CN117051043A - 一种基于环状rna编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素及其应用 - Google Patents
一种基于环状rna编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基于环状RNA编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素及其应用，并具体提供用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法，通过该方法制备得到的编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA可提高耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的表达量。环状RNA表达的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素可直接作用于细胞内的细菌，同时降低了其产生免疫原性的风险，为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的治疗和预防提供了一种治疗方案。
Description
技术领域
本申请属于核苷酸技术应用领域，具体来说，本申请涉及一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法。
背景技术
环状RNA是一类以共价闭合拓扑结构为特征的单链RNA，因此不存在游离末端。与线性RNA相比，环状RNA不容易被外切酶消化，表现出更高的稳定性，因此在生物体内和体外都有许多实际应用前景。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于革兰氏阳性菌其中一种，作为人类及动物之间普遍存在的一种病原体，该菌给临床带来重大困扰，特别是术后的感染，同时还会引起各种疾病，如败血症、脓毒症、肺炎、脑膜炎、脊髓炎等。为了防治由金黄色葡萄球菌带来的疾病，目前主要使用抗生素，但长期抗生素的使用导致了多种耐药金黄色葡萄球菌株的产生，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），这种耐药菌株的出现对人类健康带来了重大的威胁。
为了克服金黄色葡萄球菌的耐药性，噬菌体及由噬菌体基因编码的内溶素被应用于杀灭耐药菌株。内溶素是噬菌体侵染细菌后，在后代噬菌体增殖后期产生于细菌细胞内的一种蛋白质，该蛋白质可以从内部裂解细菌细胞，释放后代的同时杀死细菌。由于内溶素与抗生素杀死细菌的机理不同，并且噬菌体内溶素对细菌具有高度特异性，目前没有发现耐药菌株。
目前，获得内溶素的方式普遍是通过在大肠杆菌中通过诱导表达后，裂解大肠杆菌体外纯化内溶素蛋白，临床应用还需要特殊的递送方式。由于环状RNA（circular RNA,CircRNA）在蛋白质的体内高效持久表达等方面具有一定优势，使得其在生物医药新一代疗法的开发中具有相当值得期待的应用前景。相比于传统制备方法得到的内溶素，通过环状RNA介导的细胞内表达的内溶素具有可直接作用于细胞内的细菌且产生免疫原性的风险也相对更小的优势。本发明使用环状RNA编码内溶素蛋白，使其直接在哺乳细胞上清中表达并发挥药效作用。
发明内容
本公开的目的是提供一种编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA、其制备方法和制药用途。
一方面，本发明提供一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法。另一方面，本发明提供一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性DNA。另一方面，本发明提供一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性RNA。另一方面，本发明提供一种用于制备所述编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性DNA或所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性RNA的质粒表达载体。另一方面，本发明提供一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA。另一方面，本发明提供了所述环状RNA在制备用于治疗或预防耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物中的用途。另一方面，本发明还提供了一种用于表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的RNA序列。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法，其包括以下步骤：
步骤(a)，设计并制备线性DNA模板，所述线性DNA模板包括从5’至3’端按照以下顺序排列的元件：
5’-5’同源臂-3’Group I 内含子-3’外显子（Exon2）-内部核糖体进入位点（IRES）-信号肽-编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列-5’外显子（Exon1）-5’Group I 内含子-3’同源臂-3’；
步骤(b)，纯化步骤(a)中制备的所述线性DNA模板；
步骤(c)，将步骤(b)中的所述线性DNA模板体外转录为RNA，体外转录的反应体系包括：线性DNA模板、T7聚合酶、RNase抑制剂、NTPs、无机焦磷酸酶和反应缓冲液；
步骤(d)，向步骤(c)的体系中加入DNase I并加热，以去除体外转录所得产物中的DNA；
步骤(e)，将步骤(d)的体系加热，以环化所述线性RNA，纯化反应物以得到环状RNA。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法，其中所述编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列选自：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，所述编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列优选地为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法，其中所述内部核糖体进入位点（IRES）为如SEQ ID NO:12所示的CVB3病毒IRES序列（参见Jennifer M Bailey等人，J Virol. 2007 Jan; 81(2):650-668，图1），其中所述信号肽为如SEQ ID NO:13所示的IGK信号肽。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA制备的方法，其中所述步骤(d)中的条件为在50-60℃下处理8-60 min。所述温度可以具体选自50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃。所述时间可以具体选自8-45min、8-30min、8-15min时间段内容任意值。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法，其中所述步骤(e)是在Mg2+和GTP存在的情况下进行两次酯交换反应，使得5’端的5’同源臂-3’Group I 内含子与3’端的5’Group I 内含子-3’同源臂连接成环，并进一步切除同源臂和Group I 内含子并使-3’外显子（Exon2）和5’外显子（Exon1）连接，以形成本发明的环状RNA。参见Natalia Akopyanz等人，Nucleic Acids Research, 1992, 20(19):5137-5142和US11203767B2，第31栏第1段。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法，其中所述步骤(e)中的所述环化是通过将3’外显子（Exon2）和5’外显子（Exon1）连接，同时去除5’同源臂、3’Group I 内含子、5’Group I 内含子、3’同源臂元件来实现的。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性DNA，所述线性DNA包括从5’至3’端按照以下顺序排列的元件：5’-5’同源臂-3’Group I内含子-3’外显子（Exon2）-内部核糖体进入位点（IRES）-信号肽-编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列-5’外显子（Exon1）-5’Group I内含子-3’同源臂-3’。在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的野生型序列SEQ ID NO:1的基础上进行了密码子优化，筛选出SEQID NO:2和SEQ ID NO:3，从而显著提高了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的表达量。本发明中编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，优选地为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性DNA，其中所述内部核糖体进入位点（IRES）为如SEQ ID NO:12所示的CVB3病毒IRES序列，其中所述信号肽为如SEQ ID NO:13所示的IGK信号肽。
如本文所用，如果载体的元件位于载体上，则载体的元件是“可操作地连接的”，使得它们可以被转录以形成线性RNA，然后可以使用本文提供的方法将其环化以形成环状RNA。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性RNA，所述线性RNA是通过体外转录本发明所提供的线性DNA制备所得的。
在一些实施方案中，本发明涉及一种质粒表达载体，其被用于制备本发明所提供的编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性DNA或本发明所提供的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性RNA。
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA，所述环状RNA是通过环化本发明提供的所述线性DNA制备得到的。在一些实施方案中，本发明提供的环状RNA具备如图9所示的结构。
在一些实施方案中，本发明涉及本发明所提供的编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA在制备用于治疗或预防耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物中的用途。
在一些实施方案中，本发明涉及用于表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的RNA序列，所述RNA序列包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的序列。
在一些实施方案中，5’同源臂序列选自如SEQ ID NO:6所示的序列。在一些实施方案中，3’Group I 内含子序列选自如SEQ ID NO:7所示的序列。在一些实施方案中，3’外显子（Exon2）序列选自如SEQ ID NO:8所示的序列。在一些实施方案中，5’外显子（Exon1）序列选自如SEQ ID NO:9所示的序列。在一些实施方案中，5’Group I 内含子序列选自如SEQ IDNO:10所示的序列。在一些实施方案中，3’同源臂序列选自如SEQ ID NO:11所示的序列。
在一些实施方案中，本发明涉及用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA，所述环状RNA是通过环化本发明所提供的线性RNA制备所得的。在一些实施方案中，所述RNA序列为环化RNA序列或mRNA序列。
本文说明书中引用的现有技术，其整体通过引用方式并入本文并用于所有目的。
定义
下面列出了用于描述本文公开的核酸组合和组合物的各种术语的定义。这些定义适用于如整个本说明书和权利要求书中所使用的术语，在特定情况下另有限制除外，这些术语或单独地或作为一个更大的组的一部分使用。
如本文所用，术语“任选”“任选地”包括选择或不选择两种情形。例如“任选修饰”包括被修饰和不被修饰两种情形。
如本文所用，术语“一种(个)”和“所述”通常被解释为涵盖单数和复数形式。
本文所采用术语“包括”意指词组“包括（但不限于）”，并可与其交换使用。本文所采用术语“包含”意指词组“包含（但不限于）”，并可与其交换使用。本专利中的使用“包括”或“包含”的技术方案，可以进一步限定成“组成”或“构成”。
在本说明书全文，提到“一个实施方式”、“一些实施方式”、“实施方式”、“特定实施方式”、“相关实施方式”、“某个实施方式”、“另外的实施方式”或“进一步的实施方式”或其组合意指与所述实施方式结合描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，前述短语在本说明书全文的各个地方的出现不一定全部指相同实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合。
如本文所用，术语“circRNA”、“circular RNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”可互换使用并且是指通过共价键形成环状结构的多核糖核苷酸。
如本文所用，“同源臂”是以下任一连续序列，1)预测与RNA中的另一序列（如另一个同源臂）的至少约75%（例如，至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、约100%）形成碱基对，2)长度至少7nt且不超过250nt，位于3’内含子片段之前和附近或包含在其中，和/或5’内含子片段之后和附近或包含在其中，以及可选地，4)预测与RNA中的意外序列（例如，非同源臂序列）的碱基配对少于50%（例如，少于45%、少于40%、少于35%、少于30%、少于25%）。如本文所用，5’和3’同源臂可以是合成序列，与内部同源区域不同，但功能相似。同源臂的长度可以是例如约5-50个核苷酸，约9-19个核苷酸，例如，长度为约5、约10、约20、约30、约40或约50个核苷酸。
如本文所用，Group I 内含子（也可称为“I组内含子”或“Group I Intron”）自剪接序列的实例包括但不限于衍生自T4噬菌体基因td或蓝藻鱼腥藻属pre-tRNA-Leu基因的自剪接排列的内含子-外显子序列。
如本文所用，3’Group I 内含子片段是与天然I组内含子的3’近端片段至少75%（例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、100%）同源的连续序列，包括3’剪接位点二核苷酸，以及可选地，相邻外显子序列，其长度至少为1个核苷酸（例如，长度为至少5个核苷酸、长度为至少10个核苷酸、长度为至少15个核苷酸、长度为至少20个核苷酸、长度为至少25个核苷酸、长度为至少50个核苷酸）。在某些实施方式中，5’Group I 内含子片段是与天然I组内含子的5’近端片段至少75%（例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、100%）同源的连续序列，包括5’剪接位点二核苷酸和可选地，相邻外显子序列，其长度至少为1个核苷酸（例如，长度为至少5个核苷酸、长度为至少10个核苷酸、长度为至少15个核苷酸、长度为至少20个核苷酸、长度为至少25个核苷酸、长度为至少50个核苷酸）。
如本文所用，“载体”是指一段DNA，它是合成的（例如，使用PCR），或者是从病毒、质粒或高等生物的细胞中提取的，可以将外来DNA片段插入或已经插入其中以进行克隆和/或表达目的。在一些实施方案中，本发明所述的载体为大肠杆菌克隆质粒。
在一些实施方案中，本发明的环状RNA进一步包括内部核糖体进入位点（IRES）序列。在一些实施方案中，所述内部核糖体进入位点（IRES）序列为CVB3病毒、EV71病毒、EMCV病毒、PV病毒或CSFV病毒IRES序列，优选为CVB3病毒IRES，更优选为序列如SEQ ID NO:12所示的CVB3病毒IRES。
有益技术效果
1、本发明为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的治疗和预防提供了一种治疗方案，通过本申请的方法制备的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素对MRSA具有显著的抑菌效果。
2、本申请的发明人在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的野生型序列SEQ IDNO:1的基础上进行了密码子优化，筛选出SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，从而显著提高了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的表达量。
3、相比于传统的内溶素的制备方法，使用本发明的环状RNA表达的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素可直接作用于细胞内的细菌以发挥药效作用，同时降低了其产生免疫原性的风险。
4、相对于常规的mRNA表达技术，本发明提供的通过环状RNA表达蛋白的技术更简便，制备产生的环状RNA结构更简单，更易于实现工业生产。
附图说明
图1展示了基于重排的Group I 内含子的体外生成circRNA的示例性方法：线性RNA前体 5’到3’包含：5’同源臂、3’ Group I 内含子、3’外显子（Exon 2）、内部核糖体进入位点（IRES）、信号肽、插入序列、5’外显子（Exon 1）、5’ Group I 内含子和3’同源臂。插入序列可以包含编码内溶素多肽的核酸序列。在Mg2+和GTP存在的情况下进行两次酯交换反应，以形成环状RNA。
图2展示从质粒中扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素circEndoWT基因片段、circEndo1及circEndo2基因片段的结果：泳道1：circEndoWT的扩增片段；泳道2：circEndo1的扩增片段；泳道3：circEndo2的扩增片段；M: Trans 2k plus Ⅱ DNA Maker。
图3为含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素基因重组载体的PCR鉴定：泳道1：circEndoWT基因的鉴定结果；泳道2：circEndo1基因的鉴定结果；泳道3：circEndo2基因的鉴定结果；M: Trans 2k plus Ⅱ DNA Maker。
图4为Pme Ⅰ内切酶酶切结果：泳道1-1：质粒circEndoWT；泳道1-2：线性化质粒circEndoWT；泳道2-1：质粒circEndo1；泳道2-2：线性化质粒circEndo1；泳道3-1：质粒circEndo2；泳道3-2：线性化质粒circEndo2；M: Trans 2k plus Ⅱ DNA Maker。
图5为体外制备环状RNA（CircRNA）的电泳结果图。GTP环化后，RNA组分中的Precursor减少：M: ssRNA Ladder；
WT: IVT, DNase Ⅰ, GTP分别表示线性化质粒circEndoWT的体外转录，DNase Ⅰ酶解DNA及线性RNA环化为CircRNA后的结果；
1: IVT, DNase Ⅰ, GTP分别表示线性化质粒circEndo1的体外转录，DNase Ⅰ 酶解DNA及线性RNA环化为CircRNA后的结果；
2: IVT, DNase Ⅰ, GTP分别表示线性化质粒circEndo2的体外转录，DNase Ⅰ 酶解DNA及线性RNA环化为CircRNA后的结果。
图6为通过Western Blot检测环状RNA编码的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素蛋白circEndo（34 KD）在细胞上清中的表达：M: BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD)；泳道1：环状RNA circEndoWT在体外转染293T细胞后的蛋白表达；泳道2：环状RNA circEndo1在体外转染293T细胞后的蛋白表达；泳道3：环状RNA circEndo2在体外转染293T细胞后的蛋白表达；Non表示未转染293T细胞的阴性对照。
图7 Western Blot蛋白电泳条带定量的灰度分析图。
图8 环状RNA表达的细胞上清中的内溶素蛋白抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性分析：含有内溶素蛋白circEndoWT的处理组；含有内溶素蛋白circEndo1的处理组；含有内溶素蛋白circEndo2的处理组；vehicle为溶剂对照组（DMEM高糖培养基+10%胎牛血清，未作任何处理的细胞上清）。含有优化后序列的环状RNA circEndo1 与circEndo2 表达的内溶素蛋白的处理组OD值均远低于溶剂对照组，表现出明显的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性。
图9 环状RNA示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本公开的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本公开，而不应被视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
本发明试验中使用的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，保藏号：BNCC337371）。活化处理后使用40%的甘油进行保存。内溶素序列由合成核苷酸服务公司(安升达生命科学)合成，分别命名为circEndoWT、circEndo1和circEndo2，其对应的DNA序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
实施例1：circEndo表达载体构建
（1）基于Group I催化内含子（catalytic intron）的体外生成circRNA的示例如图1所示。合成内溶素序列片段：根据来源于猪链球菌噬菌体Streptococcus suis phagestrain 89/1591的候选endolysin PlySs2的氨基酸序列（GenBank: AGF87539.1），在N端添加Mouse Ig Kappa（IGK）信号肽序列，在C端加入3×flag标签（SEQ ID NO:14），将氨基酸序列根据密码子偏好对密码子进行优化，得到两条优化的序列。然后将设计好的序列与未经优化的PlySs2的原始序列（GenBank: KC348602.1, 287-1024）合成。基因序列如序列表中所示，未经过密码子优化的序列为SEQ ID NO:1，优化过的两条序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；
（2）设计一对引物：P1: 5’-GTTGAATACAGCAAAACTAGTGCCACC-3’（SEQ ID NO:15）；P2: 5’-CGGTAACGCATAATAGCCGTTTTG-3’（SEQ ID NO:16）；使用上述引物，对合成片段进行扩增；
（3）载体酶切：使用限制性内切酶Spe Ⅰ、Age Ⅰ对空载体进行双酶切，用于载体重组；
对上述产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并回收目的条带的胶块，使用Zymoclean Gel DNA Recovery Kits（ZYMO，美国）回收扩增片段及酶切载体；
（4）载体重组：根据Gibson Assembly Master Mix（NEB，美国）操作说明书对扩增片段和酶切载体进行载体重组，然后转化大肠杆菌T1化学感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性（50µg/mL）的LB平板上，次日挑取单克隆，并使用2×Rapid Tap Master Mix（Vazyme，中国南京）进行扩增鉴定，引物使用P1和P2，选择阳性克隆进行测序鉴定，测序正确的质粒命名为P(circEndoWT)、P(circEndo1)和P(circEndo2)；
如图2所示，PCR扩增后，在952bp处出现目的基因带circEndoWT、circEndo1和circEndo2，大小符合预期，证明片段扩增正确。如图3所示，对单克隆菌落进行PCR扩增后，在952bp处出现目的基因带circEndoWT、circEndo1和circEndo2，大小符合预期，证明载体构建正确。
实施例2：线性化质粒的制备及纯化
（1）将测序正确的阳性克隆菌接种到含卡那霉素抗性（50µg/mL）的LB液体培养基中，37℃培养过夜，根据EndoFree Mini Plasmid Kit II（TIANGEN，中国北京）操作说明书提取质粒。
（2）使用限制性内切酶Pme Ⅰ 对质粒进行酶切，37℃处理3h，使其线性化，然后根据DNA Clean &Concentrator®-25（ZYMO，美国）操作说明书对线性化的质粒进行纯化，并对纯化后的产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定质粒是否成功被线性化。
如图4所示限制性内切酶Pme Ⅰ 酶切后，在4.8kb处出现线性化后的载体带，大小与预期符合，说明重组载体成功被线性化。
实施例3：体外转录（IVT）及RNA环化
（1）对线性化后的质粒进行体外转录。按照以下表1体系，进行体外转录：
表1
| 名称 | 反应体系（mL） |
| 10×反应缓冲液 | 6.0 |
| 100 mM ATP | 3.0 |
| 100 mM CTP | 3.0 |
| 100 mM UTP | 3.0 |
| 100 mM GTP | 6.0 |
| T7聚合酶(200U/μL) | 0.99 |
| RNase抑制剂(40U/μL) | 1.65 |
| Ppase(0.1U/μL) | 0.24 |
| 线性DNA (1.2 mg) | 36.12 |
| 总计 | 60 μL |
37℃下反应3h获得RNA产物；
（2）然后按照以下表2体系加入DNase I去除体外转录后产物中的DNA，在37℃下反应15-30 min。
表2
| 名称 | 反应体系（mL） |
| RNA Mix | 60 |
| DNase I | 3 |
| 总计 | 63 mL |
（3）RNA体外环化及纯化。为了进一步得到环化CircRNA，将RNA产物55℃下处理15min，在Mg2+和GTP存在的情况下，发生两次酯交换反应。反应结束后按照Monarch® RNACleanup Kit（NEB，美国）操作说明书对RNA环化后的产物进行纯化；
（4）对体外转录、DNase I及环化步骤的RNA进行鉴定，2%的琼脂糖凝胶电泳。如图5所示体外转录（IVT）后的主要产物包括未环化的前体RNA和已环化的CircRNA，通过GTP环化后，前体RNA的条带变弱，说明部分未环化前体RNA已变成CircRNA。
实施例4：在293T细胞中检测表达
（1）准备细胞。提前培养293T细胞，培养基使用DMEM高糖培养基+1%的双抗+10%胎牛血清，待细胞汇合度达到90%以上，使用胰酶将其处理为细胞悬液，并计数在12孔板中按照每孔3.5×105个细胞进行细胞铺板；
（2）脂质体CircRNA转染293T细胞。次日待细胞汇合度达到60%-70%，去除12孔板中的培养基，加入DMEM高糖培养基+10%胎牛血清，根据Lipofectamine™ MessengerMAX™（Invitrogen，美国）操作说明书进行细胞转染。5% CO2，37℃细胞培养箱，培养48h。
（3）细胞上清蛋白表达的检测
a、收集细胞上清。将细胞上清转入1.5mL离心管中，1500rpm，4℃离心5min，小心转移上清至新的离心管中。取40μL上清样品，加入10µl 5×Dual彩色蛋白装载缓冲液（colorprotein loading buffer），100℃处理15min使蛋白变性；
b、Western blot蛋白表达检测。根据12.5% ExpressCast PAGE彩色凝胶快速试剂盒（NCM Biotech，中国苏州）说明书配制聚丙烯酰胺凝胶，分离胶浓度为12.5%，上样量20µL，浓缩胶电泳条件为80V，30min；分离胶电泳条件为120V，60min。电转：使用聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），半干转印法在25V下转膜10min。封闭：使用5%脱脂牛奶（通过TBST配制）封闭1h。一抗孵育：使用5%脱脂牛奶将一抗DYKDDDDK tag Monoclonal antibody（Proteintech，中国武汉）以1:2000进行稀释，4℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次10min。二抗孵育：使用5%脱脂牛奶将二抗HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)以1:1000稀释，常温孵育1h。用TBST洗3次，每次10min。显影：显影液A液:B液按照1:1进行配制，使用ChemiDoc MP ImagingSystem（BIO-RAD）对PVDF膜进行显影，Western blot检测蛋白的表达情况如图6所示，三组样品circEndoWT、circEndo1和circEndo2均在34KD处出现条带，证明目的蛋白成功在细胞上清表达，蛋白大小符合预期，阴性对照组则未检测到蛋白表达。然后通过ImageJ对显影图像进行灰度分析，结果如表3图7所示，环状RNA circEndoWT编码的蛋白条带明显弱于优化组circEndo1和circEndo2，优化后的内溶素环状RNA序列的蛋白表达量明显提高，分别提高了5倍与3.8倍。
表3 Western Blot蛋白电泳条带的灰度统计值
| 名称 | 反应蛋白表达 |
| circEndoWT | 1 |
| circEndo1 | 5.02 |
| circEndo2 | 3.83 |
实施例5：抗菌活性检测
（1）根据NBCC提供的操作说明书对MRSA冻干粉进行复苏，活化。
a、准备1支含有5mL NB培养基的无菌摇菌管和2个NA平板；
b、安全柜中打开，用酒精灯灼烧顶部，后迅速滴上无菌水使之破裂，随后用镊子将其敲碎；
c、吸取0.5mL液体培养基打入冻干管，充分溶解后重新打回液体试管中，混匀；
d、吸取0.2mL菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板，剩余菌悬液加入含有5mL NB培养基的无菌摇菌管中；
e、将液体试管和平板全部置于37℃，好氧培养条件下培养过夜，待长出菌株；
f、最后将活化的细菌制作成40%甘油菌，-80℃保存。1:1000比例将细菌接种于NB培养基中，37℃培养至OD值达到0.1-0.08。
（2）抗菌活性检测
a、将OD值0.1~0.08的MRSA使用NB培养基稀释100倍；
b、96孔细胞培养板中加入50µL NB培养基；
c、处理组中加入50µL细胞上清样品，溶剂对照组中加入未做任何处理细胞上清，阴性对照仅有NB培养基；
d、除阴性对照外，向96孔板内加入50µL已准备好的MRSA菌液，37℃培养16-20h，使用酶标仪测定OD600值。处理数据时将处理组和溶剂对照组的OD值全部减去阴性对照组的OD值。结果如图8所示，每个数据组两个重复，溶剂对照组vehicle中MRSA的生长未受到抑制，过夜后OD值达到0.15左右，处理组中内溶素蛋白circEndoWT由于环状RNA编码的蛋白表达量较低，其与溶剂对照组vehicle相比并未出现抑制差异，而加入含有环状RNAcircEndo1 和circRNA2编码的内溶素蛋白的处理组中，OD值仅为0.07-0.09，对比溶剂对照组vehicle达到了极显著水平，明显抑制了MRSA的生长。
结果表明，经过本发明优化后的环状RNA 序列circEndo1和circEndo2，编码的内溶素蛋白在细胞中的表达量提高了3.8-5倍，且对MRSA的抑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌效果显著高于circEndoWT，抑菌效果与蛋白表达呈正相关。
Claims (13)
1.一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(a)，设计并制备线性DNA模板，所述线性DNA模板包括从5’至3’端按照以下顺序排列的元件：
5’-5’同源臂-3’Group I 内含子-3’外显子-内部核糖体进入位点-信号肽-编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列-5’外显子-5’Group I 内含子-3’同源臂-3’；
步骤(b)，纯化步骤(a)中制备的所述线性DNA模板；
步骤(c)，将步骤(b)中的所述线性DNA模板体外转录为RNA，体外转录的反应体系包括：线性DNA模板、T7聚合酶、RNase抑制剂、NTPs、无机焦磷酸酶和反应缓冲液；
步骤(d)，向步骤(c)的体系中加入DNase I并加热，以去除体外转录所得产物中的DNA；
步骤(e)，将步骤(d)的体系加热，以环化所述线性RNA，纯化反应物以得到环状RNA。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，其中所述内部核糖体进入位点为如SEQ ID NO:12所示的CVB3病毒IRES序列，其中所述信号肽为如SEQ ID NO:13所示的IGK信号肽。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中的条件为在50-60℃下处理8-60 min。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)是在Mg2+和GTP存在的情况下进行两次酯交换反应，以形成环状RNA。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(e)中的所述环化是通过将3’外显子和5’外显子连接，同时去除5’同源臂、3’Group I 内含子、5’Group I 内含子、3’同源臂元件来实现的。
7.一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性DNA，其特征在于，所述线性DNA包括从5’至3’端按照以下顺序排列的元件：
5’-5’同源臂-3’Group I 内含子-3’外显子-内部核糖体进入位点-信号肽-编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列-5’外显子-5’Group I内含子-3’同源臂-3’；
所述编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的序列选自：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；
其中所述内部核糖体进入位点为如SEQ ID NO:12所示的CVB3病毒IRES序列，其中所述信号肽为如SEQ ID NO:13所示的IGK信号肽。
8.一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性RNA，其特征在于，所述线性RNA是通过体外转录根据权利要求7所述的线性DNA制备得到的。
9.一种质粒表达载体，其特征在于，所述质粒表达载体用于制备根据权利要求7所述的编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性DNA或根据权利要求8所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的线性RNA。
10.一种用于编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的环状RNA，其特征在于，所述环状RNA是通过环化根据权利要求7所述的线性DNA制备得到的。
11.根据权利要求10所述的环状RNA在制备用于治疗或预防耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的药物中的用途。
12.一种用于表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的RNA序列，其特征在于，所述RNA序列包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的序列。
13.根据权利要求12所述的用于表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素的RNA序列，其特征在于，所述RNA序列为环化RNA序列或mRNA序列。
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