CN117043332A - 基因组靶点的鉴定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴定能够调节细胞表型的测试刺激物的基因组靶点的方法，包括：a)提供对测试刺激物呈表型阴性响应的细胞群体；b)通过将功能获得性构建体随机插入到细胞基因组来修饰细胞群体；c)使修饰的细胞群体与测试刺激物接触；d)筛选暴露的修饰的细胞群体以鉴定对测试刺激物呈表型阳性响应的修饰细胞；以及e)鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因，从而鉴定测试刺激物的基因组靶点。

Description

基因组靶点的鉴定
技术领域
本发明提供了一种鉴定能够调节细胞表型的测试刺激物的基因组靶点的方法。
背景技术
鉴定涉及细胞过程的新基因(可以充当可成药靶点)是新药开发的关键起点。然而，最高度表达的细胞靶点并不总是代表用于治疗干预的最具生物相关性的靶点。
哺乳动物细胞(如涉及疾病的那些细胞)的生物过程或表型由细胞通路调控。这种涉及任何给定的生物过程或表型的相互作用的多样性，以及缺乏普遍适用的工具用于它们的研究和/或操纵，对目前用于候选疗法的开发的策略提出了巨大挑战。
目前可以鉴定与疾病生物学有关的候选药物靶点的筛选方法通常使用基因敲除进行。最近，已经描述了通过在基因中或基因附近插入序列来随机破坏基因功能的方法(Rad R.et al.,Science(2010)330(6007):1104-1107)。
仍然需要一种有效的方法或工具用于可成药靶点(特别是小分子药物靶点)的鉴定。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种鉴定能够调节细胞表型的测试刺激物的基因组靶点的方法，包括：
a)提供对测试刺激物呈表型阴性响应的细胞群体；
b)通过将功能获得性(gain-in-function)构建体随机插入到细胞基因组来修饰细胞群体；
c)使修饰的细胞群体与测试刺激物接触；
d)筛选暴露的修饰的细胞群体，以鉴定对测试刺激物呈表型阳性响应的修饰的细胞；以及
e)鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因，从而鉴定测试刺激物的基因组靶点。
合适地，细胞是哺乳动物细胞。
合适地，细胞包含编码用于表型相关的选择性标记物的核苷酸序列。
合适地，表型是细胞信号通路的激活。合适地，表型是钙信号(calciumsignalling)，在某些情况下，表型是伤害性(nociceptive，疼痛感受性)信号通路中的钙信号。替代地，表型是伤害性信号。
合适地，构建体是表达盒(expression cassette)。合适地，表达盒包含启动子。合适地，表达盒是转座子。合适地，转座子是激活的转座子。合适地，转座子是piggyBac转座子。
合适地，测试刺激物是作用于伤害性信号通路的化合物。
合适地，鉴定表型阳性的修饰的细胞的筛选包括鉴定与表型阴性对照细胞相比时呈表型阳性的修饰的细胞中的基因型差异。
合适地，鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因包括下一代测序。
合适地，鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因包括鉴定与条形码相关的细胞。
在本说明书的整个描述和权利要求中，词语“包含(comprise)”和“含有(contain)”及其变型是指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加、组分、整数或步骤。
在本说明书的整个描述和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数形式包含复数形式。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为考虑复数和单数。
结合本发明的特定方面、实施方式或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应被理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方式或实例，除非与其不相容。
下面进一步详细描述本发明的各个方面。
附图说明
下文参考附图进一步描述本发明的实施方式，其中：
图1提供了概述用于本发明中的示例性转座子盒的示意图，其中ITR：反向末端重复序列。Pac：嘌呤霉素N-乙酰基转移酶。pA：聚腺苷酸化位点。UCOE：通用染色质开放元件。
图2提供了TAGS的示意图。对稳定表达表型选择标记物的表型阴性细胞进行转座子介导的随机基因激活诱变(步骤1)，产生新表达基因的随机组合的衍生克隆体文库。该克隆体文库用所考虑的激动剂刺激，从而那些随机表达一个或多个正确基因的克隆体响应，并触发表型标记物的可检测变化。然后通过细胞分选来选择这些阳性克隆体(步骤2)。将分离的单个克隆细胞生长成大的克隆细胞群体并进行基因分型以鉴定转座子插入的位置(步骤3)。然后鉴定共同插入位点(CIS)，并通过siRNA和cDNA对CIS的200kb范围内的基因进行二次确认，以明确鉴定正确的靶基因。
图3提供了TAGS的基因分型策略。使用超声波处理装置(Covaris)分离和剪切来自克隆群体的基因组DNA。将定制的衔接子(adaptor)序列连接到剪切的基因组片段上，以实现插入位点特异性扩增。然后使用巢式引物(nested primer)进一步扩增来自第一PCR反应的扩增子，该巢式引物含有用于Illumina NGS平台的条形码(参见引物列表)以及衔接子的组合。将来自第二PCR的条形码化和衔接化的扩增子以等摩尔比混合，并且发送用于多重Illumina NGS。
图4提供了TAGS的验证(用于TRPA1的AITC筛选)。a)在Hela-C细胞中产生Piggy-Bac文库，用100uM的AITC和共入射光转换光刺激，以及基于CaMPARI红/绿信号通过FACS分选。b)将阳性克隆体作为单细胞收集，扩增成克隆群体，以及通过Fura-2钙成像测试AITC响应性。显示每个群体的响应细胞百分比。c-d)示例性Fura-2成像迹线。c)表型阴性的HeLa-c细胞。d)b中的群体#22的示例性迹线。e)100％响应者的基因分型。每一行显示来自16个示例性克隆群体中的一个的数据。最下面一行显示NCBI-RefSeq。蓝色箭头突出显示TRPA1的转录起始位点(TSS)。红色箭头突出显示在每个克隆体的基因分型中发现的TSS上游的真正共同插入位点(CIS)。
具体实施方式
本发明人提供了一种新型转座子激活全基因组筛选(TAGS)方法，该方法有利地提供了用于新型基因开发的新平台。该方法提供了用于测试刺激物的新型机械、热和化学受体的开发的平台。
本发明人提供了一种新的筛选方法，该方法可以使用“表型”分析来鉴定与疾病生物学相关的候选药物靶点，并且在基因水平上筛选药物或刺激物的影响。有利地，该方法可以鉴定使用传统筛选方法可能无法鉴定的生物学相关的可成药靶点。
本发明的方法涉及使用用于将表型阴性细胞转变为表型阳性细胞的随机基因激活，然后使用高通量序列分析来鉴定与阳性表型相关的基因型变化，从而鉴定用于疾病治疗的新型可成药位点。
这些方法有利地是无偏性的。它们涉及细胞中基因的随机阳性调节(例如增加的表达或激活)，然后随后确定所述随机阳性调节对于细胞对测试药物或刺激物的响应的影响。
因此，本发明提供了鉴定能够调节细胞表型的测试刺激物的基因组靶点的方法，包括提供对测试刺激物呈表型阴性响应的细胞群体；通过将功能获得性构建体随机插入到细胞基因组中来修饰细胞群体；使修饰的细胞群体与测试刺激物接触；筛选暴露的修饰的细胞群体以鉴定对测试刺激物呈表型阳性响应的修饰的细胞；鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因，从而鉴定测试刺激物的基因组靶点。
随机正向诱变
本发明的方法包括提供对测试刺激物呈表型阴性响应的细胞群体；以及随后通过将功能获得性构建体随机插入到细胞基因组中来修饰细胞群体。
在方法中有用的细胞优选是增殖细胞类型。细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适地，真核细胞是哺乳动物细胞。示例性哺乳动物细胞包括HEK 293、中国仓鼠卵巢细胞、HEK 293F、HEK 293H、HEK 293A、HEK 293FT、HEK293T、CHO DG44、CHO-S、CHO-DXB11、Expi293F、ExpiCHO-S、T-Rex、Hela、MCF7、COST、NIH 3T3、U2OS、A375、A549、N2A、PGP1 iPS、BHK、Hap1、Jurkat、N0、ARPE19或MDA-MB-231。
在某些情况下，细胞可以源自患者或疾病模型。
在某些实施方式中，细胞可以是植物细胞。植物细胞可以是作物植物，例如木薯、玉米、高粱、小麦或水稻。植物细胞也可以是藻类、树木或蔬菜。
合适地，细胞包含编码表型相关的可选择标记物的核苷酸序列。如本文所用的，“表型相关的可选择标记物”是指在表达或激活特定基因或通路(特别是与感兴趣的表型相关的特定基因或通路)后，赋予表达标记物的宿主细胞不同表型的核苷酸序列。这种核苷酸序列可以编码可选择或可筛选的标记物，这取决于该标记物是否赋予可以通过化学手段(例如通过使用可选择试剂(例如抗生素等))选择的性状，或者取决于该标记物是否仅仅是可以通过观察或测试(例如通过筛选(例如荧光))鉴定的性状。合适的可选择标记物的许多实例在本领域中是已知的，并且可用于本文描述的构建体中。在某些实施方式中，可选择的标记物是钙传感器。
如本文所用的，“表型”或“细胞表型”是指细胞或细胞群体中的任何可检测的特征。如本文所用的，表型阳性的细胞或细胞群体表现出特定的可检测的特征。如本文所用的，表型阴性的细胞或细胞群体不表现出特定的可检测的特征。可检测的特征包括但不限于细胞中或细胞亚区室中的蛋白质、RNA或DNA等。表型也可以与细胞生长、形态或细胞-细胞相互作用相关。在一些情况下，表型可以是细胞特性的时间变化、动力学等。
在一个实施方式中，特定表型选自由以下各项组成的组：细胞生长、酶活性、代谢能力、对化学或生物试剂的抗性。在一个实施方式中，表型是代谢通路或细胞信号通路的激活。
如本文所用的，“细胞信号通路”是指细胞中的一系列相互作用因子，这些因子在细胞内传递细胞内信号，以响应细胞表面的细胞外刺激，并且导致细胞表型的变化。沿着细胞信号通路的信号传递可能导致一种或多种改变基因表达的转录因子的激活。优选的细胞信号通路是已知涉及疾病模型(如疼痛、炎症、癌症)的通路。在一个实施方式中，表型是钙信号。在一个实施方式中，信号通路是伤害性信号通路，并且合适地，表型是钙信号。
功能性细胞信号通路是一种在该通路例如通过适当的细胞外刺激被开启或激活时的完整且能够传递信号的通路。活性细胞信号通路是一种例如通过适当的细胞外刺激被开启，并且主动传递信号的通路。
表型可以使用任何合适的技术来鉴定或确定，例如使用光学技术，通过分析细胞行为等。表型可以使用基于生存力、荧光、放射性、磁性特征的细胞分选技术来鉴定或确定。例如，可以通过流式细胞术或本文描述的其他技术来选择细胞。此外，在一些实施方式中，表型可以使用蛋白或核酸(例如使用可检测标记的蛋白核酸)来确定。合适地，表型可以使用荧光激活细胞分选(FACS)来确定。合适地，表型可以使用图像激活细胞分选来确定(Nitta et al.,2018,Cell 175,266-276)。
合适地，表型阳性细胞的鉴定包括对测试刺激物响应的钙信号的鉴定。
如本文所用的，如本文所用的术语“基因组”包括生物体的染色体/核基因组以及任何线粒体和/或质粒基因组。如本文所用的，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、RNAi(miRNA、siRNA、shRNA)、反微小RNA反义寡脱氧核糖核苷酸(AMO)等的核酸分子。基因可以用于或不能够用于生产功能性蛋白或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区(例如内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区)。
如本文所用的，“随机插入”是指通过在任何基因组位置插入对基因组进行无偏差修饰，从而允许随机激活给定细胞或细胞群体中的基因。这允许筛选任何所需的表型以及鉴定其相关基因。
如本文所用的，“功能获得性”构建体是指包含核酸序列的构建体，该核酸序列能够在插入到基因组后增加基因的表达或活性。特别地，构建体的核酸序列能够在插入位点或插入位点附近增加基因的表达或活性。
如本文所用的，术语“表达”是指来自DNA模板的多核苷酸的转录，产生例如mRNA或其他RNA转录物(例如非编码的，如结构或支架RNA)。该术语进一步是指转录的mRNA被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中剪接mRNA。
合适地，核酸构建体是表达盒。如本文所用的，术语“表达盒”是重组或合成产生的多核苷酸构建体，包括可操作地连接到所选多核苷酸的调控序列以促进所选多核酸在宿主细胞中的表达。调控序列可以包括激活剂结合序列、增强子、内含子、聚腺苷酸化识别序列、启动子、转录起始位点、阻遏物(repressor)结合序列、茎-环结构、翻译起始序列、内部核糖体进入位点(IRES)、翻译前导序列、转录终止序列(例如，聚腺苷酸化信号和聚-U序列)、翻译终止序列、引物结合位点等。如本文所用的，术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列或氨基酸序列被置于彼此具有功能关系。
合适地，功能获得性构建体是转座子。如本文所用的，术语“转座子”是指能够从供体多核苷酸(例如载体)中切除并将自身整合到插入位点(例如细胞的基因组或染色体外DNA)中的多核苷酸。转座子包括包含侧翼为顺式作用核苷酸序列的核酸序列的多核苷酸；如果至少一个顺式作用核苷酸序列位于核酸序列的5'，并且至少一个顺式作用核苷酸序列位于核酸序列的3'。顺式作用核苷酸序列在转座子的每个末端包括至少一个转座酶与之结合的ITR。
如本文所用的，术语“转座酶”是指催化从多核苷酸中切除转座子并随后将转座子整合到靶细胞的基因组或染色体外DNA中的多肽。
“载体”是包含感兴趣的核酸的物质组合物。在一些实施方式中，载体包括转座子，并且可以用于将转座子递送到细胞内部。
在某些优选的实施方式中，转座子是哺乳动物piggyBac转座子。术语“piggyBac转座子”是指一种通过“剪切粘贴”机制在载体和染色体之间进行转座的可移动的遗传元件。在转座期间，PB转座酶识别位于转座子载体两端的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且有效地将内容物从原始位点转移并整合到TTAA染色体位点。所得的转化细胞或细胞组是稳定的转化体。除了转座活性外，ITR还可以用作增强子以刺激插入位点附近的内源性基因的表达。
术语“插入位点”是指DNA中的转座位置。DNA转座子的插入位点可以通过短的直接重复序列，然后通过对转座酶切除很重要的一系列反向重复序列来鉴定。
合适地，转座子是一种包含启动子的激活转座子，使得转座子插入增加了在插入位点或插入位点附近的基因转录。如本文所用的，术语“启动子”是指指导细胞中多核苷酸序列的组成型、诱导型和抑制型表达的调控元件。启动子可以是诱导型启动子、抑制型启动子和组成型启动子。
可以通过本领域技术人员众所周知的任何标准程序，例如电穿孔(或任何其他合适的转化方法)，将转座子引入基因组(包括染色体和/或质粒DNA)。例如，涉及体外转染的非病毒手段是有用的。这种方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合。脂质体也可以对将DNA递送到细胞中具有潜在的益处。此外，非病毒类递送可以是基于纳米的或气溶胶化的。
修饰的细胞群体与测试刺激物的接触
随后将修饰的细胞与测试刺激物接触。
如本文所用的，“接触”具有其通常含义，是指使两个或更多个分子(例如，测试试剂和多肽)组合或使分子和细胞(例如，测试试剂和细胞)组合。接触可以在体外发生，例如，在试管或其他容器中使两种或更多种试剂组合或使测试试剂和细胞或细胞裂解物组合。接触也可以在细胞中发生或原位发生，例如，在细胞中(通过在细胞中共表达编码两种多肽的重组多核苷酸)或在细胞裂解物中使两种多肽接触。
如这里所用的，“测试刺激物”是指一种试剂或化合物，包括多肽、核酸、β折叠模拟物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯二氮低聚N-取代的甘氨酸、低聚氨基甲酸酯、多肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、吡咯烷、衍生物、结构类似物或它们的组合。测试刺激物可以是合成化合物或天然化合物。
在一些实施方式中，测试刺激物是小分子有机化合物，例如分子量不大于约1,000或不大于约500的化合物。
在一些实施方式中，测试刺激物是物理刺激，例如温度或力。
在一些实施方式中，测试刺激物是病原体，例如病毒或细菌。
阳性克隆体的选择和靶点鉴定
然后使用本领域众所周知的方法筛选与测试刺激物接触的修饰的细胞以鉴定表型阳性的细胞，例如使用高通量筛选技术，包括但不限于标记物选择、基于荧光激活细胞分选(FACS)的筛选平台、基于微流体的筛选平台等以及它们的组合。
与表型相关的一个或多个基因的鉴定可以使用本领域已知的方法(例如通过测量基因表达或活性)来确定。与表型相关的一个或多个基因的鉴定可能涉及鉴定与表型阴性对照细胞相比时为表型阳性的修饰的细胞中的基因型差异。基因型差异可以包括基因激活、基因插入、基因敲低、基因敲除或调控元件缺失。在优选的实施方式中，基因型差异包括基因激活。
基因型差异的鉴定可以包括测量或经测量的DNA、RNA、蛋白或翻译后修饰的差异；或测量或经测量的与RNA和/或DNA水平相关的蛋白或翻译后修饰的差异；或者测量或检测报告基因或蛋白的表达。
如这里所用的，术语“对照”和“阴性对照”是指表型阴性的未修饰的细胞。优选地，未修饰的细胞与修饰的表型阳性的细胞是相同类型的细胞。
鉴定一个或多个与表型相关的基因包括测序。例如，本领域技术人员已知的方法，例如在Mitra(1999)Nucleic Acids Res.27(24):e34；pp.1-6中公开的高通量测序方法。在本公开中有用的测序方法包括Shendure et al.,Accurate multiplex polonysequencing of an evolved bacterial genome,Science,vol.309,p.1728-32.2005；Drmanac et al.,Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays,Science,vol.327,p.78-81.2009；McKernan et al.,Sequence and structural variation in a human genome uncovered by short-read,massively parallel ligation sequencing using two-base encoding,Genome Res.,vol.19,p.1527-41.2009；Rodrigue et al.,Unlocking short read sequencing formetagenomics,PLoS One,vol.28,e11840.2010；Rothberg et al.,An integratedsemiconductor device enabling non-optical genome sequencing,Nature,vol.475,p.348-352.2011；Margulies et al.,Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors,Nature,vol.437,p.376-380.2005；Rasko et al.Originsof the E.coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome inGermany,N.Engl.J.Med.,Epub.2011；Huffer et al.,Labelled nucleosidetriphosphates with reversibly terminating aminoalkoxyl groups,Nucleos.Nucleot.Nucl.,vol.92,p.879-895.2010；Seo et al.,Four-colour DNAsequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescentnucleotides,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.102,P.5926-5931(2005)；Olejnik et al.；Photocleavable biotin derivatives:aversatile approach for the isolation ofbiomolecules,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,vol.92,p.7590-7594.1995；US2009/0062129和US2009/0191553。
本领域技术人员已知的示例性下一代测序方法包括大规模并行签名测序(Massively parallel signature sequencing)(MPSS)、聚合酶克隆测序(Polonysequencing)、焦磷酸测序(454)、Illumina(Solexa)合成测序、SOLiD连接测序、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)(离子激流测序)、DNA纳米球测序、链终止测序(桑格测序(Sanger sequencing))、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序(PacificBiosciences)和纳米孔测序。
与表型相关的一个或多个基因的鉴定可以包括鉴定与条形码相关的细胞或克隆。
合适地，表型阳性的单细胞克隆体在分析之前从群体中分选并且扩增以鉴定与所需表型相关的一个或多个基因。
在示例性实施方式中，本文描述的方法可用于鉴定用作镇痛治疗的治疗靶点的基因。在这种实施方式中，合适地，测试刺激物是一种已知作用于伤害性信号通路的化合物。在这种实施方式中，合适地，表型是钙信号。在这种实施方式中，合适地，细胞包括Ca2+报告子，例如基于荧光光转换的钙传感器，如CaMPARI2。在这种实施方式中，合适地，功能获得性构建体是包含启动子的转座子，特别是piggyBac转座子。
实施例
以下非限制性实施例展示了本发明的各个方面。
转座子激活全基因组筛选(TAGS)的新方法如下例示。
发明人验证了TAGS可靠鉴定基因的能力(图2)。芥子油(AITC)是TRPA1(钙渗透性离子通道)的特异性激动剂。TAGS正确地将TRPA1鉴定为赋予AITC敏感性的基因。通过FACS从筛选文库中分离出新的AITC响应的克隆体，并通过钙成像独立验证AITC响应性(图4a-d)。使用稳定表达CaMPARI-H396K的HeLa细胞来筛选文库生成。这些对AITC响应是表型阴性的(图4d)。基因分型100％响应显示出存在于所有基因分型的克隆体中的TRPA1转录起始位点(TSS)上游34-41kb的成簇插入，这暗示单一受体(图4e)。确实，TRPA1敲除小鼠对AITC失去了所有敏感性。由于这是所有克隆体中唯一存在的簇，并且范围内没有其他编码基因，因此在这种情况下不需要进行二次确认。
步骤1)随机正向诱变。
将含有强启动子的可转座DNA盒插入到表型阴性细胞系(即功能上不表达所寻找的(sought-after)基因的细胞系)的基因组。这是在PiggyBac(PB)或Tol2转座酶的帮助下进行的。插入的启动子可以激活多达40-60千碱基的基因。在含有约10^6个独特细胞克隆体(每个克隆体具有约5-20个插入)的文库中，所寻找的基因在多个克隆体中随机表达，因此这些克隆体成为表型阳性的。
生成转座子和转座酶构建体
本发明人使用不稳定型PiggyBac(DDPB)或不稳定型Tol2(DDT2)DNA转座酶。DDPB是通过将FKBP-DD结构域(由IDT合成为短基因片段，以下列为“DD”)插入到EcoRI线性化的pCMV-hyPBase质粒(Wellcome Sanger Institute)生成的。DDT2是通过用引物DDT2-F/DDT2-R对pCMV-Tol2载体(Addgene)进行PCR线性化，然后用合成的DD结构域片段进行NEBHiFi组装生成的。转座酶的稳定是通过向培养基中添加300nM的Shield-1(Generon)来实现的。
可转座DNA盒含有三个主要元件，侧翼为PiggyBac和Tol2 ITR识别序列(图1)：1.由SV40启动子驱动的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(Pac)基因；2.侧翼为loxP位点的CAG启动子；3.通用染色体开放元件(UCOE)(在HNRPA2B1-CBX3管家基因之间的1kb内含子区)。
在以下系列的3个克隆步骤中组装盒。
克隆步骤1：7片段NEB HiFi组装。使用V-F/V-R引物通过PCR从PB-SB-PGKNeo-bpA(Wellcome Sanger)生成载体片段。使用引物1-F/1-R和6-F/6-R从pKTol2p-PTK质粒(Addgene)PCR扩增片段1和6(分别为Tol2转座酶的5’和3’ITR识别序列)。使用引物2-F/2-R和3-F/3-R以及4-F/4-R从pPUR载体(Clonetech)扩增片段2-4(分别为SV40启动子、pac基因、SV40 pA信号)。片段5(F5)含有两个LoxP位点，侧翼有定制设计的多克隆位点(MCS)，并且通过IDT合成为小基因片段。
克隆步骤2：随后使用限制性内切酶AgeI-XbaI从pX330载体(Addgene)中分离出CAG启动子插入物，并且使用相同的酶位点将其亚克隆到上述载体构建体。
克隆步骤3：以下将1.5kb的UCOE片段引入CAG启动子的上游。根据制造商的说明，使用Qiagen血液和组织试剂盒从100K的HeLa细胞中分离出基因组DNA。使用引物UCOE-F/UCOE-R从基因组DNA扩增UCOE片段，并且通过NEB-HiFi克隆插入到由步骤2产生的用XbaI线性化的载体构建体。
随机正向诱变文库创建：
在HeLa和A549细胞中，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000(Thermo)将转座子构建体转染到稳定表达荧光传感器的10^6个细胞中(这些生成在步骤2中描述)。Amaxa细胞核转染仪I装置(Lonza)与细胞系细胞核转染仪试剂盒V(Lonz)一起用于ARPE19和MDA-MB-231细胞。在24小时孵育期后，将Shield-1化合物(Generon)添加到培养基以稳定转座子。在6小时后，如前所述，用转座子DNA盒转染细胞。将Shield-1在培养基中保持24小时，然后取出。在3天的孵育期之后，将细胞进行1ug/ml的嘌呤霉素(Merck)选择，持续2周。立即使用所得文库进行筛选(参见以下的步骤2)。
引物/构建体列表(在5’→3’方向)：
DD：
acggccgccagtgtgctggccaccatgggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgtgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagtcgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaaccggaaGCCGGCGCAatgggcagcagcctgg(SEQ ID NO:1)；
DDT2-F：ggagcttctaaaaccggaagccggcatggaggaagtatgtgattcatc(SEQ ID NO:2)；
DDT2-R：gccagcacactggcggccgttccgcagcttttagagcagaag(SEQ ID NO:3)；
V-F：cacctctgctctctcttcattttattatatattagtcacgatatctataacaagaaa(SEQ IDNO:4)；
V-R：ctctgggatccagaatgtttaaaagttttgttactttatagaagaaattttgagttttt(SEQID NO:5)；
1-F：tttaaacattctggatcccagaggtgtaaagtactt(SEQ ID NO:6)；
1-R：cacattccacagtctaatacgactcactatagggagaccaaggg(SEQ ID NO:7)；
2-F：gtcgtattagactgtggaatgtgtgtcagttaggg(SEQ ID NO:8)；
2-R：tggcggcaggcggccgacct(SEQ ID NO:9)；
3-F：ggccgcctgccgccaccatc(SEQ ID NO:10)；
3-R：attatgatcctcgtcaggcaccgggc(SEQ ID NO:11)；
4-F：cggtgcctgacgaggatcataatcagccataccacatttgt(SEQ ID NO:12)；
4-R：atacgaagttataatttcctttttgttaagtgacctaattaacaggag(SEQ ID NO:13)；
F5：
ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatggcgcgccattctagaggtacctaaccggtatccatggagataacttcgtatagcatacattatacgaagttat(SEQ ID NO:14)；
6-F：tacgaagttatatcaattaaccctcactaaagggagacc(SEQ ID NO:15)；
6-R：cacctctgctctctcttcattttattatatattagtcacgatatctataacaagaaa(SEQ IDNO:16)；
UCOE-F：aagttatgtaacgggtacctggccctccgcgcctacag(SEQ ID NO:17)；
UCOE-R：cgaagttatggcgcgccattggagacgccgtggccccc(SEQ ID NO:18)
步骤2)阳性克隆体的选择。
使用荧光激活细胞分选(FACS)鉴定和分离其中靶基因的激活导致表型转化的阳性克隆体。因此，这种转化与使用特定指示剂的荧光事件有关。为此，本发明人使用了基于CaMPARI2荧光光转换的钙传感器。这种荧光团对细胞内钙(普遍存在的第二信使)的变化很敏感。如果钙升高和405nm光刺激重合，则CaMPARI2将从绿色荧光永久转换为红色荧光。因此，用所考虑的激动剂刺激诱变的细胞文库，同时暴露于来自定制UV-LED光源的120mW/cm^2 405nm光转换光。
筛选稳定表达荧光报告子CaMPARI的细胞系的生成
以下本发明人购买腺病毒AAV-CaMPARI2构建体(Addgene)，并将其与CMV启动子一起亚克隆到哺乳动物pT3-Neo质粒，以使用3-片段NEB HiFi克隆来驱动其表达。使用引物对pT3-F/pT3-R从pT3-Neo扩增载体片段。用引物对F1-F/F1-R从pCMV载体(Clonetech)扩增含有CMF启动子的片段1。使用引物F2-F/F2-R从AAV-CamPARI2构建体扩增片段2。
本发明人使用定点诱变(Q5 NEB，根据试剂盒制造商的说明)来生成三种衍生的构建体，每种构建体都含有降低其钙敏感性的CaMPARI2中的点突变。因此，本发明人创建CaMPARI2-H396K、CaMPARI2-F391W-G395D和CaMPARI2-L398T。将这些构建体中的每一个稳定地插入到四个细胞系的基因组：HeLa、A549、ARPE19和MDA-MB-231细胞(从ATCC购买的原始系)。这些稳定的系是通过将我们的构建体与pCMV(CAT)T7-SB100载体(Addgene)共转染以诱导快速且强大的转基因而产生的。转染后3周，使用Melody细胞分选仪(BD)通过FACS分选来选择稳定掺入荧光CaMPARI构建体的细胞。转染后5天施加1mg/ml的G418(Merck)选择压力以限制未转染细胞的生长。将所得的12个稳定的细胞系冷冻保存。对于每个筛选实验，对这些系进行表型阴性测试，并将最合适的系用于所考虑的特定刺激物的TAGS。
引物(5’→3’方向)
pT3-F：aacaacaattgctaattaagatctcgagggaatgaaagacccc(SEQ ID NO:19)；
pT3-R：aatcaatgtcaacaactagtatcgatatgcatgctttgca(SEQ ID NO:20)；
F1-F：tcgatactagttgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggg(SEQID NO:21)；
F1-R：agcttgaattcgaagctctgcttatatagacctcccac(SEQ ID NO:22)；
F2-F：ataagcagagcttcgaattcaagctgctagcaaggatcc(SEQ ID NO:23)；
F2-R：gagatcttaattagcaattgttgttgttaacttgtttattgcag(SEQ ID NO:24)
定制UV-LED光源的创建。
将100W的UV-LED芯片(Chanzon)连接到抛物面反射器(StratusLED)和带冷却风扇的铝制散热器(Tesfish)。3000mA的恒流LED驱动器(Chanzon)用于为LED供电。电路由FRM01定时继电器控制，用于精确的光转换定时。抛物面镜倒置在反射表面上，在该区室内在细胞水平上产生约120mW/cm^2的均匀光强度。
筛选期间细胞的选择
对来自步骤1的诱变文库进行刺激，同时使用我们定制的UV-LED光源对其进行光转换，持续35秒。然后将细胞洗涤、胰蛋白酶化、重悬于含有3ug/ml的DAPI(Merck)的FACS缓冲液(2％胎牛血清，在杜氏磷酸盐缓冲盐水中的2mM的EDTA)中。使用基于红/绿荧光强度的Melody FACS分选仪(BD)选择阳性细胞。
3)基因分型。
将FACS分离的单个克隆体生长成克隆群体。在每个细胞系中都证实了对刺激物的阳性响应，随后验证这种新的阳性表型对通过使用Cre重组酶插入的启动子的依赖性。然后从每个确认的群体中分离出基因组DNA。进行插入位点特异性PCR以扩增转座子邻近基因组区域。在第二PCR步骤中用DNA条形码对这些进行标记，并且使用Illumina MiSEQ下一代测序平台平行地进行基因分型(图3)。
依赖于插入启动子的阳性表型的验证
将来自每个阳性克隆系的测试样品在补充有1ul/ml的PluronicF127的常规培养基中负载荧光钙指示剂Fura-2AM，持续30分钟，用林格溶液(Ringer solution)洗涤，并且使用常规荧光显微术测试所考虑的表型的阳性(参见图4a-d)。来自确认的阳性克隆系的进一步测试样品用pCAG-Cre载体(Addgene)转染(如上文描述)以诱导瞬时Cre重组酶表达。然后如上所述重新测试表型阳性，并丢弃其中表型持续存在的群体。以下是其中Cre介导的CAG启动子切除逆转表型转换的克隆群体的基因分型。
文库制备和基因分型
根据制造商的说明，使用96孔gDNA分离试剂盒(Zymo)从每个确认的克隆群体中分离出基因组DNA。根据制造商的说明，在Covaris机器中将基因组DNA剪切至约300个碱基对的目标大小。根据制造商的说明，使用Ampure XP磁珠(BD)以1:1的比例纯化剪切的基因组DNA(大小针对约400bp左右选择进行优化)。使用NEBNext Ultra II连接和末端修复模块(NEB)将Splinkrette衔接子(由引物SPLNK-LE和SPLNK-HP双联而成)退火成片段化DNA。用Ampure XP珠纯化连接的片段。使用5-1-F/SPL-1-R引物对在纯化的片段上进行插入特异性PCR。用Ampure XP珠纯化产物。用排列的引物对**5-2-P50*/SPL-2-P70*进行第二PCR步骤。参见下面的引物列表。产物用Amure XP珠纯化并且用MiSEQ进行多重化(根据制造商的说明在核心设施中进行)。
引物(5’→3’方向。星号表示硫代磷酸酯键)
SPLNK-HP：
5’GGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCACTTTTTTTTTTCAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:25)
SPLNK-LE：
5’GTTCCCATGGTACTACTCATAGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA*T(SEQ ID NO:26)
5-1-F：5’CGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTC*A(SEQ ID NO:27)
SPL-1-R：5’GTTCCCATGGTACTACTCAT*A(SEQ ID NO:28)
PB5-2-P501：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACATATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:29)
PB5-2-P502：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAATAGAGGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:30)
PB5-2-P503：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTATCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:31)
PB5-2-P504：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAGGCTCTGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:32)
PB5-2-P505：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAAGGCGAAGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:33)
PB5-2-P506：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACATAATCTTAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:34)
PB5-2-P507：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGACGTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:35)
PB5-2-P508：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAGTACTGACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGCGTCAATTTTACGCAGACTAT*C(SEQ ID NO:36)
T25-2-P501：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACATATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:37)
T25-2-P502：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAATAGAGGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:38)
T25-2-P503：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTATCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:39)
T25-2-P504：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAGGCTCTGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:40)
T25-2-P505：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAAGGCGAAGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:41)
T25-2-P506：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACATAATCTTAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:42)
T25-2-P507：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGGACGTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:43)
T25-2-P508：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAGTACTGACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTatttttgagtactttttacacctct*g(SEQ ID NO:44)
SPL-2-P701：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:45)
SPL-2-P702：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCGGAGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:46)
SPL-2-P703：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGAGCGGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:47)
SPL-2-P704：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAATCTCGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:48)
SPL-2-P705：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGAATGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:49)
SPL-2-P706：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAATTCGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:50)
SPL-2-P707：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTTCAGGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:51)
SPL-2-P708：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCATTAGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:52)
SPL-2-P709：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAGCCGGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:53)
SPL-2-P710：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGCGGAGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:54)
SPL-2-P711：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCGAGAGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:55)
SPL-2-P712：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATCGCTGTGACTGGAGTTCCTTGG*C(SEQ ID NO:56)
4)靶点鉴定。引起表型转换的插入以簇的形式发生，即在单个受体的情况下在所有其他选择的克隆体中发现靠近插入位点，或在两个受体的情况下在约50％的克隆体中发现靠近插入位点等。这种阳性簇是使用生物信息学方法的组合，比较插入的概率与阴性数据集(从原始文库中随机选择的阴性克隆体)来鉴定的。与阴性对照相比，显著富集的簇附近的基因构成候选名单(shortlist)用于二次验证以明确鉴定真正的致病基因。二次验证是通过在克隆群体中的siRNA敲低(确认基因对于表型的必要性)以及在亲代原初细胞系中cDNA介导的表达(确认赋予表型的基因的充分性)的组合进行的。
读者的注意力针对在与本申请相关的本说明书同时或之前提交，并且可与本说明书一起公开供公众查阅的所有文章和文件，以及所有这些文章和文件的内容通过引用并入本文。
本说明书中公开的所有特征(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或工艺的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了这些特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。
除非另有明确说明，否则本说明书中公开的每个特征(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)可以由用于相同、等效或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等效或类似特征的一般系列的一个实例。
本发明不限于任何前述实施方式的细节。本发明延伸到本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新的一个或任何新的组合，或者延伸到如此公开的任何方法或工艺的步骤的任何新的一个或任何新的组合。

Claims (16)

1.一种鉴定能够调节细胞表型的测试刺激物的基因组靶点的方法，包括：
a)提供对所述测试刺激物呈表型阴性响应的细胞群体；
b)通过将功能获得性构建体随机插入到细胞基因组修饰所述细胞群体；
c)使修饰的细胞群体与所述测试刺激物接触；
d)筛选暴露的所述修饰的细胞群体，以鉴定对所述测试刺激物呈表型阳性响应的修饰细胞；以及
e)鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因，从而鉴定所述测试刺激物的所述基因组靶点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细胞包含编码表型连接的可选择标记物的核苷酸序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表型是细胞信号通路的激活。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞信号通路是伤害性信号通路。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述表型是钙信号。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述构建体是表达盒。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表达盒包含启动子。
9.根据权利要求7至8中任一项所述的方法，其中所述表达盒是转座子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述转座子是激活转座子。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述转座子是piggyBac转座子。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测试刺激物是作用于伤害性信号通路的化合物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中鉴定表型阳性的修饰细胞的筛选包括鉴定与表型阴性对照细胞相比时呈表型阳性的修饰细胞中的基因型差异。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因包括下一代测序。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中鉴定与所述阳性表型相关的一个或多个基因包括鉴定与条形码相关的细胞。
16.一种鉴定能够调节细胞表型的测试刺激物的基因组靶点的方法，本文中参考附图对所述方法进行描述。
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