CN114324286B

CN114324286B - 一种光敏交联剂及其应用

Info

Publication number: CN114324286B
Application number: CN202210019398.8A
Authority: CN
Inventors: 秦伟捷; 刘彤; 陈永乐
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2042-01-07
Also published as: CN114324286A

Abstract

本发明涉及蛋白技术领域，具体涉及一种基于光敏交联剂的核酸‑蛋白复合物的交联、规模化富集鉴定和成像应用和方法。本发明方法针对动物组织无需经254nm紫外照射，能够在365nm紫外光照射下直接固定组织中核酸‑蛋白复合物，进而用于交联、规模化富集鉴定以及成像分析。本发明具有特异性强、反应效率高、稳定性好、周期短、规模大以及应用范围广等诸多优势。

Description

一种光敏交联剂及其应用

技术领域

本发明属于蛋白技术领域，具体涉及一种新型光敏交联剂以及基于光敏交联剂的核酸-蛋白复合物的交联、规模化富集、鉴定以及成像中应用。

技术背景

RNA作为遗传信息传递的中间体，通常与蛋白质相互作用形成动态的核糖核蛋白复合物(Ribonucleoproteincomplexes，RNPs)，以此来执行生物学功能，这其中的蛋白质称为RNA结合蛋白(RNA Binding Proteins，RBPs)。RBPs参与了转录后调控的各种生理进程，包括mRNA的剪接、切割、聚腺苷酸化、加帽、RNA稳定性、RNA定位、RNA编辑、翻译、核外输送和降解，控制着RNA生命周期的各个阶段，决定相应RNA的命运与功能。各种独立的RNA-蛋白质相互作用错综繁复，最终形成了庞大的RNA-蛋白质复合物网络，协调复杂的细胞过程。RNA或者RBPs任一组分表达改变或者两者组装异常都可能改变RNPs的功能，从而导致疾病的发生。RBPs的异常或缺失是多种疾病发生发展的根源，引起细胞功能障碍，包括代谢紊乱、肌肉萎缩性神经系统疾病、自身免疫性疾病和癌症。解密RBPs及其与癌症相关的RNA靶标之间的复杂相互作用网络将为肿瘤生物学提供更好的理解，由此RBPs也成为了潜在的疾病诊断标志物和治疗靶标研究的重要生物分子。因此系统的研究RNA-蛋白质的相互作用可以加深对多种生物学进程的理解，鉴定和定量RBPs有助于深入挖掘其在调节基本细胞功能及疾病发生发展中的作用，为疾病诊断标志物及靶向治疗方法的探索指明新的方向。

然而RNA-蛋白相互作用的高度动态性、相互作用网络的复杂性以及RNA的不稳定性使得RNPs的研究极具挑战性。为此研究者们开发了多种不同的RNA-蛋白质复合物的大规模富集鉴定方法，包括：基于poly(A)的mRNPs富集鉴定方法；基于非天然核苷酸类似物代谢标记的新合成RNPs富集鉴定方法；基于有机相和水相分离的RNPs富集鉴定方法，广泛用于RNA-蛋白相互作用的规模化研究。其中由于RNA-蛋白质复合物间为弱相互作用，在这些方法中首先要通过交联稳定RNA-蛋白质相互作用。254nm紫外交联是目前交联的“金标准”方法，其可以零距离的“冻结”活细胞中天然存在的RNPs，形成共价稳定的复合物进行后续鉴定。虽然254nm UV交联是目前研究RNPs的重要工具，但也存在一定的局限性：一方面紫外交联的效率很低，最多只有5％的RBPs可以与RNA交联形成共价键。为此研究者使用光活性核苷代谢标记替代天然核苷酸来提高交联效率，但核苷代谢标记本身也存在取代率低的缺点，同时会对细胞的生理状态产生扰动。另一方面，254nm紫外光在组织及浑浊的培养液等介质中的穿透能力很差，所以在这些介质中的交联效率会更低。因此目前基于254nm UV交联技术的RBPs富集鉴定工作，其所用的研究对象仅限于体外培养的细胞(一般为单层细胞)和微小动植物(如果蝇合子、秀丽隐杆线虫、斑马鱼合子、植物拟南芥等)，尚无直接在哺乳动物组织中RBPs的规模化富集鉴定应用。

虽然可以通过冷冻切片的方式得到微小组织片后使用254nm交联后富集鉴定，但这无疑会大幅度增加实验的工作量和工作时长，这并不利于哺乳动物组织中RNPs的富集鉴定。到目前为止，在人源细胞中已经发现上千种RBPs，同时发现了大量与疾病相关的RBPs，如QKI是肺癌中选择性剪接的关键调控因子，其在肺癌中下调且与不良预后显著相关。相较于细胞水平的研究，直接在疾病相关的组织上研究可以更加直观准确的发现疾病与RBPs间的关联。因此迫切需要发展一种更为高效的交联技术，替代原有的254nm交联，为哺乳动物组织样品中核酸-蛋白交联及RBPs的规模化富集鉴定铺路。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的核心目的是寻求一种替代254nm交联、能够在哺乳动物组织中进行核酸-蛋白交联及RBPs富集鉴定的光敏交联剂。通过简单的化学反应制备得到光敏交联剂，利用该光敏交联剂结合365nm紫外照射固定哺乳动物组织中天然存在的核酸-蛋白复合物，最终通过蛋白质组学鉴定实现哺乳动物组织中RBPs种类的解析。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

本发明首先提供一种光敏交联剂，所述光敏交联剂包含：偶联RNA的7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮基团、交联蛋白的二苯甲酮基团；

进一步的，所述光敏交联剂还包含用于引入荧光基团进行表征的炔基以及连接三个基团的连接臂。

进一步的，所述光敏交联剂结构式如式Ⅰ所示：

其中，所述n为3-5之间的任意自然数；

本发明提供一种组合物或复合物，其特征在于，所述组合物或复合物包含或连接有上述光敏交联剂。

本发明进一步提供所述光敏交联剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)式Ⅱ所示聚合物与式Ⅲ所示化合物经亲核取代反应得到式Ⅳ所示化合物；

式Ⅱ中，n为3-5之间的任意自然数；

(2)式Ⅳ所示化合物与三氟乙酸经脱保护反应得到式Ⅴ所示化合物；

(3)式Ⅴ所示化合物与式Ⅵ所示化合物经亲核取代反应得到式Ⅶ所示化合物；

(4)式Ⅶ所示化合物与式Ⅷ所示化合物经酰胺化反应得到式Ⅸ所示化合物；

(5)式Ⅸ所示化合物与式Ⅹ所示化合物经加成反应得到式Ⅰ所示化合物。

进一步的，上述的制备方法，步骤(1)中，所述式Ⅱ所示聚合物与式Ⅲ所示化合物的投料摩尔比可为1：1～1：2，具体可为1：2。

所述亲核取代反应在三乙胺(TEA)作为缚酸剂的条件下进行；所述三乙胺与式II所示化合物投料摩尔比为1：0.5～1：1.5，具体可为1：1。

所述亲核取代反应的温度可为20～25℃，具体可为25℃，时间可为8-12小时，具体为10小时。

所述亲核取代反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷(DCM)。

进一步的，上述的制备方法，步骤(2)中，所述三氟乙酸与有机溶剂的投料体积比为1:1～1:2，具体可为1:1。

所述脱保护反应的温度可为20～25℃，具体可为25℃；时间可为2-10小时，具体可为6小时。

所述脱保护反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂具体可为二氯甲烷(DCM)。

所述脱保护反应的具体步骤如下：将式Ⅳ溶于有机溶剂中，缓慢滴加三氟乙酸即可完成所述脱保护反应。

进一步的，上述的制备方法，步骤(3)中，所述式Ⅴ所示化合物与式Ⅵ所示化合物的投料摩尔比可为1：0.5～1：1，具体可为1：0.5。

所述亲核取代反应在三乙胺(TEA)作为缚酸剂的条件下进行；所述三乙胺与式Ⅵ所示化合物投料摩尔比为1：0.5～1：1.5，具体可为1：1。

所述亲核取代反应的温度可为20～25℃，具体可为25℃，时间可为8～12小时，具体为10小时。

进一步的，上述的制备方法，步骤(4)中，所述式Ⅶ所示化合物与式Ⅷ所示化合物的投料摩尔比可为1：1～1：2，具体可为1：2。

所述Ⅶ所示化合物与NHS、EDC的摩尔比可为1：1：1～1：10：10，具体可为1：10：10。

所述酰胺化反应在三乙胺(TEA)作为缚酸剂的条件下进行；所述三乙胺与式Ⅶ所示化合物投料摩尔比为1：0.5～1：1.5，具体可为1：1。

所述氨基-羧基酰胺化反应的温度可为20～25℃，具体可为25℃；时间可为8～12小时，具体可为10小时。

所述酰胺化反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷(DCM)。

进一步的，上述的制备方法，步骤(5)中，所述式Ⅸ所示化合物与式Ⅹ所示化合物的投料摩尔比可为1：1～1：1.5，具体可为1：1.5。

所述加成反应的温度可为20～25℃，具体可为25℃；时间可为8～12小时，具体可为10小时。

所述加成反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷(DCM)。

本发明进一步提供了上述式Ⅰ所示光敏交联剂在标记细胞内核酸-蛋白复合物的成像中的应用。

一种利用上述式Ⅰ所示光敏交联剂标记细胞内核酸的成像方法。其通过式Ⅰ所示光敏交联剂中的7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮和二苯甲酮在长波长紫外照射下固定细胞中天然存在的核酸及其结合蛋白，同时利用式Ⅰ所示光敏交联剂中的炔基通过点击化学引入荧光基团后进行成像分析。

所述方法的具体步骤如下：

式Ⅰ所示光敏交联剂与细胞孵育进行化学标记，长波长紫外光照处理形成共价交联；固定并通透细胞后，加入点击化学反应液进行点击化学引入荧光基团；最后使用激光扫描共聚焦显微镜成像分析。

进一步的，所述化学标记步骤中，所述式Ⅰ所示光敏交联剂的浓度可为50～400μM，具体可为150μM；孵育时间为20～30min，具体可为30min。所述长波长紫外光的波长可为320～410nm，具体可为365nm；紫外交联功率为100W，照射时间为1～4min，具体可为3min。

进一步的，所述固定并通透细胞中，固定细胞使用多聚甲醛，浓度为4％，时间为10～30min，具体可为30min，温度为22～25℃，具体可为25℃；通透细胞使用Triton X-100，浓度为0.25％～0.5％，具体可为0.5％，时间为10～30min，具体可为30min，温度为22～25℃，具体可为25℃。点击化学反应液具体组成如下：10μM Cy5-N₃，0.5mM硫酸铜，5mM THPTA以及现配的5mM抗坏血酸钠，时间为0.5～2h，具体可为0.5h，温度为22～25℃，具体可为25℃。

本发明进一步提供了上述式Ⅰ所示光敏交联剂在哺乳动物组织中核酸-蛋白交联及RBPs规模化富集和鉴定中的应用。

一种利用上述式Ⅰ所示光敏交联剂在哺乳动物组织中核酸-蛋白交联及RBPs规模化富集和鉴定的方法。其通过式Ⅰ所示光敏交联剂中的7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮和二苯甲酮在长波长紫外照射下固定哺乳动物组织中天然存在的核酸及其结合蛋白；同时引入生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针，对哺乳动物组织中核酸-蛋白复合物进行富集；最后使用RNase洗脱释放RBPs进行质谱鉴定，实现哺乳动物组织中RBPs的种类解析。

所述方法的具体步骤如下：

(1)哺乳动物组织切成合适大小；

(2)将式Ⅰ所示光敏交联剂及生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针与哺乳动物组织孵育进行化学标记，然后长波长紫外光照处理形成共价交联，哺乳动物组织裂解后使用链霉亲和素修饰的磁珠富集，清洗磁珠上的非特异性吸附得到纯净的核酸-蛋白复合物；

(3)通过RNase洗脱释放得到哺乳动物组织中的RBPs，可以进行十二烷基硫酸钠-PAGE表征，也可以进行RBPs的蛋白质组学鉴定。

进一步的，步骤(1)中，所述哺乳动物组织通过灌注得到并使用手术刀切割成合适大小；

所述具体步骤如下：通过腹腔注射1％戊巴比妥钠(生理盐水溶解)麻醉小鼠；剪开小鼠腹腔，从门静脉小心插入留置针，待有回血后，用剪刀剪开下腔静脉，预热的PBS以合适的流速进行灌注，灌注过程中按压下腔静脉以使肝脏充盈，重复几次直至肝脏中没有血液，剪下肝脏并去除胆囊，剪成合适大小。

所述灌注步骤中的流速可为3500～4000μL/min，具体可为4000μL/min；所述组织可为小鼠各个组织，具体可为肝脏和脑；所述合适大小的组织可为1mm*1mm～5mm*5mm，具体可为3mm*3mm。

进一步的，步骤(2)中，所述化学标记步骤中，7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮与核酸上的嘧啶类碱基在长波长紫外光下发生环加成反应，二苯甲酮在长波长紫外光下可与蛋白质上的氨基酸残基共价偶联，使式Ⅰ所示光敏交联剂固定核酸-蛋白复合物；同时生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针也被引入到核酸上；最终利用链霉亲和素和生物素间的强相互作用富集得到哺乳动物组织中的核酸-蛋白复合物。

所述化学标记步骤中，所述式Ⅰ所示光敏交联剂的浓度可为50～400μM，具体可为150μM；孵育时间为20～30min，具体可为30min。生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针的浓度可为5～200μM，具体可为15μM；孵育时间为20～30min，具体可为30min。所述长波长紫外光的波长可为320～410nm，具体可为365nm；紫外交联功率为100W，照射时间为1～4min，具体可为3min。

所述富集的时间可为1～2小时，具体可为1.5小时。

所述富集温度为4～16℃，具体可为4℃。

进一步的，步骤(3)中，所述RNase可为RNase A或者RNase T，具体可为RNase A。RNase酶解温度为37℃，时间为30～60min，具体可为60min。

本发明提供的基于光敏交联剂用于哺乳动物组织中核酸-蛋白复合物的交联及RBPs的富集和鉴定基于如下原理：使用光敏交联剂进行化学标记时，一端的7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮首先插入到核酸的嘧啶类碱基中，然后在长波长紫外光照射下可通过环加成反应与核酸上嘧啶类碱基的吡啶基团形成共价键，另一端的二苯甲酮同样在长波长紫外照射下可被光激发出双自由基与蛋白质上的氨基酸残基共价偶联从而交联核酸及其结合蛋白，同时生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针也引入到核酸上，利用生物素与链霉亲和素磁珠间的强相互作用，对哺乳动物组织中所有核酸-蛋白复合物进行富集。最终使用RNase酶解释放得到RBPs进行质谱鉴定，从而获得哺乳动物RBPs的种类和定量信息。此富集技术使用光敏交联剂及365nm紫外照射代替254nm进行交联(过程中完全无需254nm照射)，因365nm紫外光穿透能力明显强于254nm，因而更适合用于哺乳动物组织中RBPs的规模化富集鉴定。

本发明有益技术效果：

1)相较于早先技术，本发明在哺乳动物组织RBPs的富集鉴定应用中，无需经254nm交联，其具有着极其显著的技术优势：一方面，在时间周期上，早先技术需通过冷冻切片的方式得到微小组织片后使用254nm交联后对RBPs富集鉴定，无疑会大幅度增加实验的工作量和工作时长，考虑到RNA不稳定且易被无处不在的RNase降解，实验的工作时长越长，RNA降解的可能性就越高，不利于RBPs的富集鉴定，而本发明实现了直接在哺乳动物组织上对核酸-蛋白复合物进行交联，实验周期显著缩短，有利于哺乳动物组织中RBPs的富集鉴定；另一方面，在鉴定规模上，从小鼠肝脏RBPs的鉴定结果上发现，本发明提供的方法鉴定规模明显优于早先技术。

2)本发明的光敏交联剂一端的7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮可以与核酸共价交联，一端的二苯甲酮可与蛋白质共价交联，同时又修饰了可以通过点击化学引入荧光基团的炔基基团，既可以用来固定核酸-蛋白复合物，为后续哺乳动物组织中RBPs的规模化富集鉴定打下基础；也可以用于核酸-蛋白复合物的成像分析。

3)本发明的光敏交联剂在365nm紫外光照射下固定核酸-蛋白复合物，代替原有的254nm紫外交联，因365nm紫外光穿透能力明显强于254nm，所以可以直接应用于哺乳动物组织中核酸-蛋白复合物的固定，同时与甲醛交联相比不存在蛋白-蛋白交联的污染，特异性强。

4)本发明的光敏交联剂固定核酸-蛋白复合物的原理是基于7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮在长波长紫外光照射下通过环加成反应与核酸上嘧啶类碱基的吡啶基团形成共价键，二苯甲酮在长波长紫外照射下被光激发出双自基与蛋白质上的氨基酸残基共价偶联；这两类反应的特异性及反应效率高且稳定性强。

5)本发明首次实现直接在哺乳动物组织中RBPs规模化富集鉴定。本发明的光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针可以实现哺乳动物组织中核酸-蛋白复合物的富集，再使用RNase洗脱释放RBPs可对RBPs进行种类解析；之前的研究只能针对微小透明组织中RBPs的规模化富集鉴定，而本方法可以直接在哺乳动物组织上固定核酸-蛋白复合物并实现其中RBPs的规模化富集鉴定。

6)本发明的哺乳动物组织中RBPs的规模化富集鉴定，利用7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮与嘧啶类碱基的共价交联，可以实现所有种类RNA(编码RNA及非编码RNA)结合蛋白的富集鉴定，具有广谱性，同时使用化学标记代替代谢标记，应用范围广，标记效率高，使用RNase处理释放RBPs，特异性高。

附图说明

图1为本发明所述光敏交联剂的合成路线图。

图2为本发明所述光敏交联剂合成过程中涉及到每一步产物的核磁共振氢谱。

图3光敏交联剂标记细胞中核酸-蛋白复合物的荧光共聚焦显微成像照片。

图4A.光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针偶联同一条RNA的实验路线图；图4B.流式细胞仪分析磁珠上荧光RNA的荧光迁移；图4C.流式细胞仪分析磁珠上荧光RNA的荧光强度(n＝3)。

图5.光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针用于小鼠组织中RBPs规模化富集鉴定流程。

图6A.光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针用于小鼠大脑组织中RBPs的十二烷基硫酸钠-PAGE凝胶电泳表征；图6B光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针用于小鼠肝脏组织中RBPs的十二烷基硫酸钠-PAGE凝胶电泳表征。

图7A RNase处理对小鼠脑组织中富集产物的电泳表征；图7B RNase处理对小鼠肝脏组织中富集产物的电泳表征

图8定量差异蛋白质组策略鉴定哺乳动物组织中RBPs的实验流程

图9A小鼠脑组织中鉴定蛋白散点图；图9B小鼠肝脏组织鉴定蛋白散点图

图10A小鼠脑组织中鉴定RBPs的相关性分析，图10B小鼠肝脏组织中鉴定RBPs的相关性分析

图11A小鼠脑组织中鉴定RBPs的基因注释，图11B小鼠肝脏组织中鉴定RBPs的基因注释。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

部分术语定义

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

以上术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

下面结合具体实施例来阐述本发明。

下述实施例中所用试剂尽可能使用RNase-free的溶液，或者使用RNase-free的溶剂(如DEPC处理的水)配制，所使用的材料尽可能使用RNase-free规格，或者使用DEPC处理；如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、光敏交联剂的合成与核磁表征

1、合成

按照图1所示合成路线制备光敏交联剂，具体步骤如下

1)称取10mg的SH-PEG-NHS，溶于1mL二氯甲烷，以摩尔比SH-PEG-NHS：Boc-D-赖氨酸＝1:2加入Boc-D-赖氨酸，超声使Boc-D-赖氨酸成为更细小的颗粒，同时加入50μL三乙胺维持碱性环境，室温旋转反应过夜。反应完成后，加入500μL 1M盐酸进行萃取去除未反应的Boc-D-赖氨酸，重复两次，最终得到的二氯甲烷层使用氮气吹干，得到SH-PEG-Lys-Boc。

2)二氯甲烷与三氟乙酸按体积比1:1混合后溶解SH-PEG-Lys-Boc，室温旋转反应过夜。反应完成后氮气吹干，溶剂体积降为一半后将三氟乙酸旋转热干，得到SH-PEG-Lys-NH₂。

3)得到的SH-PEG-Lys-NH₂与NHS-7H-Furo[3,2-g]benzopyran-7-one按照摩尔比1:0.8溶于1mL二氯甲烷中，同时加入50μL三乙胺作为缚酸剂，避光室温旋转反应过夜。反应完成后，加入500μL 1M盐酸进行萃取去除未反应的SH-PEG-Lys-NH₂，重复两次，最终得到的二氯甲烷层使用氮气吹干，得到SH-PEG-Lys-7H-Furo[3,2-g]benzopyran-7-one。

4)SH-PEG-Lys-7H-Furo[3,2-g]benzopyran-7-one溶于1mL二氯甲烷中，按摩尔比SH-PEG-Lys-7H-Furo[3,2-g]benzopyran-7-one：EDC:NHS＝1:10:10称取一定量的EDC和NHS，加入混匀，然后称取过量的炔丙基胺加入，同时加入50μL三乙胺作为缚酸剂，避光室温旋转反应过夜。反应完成后，加入500μL 1M盐酸进行萃取去除未反应的炔丙基胺，重复两次，最终得到的二氯甲烷层使用氮气吹干，得到SH-PEG-7H-Furo[3,2-g]benzopyran-7-one-炔基。

5)SH-PEG-7H-Furo[3,2-g]benzopyran-7-one-炔基与马来酰亚胺-二苯甲酮按照摩尔比1:1.5溶于1mL二氯甲烷中，避光室温旋转反应10h，反应完成后使用氮气吹干，得到所述光敏交联剂(所述式Ⅰ)，使用二甲基亚砜溶解为50mM，-20℃保存备用。

2、核磁表征

对所制备的光敏交联剂合成过程中涉及到的每一步产物进行核磁共振氢谱分析，所得结果如图2。图2A是所述式Ⅳ的核磁共振氢谱表征：¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ5.32(s,1H；CONH)，4.24(s,1H；NHCH)，3.68(d,18H；OCH₂)，3.22(s,2H,NHCH₂)，2.72(q,1H,SHCH₂)，1.82-1.62(s,2H；CH₂)，1.47(q,4H；CH₂)，1.04(d,2H；CH₂)，0.86(t,9H；CH₃)；图2B是所述式Ⅴ的核磁共振氢谱表征：¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.15(s,1H；CONH)，4.53(d,2H；COCH₂)，3.84(s,2H；NHCH)，3.71(d,18H,OCH₂)，3.30(dd,2H,NH₂CH₂)，2.75(d,2H,SHCH₂)，1.31(d,6H；CH₂)，0.85(t,9H；CH₃)；图2C是所述Ⅶ的核磁共振氢谱表征：¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.76(m,2H；CH₂＝CH)，7.40(d,1H；CH₂＝CH)，6.84(t,1H；CH₂＝CH)，6.39(d,1H；CH₂＝CH)，5.32(d,1H；CONH)，4.99(s,1H；CONH)，4.56(m,3H；COCH₂,CHCOOH)，4.22(s,2H；OCH₂)，3.66(d,18H,OCH₂)，3.11(d,2H；NHCH₂)，2.75(m,2H；SHCH₂)，2.26(m,4H；CH₂)，1.55(m,2H；CH₂)，1.39-1.31(m,4H；CH₂)；图2D是所述式Ⅸ的核磁共振氢谱表征：¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.76(m,2H；CH₂＝CH)，7.43(d,1H；CH₂＝CH)，6.85(t,1H；CH₂＝CH)，6.41(d,1H；CH₂＝CH)，5.32(d,1H；CONH)，4.47(s,1H；CONH)，4.21(m,1H；COCH)，4.07(d,2H；OCH₂)，3.74(s,1H；C≡CH)，3.66(d,18H,OCH₂)，2.93(d,2H；NHCH₂)，2.73(m,2H；SHCH₂)，2.17(m,4H；CH₂)，1.87(m,2H；CH₂)，1.35-1.29(m,4H；CH₂)；图2E是所述光敏交联剂(所述式Ⅰ)的核磁共振氢谱表征：¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.93～7.83(m,6H；CH₂＝CH)，7.56(m,9H；Ar-H)，6.85(t,1H；CH₂＝CH)，6.41(d,1H；CH₂＝CH)，4.44(t,1H；CONH)，4.21(s,1H；CONH)，4.07(d,1H；COCH)，3.74(s,1H；C≡CH)，3.66(d,18H,OCH₂)，3.13(d,2H；NHCH₂)，2.73(m,2H；SHCH₂)，2.22(d,m,4H；CH₂)，2.08(q,2H；CH₂)，1.29～1.08(m,4H；CH₂)。上述结果表明所述光敏交联剂成功合成。

实施例2、光敏交联剂标记细胞内核酸-蛋白复合物的成像分析

采用实施例1中制备得到的光敏交联剂对细胞中的核酸-蛋白复合物进行化学标记并荧光成像。具体步骤如下：

取合适密度的HeLa细胞接种于20mm玻底培养皿中，37℃培养箱培养，当密度为70％～80％后用PBS清洗，接着加入200μM光敏交联剂于4℃孵育30min，365nm紫外交联；PBS清洗细胞3次，加入4％多聚甲醛(PBS稀释)室温固定30min，0.5％Triton X-100(PBS稀释)室温通透30min；细胞接着使用PBS清洗3次，加入点击化学反应液(10μM Cy5-N₃，0.5mM硫酸铜，5mM THPTA以及现配的5mM抗坏血酸钠)，室温点击化学30min以引入荧光基团；PBS清洗细胞3次后加入10μL Hoechst继续室温标记10min以定位细胞核；最后PBS清洗3次后使用激光扫描共聚焦显微镜成像。所得结果如图3。从图中发现随着光敏交联剂浓度的增加，对应荧光强度也逐渐增强，说明光敏交联剂可以成功进入细胞，同时实现细胞核和细胞质中核酸-蛋白复合物的标记，且信号强度随着光敏交联剂浓度的增加而增强，说明光敏交联剂的标记是浓度依赖的。

实施例3、光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针标记同一条RNA的评价

按照图4A所示流程图采用实施例1中制备得到的光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针标记同一条RNA，具体步骤如下：

(1)提取RNA：

使用商业化试剂盒按照说明书提取RNA，具体可为miRNeasy Micro Kit。具体步骤如下：

10cm培养皿细胞中加入700μL QIAzol Lysis，反复吹打，涡旋1min使细胞充分裂解，室温放置5min，再加140μL氯仿，剧烈振荡15s后室温放置2min；4℃、12000g离心15min，将上层水相(约350μL)移到一个新的RNase-free离心管中，加入1.5倍体积的100％乙醇，上下颠倒混匀；将所得溶液全部加入到吸附柱(Spin Column)上，轻关盖子，室温8000g离心15s，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管上；加入700μl RWT，8000g室温离心15s，再500μL80％乙醇(RNase-free Water配制)，8000g室温离心15s，小心将吸附柱转至新的离心管中，不要碰到管中液体，开盖最大转速离心5min使膜干燥，将吸附柱换到一个新的无RNase的离心管中，向吸附柱的中间部位加入14μl RNase-free Water，轻关盖子室温最大转速离心1min洗脱RNA，最终得到12μl RNA溶液，使用Nanodrop进行定量并进行质检，-80℃保存备用。

(2)使用实施例1中制备得到的光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针标记同一条RNA，具体步骤如下：

分别取100μg RNA进行标记，光敏交联剂和生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针加入(标为实验组)，同时设置4组对照组：空白对照(不加任何标记试剂，标为空白)，只标记光敏交联剂的RNA(标为光敏交联剂)，只标记生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针的RNA(标为生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针)以及只标记光敏交联剂的RNA和只标记生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针的RNA按照1:1混合(标为混合)。4℃孵育30min，365nm紫外交联，使用miRNeasy Micro Kit进一步纯化得到的RNA分别进行点击化学反应，配制点击化学反应液(在200μL Tris-HCl(20mM,pH7.5)体系中加入100μM Cy5-N₃，0.5mM硫酸铜，2mM THPTA以及现配的5mM抗坏血酸钠)，4℃反应100min，每管中加入5μL链霉亲和素磁珠，4℃富集1h；磁珠使用高盐清洗液[Tris-HCl(20mM,pH7.5)，1M氯化钠，10mM EDTA，0.1％Tween-20]清洗2次，Tris-HCl清洗2次；最后使用流式细胞仪检测磁珠上所带荧光信号。

所得结果如图4B和C，光敏交联剂和生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针同时偶联的RNA相较于其他4组对照有着明显的荧光迁移，且信号强度显著高于其他4组对照，由此说明了一条RNA上可以同时偶联光敏交联剂和生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针。

实施例4、光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针对哺乳动物组织中RBPs的富集鉴定

按照图5所示流程图采用实施例1中制备得到的光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针对哺乳动物组织中RBPs进行富集鉴定，具体步骤如下：

(1)小鼠组织提取，以小鼠肝脏和脑组织为例：

按照40mg/kg体重通过腹腔注射1％戊巴比妥钠(生理盐水溶解)麻醉C57BL/6雄性6～8周龄小鼠；剪开小鼠腹腔，从门静脉小心插入留置针，待有回血后，用剪刀剪开下腔静脉，预热的PBS以4000μL/min的流速进行灌注，灌注过程中按压下腔静脉以使肝脏充盈，重复几次直至肝脏中没有血液，剪下肝脏并去除胆囊，-80℃保存备用；同时取出小鼠脑组织迅速液氮冷冻后-80℃保存备用。

(2)光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针富集哺乳动物组织中的RBPs：

得到小鼠肝脏和大脑组织，使用手术剪将组织剪成3mm*3mm大小分别放到24孔板中，加入含有150μM光敏交联剂和15μM生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针的500μL DMEM(无血清，含有0.01％洋地黄皂苷)，37℃培养箱中孵育5min，4℃避光继续孵育30min；将孵育液吸干后，冰上365nm交联3min，接着将哺乳动物组织转移至带有研磨球的离心管中，加入500μL裂解液[Tris-HCl(20mM,pH 7.5)、500mM氯化锂、1mM EDTA、5mM二硫苏糖醇、0.5％十二烷基硫酸锂、RNA酶抑制剂及无EDTA的蛋白酶抑制剂]，使用组织研磨仪4℃研磨1min，上清转移至1.5mL RNase-free离心管中，加入80μL预清洗的磁珠(预清洗步骤如下：先使用solution A(0.1M氢氧化钠，0.05M氯化钠，DEPC处理的水配制)清洗磁珠2次，再用solution B(0.1M氯化钠，DEPC处理的水配制)清洗磁珠3次，最后80μL Tris-HCl重悬磁珠)，4℃富集90min。富集完成后磁珠分别使用200μL含有0.2％十二烷基硫酸钠的PBS溶液清洗2次，200μL含有6M尿素的PBS溶液洗涤2次，200μL PBS清洗2次，200μL 50mM碳酸氢钠水溶液洗涤2次以去除非特异性吸附得到纯净的核酸蛋白复合物；最后加入20μL 0.01μg/μLRNase A溶液在37℃孵育1h洗脱释放得到RBPs。

(3)RBPs的十二烷基硫酸钠-PAGE凝胶电泳表征：

得到20μL的RBPs溶液，同时收集组织裂解液稀释合适浓度作为全组织裂解液，两者均加入5×蛋白质十二烷基硫酸钠-PAGE上样缓冲液及β-巯基乙醇混合，95℃变性10min。取20μL上样至10％十二烷基硫酸钠-PAGE凝胶中，80V恒压20min，电压升至120V后电泳至指示剂溴酚蓝到达凝胶下端后停止电泳。将凝胶转入培养皿中使用银染试剂盒按照说明书进行银染检测，具体步骤如下：1.水洗：使用超纯水洗胶2次，每次5min；2.固定：用25mL固定液(超纯水：乙醇：冰醋酸＝6:3:1)固定凝胶2次，每次固定15min；3.洗脱：用洗脱液(10％乙醇)洗胶2次，5min/次；4.水洗：超纯水洗胶2次，5min/次；5.增敏：将上一步洗好的凝胶置于银染增敏工作液(50μL Silver Stain Sensitizer与25mL超纯水混合)中，室温准确孵育1min后用超纯水洗胶3次，20s/次；6.银染：弃去超纯水，将凝胶置于银染工作液(25mLSilver Stain加入50μL Silver Stain Enhancer混匀)孵育30min；7.水洗：用超纯水快速洗胶2次，每次洗涤准确控制为20s；8.显影：立即将洗好的凝胶浸没在显影液(25mL SilverStain Developer加入30μL Silver Stain Enhancer混匀)中，室温孵育，直至蛋白条带显示清晰；9.终止：用终止液(5％冰醋酸)洗去凝胶上的显影后，将凝胶浸泡在新的终止液中反应10min。

为了排除非特异性吸附的影响，添加了三组对照实验，分别是不使用光敏交联剂、不引入生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针、无365nm紫外光照，并使用全组织裂解液作为参照，银染结果如图6，其中图6A为小鼠脑组织中RBPs的富集鉴定结果，图6B为小鼠肝脏组织中RBPs的富集鉴定结果。从胶图中明显看出光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针并使用365nm紫外处理后才有蛋白条带；不引入光敏交联剂无法固定RNA与蛋白的相互作用，RBPs无法耐受后续严格的洗涤，从而蛋白条带减弱或者消失；不引入生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针就没有可以用来富集的把手，此时蛋白条带减弱或者消失；同样不引入365nm紫外光照，7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮与核酸的嘧啶碱基之间只能以非共价形式连接，二苯甲酮也无法与蛋白形成共价键，后续经过严格的清洗处理，结合蛋白会同非特异性吸附蛋白一起被去除，因此蛋白条带也减弱或者消失；只有当光敏交联剂在365nm紫外光照下交联了RNA与RBPs，同时生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针也共价偶联到RNA上提供富集把手后，才可以得到清晰的蛋白条带；结果表明光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针可以用于富集小鼠组织中的RBPs，且具有很好的选择性，同时证明了此方法依靠三个条件：光敏交联剂、生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针及365nm紫外辐射实现富集，三者缺一不可。

按照实施例4得到偶联了光敏交联剂和生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针组织裂解液，将裂解液平均分成2份，一份使用磁珠进行富集，一份先使用高浓度的RNase于37℃酶解1h后再使用磁珠富集，接着分别使用200μL含有0.2％十二烷基硫酸钠的PBS溶液清洗2次，200μL含有6M尿素的PBS溶液洗涤2次，200μL PBS清洗2次，200μL50mM碳酸氢钠水溶液洗涤2次以去除非特异性吸附得到纯净的核酸蛋白复合物；最后加入20μL 0.01μg/μL RNase A溶液在37℃孵育1h洗脱释放得到RBPs。得到的RBPs溶液进行十二烷基硫酸钠-PAGE凝胶电泳及银染表征。

结果如图7，其中图7A为小鼠脑组织中富集产物的鉴定结果，图7B为小鼠肝脏组织中富集产物的结果。从胶图中看到，在RNase处理后再进行富集，蛋白条带就消失了，进一步说明了富集到的蛋白是依赖于RNA富集出来的，且是与RNA直接相关的。

实施例5、光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针规模化富集哺乳动物组织中RBPs的蛋白质组学鉴定

按照图5所示流程图采用实施例1中制备得到的光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针对哺乳动物组织中核酸蛋白复合物进行富集，再按照图8所示流程图解析哺乳动物组织中的RBPs。具体步骤如下：

(1)按照实施例4中所述小鼠组织提取方法，得到小鼠的肝脏和脑组织，迅速液氮冷冻后-80℃保存备用。

(2)按照实施例4中所述光敏交联剂联合生物素类7H-糖醛[3,2-g]苯并吡喃-7-酮探针化学标记哺乳动物组织中核酸-蛋白复合物、裂解及富集的策略，得到富集产物：核酸-蛋白复合物的磁珠；

(3)接着按照图8所示流程图解析哺乳动物组织中的RBPs

得到的核酸-蛋白复合物的磁珠分为实验组和对照组，具体步骤如下：

实验组：磁珠分别使用200μL含有0.2％十二烷基硫酸钠的PBS溶液清洗2次，200μL含有6M尿素的PBS溶液洗涤2次，200μL PBS清洗2次，200μL 50mM碳酸氢钠水溶液洗涤2次以去除非特异性吸附得到纯净的核酸蛋白复合物；最后加入20μL 0.01μg/μL RNase A溶液在37℃孵育1h。

对照组：磁珠先使用0.1μg/μL RNase A溶液在37℃孵育1h酶解RNA，通过磁性分离去除上清，再依次使用200μL含有0.2％十二烷基硫酸钠的PBS溶液清洗2次，200μL含有6M尿素的PBS溶液洗涤2次，200μL PBS清洗2次，200μL 50mM碳酸氢钠水溶液清洗2次，最后加入含有20μL 0.01μg/μL RNase A溶液重悬磁珠。

(4)胰蛋白酶解及二甲基化标记定量，具体步骤如下：实验组和对照组分别再加入80μL碳酸氢钠溶液，加入终浓度为10mM二硫苏糖醇56℃还原45min，冷却至室温后加入终浓度是20mM碘乙酰胺避光反应45min；加入0.02μg胰蛋白酶，37℃酶切12h,再加入相同质量的胰蛋白酶，37℃继续酶切4h。酶切完成后通过磁性分离回收含有酶解产物肽段的上清液，使用StageTip C₁₈脱盐，步骤如下：使用三层C18膜自制C₁₈脱盐柱，C₁₈脱盐柱依次使用乙腈、含有0.1％三氟乙酸的50％乙腈及0.1％三氟乙酸活化平衡；接着将混合后的样本加入脱盐柱使肽段保留至柱子中，用0.1％三氟乙酸将脱盐柱上的盐分去除，最后使用含有0.1％三氟乙酸的50％乙腈洗脱肽段至新的离心管中，使用真空旋转干燥仪浓缩热干。

热干后的肽段进行二甲基化标记，首先肽段分别重溶于200μL 100mM TEAB缓冲溶液中，实验组加入8μL 4％甲醛溶液，对照组加入8μL 4％氘代甲醛溶液，同时每个样本中均加入8μL 0.6M氰基硼氢化钠，涡旋混匀，室温反应1h。反应完成后分别加入32μL 1％氨水溶液终止反应，再加入16μL甲酸使溶液酸化。最后将轻、重同位素标记的实验组和对照组混合，再使用StageTip C₁₈脱盐，洗脱的肽段使用真空旋转干燥仪浓缩热干。

(5)质谱鉴定：热干的肽段重溶于0.1％甲酸溶液中，14000g离心10min后取上清液加载于2cm自装预柱(内径100μm，并装有内径为3μm C₁₈填料)，同时使用内径150μm、长度15cm的自制反相分析柱(填有粒径为1.9μm的Ultimate XB-C18填料)进行分离。使用EasynLC 1000纳升级液相色谱系统，液相梯度为78min(流动相A：0.1％甲酸-水溶液，流动相B：含有0.1％甲酸-的乙腈溶液，流速为600nL/min)，洗脱梯度：0～8min，5％～8％B；8～58min，8％～22％B；58～70min，22％～32％B；70～71min，32％～90％B；71～78min，90％B。洗脱后的肽段通过电喷雾离子源依次进入Orbitrap Fusion^TMTribrid^TM质谱仪中进行分析。喷雾电压为2.0kV，数据采集模式为数据依赖模式，扫描方法为正离子扫描模式，离子传输管温度设定为320℃，一级全扫描检测范围为300～1400m/z，扫描分辨率为120000，最大注入时间为100ms，自动增益控制设置为5e⁵，采用高能碰撞诱导解离模式将母离子碎裂成二级碎片，碰撞能量为32％，使用线性离子阱快速模式进行二级数据采集，AGC设置为5000，最大注入时间设为35ms，动态排除时间设为18s。

(6)质谱数据检索及分析：通过质谱得到的原始文件使用MaxQuant软件进一步分析，使用UniProt Mouse(Release on 202103,17082 entry)数据库进行检索。选择胰蛋白酶作为酶解模式，允许的最大漏切位点设置为2，每个肽段最少含有氨基酸的个数为6，半胱氨酸脲甲基化设为固定修饰，甲硫氨酸氧化及N-末端乙酰化设为可变修饰。对于二甲化标记，轻标勾选DimethLys0和DimethNter0，重标勾选DimethLys4和DimethNter4，母离子及二级碎片离子的最大质量容差分别为20ppm和0.5Da，蛋白水平与谱图的假阳性率不高于1％。按照最小值填充原则对缺失值进行填充，再通过Persus软件计算每个蛋白的富集倍数(实验组信号强度与对照组信号强度的比值)及利用T-test检验计算富集显著的程度，用P-Value值表示，P-Value越小说明实验组信号相对对照组信号差异越显著。得到的数据通过如下原则筛选得到RBPs：1.三次实验中至少有两次鉴定到的蛋白；2.蛋白最少包含2条特异肽段；3.实验组/对照组富集倍数不低于2倍且P-Value＜0.01；满足以上三个条件的被认为是高置信的RBPs。

结果如图9所示，其中图9A是小鼠脑组织中鉴定蛋白的散点图，图9B是小鼠肝脏组织鉴定蛋白的散点图。本发明提供的富集方法在小鼠脑组织中鉴定到1764个高度可信的RBPs，在肝脏组织中鉴定到1628个高可信度的RBPs，进一步将三组生物学重复中RBPs的富集倍数两两比较，发现每两组之间均具有较好的相关性，结果如图10所示，其中图10A为小鼠脑组织中鉴定RBPs的相关性分析，图10B为小鼠肝脏组织中鉴定RBPs的相关性分析，计算得到的皮尔森相关系数在0.85之上，说明三组生物学重复中质谱鉴定到的RBPs具有相似的富集倍数，证明本发明提供的富集方法的重现性较好。进一步对鉴定的RBPs进行基因注释分析，结果如图11，其中图11A是小鼠脑组织中鉴定RBPs的基因注释，图11B是小鼠肝脏组织中鉴定RBPs的基因注释。从分析结果上发现最富集的条目都是与RNA相关的，如生物学进程方面最富集的条目大多与“翻译”相关，分子功能中最富集的条目均是“RNA结合”；表明富集到的RBPs具有高可信度，也证明了本发明提供的方法具有富集鉴定哺乳动物组织中RBPs的能力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。