CN112336702A - 一种药物载体及核酸类药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种药物载体及核酸类药物制剂，药物载体由多糖和烯烃季铵盐类单体聚合而成，其中，所述烯烃季铵盐类单体中烯基的个数为2个及以上。发明的药物载体中含有阳离子基团，从而能够提高载体与核酸类药物的复合能力。本发明的核酸类药物制剂能够有效提高核酸类药物的稳定性，并且能够利用细胞的胞吞作用传导进入细胞内部，有效促进细胞对于药物制剂的吸收；另外，药物制剂中的阳离子基团有利于实现内涵体逃逸，把核酸类药物释放于细胞质中，提高核酸类药物的转染效率；再者，本发明采用多糖衍生物为药物载体，具有较低的毒副作用，并且具有一定的耐血清性能。

Description

一种药物载体及核酸类药物制剂
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种药物载体及核酸类药物制剂。
背景技术
近年来，基因治疗、特别是基于核酸的治疗技术研究发展迅速，其作为一种未来临床应用治疗手段具有巨大的潜力。通过传递基因药物，替换缺陷基因、替代缺失基因或沉默不需要的基因表达，达到治疗许多遗传性、癌症或病毒性疾病的效果。然而，裸露的基因药物在血清中极易被核酸酶降解，且容易被肾脏代谢，导致血液循环时间较短；此外，基因药物为聚阴离子大分子，其负电性和较大的相对分子质量，使其不能通过自由扩散的方式进入细胞，即使进入了细胞，也无法有效地从内涵体中逃逸到细胞质中。所以，裸露的基因药物很难在体内发挥其作用以达到治疗的效果。因此，构建合适的核酸药物载体是提高基因药物有效传递，达到其治疗效果的主要途径。
基因药物或核酸药物的载体来源可分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体常用的载体病毒类型较多，如逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。病毒载体最大的优势在于其递送效率高，但是同时也面临着在体内容易发生严重的机体免疫反应的副作用，而且生产成本过高、载体组装困难、应用范围有限、可控性差等缺点，限制了其应用。而且，针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。因此，当前主要集中于非病毒载体的研究。
非病毒载体主要是基于天然高分子材料的药物载体，例如脂质体等，其具有优良的生物相容性及临床应用前景，因而受到了众多研究者的青睐，因此，对天然高分子材料进行化学修饰构建药物载体也已成为药物导入(递送)领域的重要研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的基于天然高分子材料的药物载体及核酸类药物制剂。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明一方面提供一种药物载体，其由多糖和烯烃季铵盐类单体聚合而成，其中，所述烯烃季铵盐类单体中烯基的个数为2个及以上。
本发明采用多糖为原料，利用多糖的分子结构中含有的大量活性反应基团(例如氨基、羟基和羧酸基团等)，采用烯烃季铵盐类单体中的烯基对多糖的活性反应基团进行阳离子化修饰，得到了一种全新的纳米级导入载体，改变了多糖的物理或化学性质，一定程度上增强了药物载体与基因药物的复合能力，提高基因药物的稳定性；同时，阳离子型的药物载体能促进细胞的吸收，提高基因药物的转染效率，在核酸药物的递送领域具有显著的优势。
根据一些实施方式，所述烯烃季铵盐类单体为如下结构式所示物质中的一种或多种：
Figure BDA0002811854880000021
其中，R1、R6独立地选自氢、碳原子数为1～3的烷基、碳原子数为2～5的烯基或碳原子数为2～5的炔基；R2、R5独立地选自碳原子数为1～3的烷基、碳原子数为2～5的烯基或碳原子数为2～5的炔基；n、m独立地为0～3之间的数；R3、R4独立地选自碳原子数为1～3的烷基、碳原子数为2～5的烯基或碳原子数为2～5的炔基；通过采用上述结构式所示的烯烃季铵盐类单体对多糖进行改性，在聚合的过程中，烯烃季铵盐类单体的烯基断裂与多糖的活性基团连接的同时，部分烯烃季铵盐类单体自身成环形成聚烯烃季铵盐类聚合物。
根据一些实施方式，所述多糖为壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、淀粉、果胶、甘露聚糖中的至少一种；所述烯烃季铵盐类单体为二甲基二烯丙基氯化铵、二乙基二烯丙基氯化铵中的至少一种。
下面以壳聚糖和二甲基二烯丙基氯化铵为例说明药物载体的反应原理，具体如下式所示：
Figure BDA0002811854880000022
本发明的第二方面提供一种如上所述药物载体的制备方法，使所述多糖和所述烯烃季铵盐类单体在引发剂的存在下进行聚合反应制得。
根据一些实施方式，所述多糖与所述烯烃季铵盐类单体的投料质量比为1:3～12。
根据一些实施方式，所述多糖以将所述多糖溶解在缓冲液中制得的多糖溶液的形式投料。
优选地，所述缓冲液为pH5～7的醋酸盐缓冲液。
优选地，所述多糖溶液中所述多糖的浓度为5mg/mL～25mg/mL。
根据一些实施方式，所述聚合反应在加热回流的状态下进行。
根据一些实施方式，所述多糖与所述引发剂的投料质量比为1:0.1～1。
根据一些实施方式，所述引发剂以引发剂水溶液的形式投料。
优选地，所述引发剂水溶液中所述引发剂的浓度为10mg/mL～50mg/mL。
优选地，所述引发剂为过硫酸铵。
根据一些具体且优选实施方式，所述制备方法的具体步骤为：将所述多糖加入缓冲液中配制成多糖溶液，然后加入所述烯烃季铵盐类单体，加热回流10～30min，然后向反应体系中滴加引发剂水溶液，加热回流反应2～6h，经后处理得到所述药物载体。
优选地，所述后处理的方法为：将反应液冷却，透析，然后经过滤、冷冻干燥制得所述药物载体。
进一步优选地，控制透析的时间为24h～48h。
本发明的第三方面是提供一种核酸类药物制剂，其包括载体和核酸活性成分，其中，所述载体为上述药物载体，或上述制备方法制得的药物载体。
根据一些实施方式，所述核酸活性成分为小干扰核酸(siRNA)、微核酸(miRNA)、信使核糖核酸(mRNA)、质粒DNA(pDNA)中的至少一种。
根据一些实施方式，所述的载体与所述核酸活性成分的质量比为2～32:1；优选为8～32:1。
根据一些实施方式，所述核酸类药物制剂还包括交联剂。
优选地，所述交联剂为三聚磷酸钠。
优选地，所述交联剂与所述核酸的质量比为0.5～2:1。
根据一些实施方式，所述核酸类药物制剂为注射剂型或雾化剂型，即，该核酸类药物制剂可用于静脉注射系统给药，也可以通过雾化给药。
根据一些实施方式，所述核酸类药物制剂呈纳米颗粒状。
本发明的第四方面是提供一种如上述核酸类药物制剂的制备方法，包括如下步骤：
将所述药物载体配制成药物载体水溶液；
将所述核酸活性成分配制成核酸活性成分水溶液；
将所述药物载体水溶液与所述核酸活性成分水溶液混合，选择性地加入交联剂，经混合、离心、静置制得所述核酸类药物制剂。
根据一些实施方式，所述药物载体水溶液中所述药物载体的浓度为0.5mg/mL～2mg/mL。
根据一些实施方式，所述核酸活性成分水溶液中的所述核酸活性成分的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明的药物载体中含有阳离子基团，从而能够提高载体与核酸类药物的复合能力。
本发明的核酸类药物制剂能够有效提高核酸类药物的稳定性，由于核酸类药物制剂中含有多糖和阳离子基团，能够利用细胞的胞吞作用传导进入细胞内部，有效促进细胞对于药物制剂的吸收；另外，药物制剂中的阳离子基团有利于实现内涵体逃逸，把核酸类药物释放于细胞质中，提高核酸类药物的转染效率；再者，本发明采用多糖衍生物为药物载体，具有较低的毒副作用，因此，具有较好的安全性，并且具有一定的耐血清性能。
本发明的制备方法简单，易于操作且重复性好，有利于临床与工业化的放大生产。
附图说明
图1为壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵(CP)的核磁共振氢谱图；
图2为阳离子化多糖核酸类药物制剂的琼脂糖凝胶图，由此可见，载体与小核酸质量比为16：1时，两者达到良好的复合效果；
图3为阳离子化多糖核酸类药物制剂(CP:ST:siRNA＝24:2:1)粒径图，结果可知，其粒径约为180nm，电位为+14.10mV；
图4为载体(CP)、交联剂(ST)与阳离子化多糖核酸类药物制剂(CP-ST-siRNA)细胞活力结果图，由此可见，载体的毒副作用低，制剂对于胰腺癌细胞的活力具有抑制效果；
图5为阳离子化多糖核酸类药物制剂PCR结果图，结果可知，在一定比例制备本发明制剂，其在mRNA水平的沉默效率优于基于LIPO2000的核酸药物复合物；
图6为阳离子化多糖核酸类药物制剂血清稳定性结果图(水—0h、10％FBS—0、1、2、24h)，结果可知，本发明制剂与含10％FBS的培养基混合，24h后仍有剩余；
图7为阳离子化多糖核酸类药物制剂含血清(CP-ST-siRNA+10％FBS)转染的细胞活力结果图，结果可知，本发明制剂含血清转染与否，其细胞活力结果相近；
图8为雾化阳离子化多糖核酸类药物制剂PCR结果图，结果可知，本制剂雾化前后，在mRNA水平的沉默效率相近。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
实施例1
1)取壳聚糖于烧瓶中，加入pH为5的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到12mg/mL的壳聚糖溶液，再加入与壳聚糖质量比为6：1的二甲基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在80℃下回流10min，取与壳聚糖质量比为0.5：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到30mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应3h，冷却至室温，透析24h，过滤，冷冻干燥，获得壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到1mg/mL的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液；取siRNA溶解于注射用水中，得到0.5mg/mL的siRNA溶液；
3)取1μL步骤(2)所述的siRNA溶液于离心管中，加入1μL 1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，混匀，再加入12μL步骤(2)所述的多糖-聚烯烃季铵盐类聚合物溶液，混匀，涡旋5s，离心，静置30min，即可制得所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂。
实施例2
1)取壳聚糖于烧瓶中，加入pH为5.5的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到12mg/mL的壳聚糖溶液，再加入与多糖质量比为6：1的二甲基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在95℃下回流10min，取与壳聚糖质量比为0.5：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到30mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应4h，冷却至室温，透析24h，过滤，冷冻干燥，获得壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到1mg/mL的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液；取siRNA溶解于注射用水中，得到0.5mg/mL的siRNA溶液；
3)取1μL步骤(2)所述的siRNA溶液于离心管中，加入1μL 1mg/mL的三聚磷酸钠溶液，混匀，再加入8μL步骤(2)所述的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液，涡旋5s，离心，静置30min，即可制得所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂。
实施例3
1)取透明质酸于烧瓶中，加入pH为5.5的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到12mg/mL的透明质酸溶液，再加入与透明质酸质量比为6：1的二甲基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在80℃下回流20min，取与透明质酸溶质量比为0.5：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到30mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应4h，冷却至室温，透析24h，过滤，冷冻干燥，获得透明质酸-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的透明质酸-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到0.5mg/mL的透明质酸-聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液；取siRNA溶解于注射用水中，得到0.1mg/mL的siRNA溶液；
3)取5μL步骤(2)所述的siRNA溶液于离心管中，加入2μL0.5mg/mL的三聚磷酸钠溶液，混匀，再加入32μL步骤(2)所述的透明质酸-聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液，涡旋10s，离心，静置40min，即可制得所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂。
实施例4
1)取海藻酸钠于烧瓶中，加入pH为6的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到5mg/mL的海藻酸钠溶液，再加入与多糖质量比为3：1的二乙基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在70℃下回流10min，取与海藻酸钠质量比为1：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到10mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应2h，冷却至室温，透析24h，过滤，冷冻干燥，获得海藻酸钠-聚二乙基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的海藻酸钠-聚二乙基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到0.5mg/mL的海藻酸钠-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液；取siRNA溶解于注射用水中，得到0.1mg/mL的siRNA溶液；
3)取5μL步骤(2)所述的siRNA溶液于离心管中，加入2μL 0.5mg/mL的三聚磷酸钠溶液，混匀，再加入24μL步骤(2)所述的海藻酸钠-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液，涡旋10s，离心，静置40min，即可制得所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂。
实施例5
1)取淀粉于烧瓶中，加入pH为7的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到20mg/mL的淀粉溶液，再加入与淀粉质量比为9：1的二乙基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在90℃下回流10min，取与淀粉质量比为0.1：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到50mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应5h，冷却至室温，透析48h，过滤，冷冻干燥，获得淀粉-聚二乙基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的淀粉-聚二乙基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到1.5mg/mL的淀粉-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液；取mRNA溶解于注射用水中，得到1mg/mL的mRNA溶液；
3)取0.5μL步骤(2)所述的核酸活性成分溶液于离心管中，加入0.5μL2mg/mL的三聚磷酸钠溶液，混匀，再加入4μL步骤(2)所述的淀粉-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液，涡旋10s，离心，静置40min，即可制得所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂。
实施例6
1)取果胶于烧瓶中，加入pH为6.5的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到20mg/mL的果胶溶液，再加入与果胶质量比为12：1的二乙基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在80℃下回流10min，取与果胶质量比为0.1：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到50mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应5h，冷却至室温，透析48h，过滤，冷冻干燥，获得果胶-聚二乙基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的果胶-聚二乙基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到2mg/mL的果胶-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液；取mRNA溶解于注射用水中，得到1mg/mL的mRNA溶液；
3)取0.5μL步骤(2)所述的核酸活性成分溶液于离心管中，加入0.5μL 1.5mg/mL的三聚磷酸钠溶液，混匀，再加入2μL步骤(2)所述的果胶-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液，涡旋15s，离心，静置20min，即可制得所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂。
实施例7
1)取甘露聚糖于烧瓶中，加入pH为6的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到25mg/mL的甘露聚糖溶液，再加入与甘露聚糖质量比为12：1的二乙基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在65℃下回流30min，取与甘露聚糖质量比为0.1：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到50mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应6h，冷却至室温，透析48h，过滤，冷冻干燥，获得甘露聚糖-聚二乙基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的甘露聚糖-聚二乙基二烯丙基氯化铵末溶解于超纯水中，得到2mg/mL的甘露聚糖-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液；取mRNA溶解于注射用水中，得到1mg/mL的mRNA溶液；
3)取0.5μL步骤(2)所述的核酸活性成分溶液于离心管中，加入0.5μL 0.5mg/mL的三聚磷酸钠溶液，混匀，再加入2μL步骤(2)所述的甘露聚糖-聚二乙基二烯丙基氯化铵溶液，涡旋15s，离心，静置20min，即可制得所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂。
试验例1：结构的测量
试验方法：取20mg实施例1步骤1)制得的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵于离心管中，加入1mL0.1％氘代盐酸完全溶解，取0.6mL溶液样品至核磁管中，放置仪器中进行核磁共振氢谱扫描。
实验结果如图1所示，4.85ppm处的质子峰为重水的溶剂峰，1.91ppm处是壳聚糖的乙酰基质子峰；3.72ppm处是聚二甲基二烯丙基氯化铵中五元环上与N相连—CH2—上的质子峰；3.01ppm处是N上所连—CH3的质子峰；5.56、5.86ppm处是CH2＝CH—的质子峰，这可能是聚合物末端双键。上述质子峰可说明二甲基二烯丙基氯化铵与壳聚糖成功反应得到壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵。
试验例2：导入系统与核酸的复合能力研究
准备裸siRNA备用。
制备样品一：12:1(CP:siRNA)
1)取壳聚糖于烧瓶中，加入pH为5的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到12mg/mL的壳聚糖溶液，再加入与壳聚糖质量比为6：1的二甲基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在80℃下回流10min，取与壳聚糖质量比为0.5：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到30mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应3h，冷却至室温，透析24h，过滤，冷冻干燥，获得壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到1mg/mL的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液；取siRNA溶解于注射用水中，得到0.5mg/mL的siRNA溶液；
3)取1μL步骤(2)所述的siRNA溶液于离心管中，再加入6μL步骤(2)所述的多糖-聚烯烃季铵盐类聚合物溶液，混匀，涡旋5s，离心，静置30min，即可制得样品一。
制备样品二：16:1(CP:siRNA)
制备方法基本与样品一的制备方法相同，不同之处仅在于步骤3)中所述的多糖-聚烯烃季铵盐类聚合物溶液的加入量为8μL。
制备样品三：24:1(CP:siRNA)
制备方法基本与样品一的制备方法相同，不同之处仅在于步骤3)中所述的多糖-聚烯烃季铵盐类聚合物溶液的加入量为12μL。
样品四：24:2:1(CP:ST:siRNA)为实施例1制得的产品。
样品五：24:1:1(CP:ST:siRNA)
制备方法基本与样品四的制备方法相同，不同之处仅在于步骤3)中三聚磷酸钠溶液的添加量为0.5μL。
试验方法：取0.24g琼脂糖于锥形瓶中，加入20mL1×TAE溶液，放入微波炉中加热使琼脂糖完全溶解，倒入凝胶槽中，冷却。分别将等量siRNA质量(0.1μg)的上述裸siRNA、以及样品一至五与1μL含染液的M5 6×DNA电泳上样缓冲液混合，并加到琼脂糖凝胶孔内，设置电泳电压为120V，室温下测试时间35min。
试验结果如图2所示，载体与核酸质量比在12：1时，载体没有与核酸很好复合，导致拖带现象的出现。载体与核酸质量比增加到16：1时，已没有出现拖带现象，说明在此质量比下，载体能达到很好的包封效果，两者达到很好的复合。同理，载体、核酸与交联剂质量比增加到24：2：1时，也达到很好的复合效果。
试验例3：基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的粒径研究
试验方法：将基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂(实施例1所述)按一定比例稀释，通过纳米粒度仪测试制剂的粒径及电位。
试验结果如图3所示，阳离子化多糖核酸类药物制的粒径为180nm，电位为+14.10mV。
试验例4：基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的细胞毒性研究
准备LIPO2000：赛默飞Lipofectamine2000转染试剂(货号：11668019)。
准备LIPO2000-siRNA：2μL LIPO2000与1μL的siRNA混合，静置10min得到。
CP：实施例1步骤1)的方法制得。
ST：1mg/mL的三聚磷酸钠溶液。
CP-ST(12:1)：
1)取壳聚糖于烧瓶中，加入pH为5的NaAc/HAc缓冲溶液，搅拌使其完全溶解，得到12mg/mL的壳聚糖溶液，再加入与壳聚糖质量比为6：1的二甲基二烯丙基氯化铵单体，磁力搅拌下混匀，在80℃下回流10min，取与壳聚糖质量比为0.5：1的过硫酸铵于烧杯中，加入超纯水使其完全溶解，得到30mg/mL的过硫酸铵溶液，再滴加进回流体系中，反应3h，冷却至室温，透析24h，过滤，冷冻干燥，获得壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末；
2)取步骤(1)所述的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵粉末溶解于超纯水中，得到1mg/mL的壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液；
3)取1μL 1mg/mL的三聚磷酸钠溶液于离心管中，再加入12μL步骤(2)所述的多糖-聚烯烃季铵盐类聚合物溶液，混匀，涡旋5s，离心，静置30min制得。
CP-siRNA(24:1)：制备方法同试验例2的样品三。
CP:ST:siRNA(24:2:1)为实施例1制得的产品。
试验方法：本实验选用BXPC3细胞为模型，考察基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的细胞毒性。将BXPC3细胞以1×104的密度接种于96孔板中，培养24h。控制相同的核酸质量(0.5μg)，将上述不同样品分别移至离心管中，加入Opti-MEN培养基至相同刻度，分别加入96孔板中，培养4h，去掉培养基，每孔用1640培养基清洗，去掉培养基，每孔加入100μL含有10％FBS的1640培养基，培养24h。每孔加入10μL的CCK8染液，培养2～4h。采用酶标仪在波长为450nm条件下测定样品的OD值，重复3次，计算细胞活力。
试验结果如图4所示，加入壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵(CP)的基本没有致死细胞，壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵与三聚磷酸钠交联后，细胞活力达到86％，相比LIPO2000细胞活力提高23％，说明载体具有更低的细胞毒性。壳聚糖-聚二甲基二烯丙基氯化铵结合核酸后，细胞活力显著降低，说明复合粒子具有较好的抗癌作用；当加入三聚磷酸钠交联剂后，细胞活性降低了3％，这可能源于加入交联剂后，降低原来的粒径，促进了细胞对复合粒子的吸收，从而降低了细胞活性。基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂与基于LIPO2000的核酸药物复合物具有相近的细胞毒性，但基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂具有更高的安全性。
试验例5：基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的基因沉默研究
准备GFP绿色荧光蛋白。
LIPO2000-siRNA的制备方法与试验例4的LIPO2000-siRNA的制备方法相同。
CP:ST:siRNA(24:2:1)为实施例1制得的产品。
CP:ST:siRNA(24:1:1)的制备方法与试验例2的样品五的制备方法相同。
CP:ST:siRNA(24:0:1)的制备方法与试验例4的CP-siRNA(24:1)的制备方法相同。
试验方法：本实验选用BXPC3细胞为模型，考察基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的基因沉默效果。(1)将BXPC3细胞以1×104的密度接种于12孔板中，培养24h。控制相同的核酸质量(0.5μg)，将上述不同样品移至离心管中，加入Opti-MEN培养基至相同刻度，分别加入12孔板中，培养4h，去掉培养基，每孔用1640培养基清洗，去掉培养基，每孔加入1mL含有10％FBS的1640培养基，培养24h。(2)根据M5 Universal RNA Mini Kit试剂盒提取细胞总RNA，RNA浓度用Micro Drop分光光度计测量。(3)提取的RNA于65℃孵育5min，立即冰浴2min，并加入DEPC-ddH2O和5×M5 RT Super Mix，混匀，离心，进行逆转录操作，完成后得到cDNA，冰浴并用无菌水稀释5倍，-20℃保持。(4)配置PCR反应体系(cDNA、引物、2×RealtimePCR Super Mix、ddH2O)，按照2×Realtime PCR Super Mix试剂盒设置温度程序并开始测试。
试验结果如图5所示，基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂与基于LIPO2000的核酸药物复合物的TGF-β1基因沉默效果相近，但基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的COX-2基因的沉默效果优于基于LIPO2000的核酸药物复合物，说明本发明制剂具有良好的基因沉默效果。
试验例6：基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的耐血清研究
试验方法：基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂(实施例1所示方法制得)与含10％FBS的1640培养基混合，在37℃培养箱中放置0h、1h、2h、24h，再通过琼脂糖凝胶实验测试siRNA的剩余情况。
试验结果如图6所示，放置2h后，可在凝胶孔中观察到siRNA，但比0h的siRNA亮度低；放置24h后，siRNA的亮度虽然很低，但siRNA有一部分没有被血清分解。这说明基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂具有一定的耐血清效果。
试验例7：基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂含血清转染的细胞活性研究
试验方法：按照试验例4的实验方法测试。其中，把Opti-MEN培养基换成含10％FBS的1640培养基。
试验结果如图7所示，LIPO2000-siRNA与血清混合转染，对细胞活性基本没有影响。基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂在含血清与不含血清转染后的细胞活性相近，说明基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂具有一定的耐血清效果，含血清的环境下也不影响核酸的转染。
试验例8：基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的雾化研究
试验方法：将1mL实施例1制得的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂通过雾化器雾化，离心管在冰浴环境下收集雾化制剂，雾化器中剩余的药剂为剩余制剂。按照试验例5的实验方法测试，其中，试验例5是在6月份进行的实验，本试验是在10月份进行。
试验结果如图8所示，基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂、雾化阳离子化多糖核酸类药物制剂与雾化剩余的阳离子化多糖核酸类药物制剂三者的PCR结果相近，没有显著差别，且具有良好的基因沉默效果。这说明基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂经过雾化后没有改变其结构，并保持原有的基因沉默效果。本制剂可通过雾化，扩展给药途径，拓展制剂的治疗领域。
综上所述，本发明所述的基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂具有较高的癌细胞毒性，且具有较低的细胞毒副作用。其次，基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂的基因沉默效率与基于LIPO2000的复合制剂的基因沉默效率相近，说明本发明所述制剂具有高的转染效率与基因沉默效率。另外，耐血清实验阐明，基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂具有耐血清性能，在血清中也能保持良好的癌细胞毒性。最后，基于阳离子化多糖的核酸类药物制剂通过雾化，可保持原有的基因沉默效果，扩展了基因药物的给药途径。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种药物载体，其特征在于：其由多糖和烯烃季铵盐类单体聚合而成，其中，所述烯烃季铵盐类单体中烯基的个数为2个及以上。
2.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于：所述烯烃季铵盐类单体为如下结构式所示物质中的一种或多种：
Figure FDA0002811854870000011
其中，R1、R6独立地选自氢、碳原子数为1～3的烷基、碳原子数为2～5的烯基或碳原子数为2～5的炔基；R2、R5独立地选自碳原子数为1～3的烷基、碳原子数为2～5的烯基或碳原子数为2～5的炔基；n、m独立地为0～3之间的数；R3、R4独立地选自碳原子数为1～3的烷基、碳原子数为2～5的烯基或碳原子数为2～5的炔基。
3.根据权利要求1或2所述的药物载体，其特征在于：所述多糖为壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、淀粉、果胶、甘露聚糖中的至少一种；所述烯烃季铵盐类单体为二甲基二烯丙基氯化铵、二乙基二烯丙基氯化铵中的至少一种。
4.一种如权利要求1至3中任一项所述的药物载体的制备方法，其特征在于：使所述多糖和所述烯烃季铵盐类单体在引发剂的存在下进行聚合反应制得。
5.根据权利要求4所述的药物载体的制备方法，其特征在于：所述多糖与所述烯烃季铵盐类单体的投料质量比为1:3～12；和/或，
所述多糖以将所述多糖溶解在缓冲液中制得的多糖溶液的形式投料；优选地，所述缓冲液为pH5～7的醋酸盐缓冲液；优选地，所述多糖溶液中所述多糖的浓度为5mg/mL～25mg/mL；和/或，
所述聚合反应在加热回流的状态下进行；和/或，
所述多糖与所述引发剂的投料质量比为1:0.1～1；和/或，
所述引发剂以引发剂水溶液的形式投料；优选地，所述引发剂水溶液中所述引发剂的浓度为10mg/mL～50mg/mL；优选地，所述引发剂为过硫酸铵；和/或，
所述制备方法的具体步骤为：将所述多糖加入缓冲液中配制成多糖溶液，然后加入所述烯烃季铵盐类单体，加热回流10～30min，然后向反应体系中滴加引发剂水溶液，加热回流反应2～6h，经后处理得到所述药物载体；优选地，所述后处理的方法为：将反应液冷却，透析，然后经过滤、冷冻干燥制得所述药物载体。
6.一种核酸类药物制剂，其特征在于：其包括载体和核酸活性成分，其中，所述载体为权利要求1至3中任一项所述的药物载体，或权利要求4或5所述制备方法制得的药物载体。
7.根据权利要求6所述的核酸类药物制剂，其特征在于：所述核酸活性成分为小干扰核酸、微核酸、信使核糖核酸、质粒DNA中的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述的核酸类药物制剂，其特征在于：所述的载体与所述核酸活性成分的质量比为2～32:1；优选为8～32:1；和/或，
所述核酸类药物制剂还包括交联剂；优选地，所述交联剂为三聚磷酸钠；优选地，所述交联剂与所述核酸的质量比为0.5～2:1；和/或，
所述核酸类药物制剂为注射剂型或雾化剂型；和/或，
所述核酸类药物制剂呈纳米颗粒状。
9.一种如权利要求6至8中任一项所述的核酸类药物制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
将所述药物载体配制成药物载体水溶液；
将所述核酸活性成分配制成核酸活性成分水溶液；
将所述药物载体水溶液与所述核酸活性成分水溶液混合，选择性地加入交联剂，经混合、离心、静置制得所述核酸类药物制剂。
10.根据权利要求9所述的核酸类药物制剂的制备方法，其特征在于：所述药物载体水溶液中所述药物载体的浓度为0.5mg/mL～2mg/mL；和/或，
所述核酸活性成分水溶液中的所述核酸活性成分的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL。
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