CN103083223A - 半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体为一种半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。本发明的纳米粒由荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐和离子交联剂经离子交联作用生成，同时包载蛋白质多肽药物或核酸药物。其中半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐由壳聚糖的氨基依次经季铵化、半乳糖修饰和巯基化修饰而成。该纳米粒的制备过程简单、无需使用有机溶剂，可保护蛋白质多肽药物或核酸药物的活性。该纳米粒结构稳定，可主动靶向炎症巨噬细胞和肝癌细胞，有效提高口服药物的小肠吸收并改善核酸药物的转染效率，抗炎和抗肿瘤效果显著优于现有壳聚糖类纳米粒，可用于制备口服给药系统或者联合给药系统等。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
纳米粒是一种新型药物递送系统，可包载化疗药物、基因药物等多种药物。纳米粒可改变药物的体内分布，具有靶向给药、缓释药物、降低药物毒副作用、增溶难溶性药物、提高药物稳定性、促进生物膜的转运和吸收、提高生物大分子药物生物利用度等优势（Adv Drug Deliv Rev 2008,60:1638-1649），在生物大分子药物给药系统中应用尤为广泛。纳米粒的制备方法主要有共价交联法、离子交联法、复凝聚/沉淀法、乳化/溶剂扩散法、反胶束法、喷雾干燥法、热加工法、简单聚合法等。共价交联、反胶束法、乳化/溶剂扩散法等均需使用有机溶剂，易造成药物活性降低甚至失活。离子交联法通过荷相反电荷物质间的聚电解质作用自组装形成纳米粒，无需使用有机溶剂，反应条件温和，可最大限度保护生物大分子药物的活性（Int J Biol Macromol 2010,46:342-349）。
天然阳离子聚合物壳聚糖无免疫原性、生物可降解、安全性好，分子结构上的活性氨基可连接不同功能基团，如季铵等质子化基团、pH敏感基团、巯基或特异性靶向配体等。壳聚糖衍生物N,N,N-三甲基壳聚糖季胺盐（Trimethyl chitosan, TMC）在中性条件下荷正电，溶解性好，用于口服给药时，可打开肠道上皮细胞间紧密连接，促进亲水性大分子药物经细胞旁路转运和吸收；巯基化聚合物用于口服给药时，可紧密结合于黏膜，延长滞留时间，提高局部药物浓度，促进药物吸收，并发挥促渗作用。靶向给药系统的研究中，半乳糖靶向配体修饰的给药系统可通过与肝细胞去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGP-R）或巨噬细胞半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特异性凝集素（macrophage galactose/N-acetyl galactosamine-specific lectin, MGL）特异性结合，实现主动靶向肝脏或巨噬细胞，发挥疾病治疗功效。聚乙烯亚胺接枝半乳糖修饰壳聚糖（GC-g-PEI）包载pDNA，对肝癌细胞株HepG2细胞的转染效率明显高于宫颈癌细胞株HeLa细胞（Gene Ther 2007,14:1389-1398）。半乳糖修饰的低分子量壳聚糖包载反义寡聚核苷酸，结肠给药后可主动靶向炎症巨噬细胞发挥抗炎功效（Gut 2010,59:470-479）。但上述半乳糖修饰的纳米粒均未通过口服途径给药实现主动靶向治疗功效。上述给药系统亦缺乏有效途径可控调节药物和载体间的结合力，无法保证所载药物在生理环境中的稳定和在治疗靶点的快速释放。此外，现有文献中半乳糖修饰的载体均仅包载一种药物，进行单靶点治疗，易产生耐药性，尚无使用半乳糖修饰的给药载体同时包载多种药物，实现多靶点联合给药，协同发挥疾病治疗功效的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒及其制备方法和应用。
本发明第一方面，提供半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒。该纳米粒可通过离子交联法（ionic gelation）制备，包载生物大分子药物（蛋白质多肽药物或核酸药物）。其中：
所述的离子交联法为荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂通过聚电解质作用形成纳米粒，同时包载蛋白质多肽药物或核酸药物；所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为壳聚糖的氨基依次经季铵化修饰、半乳糖修饰和巯基化修饰所得的共聚物，其中壳聚糖分子量为30-1000 kDa，季铵化度为15-60 mol%（根据1H NMR计算而得，方法参见Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83），半乳糖修饰物为乳糖醛酸，半乳糖修饰度为5-60 mol%（根据1H NMR计算而得，方法参见J Control Release 2008,131:150-157），巯基化修饰物为半胱氨酸盐酸盐，游离巯基修饰率为50-200 μmol/g，二硫键修饰率为100-300 μmol/g。
在本发明的优选例中，所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐具有下式结构：
所述离子交联剂为三聚磷酸钠、透明质酸、γ-聚谷氨酸、丙烯酸树脂中的一种或几种。
所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与离子交联剂的质量比为1:1-20:1，优选的质量比为5:1-15:1。
所述的蛋白质多肽药物选自下组：尼妥珠单抗（Nimotuzumab，表皮生长因子受体单抗）、群司珠单抗（Trastuzumab，HER-2单克隆抗体）、英夫利昔（Infliximab，TNF-α人鼠嵌合单克隆抗体）、贝伐单抗、胰岛素、依诺肝素、降钙素、干扰素、抗利尿激素、奥曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、红细胞生长素、各种生长因子、白介素、集落刺激因子、抗原或抗体的一种或几种。
所述的核酸药物选自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一种或几种。
所述的DNA为质粒DNA（pDNA）。
所述的pDNA可以表达蛋白质或转录成小分子干扰RNA。
所述的RNA为siRNA、shRNA、mRNA或microRNA中的一种或几种。
所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的平均粒径为100-500 nm，优选的平均粒径为100-200 nm。
所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的Zeta电势为10-45 mV，优选的Zeta电势为15-30 mV。
所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的包封率为60-100%，优选的包封率为80-100%。
本发明第二方面，提供所述半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
（1）半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐、离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物溶于水；
（2）将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物的混合溶液中，其中半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与一种或多种离子交联剂的质量比为1:1-20:1，一种或多种离子交联剂与蛋白质多肽药物或核酸药物的质量比为1:5-25:1；
（3）室温静置，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂、蛋白质多肽药物或核酸药物经聚电解质作用形成纳米粒。
其中，所述半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐的制备的具体步骤如下：
（1）按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中加入壳聚糖和碘甲烷加热反应制得壳聚糖季铵盐，反应时间为45-180 min，所得壳聚糖季铵盐以Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；其中反应45、120和180 min所得壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和60%；
（2）将壳聚糖季铵盐和乳糖醛酸分别溶于四甲基乙二胺/HCl缓冲液（pH 4.7），乳糖醛酸和壳聚糖季铵盐的质量比为0.2:1-3:1，加入终浓度为50-200 mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），调节反应pH为3.0-5.0，室温反应24-72 h，超滤，冷冻干燥，得半乳糖修饰壳聚糖季铵盐；
（3）将半乳糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸盐酸盐溶于水，半乳糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸盐酸盐的质量比为1:1-1:4，加入终浓度为50-200 mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），调节pH至3.0-5.0，室温反应2-8 h，透析，冷冻干燥，得半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐。
半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的三步合成反应需按照季铵化修饰、半乳糖修饰和巯基化修饰的顺序依次进行，这是由于半乳糖修饰反应需常温搅拌24-72 h，若先进行巯基化修饰，所得的游离巯基易氧化，降低材料的黏膜黏附性。
乳糖醛酸和壳聚糖季铵盐的质量比为0.2:1-3:1。质量比过低，半乳糖修饰率较低，材料的主动靶向性降低；质量比过高，半乳糖修饰率较高，占用的壳聚糖氨基数量较多，影响巯基化修饰反应，减弱材料的黏膜黏附性。
离子交联法制备纳米粒可通过控制交联剂的种类和质量比调节药物和载体间的结合力。参与形成纳米粒的交联剂种类越多，纳米粒与药物结合力越强，药物释放速度越慢；分子量高的交联剂含量越多，药物释放速度越慢。
本发明第三方面，提供所述半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备口服给药系统中的应用。
在一优选例中，提供了半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在抗炎口服给药系统中的应用。所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒以三聚磷酸钠为单一交联剂，粒径为100-200 nm，可在pH 1.2-7.4的高离子强度环境下保持结构稳定，胃肠道稳定性较好。所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒可显著增加在肠道炎症部位聚集的巨噬细胞摄取量，提高炎症部位的药物浓度，显著增强用于肠道局部炎症治疗的蛋白质多肽药物或核酸药物的抗炎功效。
本发明第四方面，提供半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备抗肿瘤给药系统中的应用。
在一优选例中，提供了半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备抗肿瘤给药系统中的应用。所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒以三聚磷酸钠、γ-聚谷氨酸和丙烯酸树脂的一种或者几种为交联剂，粒径为100-200 nm，具有不同的siRNA结合-释放速率性。所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒具有不同的胞外稳定性和胞内释放速率，调节离子交联剂种类和比例可显著提高用于抗肝癌治疗的核酸或蛋白质、多肽药物的治疗功效。
本发明第五方面，提供半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备同时包载多种药物，实现多靶点联合治疗的给药系统中应用，协同发挥疾病治疗功效。
在一优选例中，提供了同时包载VEGF siRNA和iSUR-pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在抗肿瘤口服基因传释系统中的应用。所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径为100-200 nm，具有良好的胃肠道稳定性。所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒可提高pDNA和siRNA的小肠转运效率，口服后可快速经小肠吸收进入血液循环，富集于肝癌细胞，发挥多靶点治疗作用，协同提高口服抗肿瘤功效，也可用于显著改善抗肝癌蛋白质、多肽药物的治疗功效。
本发明的主要优点在于：
（1）半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒同时具有壳聚糖季铵盐和巯基化聚合物在口服给药系统中的优势。荷正电季铵基团和巯基基团可分别通过静电吸引和形成分子间二硫键提高与荷负电细胞膜和富含半胱氨酸残基的黏蛋白的亲和力，从而具有更好的细胞黏附和黏膜黏附能力。此外，壳聚糖季铵盐和巯基化聚合物可分别通过正电性和抑制酪氨酸磷酸酶活性打开小肠上皮紧密连接，促进亲水性药物的小肠吸收。
（2）半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒胃肠道稳定性较好，可在稀释、高离子强度和pH变化的环境下保持结构稳定，可有效屏蔽生物大分子药物的酶切位点，提高药物的抗酶解能力。对于蛋白质多肽药物而言，可有效抑制蛋白水解酶，如肠腔中的胰蛋白酶、糜蛋白酶和缩肽酶，刷状缘膜囊中的外肽酶和细胞液中的溶菌酶对药物的降解，保持药物在转运和吸收过程中的生物活性。对于核酸药物而言，可有效抑制核酸酶，如脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）对药物的降解，保护药物在细胞外液和细胞内液中免受降解，发挥其生物功效。
（3）对于消化道局部炎症疾病而言，本发明纳米粒可发挥局部给药作用。机体发生炎症时，炎症部位巨噬细胞表面过量表达半乳糖受体，本发明的纳米粒经口服后可在肠道黏膜处通过半乳糖受体介导的特异性细胞内吞进入活化巨噬细胞，并随巨噬细胞聚集于炎症部位，发挥靶向抗炎作用。
（4）对于非消化道局部炎症疾病而言，本发明纳米粒可发挥全身给药作用。粒径为100-300 nm的纳米粒在正常小肠上皮细胞、Peyer’s结处巨噬细胞的摄取量较高，经口服后可快速经小肠吸收进入体循环，将药物递送至全身。
（5）本发明的纳米粒不仅可包载单一大分子药物，还可同时包载多种蛋白质多肽药物或核酸药物，实现多靶点联合给药治疗，避免单靶点治疗所产生的耐药性。
（6）本发明通过控制离子交联剂的种类和比例调节药物与载体的结合力，可针对不同疾病特征，调整药物释放速率，保证药物到达到治疗靶点前的稳定和到达靶点后的快速释放。
（7）本发明的纳米粒制备过程简便，无需使用有机溶剂，可最大限度保护生物大分子药物的活性。
（8）半乳糖修饰和巯基化修饰可降低壳聚糖季铵盐的正电荷，减轻由正电荷带来的细胞毒性。
术语：
“TMC”指壳聚糖季铵盐；
“TC”巯基化壳聚糖季铵盐；
“GT”指半乳糖修饰壳聚糖季铵盐；
“GTC”指半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐；
“GTC(m,n)”指壳聚糖分子量为m（kDa）、季铵化度为n（%）的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐；
“TC(m,n)”指壳聚糖分子量为m（kDa）、季铵化度为n（%）的巯基化壳聚糖季铵盐。
附图说明
图1为同时包载siRNA和pDNA的GTC(200,30)纳米粒（实施例69）的扫描电镜图。
图2为同时包载siRNA和pDNA的GTC(200,30)纳米粒（实施例69，70）在小鼠体液中的稳定性电泳图。图中A为裸pDNA或裸siRNA ；B为半乳糖修饰壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例69）；C为半乳糖修饰壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例70）。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，浓度为质量体积百分数（w/v）。
实施例1 半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为30 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取50 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为50 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至3.0，室温搅拌24 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和400 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为200 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌2 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例2半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为100 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取150 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为100 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.0，室温搅拌24 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和300 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为150 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例3半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取120 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为80 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温搅拌72 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和250 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为120 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例4半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为500 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取200 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为150 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌48 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和150 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为80 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌8 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例5半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为1000 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取300 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为200 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌24 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和100 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为50 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌8 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例6半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取20 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为50 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌24 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和250 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为120 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例7半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取50 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为50 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌48 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和250 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为120 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例8半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取200 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为100 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌72 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和250 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为120 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至3.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例9半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取300 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为200 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌72 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和250 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为120 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至5.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例10半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取120 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为80 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌72 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和100 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为50 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温避光搅拌2 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例11半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取120 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为80 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌72 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和150 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为100 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至4.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例12半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取120 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为80 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌72 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和300 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为150 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至3.0，室温避光搅拌5 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例13半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐的制备
按照文献报道方法（Eur J Pharm Biopharm 2004,57:77-83）在甲基吡咯烷酮溶剂中合成TMC，壳聚糖分子量为200 kDa，反应时间分别为45 min、120min和180 min，所得TMC的季铵化度分别为15%、30%和60%。Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；称取120 mg乳糖醛酸（LA）溶于3 mL 四甲基乙二胺（TEMED）/HCl缓冲液（pH 4.7），加入终浓度分别为80 mM的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌溶解；称取100 mg TMC溶于12 mL TEMED/HCl缓冲液（pH 4.7）；混合LA和TMC溶液，加1 mol/L NaOH调pH至4.5，室温搅拌72 h，4 °C超滤纯化（MWCO 10 kDa），冷冻干燥，制得GT；称取100 mg GT和400 mg半胱氨酸盐酸盐（Cys）分别溶于12 mL和3 mL水，加10 mol/L NaOH调节Cys溶液pH至2-3；混合GT和Cys溶液，加入终浓度分别为200 mM的EDC和NHS溶液，搅拌溶解；加1 mol/L NaOH调pH至4.0，室温避光搅拌8 h；以pH 5.0 HCl溶液4 °C透析3天（MWCO 3,500 Da），冷冻干燥，制得GTC。
实施例14载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和尼妥珠单抗分别溶于水，浓度均为1 mg/mL，按TPP和尼妥珠单抗质量比为15:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至TPP和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例15载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和尼妥珠单抗分别溶于水，浓度均为1 mg/mL，按TPP和尼妥珠单抗质量比为1:5混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至TPP和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与TPP的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例16载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。透明质酸（HA）和尼妥珠单抗溶于水，浓度均为1 mg/mL，按HA和尼妥珠单抗质量比为25:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至HA和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与HA的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的HA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例17载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和尼妥珠单抗溶于水，浓度均为1 mg/mL，按γ-PGA和尼妥珠单抗质量比为15:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至γ-PGA和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与γ-PGA的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的γ-PGA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例18载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，尼妥珠单抗溶于水，丙烯酸树脂和尼妥珠单抗的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和尼妥珠单抗质量比为25:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至丙烯酸树脂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与丙烯酸树脂的质量比为1:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例19载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，尼妥珠单抗溶于水，丙烯酸树脂和尼妥珠单抗的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和尼妥珠单抗质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至丙烯酸树脂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与丙烯酸树脂的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例20载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）和尼妥珠单抗溶于水，TPP和HA的浓度均为1 mg/mL，尼妥珠单抗的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/尼妥珠单抗质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例21载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和尼妥珠单抗溶于水，TPP和γ-PGA的浓度均为1 mg/mL，尼妥珠单抗的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/γ-PGA/尼妥珠单抗质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例22载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和尼妥珠单抗溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，尼妥珠单抗的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/丙烯酸树脂/尼妥珠单抗质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为15:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例23载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和尼妥珠单抗溶于水，TPP、HA和γ-PGA的浓度均为1 mg/mL，尼妥珠单抗的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/尼妥珠单抗质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为15:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例24载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）和尼妥珠单抗溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，尼妥珠单抗的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸树脂/尼妥珠单抗质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例25载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和尼妥珠单抗溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、γ-PGA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，尼妥珠单抗的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/γ-PGA/丙烯酸树脂/尼妥珠单抗质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例26载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和尼妥珠单抗溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，尼妥珠单抗的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸树脂/尼妥珠单抗质量比为5:1:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和尼妥珠单抗混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载尼妥珠单抗。
实施例27载胰岛素的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和胰岛素溶液浓度均为1 mg/mL，按TPP和胰岛素质量比为20:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至TPP和胰岛素混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与TPP的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例28载胰岛素的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。透明质酸（HA）溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，HA和胰岛素溶液浓度均为1 mg/mL，按HA和胰岛素质量比为10:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至HA和胰岛素混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与HA的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的HA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例29载胰岛素的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，丙烯酸树脂和胰岛素溶液的浓度均为1 mg/mL，按丙烯酸树脂和胰岛素质量比为15:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至丙烯酸树脂和胰岛素混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与丙烯酸树脂的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的丙烯酸树脂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例30载胰岛素的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，胰岛素的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸树脂/胰岛素质量比为1:1:1:1:5混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和胰岛素混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为1:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例31载胰岛素的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，TPP和HA的浓度均为1 mg/mL，胰岛素的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/胰岛素质量比为1:5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和胰岛素混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为15:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例32载胰岛素的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）溶于水，胰岛素溶于pH 2.0 HCl中并调节pH至7.0，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，胰岛素的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸树脂/胰岛素质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和胰岛素混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载胰岛素。
实施例33载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和siRNA分别溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，siRNA浓度为0.2 mg/mL，按TPP和siRNA质量比为25:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至TPP和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与TPP的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例34载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为4 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和siRNA分别溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，siRNA浓度为0.2 mg/mL，按TPP和siRNA质量比为18:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至TPP和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与TPP的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例35载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为6 mg/mL。透明质酸（HA）和siRNA分别溶于水，HA浓度为1 mg/mL，siRNA浓度为0.2 mg/mL，按HA和siRNA质量比为25:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至HA和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与HA的质量比为1:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的HA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例36载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为6 mg/mL。透明质酸（HA）和siRNA分别溶于水，HA浓度为1 mg/mL，siRNA浓度为0.2 mg/mL，按HA和siRNA质量比为15:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至HA和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与HA的质量比为5:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的HA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例37载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为4 mg/mL。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和siRNA分别溶于水，γ-PGA浓度为1 mg/mL，siRNA浓度为0.2 mg/mL，按γ-PGA和siRNA质量比为10:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至γ-PGA和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与γ-PGA的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的γ-PGA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例38载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为4 mg/mL。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和siRNA分别溶于水，γ-PGA浓度为1 mg/mL，siRNA浓度为0.2 mg/mL，按γ-PGA和siRNA质量比为1:5混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至γ-PGA和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与γ-PGA的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的γ-PGA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例39载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，siRNA溶于水，丙烯酸树脂和siRNA的浓度分别为 1 mg/mL和0.2 mg/mL，按丙烯酸树脂和siRNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至丙烯酸树脂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与丙烯酸树脂的质量比为8:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例40载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）和siRNA溶于水，TPP和HA的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/siRNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例41载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和siRNA溶于水，TPP和γ-PGA的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/γ-PGA/siRNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为15:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例42载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和siRNA溶于水，TPP和γ-PGA的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/γ-PGA/siRNA质量比为1:5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例43载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和siRNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/丙烯酸树脂/siRNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例44载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和siRNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/丙烯酸树脂/siRNA质量比为1:5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例45载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和siRNA溶于水，TPP、HA和γ-PGA的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/siRNA质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例46载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）和siRNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸树脂/siRNA质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例47载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和siRNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、γ-PGA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/γ-PGA/丙烯酸树脂/siRNA质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例48载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和siRNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，siRNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸树脂/siRNA质量比为5:1:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和siRNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载siRNA。
实施例49载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和pDNA分别溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，pDNA浓度为0.2 mg/mL，按TPP和pDNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至TPP和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与TPP的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例50载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和pDNA分别溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，pDNA浓度为0.2 mg/mL，按TPP和pDNA质量比为1:5混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至TPP和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与TPP的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的TPP经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例51载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。透明质酸（HA）和pDNA分别溶于水，HA浓度为1 mg/mL，pDNA浓度为0.2 mg/mL，按HA和pDNA质量比为25:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至HA和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与HA的质量比为1:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的HA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例52载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。透明质酸（HA）和pDNA分别溶于水，HA浓度为1 mg/mL，pDNA浓度为0.2 mg/mL，按HA和pDNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至HA和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与HA的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的HA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例53载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和pDNA分别溶于水，γ-PGA浓度为1 mg/mL，pDNA浓度为0.2 mg/mL，按γ-PGA和pDNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至γ-PGA和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与γ-PGA的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的γ-PGA经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例54载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，pDNA溶于水，丙烯酸树脂和pDNA的浓度分别为 1 mg/mL和0.2 mg/mL，按丙烯酸树脂和pDNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至丙烯酸树脂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与丙烯酸树脂的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例55载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）和pDNA溶于水，TPP和HA的浓度均为1 mg/mL，pDNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/pDNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例56载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和pDNA溶于水，TPP和γ-PGA的浓度均为1 mg/mL，pDNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/γ-PGA/pDNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例57载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）和pDNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，pDNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/丙烯酸树脂/pDNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例58载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和pDNA溶于水，TPP、HA和γ-PGA的浓度均为1 mg/mL，pDNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/pDNA质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例59载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）和pDNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，pDNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/丙烯酸树脂/pDNA质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例60载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和pDNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、γ-PGA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，pDNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/γ-PGA/丙烯酸树脂/pDNA质量比为5:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例61载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、透明质酸（HA）、γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和pDNA溶于水，丙烯酸树脂溶于pH 8.0 NaOH后调节pH至中性，TPP、HA、γ-PGA和丙烯酸树脂的浓度均为1 mg/mL，pDNA的浓度为0.2 mg/mL。按TPP/HA/γ-PGA/丙烯酸树脂/pDNA质量比为5:1:1:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和pDNA混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与各离子交联剂质量总和的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂经聚电解质作用形成纳米粒，同时包载pDNA。
实施例62同时包载尼妥珠单抗和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、尼妥珠单抗和siRNA溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，尼妥珠单抗和siRNA浓度均为0.2 mg/mL。按TPP/尼妥珠单抗/siRNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与交联剂的质量比为1:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的交联剂经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例63同时包载尼妥珠单抗和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、尼妥珠单抗和siRNA溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，尼妥珠单抗和siRNA浓度均为0.2 mg/mL。按TPP/尼妥珠单抗/siRNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与交联剂的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的交联剂经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例64同时包载尼妥珠单抗和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、尼妥珠单抗和siRNA溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，尼妥珠单抗和siRNA浓度均为0.2 mg/mL。按TPP/尼妥珠单抗/siRNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与交联剂的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的交联剂经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例65同时包载尼妥珠单抗和pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、尼妥珠单抗和pDNA溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，尼妥珠单抗和pDNA浓度均为0.2 mg/mL。按TPP/尼妥珠单抗/pDNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与交联剂的质量比为1:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的交联剂经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例66 同时包载尼妥珠单抗和pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、尼妥珠单抗和pDNA溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，尼妥珠单抗和pDNA浓度均为0.2 mg/mL。按TPP/尼妥珠单抗/pDNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与交联剂的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的交联剂经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例67 同时包载尼妥珠单抗和pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。三聚磷酸钠（TPP）、尼妥珠单抗和pDNA溶于水，TPP浓度为1 mg/mL，尼妥珠单抗和pDNA浓度均为0.2 mg/mL。按TPP/尼妥珠单抗/pDNA质量比为5:1:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与交联剂的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的交联剂经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例68 同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。pDNA和siRNA溶于水，浓度均为0.2 mg/mL。按pDNA和siRNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与药物的质量比为1:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的药物经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例69 同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。pDNA和siRNA溶于水，浓度均为0.2 mg/mL。按pDNA和siRNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与药物的质量比为10:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的药物经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例70 同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备
实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。pDNA和siRNA溶于水，浓度均为0.2 mg/mL。按pDNA和siRNA质量比为5:1混合。搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和药物混合溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与药物的质量比为20:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的药物经聚电解质作用形成纳米粒。
实施例71 半乳糖修饰壳聚糖季铵盐的半乳糖修饰度测定
GT冻干粉（实施例1、3、4、6、7、8、9，季铵化度为30%）分别溶于氘水（D2O），以四甲基硅烷（TMS）为内标，AVANCE DMX500型核磁共振仪于80 ○C测定1H NMR图谱。按下列公式计算GT的半乳糖修饰度（GD，mol%）：
其中[CH]为化学位移4.5 ppm处半乳糖上的氢峰面积，[CH3]为化学位移2.0 ppm处壳聚糖骨架上乙酰基氢的峰面积，DD为GT的脱乙酰度（85%）。
如表1所示，GT的半乳糖修饰度为5-60%。
表1 GT的半乳糖修饰度
| Sample | 半乳糖修饰度（GD，%） |
| GT(30,30) 实施例1 | 10.5 |
| GT(200,30) 实施例3 | 28.6 |
| GT(500,30) 实施例4 | 42.9 |
| GT(200,30) 实施例6 | 5.2 |
| GT(200,30) 实施例7 | 12.7 |
| GT(200,30) 实施例8 | 47.6 |
| GT(200,30) 实施例9 | 60.3 |
实施例72 半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐游离巯基和二硫键的测定
游离巯基标准曲线：精密称取Cys 0.035 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，制得2 μmol/mL贮备液；分别精密量取0.1、0.25、0.5、1、1.5、2.5、5 mL，置10 mL量瓶中，加水至刻度，制得浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 μmol/mL的Cys标准溶液。分别精密量取0.5 mL，加0.5 mL 0.3 mg/mL DTNB溶液（以0.5 mol/L pH 8.0 PBS配制），混匀，室温避光静置2 h，以不加Cys标准溶液管为对照，测定450 nm处吸光值。以浓度（μmol/mL）对吸光值（A）进行线性回归。
总巯基标准曲线：配制浓度分别为0.2、0.3、0.5、1.0、1.5 μmol/mL的Cys标准溶液；分别精密量取0.5 mL，加0.5 mL 0.05 mol/L PBS（pH 8.0），混匀，室温静置30 min；加0.6 mL 3%（w/v）NaBH4溶液，37 °C水浴2 h；加0.5 mL 1 mol/L HCl溶液和0.1 mL丙酮，混匀，室温静置10 min；加1 mL 1 mol/L PBS（pH 8.0）和0.2 mL 0.5 mg/mL DTNB溶液（以0.5 mol/L pH 8.0 PBS配制），混匀，以不加Cys标准溶液管为对照，测定450 nm处吸光值。以浓度（μmol/mL）对吸光值（A）进行线性回归。
样品游离巯基含量测定：量取0.25 mL GTC溶液（实施例1、2、3、4、5、10、12、13，季铵化度为30%，浓度为2 mg/mL），加0.25 mL 0.5 mol/L PBS（pH 8.0）和0.5 mL 0.3 mg/mL DTNB溶液（以0.5 mol/L pH 8.0 PBS配制），混匀，室温避光静置2 h，以不加GTC溶液管为对照，测定450 nm处吸光值。由标准曲线计算游离巯基含量，结果以每1克GTC含游离巯基的量（μmol）表示（μmol/g）。
样品二硫键含量测定：量取0.5 mL GTC溶液（实施例1、2、3、4、5、10、12、13，季铵化度为30%，浓度为2 mg/mL），加0.5 mL 0.05 mol/L PBS（pH 8.0），混匀，室温静置30 min；加0.6 mL 3%（w/v）NaBH4溶液，37 °C水浴2 h；加0.5 mL 1 mol/L HCl溶液和0.1 mL丙酮，混匀，室温静置10 min；加1 mL 1 mol/L PBS（pH 8.0）和0.2 mL 0.5 mg/mL DTNB溶液（以0.5 mol/L pH 8.0 PBS配制），混匀，以不加GTC溶液管为对照，测定450 nm处吸光值。由标准曲线计算总巯基含量。总巯基含量减去游离巯基含量差的一半为二硫键含量，结果以每1克GTC含二硫键的量（μmol）表示（μmol/g）。
表2 GTC上-SH和-S-S-的含量
| Sample | -SH (μmol/g) | -S-S-(μmol/g) |
| GTC(30,30) 实施例1 | 179 ± 1.5 | 250 ± 2.4 |
| GTC(100,30) 实施例2 | 136.8 ± 2.3 | 239.7 ± 3.5 |
| GTC(200,30) 实施例3 | 120 ± 2.8 | 190.2 ± 3.9 |
| GTC(500,30) 实施例4 | 88.7 ± 4.5 | 159.3 ± 1.6 |
| GTC(1000,30) 实施例5 | 50.5 ± 3.8 | 130.3 ± 3.1 |
| GTC(200,30) 实施例10 | 51.2 ± 4.3 | 101.3 ± 1.5 |
| GTC(200,30) 实施例12 | 95.3 ± 1.5 | 124.3 ± 3.6 |
| GTC(200,30) 实施例13 | 153.9 ± 4.5 | 299.7 ± 1.6 |
实施例73 载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Zetasizer Nano-ZS型电位及粒度测定仪测定纳米粒的粒径和Zeta电势。粒径测定参数：He-Ne激光（波长633 nm），散射角θ=173°，测定温度25 °C；Zeta电势测定参数：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 °C。
尼妥珠单抗包封率：
取载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例14、16、17、19、20、21、22、23、24、25、26，季铵化度为30%）溶液1 mL，13,300 rpm离心30 min，取上清液500 μL，Lowry法测定尼妥珠单抗含量。按下式计算尼妥珠单抗包封率：
包封率（%）= (A-B)×100/A
其中A为尼妥珠单抗投料量（mg）；B为离心后上清液中的尼妥珠单抗含量（mg）。
如表3所示，载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径为200-500 nm，Zeta电势为15-30 mV，胰岛素的包封率均高于70%。
表3 载尼妥珠单抗的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径、Zeta电势和包封率
| Sample | 粒径（nm） | Zeta电势（mV） | 包封率（%） |
| 实施例14 | 202.1 ± 4.1 | 25.1 ± 2.8 | 99.2 ± 1.1 |
| 实施例16 | 275.2 ± 3.6 | 29.1 ± 4.3 | 95.7 ± 1.4 |
| 实施例17 | 221.1 ± 2.3 | 32.4 ± 3.3 | 90.3 ± 4.7 |
| 实施例19 | 313.3 ± 4.8 | 27.5 ± 1.9 | 79.6 ± 5.4 |
| 实施例20 | 214.5 ± 1.3 | 29.4 ± 1.4 | 85.0 ± 1.2 |
| 实施例21 | 276.2 ± 18.4 | 15.1 ± 0.5 | 75.4 ± 3.2 |
| 实施例22 | 307.1 ± 15.2 | 30.3 ± 1.9 | 90.2 ± 3.1 |
| 实施例23 | 244.3 ± 9.4 | 27.6 ± 1.7 | 96.7 ± 2.8 |
| 实施例24 | 349.8 ± 23.9 | 17.3 ± 2.2 | 88.0 ± 3.3 |
| 实施例25 | 323.0 ± 7.8 | 23.4 ± 4.8 | 93.0 ± 2.7 |
| 实施例26 | 443.2 ± 6.8 | 20.3 ± 1.9 | 86.4 ± 2.3 |
实施例74 载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Zetasizer Nano-ZS型电位及粒度测定仪测定载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例34、36、37、39、40、41、43、45、46、47、48，季铵化度为30%）的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光（波长633 nm），散射角θ=173°，测定温度25 °C。Zeta电势测定参数如下：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 °C。
siRNA包封率：
取载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例34、36、37、39、40、41、43、45、46、47、48，季铵化度为30%）溶液1 mL，13,300 rpm离心30 min，取上清液500 μL，Pico green试剂测定siRNA含量。按下式计算siRNA包封率：
包封率（%）= (A-B)×100/A
其中A为siRNA投料量（mg）；B为离心后上清液中的siRNA含量（mg）。
如表4所示，载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径为100-200 nm，Zeta电势为20-30 mV，siRNA的包封率均高于60%。
表4 载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径、Zeta电势和包封率
| Sample | 粒径（nm） | Zeta电势（mV） | 包封率（%） |
| 实施例34 | 132.3 ± 5.2 | 26.3 ± 4.0 | 85.4 ± 2.9 |
| 实施例36 | 176.8 ± 7.4 | 29.8 ± 2.2 | 82.5 ± 2.3 |
| 实施例37 | 164.2 ± 5.5 | 27.3 ± 1.0 | 75.7 ± 3.6 |
| 实施例39 | 187.4 ± 3.9 | 20.3 ± 1.4 | 65.2 ± 3.9 |
| 实施例40 | 101.4 ± 2.5 | 27.3 ± 5.2 | 77.9 ± 2.5 |
| 实施例41 | 145.8 ± 15.2 | 22.3 ± 3.9 | 69.4 ± 7.5 |
| 实施例43 | 179.4 ± 5.9 | 27.8 ± 2.0 | 77.5 ± 3.9 |
| 实施例45 | 119.6 ± 10.4 | 23.8 ± 3.7 | 68.0 ± 1.2 |
| 实施例46 | 149.2 ± 2.2 | 26.2 ± 1.9 | 74.2 ± 4.3 |
| 实施例47 | 177.5 ± 7.2 | 25.4 ± 3.4 | 72.5 ± 3.1 |
| 实施例48 | 197.5 ± 10.5 | 28.7 ± 4.9 | 77.5 ± 2.3 |
实施例75 载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Zetasizer Nano-ZS型电位及粒度测定仪测定载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例49、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61，季铵化度为30%）的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光（波长633 nm），散射角θ=173°，测定温度25 °C。Zeta电势测定参数如下：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 °C。
pDNA包封率：
取载pDNA的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例49、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61，季铵化度为30%）溶液1 mL，13,300 rpm离心30 min，取上清液500 μL，Hochest 33258试剂测定pDNA含量。按下式计算pDNA包封率：
包封率（%）= (A-B)×100/A
其中A为pDNA投料量（mg）；B为离心后上清液中的pDNA含量（mg）。
如表5所示，载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径为150-250 nm，Zeta电势为15-30 mV，pDNA的包封率均高于60%。
表5载pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径、Zeta电势和包封率
| Sample | 粒径（nm） | Zeta电势（mV） | 包封率（%） |
| 实施例49 | 152.4 ± 14.1 | 25.4 ± 2.2 | 86.2 ± 4.8 |
| 实施例52 | 236.7 ± 5.9 | 30.2 ± 4.1 | 81.3 ± 2.7 |
| 实施例53 | 249.8 ± 4.2 | 24.4 ± 2.3 | 69.5 ± 4.9 |
| 实施例54 | 219.2 ± 4.0 | 27.6 ± 8.3 | 71.4 ± 1.2 |
| 实施例55 | 165.2 ± 3.2 | 28.4 ± 2.9 | 84.9 ± 2.4 |
| 实施例56 | 233.3 ± 8.0 | 27.3 ± 2.1 | 80.3 ± 5.2 |
| 实施例57 | 189.4 ± 7.2 | 25.8 ± 3.4 | 76.4 ± 9.2 |
| 实施例58 | 177.2 ± 5.8 | 24.8 ± 5.0 | 72.5 ± 1.3 |
| 实施例59 | 167.8 ± 6.9 | 20.5 ± 1.9 | 74.2 ± 8.4 |
| 实施例60 | 195.1 ± 2.7 | 18.3 ± 1.6 | 77.6 ± 3.9 |
| 实施例61 | 172.2 ± 6.1 | 26.4 ± 4.0 | 64.3 ± 5.9 |
实施例76 同时包载多种蛋白质多肽药物或核酸药物的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径、Zeta电势和包封率
粒径、Zeta电势：
Zetasizer Nano-ZS型电位及粒度测定仪测定同时载多种蛋白质多肽药物或核酸药物的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例62、63、64、65、66、67、68、69、70，季铵化度为30%）的粒径和Zeta电势。粒径测定参数如下：He-Ne激光（波长633 nm），散射角θ=173°，测定温度25 °C。Zeta电势测定参数如下：He-Ne激光（波长635 nm），散射角θ=14°，测定温度25 °C。
如表6所示，同时包载多种蛋白质多肽药物或核酸药物的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的粒径为150-250 nm，Zeta电势为15-30 mV，
表6同时包载多种蛋白质多肽药物或核酸药物的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒粒径和Zeta电势
| Sample | 粒径（nm） | Zeta电势（mV） |
| 实施例62 | 230.3 ± 21.4 | 21.8 ± 3.1 |
| 实施例63 | 166.4 ± 14.1 | 25.4 ± 1.2 |
| 实施例64 | 158.7 ± 5.9 | 28.6 ± 5.1 |
| 实施例65 | 212.8 ± 5.2 | 23.4 ± 2.6 |
| 实施例66 | 178.2 ± 5.8 | 27.6 ± 8.3 |
| 实施例67 | 161.2 ± 2.2 | 28.4 ± 3.9 |
| 实施例68 | 249.3 ± 21.4 | 15.8 ± 3.1 |
| 实施例69 | 216.4 ± 14.1 | 20.4 ± 1.2 |
| 实施例70 | 172.7 ± 2.9 | 26.6 ± 5.1 |
实施例77 载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒离子强度和pH稳定性
载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）加1 mol/L NaCl调节离子强度至0.2 mol/L，测定纳米粒的粒径和Zeta电势。
载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）加1 mol/L HCl调节pH至1.2，静置1 min，以1 mol/L NaOH回调pH至7.4，测定纳米粒的粒径和Zeta电势。
环境离子强度升至0.2 mol/L后，载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）的粒径为144.0 ± 13.6 nm，Zeta电势为20.9 ± 1.6 mV；pH由1.2调节至7.4后，载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）的粒径为193.8 ± 27.1 nm，Zeta电势为13.5 ± 1.3 mV。表明载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒可抵抗胃肠道高离子强度环境和pH变化对纳米粒结构带来的破坏作用。
实施例78 交联剂对载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒稀释稳定性的影响
无交联剂载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒的制备方法包括如下步骤：实施例3的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶于水，浓度为2 mg/mL。siRNA溶于水，浓度为0.2 mg/mL，搅拌下将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至siRNA溶液中，半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与siRNA的质量比为15:1。室温静置30 min，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的siRNA经聚电解质作用形成纳米粒。测定纳米粒的粒径和Zeta电势。
无交联剂载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒和TPP交联的载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）分别加水稀释250倍，测定纳米粒的粒径和Zeta电势。
无交联剂载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒的粒径为150.2 ± 11.8 nm，Zeta电势为24.5 ± 2.7 mV，经过250倍稀释后粒径为367.1 ± 10.7 nm，Zeta电势为4.8 ± 1.2 mV；载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）经过250倍稀释后粒径为187.0 ± 1.0 nm，Zeta电势为23.5 ± 2.9 mV。表明交联剂可提高载siRNA的GTC纳米粒的稳定性。
实施例79 同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰壳聚糖季铵盐纳米粒在小鼠体液中的稳定性
同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖纳米粒（实施例69、70）、siRNA溶液或pDNA溶液，加入等体积小鼠胃液、小肠液或小肠匀浆液，混匀，37 °C孵育一定时间；80 °C水浴5 min终止酶反应，加入4 μL 40 mg?mL-1肝素钠溶液，室温放置2 h使纳米粒解离；量取一定体积（含100 ng NC siRNA或1 μg pDNA），加至琼脂糖凝胶上样孔（siRNA电泳：4%琼脂糖凝胶；pDNA电泳：1%琼脂糖凝胶），电泳（siRNA电泳：55 V，60 min；pDNA电泳：100 V，60 min），EB显色，凝胶成像仪观察siRNA或pDNA条带并拍照。
如图2所示，与小鼠体液温育后，裸siRNA和pDNA降解，GTC(200, 30)纳米粒组均可见清晰的siRNA和pDNA电泳条带，表明GTC(200, 30)纳米粒通过包载核酸药物、屏蔽siRNA和pDNA上的酶切位点可有效保护siRNA和pDNA免被小鼠体液中的核酶降解。
实施例80 载siRNA半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的体外释放
量取一定体积纳米粒溶液（实施例34、42、44，含1 μg FAM-NC siRNA），13,300 rpm离心10 min，弃上清液，加1 mL 0.2 mol/L PBS（pH 7.4）分散沉淀，37 °C、100 rpm振荡温育。分别于0.5、1、2、4 h 13,300 rpm离心10 min，精密量取上清液0.5 mL，酶标仪测定FAM-siRNA（FAM λex=480 nm, λem=520 nm；），并计算累积释放量（%）。每次取样后补加0.5 mL释放介质，分散沉淀，继续温育。
载siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34、42、44）的4 h体外siRNA累积释放量分别为77.26 ± 1.30%、58.70 ± 2.90%和52.43 ± 2.21%，表明改变离子交联剂种类可有效调节纳米粒中siRNA的结合-释放速率。
实施例81 同时包载siRNA和pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在SD大鼠小肠的离体转运
取SD大鼠，实验前禁食12小时，可自由饮水。断颈椎处死，沿腹中线打开腹腔，取出回肠，以Kreb’s-Ringer缓冲液清洗干净，剪下约8 cm长的肠段（含3个Peyer’s结），两端约1 cm处用丝线结扎形成封闭肠环，肠环内注入0.6 mL 纳米粒（实施例69，含4 μg FAM-NC siRNA或20 μg FITC-pDNA），以相同浓度的FAM-NC siRNA或FITC-pDNA溶液为对照。肠环置高型称量瓶中，加入6 mL 37 °C、氧气饱和的Kreb’s-Ringer缓冲液，使肠环保持拉伸状态，37 °C、100 rpm振荡培养。分别于15、30、60、90、120、180、240 min取样200 μL，补加37 °C Kreb’s-Ringer缓冲液200 μL。样品12,000 rpm离心5 min，荧光多功能酶标仪测定上清液中FAM-siRNA或FITC-pDNA含量（FAM λex=480 nm, λem=520 nm；FITC λex=488 nm, λem=519 nm）。按下式计算计算表观渗透系数P app：
GTC(200, 30)纳米粒组siRNA和裸siRNA的P app分别为（3.99 ± 0.77）×10-6 cm/s和（0.93 ± 0.05）×10-6 cm/s，GTC(200, 30)纳米粒组pDNA和裸pDNA的P app分别为（3.37 ± 0.48）×10-6 cm/s和（1.04 ± 0.04）×10-6 cm/s，表明纳米粒可显著促进siRNA和pDNA的小肠转运。
实施例82 载siRNA半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在LPS刺激的Raw 264.7细胞的细胞黏附
取对数生长期的Raw 264.7细胞，胰酶消化，3,000 rpm离心5 min，沉淀以等渗缓冲液（葡萄糖44.4 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，KH2PO4 0.2 g/L）重复洗涤三次，稀释至0.5×106-1×106细胞/mL的细胞悬液；分别量取30 μL的纳米粒，加至1 mL细胞悬液中，加入20 μL 0.5 μg/mL LPS溶液（以0.2 mol/L pH 7.4 PBS配制），37 °C培养2 h；3,000 rpm离心5 min，沉淀以1 mL 0.2 mol/L PBS（pH 7.4）分散，测定Zeta电势。以加PBS的细胞为空白对照。
LPS刺激的Raw 264.7细胞与GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）和相应TC(200, 30)纳米粒共培养后，Zeta电势由-14.9 ± 0.3 mV分别变为-1.1 ± 0.5 mV和-5.7 ± 0.5 mV。与GTC(200, 30)纳米粒共培养后细胞的Zeta电势显著高于TC(200, 30)纳米粒组，表明GTC纳米粒的细胞黏附力显著高于TC(200, 30)纳米粒。
实施例83 同时包载siRNA和pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在BEL-7402细胞和HeLa细胞的细胞黏附
取对数生长期的BEL-7402细胞或HeLa细胞，胰酶消化，3,000 rpm离心5 min，沉淀以等渗缓冲液（葡萄糖44.4 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9 g/L，KH2PO4 0.2 g/L）重复洗涤三次，稀释至0.5×106-1×106细胞/mL的细胞悬液；分别量取30 μL的纳米粒加至1 mL细胞悬液中，37 °C培养2 h；3,000 rpm离心5 min，沉淀以1 mL 0.2 mol/L PBS（pH 7.4）分散，测定Zeta电势。以加PBS的细胞为空白对照。
BEL-7402细胞与GTC(200, 30)纳米粒和相应TC(200, 30)纳米粒共培养后，Zeta电势由-13.2 ± 0.6 mV分别变为-6.3 ± 0.3 mV和-9.1 ± 0.1 mV；HeLa细胞与GTC(200, 30)纳米粒和相应TC(200, 30)纳米粒共培养后，Zeta电势由-11.2 ± 0.7 mV分别变为-7.9 ± 0.2 mV和-7.7 ± 0.4 mV。与GTC(200, 30)纳米粒共培养后BEL-7402细胞的Zeta电势显著高于TC纳米粒组，而二种纳米粒对HeLa细胞表面电势的影响无显著差异，表明GTC(200, 30)纳米粒对肝癌细胞的黏附力显著高于TC(200, 30)纳米粒，对非肝癌细胞的黏附力与 TC(200, 30)纳米粒无差异。
实施例84 载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在LPS刺激的Raw 264.7细胞的摄取
以5×104细胞/孔的密度接种对数生长期的Raw 264.7细胞至24孔板，37 °C、5% CO2培养24 h；吸弃孔中液体，依次加入1 mL无血清培养基和20 μL 0.5 μg/mL LPS溶液（以0.2 mol/L pH 7.4 PBS配制），3孔为一组，按每孔0.4 μg FAM-NC siRNA分别加入纳米粒溶液，37 °C、5% CO2培养4 h；吸弃孔中液体，以0.2 mol/L PBS（pH 7.4）洗涤三次，加0.8 mL 0.5% SDS（w/v）溶液（pH 8.0），37 °C、100 rpm避光振荡2 h。荧光多功能酶标仪测定细胞裂解液中FAM-NC siRNA的含量（λex=480 nm，λem=520 nm），Lowry法测定裂解液中蛋白质的含量。摄取量以每1 mg蛋白质含FAM-NC siRNA的量（ng）表示（ng/mg）。
载siRNA GTC(200,30)纳米粒（实施例34）在LPS刺激的Raw 264.7细胞的摄取量为340.5 ± 22.3 ng/mg，而相应的TC(200, 30)纳米粒在LPS刺激的Raw 264.7细胞的摄取量为210.0 ± 29.1 ng/mg，表明半乳糖修饰显著提高活化巨噬细胞对纳米粒的摄取能力。
实施例85同时包载siRNA和pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在BEL-7402细胞和HeLa细胞的细胞摄取
取生长旺盛的BEL-7402和HeLa细胞，以5×104细胞/孔的密度接种细胞至24孔板，37 °C、5% CO2培养24 h；吸弃培养基，加入1 mL无血清DMEM，3孔为一组，按每孔0.4 μg FAM-siRNA分别向每组孔中加入同时包载siRNA和pDNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒（实施例69），37 °C、5% CO2培养4 h；吸弃孔中液体，加PBS洗涤三次，加入0.5 mL 0.5% SDS溶液（pH 8.0），室温、避光裂解20 min。荧光多功能酶标仪测定裂解液中FAM-siRNA或FITC-pDNA的含量（FAM λex=480 nm, λem=520 nm；FITC λex=488 nm, λem=519 nm），Lowry法测定蛋白质含量。摄取量以每1 mg蛋白质含FAM-siRNA或FITC-pDNA的量（μg）表示（μg/mg）。
BEL-7402细胞对GTC(200, 30)纳米粒和相应TC(200, 30)纳米粒中pDNA摄取量分别为5.91 ± 0.13和3.64 ± 0.16 μg/mg，siRNA摄取量分别为0.60 ± 0.04和0.36 ± 0.02 μg/mg；HeLa细胞对GTC(200, 30)纳米粒和相应TC(200, 30)纳米粒中pDNA摄取量分别为3.37 ± 0.36和3.61 ± 0.13 μg/mg，siRNA摄取量分别为0.30 ± 0.06和0.32 ± 0.04 μg/mg。GTC(200, 30)纳米粒在BEL-7402细胞中的摄取量显著高于TC(200, 30)纳米粒组，而二种纳米粒在HeLa细胞中的摄取量无显著差异，表明GTC纳米粒可提高pDNA和siRNA在肝癌细胞中的摄取量。
实施例86 载siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在LPS刺激的Raw 264.7细胞的转染
以Map4k4 siRNA为基因药物，以2×104细胞/孔的密度接种Raw 264.7细胞至24孔板，37 °C、5% CO2培养24 h；吸弃孔中液体，依次加入1 mL新鲜无血清培养基和20 μL 0.5 μg/mL LPS溶液（以0.2 mol/L pH 7.4 PBS配制），3孔为一组，按每孔0.4 μg Map4k4 siRNA分别加入载药纳米粒或Lipofecatmine 2000/siRNA复合物，37 °C、5% CO2培养4 h；吸弃孔中液体，每孔加入1 mL含10% FCS的培养基，37 °C、5% CO2继续培养20 h；更换培养基，每孔加入20 μL 0.5 μg/mL LPS溶液（以0.2 mol/L pH 7.4 PBS配制），37 °C、5% CO2培养5 h。吸取上清液，小鼠TNF-α ELISA试剂盒测定TNF-α蛋白质的含量（ng/mL）。
载siRNA GTC(200,30)纳米粒（实施例34）在Raw 264.7细胞的基因沉默效率为59.2 ± 2.4%时，而相应的载siRNA TC(200, 30)纳米粒和Lipofectamine2000/siRNA复合物在LPS刺激的Raw 264.7细胞的基因沉默效率分别为51.4 ± 4.6%和31.1 ± 7.4%。上述结果表明半乳糖修饰显著提高了纳米粒的细胞转染效率，且GTC(200,30)纳米粒的转染效率优于常用的转染试剂Lipofectamine 2000。
实施例87同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在BEL-7402细胞的转染
以iSUR-pDNA和VEGF siRNA为靶基因，以4×104细胞/孔的密度接种BEL-7402细胞至24孔板，37 °C、5% CO2培养24 h；更换无血清培养基，加入纳米粒，37 °C、5% CO2培养4 h；不加纳米粒的孔为空白对照，Lipofectamine RNAiMAX/siRNA和Lipofectamine2000/pDNA复合物的孔为阳性对照；吸弃孔中液体，每孔加入1 mL含10% 胎牛血清的DMEM培养基，37 °C、5% CO2继续培养20 h（转染总时间为24 h）；吸取上清液，人VEGF ELISA试剂盒测定VEGF含量，以空白对照组VEGF含量为100%，计算各试验组相对百分含量（%）；继续培养24 h（转染总时间为48 h），荧光素酶报告基因检测试剂盒测定pDNA中荧光素酶表达量，Lowry法测定细胞蛋白质的含量。摄取量以每1 mg蛋白质所含相对光子数（RLU）表示（RLU/mg）。
GTC(200,30)纳米粒（实施例69）在BEL-7402细胞的siRNA沉默效率为65.99 ± 3.41%，而相应的TC(200, 30)纳米粒和Lipofectamine RNAiMAX/siRNA复合物在BEL-7402细胞的基因沉默效率分别为50.06 ± 1.31%和73.98 ± 2.11%。上述结果表明半乳糖修饰显著提高了纳米粒的siRNA基因沉默效率。GTC(200,30)纳米粒（实施例69）在BEL-7402细胞的pDNA表达量为（2.97 ± 0.19）×105 RLU/mg，而相应的TC(200, 30)纳米粒和Lipofectamine 2000/pDNA复合物在BEL-7402细胞的基因沉默效率分别为（1.56 ± 0.08）×105和（1.69 ± 0.06）×105。上述结果表明半乳糖修饰显著提高了纳米粒的pDNA转染效率，且GTC(200,30)纳米粒的转染效率优于常用的转Lipofectamine 2000。
实施例88 载Map4k4 siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒口服后在葡聚糖硫酸钠诱导溃疡性结肠炎模型小鼠的体内转染
雄性C57BL/6小鼠，称重，随机分为三组。第一组给予3%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液自由饮用7天且于前6天连续每天灌胃给予GTC(200, 30)纳米粒（实施例34，给药剂量按Map4k4 siRNA计为250 μg?kg-1）；第二组给予3% DSS溶液自由饮用7天且于前6天连续每天灌胃给予0.2 mL生理盐水（疾病对照组）；第三组给予水自由饮用7天（正常对照组）。第8天处死小鼠，小鼠TNF-α ELISA试剂盒测定小鼠结肠组织匀浆液中TNF-α含量。
载Map4k4 siRNA GTC(200, 30)纳米粒组、疾病对照组和正常对照组小鼠结肠组织TNF-α含量分别为732.4 ± 214.8、3272.7 ± 803.8和480.8 ± 189.0 pg/g，GTC纳米粒可有效降低DSS诱导溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织的TNF-α含量，表明半乳糖修饰可促进纳米粒口服后靶向聚集于结肠炎症部位的巨噬细胞，并转染巨噬细胞、沉默TNF-α，发挥口服RNAi作用。
实施例89 载siRNA半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的组织分布
取C57BL/6小鼠24只，以3%（w/v）葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液替代普通饮用水，正常喂食，构建溃疡性结肠炎小鼠模型。造模第7天，小鼠禁食12小时，可自由饮水，称重，随机分为二组，每组12只，分别灌胃给予载tamra-NC siRNA的GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）和TC(200, 30)纳米粒（给药剂量按tamra-NC siRNA计为250 μg/kg）。每组分别于2、6、12 h取4只小鼠，摘眼球取血，血样置经肝素抗凝处理的离心管中，3,000 rpm离心10 min，荧光多功能酶标仪测定上清液血浆中tamra-NC siRNA含量（λex=544 nm, λem=576 nm）；分别取肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠和结肠，生理盐水清洗，滤纸吸干水分，称重，剪碎，每0.1 g组织中加1 mL RIPA裂解液以玻璃匀浆器匀浆，匀浆液3,000 rpm离心10 min，荧光多功能酶标仪分别测定上清液中tamra-NC siRNA含量（λex=544 nm, λem=576 nm）。不同时间血浆或组织中tamra-NC siRNA占总给药量的百分数即为体内药物的相对分布百分率（%）。
tamra-NC siRNA在脾脏、肺脏和肾脏中的分布百分比显著低于在肝脏、血液、小肠和结肠中的分布百分比。tamra-NC siRNA在小肠和结肠中的分布随着时间的延长而下降，给药后2 h，GTC(200, 30)纳米粒（实施例34）组tamra-NC siRNA在小肠和结肠中的分布水平分别为28.5 ± 10.6%和21.3 ± 3.5%；TC(200, 30)纳米粒组tamra-NC siRNA在小肠和结肠中的分布水平分别为48.9 ± 10.3%和9.0 ± 4.5%。给药后6 h，tamra-NC siRNA在血浆和肝脏中的分布达到峰值，此时GTC(200, 30)纳米粒组tamra-NC siRNA在血浆和肝脏中的分布水平分别为1.2 ± 0.2%和7.8 ± 1.4%；TC(200, 30)纳米粒组tamra-NC siRNA在血浆和肝脏中的分布水平分别为6.2 ± 2.6%和15.6 ± 2.0%。表明GTC(200, 30)纳米粒可显著促进tamra-NC siRNA在结肠中的分布，且GTC(200, 30)纳米粒经口服后主要聚集于炎症结肠组织，仅少量经小肠吸收进入血液循环。
实施例90 同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒抗肿瘤
胰酶消化对数生长期BEL-7402细胞，1,500 rpm离心5 min收集细胞；加入10 mL PBS （0.2 M, pH 7.4）重悬细胞沉淀，1500 rpm离心5min收集细胞，PBS重复洗涤三次；向细胞沉淀中加入适量0.2 mol/L PBS（pH 7.4）制备单细胞悬液，细胞计数后调整细胞浓度至2×107细胞/mL；吸取0.2 mL细胞悬液，皮下接种于雌性Balb/c裸鼠右前肢腋下部位，待肿瘤体积长至100 mm3时，随机分为5组，每组6只。分别灌胃给予同时包载iSUR-pDNA和VEGF siRNA的GTC纳米粒，同时包载iSUR-pDNA和VEGF siRNA的TC纳米粒，同时包载pGL-3和VEGF siRNA的GTC纳米粒，同时包载iSUR-pDNA和scramble VEGF siRNA的GTC纳米粒和200 μL生理盐水。第一次给药时间定为第0 d，分别于第0、2、4、6、8 、10、12、14、16和18 d给药（给药剂量按siRNA计为200 μg/kg）。隔天用游标卡尺测量瘤块的长径（Lt, mm）和短径（St, mm），计算肿瘤体积（Vt, mm3）：Vt = Lt×St2/2，绘制肿瘤生长曲线。第20 d处死所有小鼠，剖出瘤块，拍照，称重，-70 °C保存。
上述四个纳米粒组的抑瘤率分别为87.94%、74.88%、63.30%和75.78%，GTC(200, 30)纳米粒组抑瘤效率优于相应TC(200, 30)纳米粒组，表明半乳糖修饰可提高体内转染效率，GTC(200, 30)联合给药组抑瘤效率优于GTC(200, 30)单给药组，表明siRNA和pDNA联合给药可发挥协同作用，提高体内抗肿瘤疗效。
实施例91 同时包载pDNA和siRNA的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒抗肿瘤
胰酶消化对数生长期QGY-7703细胞，1,500 rpm离心5 min收集细胞；加入10 mL PBS （0.2 M, pH 7.4）重悬细胞沉淀，1500 rpm离心5min收集细胞，PBS重复洗涤三次；向细胞沉淀中加入适量0.2 mol/L PBS（pH 7.4）制备单细胞悬液，细胞计数后调整细胞浓度至2×107细胞/mL；吸取0.2 mL细胞悬液，皮下接种于雌性Balb/c裸鼠右前肢腋下部位，待肿瘤体积长至100 mm3时，随机分为4组，每组6只。分别瘤内注射给予载VEGF siRNA的GTC纳米粒（实施例34、42、44）和100 μL生理盐水。第一次给药时间定为第0 d，分别于第0、2、4、6、8 、10、12、14、16和18 d给药（给药剂量按siRNA计为50 μg/kg）。隔天用游标卡尺测量瘤块的长径（Lt, mm）和短径（St, mm），计算肿瘤体积（Vt, mm3）：Vt = Lt×St2/2，绘制肿瘤生长曲线。第20 d处死所有小鼠，剖出瘤块，拍照，称重，-70 °C保存。
上述三组GTC(200, 30)纳米粒组的抑瘤率分别为70.86%、94.22%和85.67%，实施例42纳米粒组抑瘤效率最佳，表明改变离子交联剂调节siRNA结合-释放速率后，可保证siRNA的胞外稳定和胞内释放，提高siRNA的体内抗肿瘤功效。
Claims (12)
1. 一种半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于由荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐和离子交联剂经离子交联作用生成，同时包载蛋白质多肽药物或核酸药物；其中，所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐为壳聚糖的氨基依次经季铵化修饰、半乳糖修饰和巯基化修饰所得的共聚物；壳聚糖分子量为30-1,000 kDa；所述季铵化度为15-60 mol%；半乳糖修饰物为乳糖醛酸，所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐的半乳糖修饰度为5-60 mol%；巯基化修饰物为半胱氨酸盐酸盐，所述的游离巯基修饰率为50-200 μmol/g，二硫键修饰率为100-300 μmol/g。
2. 根据权利要求1所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述离子交联剂选自三聚磷酸钠、透明质酸、γ-聚谷氨酸、丙烯酸树脂中的一种或几种。
3. 根据权利要求1所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述的蛋白质多肽药物选自表皮生长因子受体单抗、HER-2单克隆抗体、TNF-α人鼠嵌合单克隆抗体、贝伐单抗、胰岛素、依诺肝素、降钙素、干扰素、抗利尿激素、奥曲肽、布舍瑞林、亮丙瑞林、红细胞生长素、各种生长因子、白介素、集落刺激因子、抗原或抗体中的一种或几种；所述核酸药物选自DNA、RNA、寡聚核苷酸或多核苷酸中的一种或几种。
4. 根据权利要求3所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述的DNA为pDNA；所述的RNA为siRNA、shRNA或microRNA。
5. 根据权利要求1–4之一所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒的平均粒径为100-500 nm。
6. 根据权利要求1–4之一所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒的Zeta电势为10-45 mV。
7. 根据权利要求1–4之一所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒，其特征在于所述纳米粒对蛋白质多肽药物或核酸药物的包封率为60-100%。
8. 一种如权利要求1–7之一所述半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐、离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物溶于水；
（2）将半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐溶液滴加至离子交联剂和蛋白质多肽药物或核酸药物的混合溶液中，其中半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与一种或几种离子交联剂的质量比为1:1-20:1，一种或几种离子交联剂与蛋白质多肽药物或核酸药物的质量比为1:5-25:1；
（3）室温静置，荷正电的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐与荷负电的离子交联剂、蛋白质多肽药物或核酸药物经离子交联作用形成纳米粒。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述的半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐按如下步骤制备：
（1）合成壳聚糖季铵盐，反应时间为45-180 min，所得壳聚糖季铵盐以Cl-型阴离子交换树脂去除I-，冷冻干燥；其中反应45、120和180 min所得壳聚糖季铵盐的季铵化度分别为15%、30%和60%；
（2）将壳聚糖季铵盐和乳糖醛酸分别溶于四甲基乙二胺/HCl缓冲液，乳糖醛酸和壳聚糖季铵盐的质量比为0.2:1-3:1，加入终浓度为50-200 mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节反应pH为3.0-5.0，室温反应24-72 h，超滤，冷冻干燥，得半乳糖修饰壳聚糖季铵盐；
（3）将半乳糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸盐酸盐溶于水，半乳糖修饰壳聚糖季铵盐和半胱氨酸盐酸盐的质量比为1:1-1:4，加入终浓度为50-200 mM的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH至3.0-5.0，室温反应2-8 h，透析，冷冻干燥，得半乳糖修饰巯基化壳聚糖季铵盐。
10. 权利要求1–7之一所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备口服给药系统或者联合给药系统中的应用。
11. 权利要求1–7之一所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备抗肿瘤给药系统中的应用。
12. 权利要求1–7之一所述的半乳糖修饰的巯基化壳聚糖季铵盐纳米粒在制备同时包载多种药物，实现多靶点联合治疗的给药系统中应用。
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