CN105732764A - 一种基于可逆键合材料的蛋白质n-端富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于可逆键合材料的蛋白质N-端富集方法，包括：蛋白质胍基化标记，蛋白质固载，N端肽段的还原释放。首先将蛋白侧链氨基进行选择性的胍基化标记封闭侧链氨基，然后通过剩余的末端氨基将蛋白固载于固体材料上，酶解蛋白以游离中间肽段保留N端肽段于固体材料上，最后对键合链进行断裂从而得到蛋白N端的释放。本发明的优点是可逆键合材料与氨基的化学键合活性高，富集效率高，且可避免非特异性吸附，使得蛋白N端的富集具有优异的富集效率与选择性。可用于复杂生物样品中蛋白质组N端肽段的富集和鉴定。

Description

一种基于可逆键合材料的蛋白质N-端富集方法

技术领域

本发明涉及一种基于可逆键合材料的蛋白质N-端富集方法，实现蛋白N-端高效高选择性富集。

背景技术

蛋白质末端的修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一，常见的N端乙酰化与信号肽剪切与蛋白质的稳定性、定位及活性相关。此外，生物体内蛋白的水解是体内最常见的翻译后修饰之一，促使蛋白产生新的末端，此类过程与细胞凋亡、趋化因子加工等众多生物学过程及生理机能密切相关。末端蛋白组学的建立也大大的促进了蛋白水解酶底物鉴定及位点分析等领域的发展。但是，蛋白的末端不具有如磷酸化糖基化等修饰可进行直接富集的靶标，因为，如何有效的区分末端肽段与酶解所产生的中间肽段进而实现末端肽段的有效富集，对于了解生物过程及寻找疾病的生物标志物都将起到重要作用。

蛋白末端的富集主要分为两大类，正向富集与反向富集。反向富集方法通过氨基活性颗粒或带有标签的氨基活性试剂去除中间肽段从而得到末端肽段(Molecular&CellularProteomics2012,11,832-842；NatureBiotechnology2010,28,281-288；)。由于中间肽段难以去除完全，限制了方法的选择性；此外，此类方法需要采用大量的材料键合或吸附中间肽段，从而引起大量的非特异性吸附，而造成末端肽段的丢失。正向富集通常在蛋白末端引入亲和标签，酶解后通过亲和标签实现蛋白N端富集(Cell2008,134,866–876；AnalyticalChemistry2013,85,6826-6832；ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences2009,106,19310-19315)，此类方法避免了大量材料的非特异性吸附所引起的末端丢失，但是步骤繁琐，且基于通常的生物素-亲和素相互作用的富集机理，由于其相互作用是非共价的，从而限制了富集能力与抗干扰性。

为克服以上方法所存在的问题，我们并不直接在蛋白N端引入亲和标签，而是将蛋白末端共价键合于材料上，并实现其可逆释放，以实现蛋白质N末端的高效高选择性富集。

发明内容

本发明发展了一种基于可逆键合材料的蛋白质N-端富集方法，富集效率高，选择性强。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1)在强碱性条件下，选择性的对肽段侧链氨基进行胍基化

将蛋白进行变性、还原、烷基化后，采用氢氧化钠调节pH至9-12，加入终浓度为0.1-2MO-甲基异脲和终浓度为1-6M盐酸胍或尿素，于4-10℃振荡反应6-36h，得溶液A；

2)通过蛋白末端剩余的氨基将蛋白键合于固体材料上

将溶液B的pH调节至6-9，加入固体材料，此材料表面键合的链为中间含可断裂基团，末端含可与氨基反应的活性基团，于10-60℃振荡反应2-12h。蛋白键合完成后，加入10-1000mM羟胺以封闭材料表面未反应的活性基团，振荡反应10min-2h后去除上清，加入10-100mM碳酸氢铵溶液，得溶液B。

3)将蛋白进行酶解

于溶液B中加入蛋白水解酶，于37℃中孵育12-24h后去除上清中游离的肽段，采用不同的清洗溶液去除非特异性吸附，仅获得键合有末端的材料。其中清洗溶液分别为1-6M尿素，200-2000mM氯化钠,30％-80％乙腈。

4)还原二硫键，释放末端肽段

往材料中加入10-1000mM的二硫苏糖醇(DTT)，10-60℃振荡30-120min，加入2-4倍DTT质量的碘乙酰胺(IAA)，室温避光振荡30-120min后，收集上清液，除盐，冻干，得到蛋白N端。

本发明的有益效果为：

1、胍基化反应的效率高选择性高，从而避免了中间肽段的共富集和末端肽段的丢失；

2、富集材料与末端的共价键合，使方法具有很好的选择性。

3、无需对样品进行除盐冻干等操作，减少了样品的损失。

4、不需常规的膜过滤除盐，避免了内源性肽段的损失，因此适合用于含大量内源性肽段样品的N端富集，比如血清样品。

附图说明

图1基于可逆键合材料的蛋白N-末端富集流程；

图2(a)富集前胍基化与磷酸根标记的牛血清蛋白(BSA)胰蛋白酶酶解产物；

图2(b)富集后带有烷基化巯基标签的牛血清蛋白N-端肽段；

图2(c)富集前胍基化与磷酸根标记的溶菌酶胰蛋白酶酶解产物；

图2(d)富集后带有烷基化巯基标签的溶菌酶N-端肽段。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，蛋白经过变性还原烷基化后，进行胍基化和材料固载，将蛋白进行酶解去除游离的肽段，仅获得键合于材料上的N-端肽，通过功能团的断裂，释放蛋白N-端，从而得到蛋白N-端。

以牛血清蛋白和溶菌酶为样品，100μg蛋白溶于100μl6M盐酸胍，加入2μl100mM二硫苏糖醇，56℃变性还原1h后，加入2μl200mM碘乙酰胺避光反应30min后，采用NaOH将溶液的pH调至10后，往溶液中加入O-甲基异脲进行胍基化，其中O-甲基异脲终浓度为1M，4℃振荡反应24h，反应完成后将溶液pH调回8，然后往溶液中加入键合有含二硫键的氨基活性基团材料固载蛋白，于37℃反应12h。在以过程中均保持溶液中盐酸胍浓度为6M，防止蛋白的沉淀，并采用不含氨的缓冲液三乙二胺碳酸盐(pH8)。反应完成后，加入100mM羟胺，调节体系pH为8，振荡反应1h后，去除上清，加入50mM碳酸氢铵。于以上溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，其中酶用量为样品质量的1/50(w/w)，温度为37℃，酶解12h后，离心去除上清液，并分别采用清洗溶液2M尿素，2M氯化钠,80％ACN洗去材料上的非特异性吸附，最后加入100mM二硫苏糖醇，200mM碘乙酰胺还原二硫键释放材料键合的N-端肽段，收集上清，除盐，冻干，得到蛋白N-端肽段。

Claims (10)

1.一种基于可逆键合球的蛋白质N-端富集方法，包括：

蛋白质样品通过选择性的胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基，然后通过剩余的蛋白末端氨基将蛋白键合于固体材料上，蛋白在球上进行酶解使中间肽段游离于溶液，蛋白N端仍被键合，最后对键合链进行断裂从而得到蛋白N端的释放并进行鉴定。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述选择性的胍基化反应封闭蛋白质样品的侧链氨基，将蛋白质溶于含2-10M盐酸胍，10-100mM二硫苏糖醇的溶液中，于25-70℃进行变性及二硫键的还原，反应30-120min后，加入20-200mM碘乙酰胺对游离的巯基进行烷基化，于室温避光反应10-120min后，采用氢氧化钠调节pH至9-12，加入O-甲基异脲和盐酸胍或尿素，于4-10℃振荡反应6-36h，得溶液B。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述O-甲基异脲的终浓度范围为0.1-2M，盐酸胍或尿素的终浓度范围为1-6M。

4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的通过剩余的蛋白末端氨基将蛋白键合于固体材料上，具体步骤如下，

将所述的溶液B的pH调节至6-9，加入固体材料，于10-60℃振荡反应2-12h；当采用链末端为醛基的材料时，另加入终浓度6-600mM的氰基硼氢化纳；蛋白键合完成后，加入10-1000mM羟胺以封闭材料表面未反应的活性基团，振荡反应10min-2h,去除上清，加入10-100mM碳酸氢铵，得溶液C。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的材料的加入量为蛋白质量的10-1000倍；

所述的蛋白键合材料表面键合的链为中间含可断裂基团、末端含可与氨基反应的活性基团，具体为材料表面键合的链为中间含二硫键，邻二羟基，腙，或希夫碱基团中的一种，末端含可与氨基反应的活性基团。

6.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述的蛋白在球上进行酶解使中间肽段游离于溶液，具体步骤如下：

于所述的溶液C中加入蛋白水解酶，于25-50℃中振荡孵育6-24h后，去除上清，并采用清洗溶液清洗材料以去除非特异性吸附。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的清洗溶液分别为1-6M尿素；200-2000mM氯化钠；或30％-80％乙腈中的一种或二种以上。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的对材料表面的键合链进行断裂从而得到蛋白N端的释放并进行鉴定，具体步骤如下：

往材料中加入10-1000mM的二硫苏糖醇，10-60℃振荡30-120min，加入2-4倍二硫苏糖醇质量的碘乙酰胺，室温避光振荡30-120min后，收集上清液，除盐，冻干。

9.按照权利要求6所述方法，其特征在于：

采用的酶可为胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，弹性蛋白酶，胃蛋白酶，或内肽酶Glu-C。

10.按照权利要求1所述的方法，其用于复杂蛋白质样品，内源性长肽，或小蛋白N-端肽段的富集及鉴定。