据实际情况在常规载体中进行选择，此处不做限定。

第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法，所述构建方法包括：

将促进环状RNA成环的序列组合连入骨架载体的多克隆位点中，得到所述促进环状RNA成环的载体。

优选地，所述构建方法还包括测序验证的步骤。

第四方面，本发明提供了一种促进环状RNA成环并过表达的方法，所述方法包括：

合成环状RNA的编码序列，同源重组连入第二方面所述的促进环状RNA成环的载体中，得到环状RNA过表达载体，再对所述环状RNA过表达载体进行表达检测。

本发明中，所述方法配合促进环状RNA成环的载体一同使用，可以进一步提升环状RNA在体外的成环及表达效率，技术成熟，成功率高，应用前景广阔。

优选地，所述表达检测前还包括测序验证的步骤。

优选地，所述表达检测的方法包括荧光信号强度分析和/或荧光定量PCR检测表达量。

优选地，所述表达检测前还包括构建瞬转细胞和/或稳定表达细胞的步骤。

优选地，所述构建瞬转细胞包括：

将所述环状RNA过表达载体转染到细胞中，培养，得到所述瞬转细胞。

优选地，所述细胞包括293T细胞。

优选地，所述培养的时间为40～50h，例如可以是40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h或50h。

所述构建稳定表达细胞包括：

将所述环状RNA过表达载体和辅助质粒共转染至包装细胞中，培养，得到重组慢病毒并纯化；

纯化后的重组慢病毒侵染细胞，筛选，得到所述稳定表达细胞。

优选地，所述辅助质粒包括PLP1、PLP2和pLP-VSVG质粒。

优选地，所述包装细胞包括293T细胞。

优选地，所述培养的时间为48～72h，例如可以是48h、50h、55h、60h、65h、70h或72h。

本发明中，可根据具体的实验情况及目的选择病毒侵染的细胞类型，此处不做限定。

优选地，所述筛选包括嘌呤霉素筛选。

作为优选技术方案，本发明所述促进环状RNA成环并过表达的方法，包括以下步骤：

(1)构建促进环状RNA成环的载体：

将促进环状RNA成环的序列组合通过同源重组连入骨架载体的多克隆位点中，测序验证正确后，得到所述促进环状RNA成环的载体；

(2)构建环状RNA过表达载体：

合成环状RNA的编码序列，同源重组连入所述促进环状RNA成环的载体中，测序验证正确后，得到所述环状RNA过表达载体；

(3)构建瞬转细胞和/或稳定表达细胞：

将所述环状RNA过表达载体转染到293T细胞中，培养40～50h，得到所述瞬转细胞；

将所述环状RNA过表达载体和辅助质粒PLP1、PLP2和pLP-VSVG质粒共转染至293T细胞中，培养48～72h，得到重组慢病毒并纯化；

纯化后的重组慢病毒侵染细胞，嘌呤霉素筛选，得到所述稳定表达细胞；

(4)表达检测：

对所述瞬转细胞和/或稳定表达细胞进行荧光信号强度分析，

和/或所述收集瞬转细胞和/或稳定表达细胞，提取RNA并进行逆转录，以所得cDNA作为模板，通过荧光定量PCR检测表达量。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的促进环状RNA成环的序列组合、第二方面所述的促进环状RNA成环的载体、第三方面所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法或第四方面所述的促进环状RNA成环并过表达的方法中的任意一种或至少两种的组合在制备环状RNA过表达产品中的应用。

本发明中，所述促进环状RNA成环的序列组合可以提高环状RNA在体外的成环效率，所述促进环状RNA成环的载体可以实现环状RNA在体外的高环化率、高效表达，且制备简单，使用方便，配合相应的促进环状RNA成环并过表达的方法，制成方便使用的试剂盒等相关产品，促进了技术的推广与使用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明所述促进环状RNA成环的序列组合具有良好的促进环状RNA环化的效果，对不同物种、不同长度的目标序列均可以产生良好的促进环化效果，环化效率不低于79.2％；所述促进环状RNA成环的载体可以保证插入的目标circRNAs的线性序列精确环化，并具有促进环化RNA过表达的效果，过表达效率不低于100倍，效果显著；所述促进环状RNA成环并过表达的方法适用性强，可根据具体的实验情况选择对应的表达及检测方法，达到相应的实验目的，操作简便，成本较低，应用价值极其广泛。

附图说明

图1为本发明实施例1构建的促进环状RNA成环的载体的结构示意图；

图2为本发明实施例1中oligo assemble反应产物的凝胶电泳图片，图中，M-标准DNA分子量DL5000 marker，泳道1-oligo assemble反应产物；

图3为本发明实施例1中pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-puro载体双酶切的凝胶电泳图片，图中，M-标准DNA分子量DL5000 marker，泳道1-未酶切的载体，2-NheI/NotI双酶切后的载体；

图4为本发明实施例2构建的促进环状RNA成环的载体的结构示意图；

图5为本发明实施例3构建的促进环状RNA成环的载体的结构示意图；

图6为本发明实施例3中oligo assemble反应产物的凝胶电泳图片，图中，M-标准DNA分子量DL2000 marker，泳道1-oligo assemble反应产物；

图7为本发明实施例3中pcDNA3.1载体双酶切的凝胶电泳图片，图中，M-标准DNA分子量DL5000 marker，泳道1-未酶切的载体，2-NheI/NotI双酶切后的载体；

图8为本发明实施例4中oligo assemble反应产物的凝胶电泳图片，图中，M-标准DNA分子量DL2000 marker，泳道1-oligo assemble反应产物；

图9A为本发明实施例4中转染了环状RNA过表达载体48h后的293T细胞的光学图片(放大倍数为100×)；

图9B为本发明实施例4中转染了环状RNA过表达载体48h后的293T细胞的荧光图片(放大倍数为100×)；

图10为本发明实施例4中提取的RNA的凝胶电泳图片，图中，M-标准DNA分子量marker，1-对照组细胞的RNA提取结果，2-实验组细胞的RNA提取结果；

图11A为本发明实施例4中对照组细胞的荧光定量PCR的熔解曲线图片；

图11B为本发明实施例4中实验组细胞的荧光定量PCR的熔解曲线图片；

图12为本发明实施例4中对照组细胞和实验组细胞荧光定量PCR扩增产物的凝胶电泳图片，图中，M-标准DNA分子量marker，1-对照组细胞使用检测线性产物的引物的扩增结果，2-对照组细胞使用检测环形产物的引物的扩增结果，3-实验组细胞使用检测线性产物的引物的扩增结果，4-实验组细胞使用检测环形产物的引物的扩增结果；

图13A为本发明实施例5中质粒共转染24h后的293T细胞的光学图片(放大倍数为100×)；

图13B为本发明实施例5中质粒共转染24h后的293T细胞的荧光图片(放大倍数为100×)；

图14A为本发明实施例5中慢病毒接种48h后的293T细胞的光学图片(放大倍数为100×)；

图14B为本发明实施例5中慢病毒接种48h后的293T细胞的荧光图片(放大倍数为100×)。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-puro、pCDH-CMV-MCS-EF1-mCherry-puro、pc DNA3.1、PLP1、PLP2和pLP-VSVG购自生物风公司；

oligo assemble(引物合成)试剂、NheI酶、NotI酶、质粒提取试剂盒、RNA提取试剂、反转录试剂、同源重组试剂、感受态细胞stbl3、感受态细胞Match-T1和荧光定量PCR反应试剂购自广州艾基生物有限公司；

293T细胞来自北纳生物；

转染试剂购自Life Technologies company。

实施例1

本实施例提供一种促进环状RNA成环的载体plenti-ciR-copGFP-T2A-puro，其结构示意图如图1所示。所述促进环状RNA成环的载体含有SEQ ID No.3～4所示的促进环状RNA成环的核苷酸序列组合，所述载体的骨架载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-puro。

所述促进环状RNA成环的载体的构建方法如下：

将SEQ ID No.3～4所示的促进环状RNA成环的核苷酸序列通过oligo assemble连入骨架载体的MCS区域，插入到NheI和NotI这两个位点中，其中，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列作为5'模块(5'frame)，SEQ ID No.4所示的核苷酸序列作为3'模块(3'frame)，5'frame和3'frame之间保留EcoRI以及BamHI两个位点，以便后续circRNA的插入组装。

具体步骤如下：

①oligo assemble反应合成含有SEQ ID No.3～4以及EcoRI以及BamHI两个酶切位点的序列：

所述oligo assemble使用的引物序列如SEQ ID No.5～33所示。

SEQ ID No.5：tgacctccatagaagattctagagctagcaaacaagagagaatgctatagtcgta；

SEQ ID No.6：ccctagataagtaatgggtatcagatagtcgggaaactatactatacgactatagcattc；

SEQ ID No.7：cattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgata；

SEQ ID No.8：aaacccgcccaaaatttatttatttaaatttattccccaatatctatcgatatccgagaa；

SEQ ID No.9：aattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaatttaca；

SEQ ID No.10：cgtgtttaaaattttgttgtattttttcataattttataagtcttgtaaatttctagcga；

SEQ ID No.11：caaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttgggcggttttagggcgttagagtaggcg；

SEQ ID No.12：tattcttgatcaggatcaaagcctagtcgatgtaaccctgtcctcgcctactctaacgcc；

SEQ ID No.13：atcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttca；

SEQ ID No.14：attatacccataaatcgtacagtaaaaaggtatactagattcgttgaaaaataggtaaca；

SEQ ID No.15：gatttatgggtataataataagctaaatcgagactaagttttattgttatatatattttt；

SEQ ID No.16：ttcttacggatccgatttaaattcgaattcctgcataaaataaaaaaaatatatataaca；

SEQ ID No.17：atcggatccgtaagaagcaaggtaagtattcaaaattccaaaattttttactagaaatat；

SEQ ID No.18：acaatagtatacaatagtatagaaactgcctattaaaaaatcgaatatttctagtaaaaa；

SEQ ID No.19：tattgtatactattgtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccg；

SEQ ID No.20：ctcggctattgatccttattaagaatatatatactttacatggtcggaaatgctttattc；

SEQ ID No.21：aggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattattttattaccgccg；

SEQ ID No.22：tatgctaaaactcatccttctagcttttatagttcctgatgtctcggcggtaataaaata；

SEQ ID No.23：gatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttgttgatccatg；

SEQ ID No.24：ggcatggcagttttgggcaatttgagaaagttaaagcgtggcagcatggatcaacaaact；

SEQ ID No.25：ccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaattttttcataattgtattac；

SEQ ID No.26：gcgtgacaaaaagttttttggcaaattgatggaaatttacacgagtaatacaattatgaa；

SEQ ID No.27：aaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccgccaatttggtcacgcccacactattg；

SEQ ID No.28：gatagatattggggaataaaatgagaaaaaatttgataattgctcaatagtgtgggcgtg；

SEQ ID No.29：ttccccaatatctatcgatatccccgattatgaaattattaaatttcgcgttcgcattca；

SEQ ID No.30：aagtcgatttccccaactatcagatactcgttactcagctagtgtgaatgcgaacgcgaa；

SEQ ID No.31：ttggggaaatcgacttattttttatatacaatgaaaatgaatttaatcatatgaatatcg；

SEQ ID No.32：ccttaagcccaaataaatattcatattaaataaaaagctataatcgatattcatatgatt；

SEQ ID No.33：ccggagcgatcgcagatccttcgcggccgcaggaggttacaccttaagcccaaataa。

所述oligo assemble的体系如下：

所述oligo assemble的反应条件如下：

94℃，150s；

94℃，20s；56℃，30s；72℃，90s；循环20次；

72℃，5min；

15℃，保持。

oligo assemble反应产生的序列如SEQ ID No.34所示，凝胶电泳验证图片如图2所示，由图可以看出，扩增产物大小与预期相符，证明反应成功。

SEQ ID No.34：

aaacaagagagaatgctatagtcgtatagtatagtttcccgactatctgatacccattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgatagatattggggaataaatttaaataaataaattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaatttacaagacttataaaattatgaaaaaatacaacaaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttgggcggttttagggcgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataataataagctaaatcgagactaagttttattgttatatatattttttttattttatgcaggaattcgaatttaaatcggatccgtaagaagcaaggtaagtattcaaaattccaaaattttttactagaaatattcgattttttaataggcagtttctatactattgtatactattgtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattattttattaccgccgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttgttgatccatgctgccacgctttaactttctcaaattgcccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaattttttcataattgtattactcgtgtaaatttccatcaatttgccaaaaaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccgccaatttggtcacgcccacactattgagcaattatcaaattttttctcattttattccccaatatctatcgatatccccgattatgaaattattaaatttcgcgttcgcattcacactagctgagtaacgagtatctgatagttggggaaatcgacttattttttatatacaatgaaaatgaatttaatcatatgaatatcgattatagctttttatttaatatgaatatttatttgggcttaaggtgtaacctcct。

②pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-puro载体的双酶切

酶切反应体系如下：

在37℃下酶切1h，通过凝胶电泳进行鉴定，如图3所示，结果显示成功获得线性载体，通过凝胶电泳回收酶切产物。

③oligo assemble反应产物与酶切后载体的同源重组

同源重组的反应体系如下：

在50℃下连接30min。

④重组载体的鉴定

将同源重组反应产物加入到感受态细胞stbl3中进行转化，涂布于氨苄青霉素抗性的细菌培养平板上，筛选单克隆后于含有氨苄青霉素抗性的2×YT培养基中扩大培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒后，琼脂糖凝胶电泳上验证质粒大小与预期相符后，将质粒送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，测序验证正确后，得到所述促进环状RNA成环的载体plenti-ciR-copGFP-T2A-puro。

实施例2

本实施例提供一种促进环状RNA成环的载体plenti-ciR-mCherry-T2A-puro，其结构示意图如图4所示。所述促进环状RNA成环的载体含有SEQ ID No.3～4所示的促进环状RNA成环的核苷酸序列组合，所述载体的骨架载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-mCherry-puro。

所述促进环状RNA成环的载体的构建方法如下：

将SEQ ID No.3～4所示的促进环状RNA成环的核苷酸序列通过oligo assemble连入骨架载体的MCS区域，插入到NheI和NotI这两个位点中，其中，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列作为5'模块(5'frame)，SEQ ID No.4所示的核苷酸序列作为3'模块(3'frame)，5'frame和3'frame之间保留EcoRI以及BamHI两个位点，以便后续circRNA的插入组装，所述促进环状RNA成环的载体的构建方法与实施例1中的相同。

实施例3

本实施例提供一种促进环状RNA成环的载体pcDNA3.1(+)-CircRNA，其结构示意图如图5所示。所述促进环状RNA成环的载体含有SEQ ID No.1～2所示的促进环状RNA成环的核苷酸序列组合，所述载体的骨架载体为pcDNA3.1。

所述促进环状RNA成环的载体的构建方法如下：

将SEQ ID No.1～2所示的促进环状RNA成环的核苷酸序列通过oligo assemble连入骨架载体的MCS区域，插入到NheI和NotI两个位点之间，其中，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列作为5'模块(5'frame)，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列作为3'模块(3'frame)，5'frame和3'frame之间保留EcoRI以及BamHI两个位点，以便后续circRNA的插入组装。

具体步骤如下：

①oligo assemble反应合成含有SEQ ID No.1～2以及EcoRI以及BamHI两个酶切位点的序列：

所述oligo assemble使用的引物序列如SEQ ID No.35～46所示。

SEQ ID No.35：ctcactatagggagacccaagctggctagcagggcgttagagtaggcgaggacagggtt；

SEQ ID No.36：ataaagtatatatattcttgatcaggatcaaagcctagtcgatgtaaccctgtcctcgcct；

SEQ ID No.37：aatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtat；

SEQ ID No.38：cgatttagcttattattatacccataaatcgtacagtaaaaaggtatactagattcgttga；

SEQ ID No.39：ataataagctaaatcgagactaagttttattgttatatatattttttttattttatgcagg；

SEQ ID No.40：tgaatacttaccttgcttcttacggatccgatttaaattcgaattcctgcataaaataaaa；

SEQ ID No.41：gcaaggtaagtattcaaaattccaaaattttttactagaaatattcgattttttaataggc；

SEQ ID No.42：atacttttcaacgaatctacaatagtatacaatagtatagaaactgcctattaaaaaatcg；

SEQ ID No.43：attcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatata；

SEQ ID No.44：gacggacatggcgagatcgactcggctattgatccttattaagaatatatatactttacat；

SEQ ID No.45：tctcgccatgtccgtctgtcttattattttattaccgccgagacatcaggaactataaaag；

SEQ ID No.46：taaacgggccctctagactcgagcggccgctcatccttctagcttttatagttcctga。

所述oligo assemble的体系如下：

所述oligo assemble的反应条件如下：

94℃，150s；

94℃，20s；56℃，32s；72℃，30s；循环20次；

72℃，5min；

15℃，保持。

oligo assemble反应产生的序列如SEQ ID No.47所示，凝胶电泳验证图片如图6所示，由图可以看出，扩增产物大小与预期相符，证明反应成功。

SEQ ID No.47：

ctcactatagggagacccaagctggctagcagggcgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataataataagctaaatcgagactaagttttattgttatatatattttttttattttatgcaggaattcgaatttaaatcggatccgtaagaagcaaggtaagtattcaaaattccaaaattttttactagaaatattcgattttttaataggcagtttctatactattgtatactattgtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattattttattaccgccgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagcggccgctcgagtctagagggcccgttta。

②pcDNA3.1载体的双酶切

所述酶切的反应体系及酶切条件与实施例1中相同，通过凝胶电泳进行鉴定，如图7所示，结果显示成功获得线性载体，通过凝胶电泳回收酶切产物。

③oligo assemble反应产物与酶切后载体的同源重组

同源重组的反应体系如下：

在50℃下连接30min。

④重组载体的鉴定

鉴定步骤与实施例1中的相同，使用的感受态细胞为Match-T1，最终得到所述促进环状RNA成环的载体pcDNA3.1(+)-CircRNA。

实施例4

本实施例使用实施例1制备的促进环状RNA成环的载体，在体外进行环状RNA的成环并过表达，并对表达和成环效率进行检测，同时使用未进行转染的293T细胞进行相同的操作作为对照组。

所述环状RNA的体外成环及过表达的步骤如下：

(1)构建环状RNA过表达载体：

①合成环状RNA的编码序列，序列如SEQ ID No.48所示。

SEQ ID No.48：

gtgaaatgaggaatgatttatatatcactattgaaaggggagaatttgagaaaggagggaagagcgtggccagaaatgtggaagttacgatgttcattgtagacagtagtggccaaaccctgaaggattttatctccttcggctctggggagccaccagccagtgagtaccactcctttgtgctttaccataacaacagtcccaggtggtctgaactgctgaaacttcccattcctgtggataaattccggggtgcacacatccgcttcgagtttcggcattgttccacaaaggagaaaggagagaagaagttgtttgggttttcttttgtccctctgatgcaagaagatggtaggactcttccagatggcactcatgagctcatcgtgcataag。

②oligo assemble反应合成含有EcoRI以及BamHI两个酶切位点的环状RNA的编码序列：

所述oligo assemble使用的引物序列如SEQ ID No.49～59所示。

SEQ ID No.49：aaatcgagactaagttttattgttatatatattttttttattttatgcaggtgaaatg；

SEQ ID No.50：ttctcaaattctcccctttcaatagtgatatataaatcattcctcatttcacctgcataa；

SEQ ID No.51：

ggggagaatttgagaaaggagggaagagcgtggccagaaatgtggaagttacgatgttca；

SEQ ID No.52：gaaggagataaaatccttcagggtttggccactactgtctacaatgaacatcgtaactt；

SEQ ID No.53：ggattttatctccttcggctctggggagccaccagccagtgagtaccactcctttgtgct；

SEQ ID No.54：gaagtttcagcagttcagaccacctgggactgttgttatggtaaagcacaaaggagtg；

SEQ ID No.55：gaactgctgaaacttcccattcctgtggataaattccggggtgcacacatccgcttcgag；

SEQ ID No.56：aacaacttcttctctcctttctcctttgtggaacaatgccgaaactcgaagcggatgtgt；

SEQ ID No.57：gagagaagaagttgtttgggttttcttttgtccctctgatgcaagaagatggtaggactc；

SEQ ID No.58：aatacttaccttatgcacgatgagctcatgagtgccatctggaagagtcctaccatcttc；

SEQ ID No.59：taaaaaatcgaatatttctagtaaaaaattttggaattttgaatacttaccttatgc。

所述oligo assemble的体系如下：

所述oligo assemble的反应条件与实施例1中①的oligo assemble条件相同。

oligo assemble反应产物的凝胶电泳验证图片如图8所示，由图可以看出，扩增产物大小与预期相符，证明反应成功。

③plenti-ciR-copGFP-T2A-puro载体的双酶切

酶切反应体系及条件与实施例1中②的相同。

④oligo assemble反应产物与酶切后载体的同源重组

同源重组的反应体系如下：

在50℃下连接30min。

⑤重组载体的鉴定

鉴定步骤与实施例1中④的相同，最终得到所述环状RNA过表达慢病毒载体plenti-hsa_circ_0081979-copGFP-T2A-puro。

(2)构建瞬转细胞：

将所述环状RNA过表达载体转染到293T细胞中，培养48h，得到所述瞬转细胞，过程如下；

①培养293T细胞，按照1.5×10⁶cell/10cm²进行传代；

②将293T细胞按照3×10⁵cell/孔的细胞密度接种至6孔板中；

③细胞接种均匀，且融合程度是否达到20％～30％时进行转染，去除原有培养液，加入2mL新鲜培养液；

④准备一个1.5mL EP管，加入125μL Opti-MEM培养液和2μg质粒，充分颠倒混匀；准备另外一个1.5mL EP管，加入125μL Opti-MEM培养液和5μLLipo2000试剂，轻柔颠倒混匀，室温孵育5min；

⑤将含有质粒DNA的Opti-MEM培养液加入到含Lipo2000的Opti-MEM培养液，轻柔颠倒混匀，室温孵育10,min；

⑥将DNA-Lipo2000复合物加到293T细胞中，轻柔摇晃培养板以混匀复合物，放置与37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养；

⑦4小时后更换新鲜培养基，继续培养。

(3)表达效率检测：

对所述瞬转细胞进行荧光信号强度分析，将瞬转后的细胞分别在光学显微镜和荧光显微镜下观察，结果如图9A和图9B所示。

由图可以看出，转染后的293T细胞表现出典型的转染后的形态，荧光显微镜下可以观察到绿色荧光，表明所述环状RNA过表达载体已经成功表达。

此外，还通过荧光定量PCR的方式对表达量进行检测，步骤如下：

①收集瞬转细胞，提取RNA，提取步骤如下：

将细胞接种到六孔板，待细胞生长到90％融合时，进行RNA抽提；

吸去培养液，加入1mL Trizol，室温放置5min后反复吹打细胞；

将细胞裂解物移入一个1.5mL EP管，加入0.2倍体积的氯仿，振荡15s，室温放置3min后，12000rpm，离心10min；

吸取上层水相至新的EP管中，然后加入等体积70％的乙醇，颠倒混匀；

将混合液移到吸附柱中，12000rpm，离心30s，弃去收集管中的滤液；

向离心柱中加入600μL洗液Ⅰ，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的滤液；

向离心柱中加入600μL洗液Ⅱ，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的滤液；

重复上一步操作；

12000rpm空离心2min后，将吸附柱置于1.5mL EP管中放置3min，除去残留乙醇；

加入50μL DEPC水，盖上盖子，室温放置3min溶解RNA沉淀后，12000rpm离心2min；

用超微量分光光度计测定抽提的RNA浓度和纯度，-80℃保存。

提取的RNA的电泳结果如图10所示。由图可知，实验组和对照组细胞提取的RNA的质量均较高，可用于后续的反转录实验中。

使用提取的RNA进行逆转录，反应体系如下：

反转录反应程序如下：

50℃，30min；85℃，5min；15℃，保存。

以所得cDNA作为模板，通过荧光定量PCR检测表达量。其中，用于检测线性产物的引物序列如SEQ ID No.60～61所示，用于检测环状产物的引物序列如SEQ ID No.62～63所示。

SEQ ID No.60：GGGAGAATTTGAGAAAGGAGGGA；

SEQ ID No.61：CACCTGGGACTGTTGTTATGGT；

SEQ ID No.62：TTGTCCCTCTGATGCAAGAAGA；

SEQ ID No.63：CGCTCTTCCCTCCTTTCTCAAA。

荧光定量PCR反应的体系如下：

扩增程序如下：

95℃，10min；

95℃，30s；60℃，1min；循环40次；

95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s。

对照组细胞的荧光定量PCR的熔解曲线如图11A所示，实验组细胞的荧光定量PCR的熔解曲线如图11B所示。由图可以看出，对照组细胞中分子主要以线性形式存在，几乎没有环状分子，而导入了过表达载体的实验组细胞内则同时含有线性分子和环状分子，且表达量明显提升，表达量高于对照组细胞表达量的100倍，即实现了过表达。由此可知，所述促进环状RNA成环的载体具有促进环状RNA成环并过表达的作用。

(4)成环效率检测

将(3)中的扩增产物进行凝胶电泳，采用软件对电泳条带进行灰度分析，进而计算成环效率，结果如图12和表1所示。

表1

组别	灰度值
		对照组-线性产物引物	8592.823
对照组-环状产物引物	0
		实验组-线性产物引物	12873.752
实验组-环状产物引物	16328.066

由图12可以看出，对照组细胞仅能扩增出线性分子，使用检测环状分子的引物的扩增体系中无扩增条带，而实验组细胞中可以同时扩增出线性分子和环状分子，凝胶电泳的结果与图11A和图11B的结果一致。结合表1中灰度值检测的结果，可以计算出所述环状RNA的成环效率为79.2％，远高于现用技术中的相关载体的成环效率，应用价值更高。

实施例5

本实施例使用实施例4构建的环状RNA过表达慢病毒载体plenti-hsa_circ_0081979-copGFP-T2A-puro，构建稳定表达细胞，并通过荧光信号强度分析对表达效率进行评价，步骤如下：

(1)将plenti-hsa_circ_0081979-copGFP-T2A-puro和PLP1、PLP2和pLP-VSVG质粒共转染至293T细胞中，转染步骤与实施例4步骤(2)中相同；

培养24h后，观察细胞，如图13A和13B所示，转染后的细胞表现出明显病变形态，并且可以观察到绿色荧光，证明环状RNA过表达慢病毒载体成功表达；

(2)收集细胞培养上清，在4℃下，3000rpm离心15min，并使用0.45μm的过滤器重新过滤，加入6mL PEG浓缩液摇匀浓缩过夜，再在4℃下，1500rpm离心30min，弃上清后，在4℃下，1500rpm离心4min，去除多余上清，加入1mL HBSS溶液重悬病毒沉淀，吹混后分装；

(3)将培养后的293T细胞按照1.5×10⁵cell/孔的细胞密度接种至12孔板中，每孔中接种步骤(2)中制备的病毒浓缩液5μL，孵育4h后更换为完全培养基；

(4)病毒侵染48h后，观察细胞，如图14A和14B所示，可以看出病毒侵染后的293T细胞的绿色荧光十分明显，证明环状RNA可在细胞内持续表达。

综上所述，本发明提供了一种促进环状RNA成环的序列组合，所述序列具有促进环状RNA成环的功能；连接到骨架载体中，构建得到的促进环状RNA成环的载体可以在促进环状RNA成环的同时实现其过表达，过表达量不低于100倍，成环效率不低于79.2％，效果极好；所述促进环状RNA成环并过表达的方法操作简单，技术成熟，在环状RNA功能的相关研究中具有广阔的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 广州艾基生物技术有限公司

广州金泰生物科技有限公司

<120> 一种促进环状RNA成环的序列组合及其应用

<130> 2021

<160> 63

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggcgttag agtaggcgag gacagggtta catcgactag gctttgatcc tgatcaagaa 60

tatatatact ttataccgct tccttctaca tgttacctat ttttcaacga atctagtata 120

cctttttact gtacgattta tgggtataat aataagctaa atcgagacta agttttattg 180

ttatatatat tttttttatt ttatgcag 208

<210> 2

<211> 248

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtaagtattc aaaattccaa aattttttac tagaaatatt cgatttttta ataggcagtt 60

tctatactat tgtatactat tgtagattcg ttgaaaagta tgtaacagga agaataaagc 120

atttccgacc atgtaaagta tatatattct taataaggat caatagccga gtcgatctcg 180

ccatgtccgt ctgtcttatt attttattac cgccgagaca tcaggaacta taaaagctag 240

aaggatga 248

<210> 3

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaacaagaga gaatgctata gtcgtatagt atagtttccc gactatctga tacccattac 60

ttatctaggg ggaatgcgaa cccaaaattt tatcagtttt ctcggatatc gatagatatt 120

ggggaataaa tttaaataaa taaattttgg gcgggtttag ggcgtggcaa aaagtttttt 180

ggcaaatcgc tagaaattta caagacttat aaaattatga aaaaatacaa caaaatttta 240

aacacgtggg cgtgacagtt ttgggcggtt ttagggcgtt agagtaggcg aggacagggt 300

tacatcgact aggctttgat cctgatcaag aatatatata ctttataccg cttccttcta 360

catgttacct atttttcaac gaatctagta taccttttta ctgtacgatt tatgggtata 420

ataataagct aaatcgagac taagttttat tgttatatat atttttttta ttttatgcag 480

<210> 4

<211> 710

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaagtattc aaaattccaa aattttttac tagaaatatt cgatttttta ataggcagtt 60

tctatactat tgtatactat tgtagattcg ttgaaaagta tgtaacagga agaataaagc 120

atttccgacc atgtaaagta tatatattct taataaggat caatagccga gtcgatctcg 180

ccatgtccgt ctgtcttatt attttattac cgccgagaca tcaggaacta taaaagctag 240

aaggatgagt tttagcatac agattctaga gacaaggacg cagagcaagt ttgttgatcc 300

atgctgccac gctttaactt tctcaaattg cccaaaactg ccatgcccac atttttgaac 360

tattttcgaa attttttcat aattgtatta ctcgtgtaaa tttccatcaa tttgccaaaa 420

aactttttgt cacgcgttaa cgccctaaag ccgccaattt ggtcacgccc acactattga 480

gcaattatca aattttttct cattttattc cccaatatct atcgatatcc ccgattatga 540

aattattaaa tttcgcgttc gcattcacac tagctgagta acgagtatct gatagttggg 600

gaaatcgact tattttttat atacaatgaa aatgaattta atcatatgaa tatcgattat 660

agctttttat ttaatatgaa tatttatttg ggcttaaggt gtaacctcct 710

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgacctccat agaagattct agagctagca aacaagagag aatgctatag tcgta 55

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccctagataa gtaatgggta tcagatagtc gggaaactat actatacgac tatagcattc 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cattacttat ctagggggaa tgcgaaccca aaattttatc agttttctcg gatatcgata 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaacccgccc aaaatttatt tatttaaatt tattccccaa tatctatcga tatccgagaa 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aattttgggc gggtttaggg cgtggcaaaa agttttttgg caaatcgcta gaaatttaca 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgtgtttaaa attttgttgt attttttcat aattttataa gtcttgtaaa tttctagcga 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caaaatttta aacacgtggg cgtgacagtt ttgggcggtt ttagggcgtt agagtaggcg 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tattcttgat caggatcaaa gcctagtcga tgtaaccctg tcctcgccta ctctaacgcc 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atcctgatca agaatatata tactttatac cgcttccttc tacatgttac ctatttttca 60

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

attataccca taaatcgtac agtaaaaagg tatactagat tcgttgaaaa ataggtaaca 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gatttatggg tataataata agctaaatcg agactaagtt ttattgttat atatattttt 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttcttacgga tccgatttaa attcgaattc ctgcataaaa taaaaaaaat atatataaca 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atcggatccg taagaagcaa ggtaagtatt caaaattcca aaatttttta ctagaaatat 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acaatagtat acaatagtat agaaactgcc tattaaaaaa tcgaatattt ctagtaaaaa 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tattgtatac tattgtagat tcgttgaaaa gtatgtaaca ggaagaataa agcatttccg 60

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctcggctatt gatccttatt aagaatatat atactttaca tggtcggaaa tgctttattc 60

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aggatcaata gccgagtcga tctcgccatg tccgtctgtc ttattatttt attaccgccg 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tatgctaaaa ctcatccttc tagcttttat agttcctgat gtctcggcgg taataaaata 60

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gatgagtttt agcatacaga ttctagagac aaggacgcag agcaagtttg ttgatccatg 60

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggcatggcag ttttgggcaa tttgagaaag ttaaagcgtg gcagcatgga tcaacaaact 60

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccaaaactgc catgcccaca tttttgaact attttcgaaa ttttttcata attgtattac 60

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gcgtgacaaa aagttttttg gcaaattgat ggaaatttac acgagtaata caattatgaa 60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aaactttttg tcacgcgtta acgccctaaa gccgccaatt tggtcacgcc cacactattg 60

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gatagatatt ggggaataaa atgagaaaaa atttgataat tgctcaatag tgtgggcgtg 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ttccccaata tctatcgata tccccgatta tgaaattatt aaatttcgcg ttcgcattca 60

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aagtcgattt ccccaactat cagatactcg ttactcagct agtgtgaatg cgaacgcgaa 60

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ttggggaaat cgacttattt tttatataca atgaaaatga atttaatcat atgaatatcg 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ccttaagccc aaataaatat tcatattaaa taaaaagcta taatcgatat tcatatgatt 60

<210> 33

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ccggagcgat cgcagatcct tcgcggccgc aggaggttac accttaagcc caaataa 57

<210> 34

<211> 1225

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aaacaagaga gaatgctata gtcgtatagt atagtttccc gactatctga tacccattac 60

ttatctaggg ggaatgcgaa cccaaaattt tatcagtttt ctcggatatc gatagatatt 120

ggggaataaa tttaaataaa taaattttgg gcgggtttag ggcgtggcaa aaagtttttt 180

ggcaaatcgc tagaaattta caagacttat aaaattatga aaaaatacaa caaaatttta 240

aacacgtggg cgtgacagtt ttgggcggtt ttagggcgtt agagtaggcg aggacagggt 300

tacatcgact aggctttgat cctgatcaag aatatatata ctttataccg cttccttcta 360

catgttacct atttttcaac gaatctagta taccttttta ctgtacgatt tatgggtata 420

ataataagct aaatcgagac taagttttat tgttatatat atttttttta ttttatgcag 480

gaattcgaat ttaaatcgga tccgtaagaa gcaaggtaag tattcaaaat tccaaaattt 540

tttactagaa atattcgatt ttttaatagg cagtttctat actattgtat actattgtag 600

attcgttgaa aagtatgtaa caggaagaat aaagcatttc cgaccatgta aagtatatat 660

attcttaata aggatcaata gccgagtcga tctcgccatg tccgtctgtc ttattatttt 720

attaccgccg agacatcagg aactataaaa gctagaagga tgagttttag catacagatt 780

ctagagacaa ggacgcagag caagtttgtt gatccatgct gccacgcttt aactttctca 840

aattgcccaa aactgccatg cccacatttt tgaactattt tcgaaatttt ttcataattg 900

tattactcgt gtaaatttcc atcaatttgc caaaaaactt tttgtcacgc gttaacgccc 960

taaagccgcc aatttggtca cgcccacact attgagcaat tatcaaattt tttctcattt 1020

tattccccaa tatctatcga tatccccgat tatgaaatta ttaaatttcg cgttcgcatt 1080

cacactagct gagtaacgag tatctgatag ttggggaaat cgacttattt tttatataca 1140

atgaaaatga atttaatcat atgaatatcg attatagctt tttatttaat atgaatattt 1200

atttgggctt aaggtgtaac ctcct 1225

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ctcactatag ggagacccaa gctggctagc agggcgttag agtaggcgag gacagggtt 59

<210> 36

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ataaagtata tatattcttg atcaggatca aagcctagtc gatgtaaccc tgtcctcgcc 60

t 61

<210> 37

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aatatatata ctttataccg cttccttcta catgttacct atttttcaac gaatctagta 60

t 61

<210> 38

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cgatttagct tattattata cccataaatc gtacagtaaa aaggtatact agattcgttg 60

a 61

<210> 39

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ataataagct aaatcgagac taagttttat tgttatatat atttttttta ttttatgcag 60

g 61

<210> 40

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

tgaatactta ccttgcttct tacggatccg atttaaattc gaattcctgc ataaaataaa 60

a 61

<210> 41

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gcaaggtaag tattcaaaat tccaaaattt tttactagaa atattcgatt ttttaatagg 60

c 61

<210> 42

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

atacttttca acgaatctac aatagtatac aatagtatag aaactgccta ttaaaaaatc 60

g 61

<210> 43

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

attcgttgaa aagtatgtaa caggaagaat aaagcatttc cgaccatgta aagtatatat 60

a 61

<210> 44

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gacggacatg gcgagatcga ctcggctatt gatccttatt aagaatatat atactttaca 60

t 61

<210> 45

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tctcgccatg tccgtctgtc ttattatttt attaccgccg agacatcagg aactataaaa 60

g 61

<210> 46

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

taaacgggcc ctctagactc gagcggccgc tcatccttct agcttttata gttcctga 58

<210> 47

<211> 551

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ctcactatag ggagacccaa gctggctagc agggcgttag agtaggcgag gacagggtta 60

catcgactag gctttgatcc tgatcaagaa tatatatact ttataccgct tccttctaca 120

tgttacctat ttttcaacga atctagtata cctttttact gtacgattta tgggtataat 180

aataagctaa atcgagacta agttttattg ttatatatat tttttttatt ttatgcagga 240

attcgaattt aaatcggatc cgtaagaagc aaggtaagta ttcaaaattc caaaattttt 300

tactagaaat attcgatttt ttaataggca gtttctatac tattgtatac tattgtagat 360

tcgttgaaaa gtatgtaaca ggaagaataa agcatttccg accatgtaaa gtatatatat 420

tcttaataag gatcaatagc cgagtcgatc tcgccatgtc cgtctgtctt attattttat 480

taccgccgag acatcaggaa ctataaaagc tagaaggatg agcggccgct cgagtctaga 540

gggcccgttt a 551

<210> 48

<211> 395

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gtgaaatgag gaatgattta tatatcacta ttgaaagggg agaatttgag aaaggaggga 60

agagcgtggc cagaaatgtg gaagttacga tgttcattgt agacagtagt ggccaaaccc 120

tgaaggattt tatctccttc ggctctgggg agccaccagc cagtgagtac cactcctttg 180

tgctttacca taacaacagt cccaggtggt ctgaactgct gaaacttccc attcctgtgg 240

ataaattccg gggtgcacac atccgcttcg agtttcggca ttgttccaca aaggagaaag 300

gagagaagaa gttgtttggg ttttcttttg tccctctgat gcaagaagat ggtaggactc 360

ttccagatgg cactcatgag ctcatcgtgc ataag 395

<210> 49

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

aaatcgagac taagttttat tgttatatat atttttttta ttttatgcag gtgaaatg 58

<210> 50

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ttctcaaatt ctcccctttc aatagtgata tataaatcat tcctcatttc acctgcataa 60

<210> 51

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ggggagaatt tgagaaagga gggaagagcg tggccagaaa tgtggaagtt acgatgttca 60

<210> 52

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

gaaggagata aaatccttca gggtttggcc actactgtct acaatgaaca tcgtaactt 59

<210> 53

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ggattttatc tccttcggct ctggggagcc accagccagt gagtaccact cctttgtgct 60

<210> 54

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gaagtttcag cagttcagac cacctgggac tgttgttatg gtaaagcaca aaggagtg 58

<210> 55

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

gaactgctga aacttcccat tcctgtggat aaattccggg gtgcacacat ccgcttcgag 60

<210> 56

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

aacaacttct tctctccttt ctcctttgtg gaacaatgcc gaaactcgaa gcggatgtgt 60

<210> 57

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gagagaagaa gttgtttggg ttttcttttg tccctctgat gcaagaagat ggtaggactc 60

<210> 58

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

aatacttacc ttatgcacga tgagctcatg agtgccatct ggaagagtcc taccatctt 59

<210> 59

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

taaaaaatcg aatatttcta gtaaaaaatt ttggaatttt gaatacttac cttatgc 57

<210> 60

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gggagaattt gagaaaggag gga 23

<210> 61

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cacctgggac tgttgttatg gt 22

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ttgtccctct gatgcaagaa ga 22

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

cgctcttccc tcctttctca aa 22

Claims

1.一种促进环状RNA成环的序列组合，其特征在于，所述促进环状RNA成环的序列组合包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列组合或SEQ ID No.3～4所示的核苷酸序列组合。

2.一种促进环状RNA成环的载体，其特征在于，所述促进环状RNA成环的载体含有权利要求1所述的促进环状RNA成环的序列组合；

所述促进环状RNA成环的载体还包括骨架载体。

3.根据权利要求2所述的促进环状RNA成环的载体，其特征在于，所述骨架载体包括克隆载体或表达载体。

4.一种权利要求2或3所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

5.根据权利要求4所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括测序验证的步骤。

6.一种促进环状RNA成环并过表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

合成环状RNA的编码序列，同源重组连入权利要求2或3所述的促进环状RNA成环的载体中，得到环状RNA过表达载体，再对所述环状RNA过表达载体进行表达检测；

优选地，所述表达检测前还包括测序验证的步骤；

优选地，所述表达检测的方法包括荧光信号强度分析和/或荧光定量PCR检测表达量；

7.根据权利要求6所述的促进环状RNA成环并过表达的方法，其特征在于，所述构建瞬转细胞包括：

将所述环状RNA过表达载体转染到细胞中，培养，得到所述瞬转细胞；

优选地，所述细胞包括293T细胞；

优选地，所述培养的时间为40～50h。

8.根据权利要求6或7所述的促进环状RNA成环并过表达的方法，其特征在于，所述构建稳定表达细胞包括：

纯化后的重组慢病毒侵染细胞，筛选，得到所述稳定表达细胞；

优选地，所述辅助质粒包括PLP1、PLP2和pLP-VSVG质粒；

优选地，所述包装细胞包括293T细胞；

优选地，所述培养的时间为48～72h；

优选地，所述筛选包括嘌呤霉素筛选。

9.根据权利要求6～8任一项所述的促进环状RNA成环并过表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)构建促进环状RNA成环的载体：

(2)构建环状RNA过表达载体：

(3)构建瞬转细胞和/或稳定表达细胞：

(4)表达检测：

对所述瞬转细胞和/或稳定表达细胞进行荧光信号强度分析，

和/或收集所述瞬转细胞和/或稳定表达细胞，提取RNA并进行逆转录，以所得cDNA作为模板，通过荧光定量PCR检测表达量。

10.权利要求1所述的促进环状RNA成环的序列组合、权利要求2或3所述的促进环状RNA成环的载体、权利要求4或5所述的促进环状RNA成环的载体的构建方法或权利要求6～9任一项所述的促进环状RNA成环并过表达的方法中的任意一种或至少两种的组合在制备环状RNA过表达产品中的应用。