CN103884574A - 一种集成化的蛋白质c-端富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种集成化蛋白质C-端富集方法，包括：选择性二甲基化标记、DL-甘油醛-3-磷酸标记、二氧化钛亲和去除。蛋白质样品的酶解产物首先在酸性条件下在反相捕集柱上进行选择性的N-端氨基二甲基化标记，然后采用DL-甘油醛-3-磷酸柱上标记肽段侧链氨基，最后采用TiO₂材料亲和去除标记有磷酸根的肽段，从而得到蛋白C-端，中间无需进行样品转移、除盐冻干。本发明的优点是标记效率高、选择性高、处理步骤简单、节约时间与样品用量、且减少了样品的丢失污染问题。此外，该方法与色谱质谱分离鉴定平台也显示出良好的兼容性。

Description

一种集成化的蛋白质C-端富集方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质C-端富集方法，并将过程集成化，实现蛋白C-端快速高效富集。

背景技术

Bottom-up策略在目前蛋白组分离测定中的应用最为广泛。然而，该策略将数万个蛋白质酶解成数十万、甚至数百万条肽段后进行分离鉴定，不仅对色谱分离提出很高的挑战，而且也会影响质谱鉴定的准确性。因此，发展针对特征性肽段的分离鉴定新方法对提高蛋白分离鉴定能力具有重要意义。根据统计分析，蛋白C-末端区域具有高度序列特异性，蛋白末端4个氨基酸序列对于74%~97%的蛋白是唯一的[1]，因此末端的序列能在一定程度上代表蛋白。因此，相对“鸟枪法”，采用蛋白的C-末端进行蛋白鉴定无需要求高度的序列覆盖率，大大的降低了样品的复杂程度和动态范围，从而大大提高蛋白鉴定的通量，而且不损失鉴定的准确度。

Oliver Schilling等采用乙醇胺在酶解前对末端和侧链羧基进行封闭后，进行酶切，随后采用带有多个氨基的聚合物链与羧基的共价键合去除非C-端肽。Guoqiang Xu等报道了一种对C-末端肽进行正向富集的方法。利用羧肽酶Y在pH 11.6时转肽酶的活性，在蛋白C-末端特异性的标记上一个带有生物素的氨基化合物，经酶切后，采用生物素-抗生素亲和作用对C-末端肽进行亲和富集。根据C-末端与非C-末端所带电荷的差异，还可以采用离子交换色谱富集不含碱性氨基酸的C-末端肽。但是这些富集方法存在反应效率低，存在难以控制的副反应，过程繁琐耗时，特异性不足等缺点。

为克服以上方法所存在的问题，建立一种高效简便的富集方法，我们选择了效率高且简易快速的标记方法，且将过程集成化，进一步简化操作，并大大缩减了时间和样品用量，提高富集的选择性和通量。

发明内容

本发明发展了一种集成化的蛋白质C-端富集方法，标记效率高，选择性高，且将过程集成化，无需样品的转移，处理步骤简单，无需离线除盐冻干步骤，大大缩减了时间与样品用量。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

将二甲基化标记、DL-甘油醛-3-磷酸标记与TiO₂去除过程集成化。

1、采用Lys-C酶切蛋白样品，产生除C-端肽外均含有侧链氨基的肽段。

2、在反相C18捕集柱上于酸性条件下，选择性的对肽段末端氨基进行二甲基化标记。

3、在反相C18捕集柱上，采用DL-甘油醛-3-磷酸标记肽段剩余的侧链氨基。

4、连接反相捕集柱与TiO₂捕集柱，洗脱反相柱上肽段至TiO₂柱，选择性吸附标有磷酸根的肽段，流出的组分即为蛋白C-端肽。

具体过程如下：

蛋白质样品采用Lys-C酶切；

酶解产物上样到C18反相捕集柱上，在pH=3-5酸性条件下于C18反相捕集柱通入终浓度0.04%-0.08%(v/v)甲醛和6-10mM氰基硼氢化钠的1%-0.5%醋酸溶液，使肽段末端的氨基被二甲基化，标记完C18反相捕集柱通入A相除去过量标记试剂；C18反相捕集柱通入终浓度30-45mg/mLDL-甘油醛-3-磷酸和6-10mM氰基硼氢化钠的100mM磷酸氢二钠缓冲液（pH=8）使肽段赖氨酸侧链氨基被磷酸化，标记完C18反相捕集柱通入A相除去过量标记试剂；

C18反相捕集柱通入B相洗脱肽段至TiO₂柱上选择性吸附去除标有磷酸根的肽段，流出的不被吸附的组分即为蛋白C-端肽段；

按体积百分浓度计，A相：2%乙腈+0.1%三氟乙酸，其余为水；B相60%-80%乙腈+0.1%-5%三氟乙酸，其余为水。

采用Lys-C酶切，产生除C-端外均带有侧链氨基的肽段，酶用量为蛋白质质量的1/50-1/100（w/w），酶解时间为12-16h，酶解pH=7.5-8.5。

在C18柱上结合二甲基标记末端氨基、DL-甘油醛-3-磷酸标记侧链氨基与除盐步骤：0.15mm i.d×50mm的C18捕集柱上二甲基化标记末端氨基时间为4-10min；DL-甘油醛-3-磷酸标记侧链氨基的流速为1-0.2μL/min，标记时间为60-80min。

TiO₂选择性去除带有磷酸根肽段，采用微米级TiO₂装填捕集柱与C18柱相连，吸附由C18柱洗脱组分中带磷酸根的肽段：

TiO₂与蛋白的用量比为100/1-50/1(w/w)，TiO₂的上样条件与C18柱的洗脱条件一致，按体积百分浓度计，流动相为60%-80%乙腈+0.1%-5%三氟乙酸，其余为水。

本发明的有益效果为：

1、反应效率高、副反应少、选择性高。

2、操作步骤简单。

3、不需要离线的标记、除盐、冻干，大大缩减了时间且降低了样品损失、污染的可能性。

4、过程的集成化，可以与分离鉴定技术联用，为实现高通量的蛋白分析提供技术支撑。

附图说明

图1（a）蛋白C-末端富集流程；(b)集成化装置示意图，包括（1）：C18捕集柱；（2）：六通阀；（3）：TiO₂捕集柱。

图2、β-酪蛋白C-末端富集质谱图，a:β-酪蛋白Lys-C酶解产物；b:选择性二甲基标记肽段末端氨基（+28Da）；c:DL-甘油醛-3-磷酸标记肽段侧链氨基（+154Da）；d:β-酪蛋白C-末端（TiO₂吸附标有磷酸根肽段）。

具体实施方式

实施例1

如图1所示，蛋白由Lys-C酶解产生除C-端外均带有侧链氨基的肽段，将酶解产物通入C18捕集柱，经柱上标记除盐后洗脱至TiO₂捕集柱上吸附去除标有磷酸根的肽段，得到C-末端肽。

以β-酪蛋白为样品，采用Lys-C酶解，其中酶用量为样品质量的1/100(w/w)，温度为37℃，pH=8，酶解12h。将酶解产物推入C18捕集柱(0.15mm i.d×50mm)，通入2%ACN除盐后。通入二甲基化标记溶液，其中标记溶液组成为500μL 1%醋酸+5μL 4%甲醛水溶液+5μL 0.6M氰基硼氢化钠溶液(1%醋酸)，流速5μL/min，标记时间8min，标记完成后通入2%ACN去除过量标记溶液。通入磷酸根标记溶液，其中标记溶液组成为30μL 45mg/mL DL-甘油醛-3-磷酸水溶液(pH=7)+3μL 6M氰基硼氢化钠溶液(100mM磷酸二氢钠，pH=8)，流速0.5μL/min，标记时间60min，标记完成后通入2%ACN去除过量标记溶液，通入80%ACN洗脱肽段至TiO₂柱上，收集流出组分进行质谱分析。

Claims (6)

1.一种集成化的蛋白质C-端富集方法，包括：

蛋白质样品采用Lys-C酶切；蛋白Lys-C酶解产物的选择性二甲基化柱上标记肽段末端氨基，DL-甘油醛-3-磷酸柱上标记肽段侧链氨基，TiO₂选择性亲和去除标有磷酸根肽段。

2.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：

1）采用Lys-C酶切蛋白样品，产生除C-端肽外均含有侧链氨基的肽段；

2）在反相C18捕集柱上于酸性条件下，选择性的对肽段末端氨基进行二甲基化标记；

3）在反相C18捕集柱上，采用DL-甘油醛-3-磷酸标记肽段剩余的侧链氨基；

4）连接反相捕集柱与TiO₂捕集柱，洗脱反相柱上肽段至TiO₂柱，选择性吸附标有磷酸根的肽段，流出的组分即为蛋白C-端肽。

3.按照权利要求1或2所述富集方法，其特征在于

具体过程如下：

蛋白质样品采用Lys-C酶切；

酶解产物上样到C18反相捕集柱上，在pH=3-5酸性条件下于C18反相捕集柱通入终浓度0.04%-0.08%(v/v)甲醛和6-10mM氰基硼氢化钠的1%-0.5%醋酸溶液，使肽段末端的氨基被二甲基化，标记完C18反相捕集柱通入A相除去过量标记试剂；C18反相捕集柱通入终浓度30-45mg/mLDL-甘油醛-3-磷酸和6-10mM氰基硼氢化钠的100mM磷酸氢二钠缓冲液（pH=8）使肽段赖氨酸侧链氨基被磷酸化，标记完C18反相捕集柱通入A相除去过量标记试剂；

C18反相捕集柱通入B相洗脱肽段至TiO₂柱上选择性吸附去除标有磷酸根的肽段，流出的不被吸附的组分即为蛋白C-端肽段；

按体积百分浓度计，A相：2%乙腈+0.1%三氟乙酸，其余为水；B相60%-80%乙腈+0.1%-5%三氟乙酸，其余为水。

4.按照权利要求3所述富集方法，其特征在于：采用Lys-C酶切，产生除C-端外均带有侧链氨基的肽段，酶用量为蛋白质质量的1/50-1/100（W/W），酶解时间为12-16h，酶解pH=7.5-8.5。

5.按照权利要求3所述富集方法，其特征在于：在C18柱上结合二甲基标记末端氨基、DL-甘油醛-3-磷酸标记侧链氨基与除盐步骤：0.15mm i.d×50mm的C18捕集柱上二甲基化标记末端氨基时间为4-10min；DL-甘油醛-3-磷酸标记侧链氨基的流速为1-0.2μL/min，标记时间为60-80min。

6.按照权利要求3所述富集方法，其特征在于：

TiO₂选择性去除带有磷酸根肽段，采用微米级TiO₂装填捕集柱与C18柱相连，吸附由C18柱洗脱组分中带磷酸根的肽段：

TiO₂与蛋白的用量比为100/1-50/1(w/W)，TiO₂的上样条件与C18柱的洗脱条件一致，按体积百分浓度计，流动相为60%-80%乙腈+0.1%-5%三氟乙酸，其余为水。

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