CN105319116B - 基于磁性微球的蛋白质n末端肽段分离方法 - Google Patents

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本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于磁性微球的蛋白质N末端分离方法。本发明方法的步骤包括：合成磁性纳米粒子；对蛋白进行氨基封闭，再加入胰蛋的酶，得到氨基封闭蛋白的酶解液；用特劳特试剂和氨基封闭蛋白的酶解液进行反应，非N末端肽段得到巯基衍生；加入磁性纳米粒子对含巯基的非N末端肽段进行分离富集；最后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定。本发明方法可以方便高效地去除非N末端肽段，提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。

Description

基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白质N末端肽段分离方法。
背景技术
鉴定蛋白质N末端序列及其翻译后修饰对于理解蛋白质的生物功能等具有重要意义。如蛋白质N末端的乙酰化影响蛋白质的稳定性；蛋白质N末端泛素化也影响蛋白质在体内的降解等。
目前，蛋白质N末端的方法主要基于正向富集和反向去除策略。正向富集策略的主要原理是利用特异性材料对衍生上特异性标签的蛋白质N末端进行富集，而使得排除其他非末端肽段的干扰。反相去除策略主要利用非末端肽上的游离氨基，利用氨基活性材料对其进行分离，使得N末端肽段得到富集。反相去除方法与正向富集方法相比，从方法设计上来看，可以用于分离富集包括N末端氨基游离和因化学修饰而导致氨基封闭的蛋白N末端肽段。因此，许多不同的氨基反应材料都被开发用于非末端肽段的有效去除，其中，包括三氟乙磺酸基材料，醛基材料，环氧基材料等，这些材料利用了氨基的亲核性，对非N末端肽段进行去除。
为进一步改善非N末端肽段去除效果，需要探索更高效的新型去除材料。有文献表明，利用特劳特试剂（Traut’s Reagent）可以对氨基进行高效快速的巯基衍生。另一方面，磁性纳米颗粒（Fe3O4）具有良好的亲水性、大的比表面积和良好的磁响应，因此，被广泛用于生物和环境分析中。与此同时，磁性纳米粒子也可以和巯基相互作用，可以在温和的条件下结合。与以石墨烯为基底的金球修饰材料相比，磁性纳米粒子非特异性吸附更小。当对蛋白酶解液进行巯基衍生后，再利用磁性纳米颗粒对巯基衍生后的非末端肽进行去除，便可以实现蛋白质N末端的高效分离鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法。
本发明提供的基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法，其基本步骤为：
（1）首先，合成磁性纳米粒子（Fe3O4）；
（2）对蛋白进行氨基封闭，再加入胰蛋白酶，加入量为蛋白重量的2.5%-5%，得到氨基封闭蛋白的酶解液；
（3）用特劳特试剂和氨基封闭蛋白的酶解液进行反应，非N末端肽段得到巯基衍生；
（4）加入磁性纳米粒子（Fe3O4）对含巯基的非N末端肽段进行分离富集；
（5）最后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）进行分析鉴定。
本发明方法的具体操作步骤如下：
（1）通过水热法合成磁性纳米粒子Fe3O4 ；
（2）制备氨基封闭蛋白的酶解液；
（3）将氨基封闭蛋白的酶解液溶于（pH大于等于7.2）无氨的缓冲液（包括三乙胺溶液等）中，在蛋白酶解液中添加0.1-20倍重量的特劳特试剂，置于20-60 ℃反应0.5-12小时；
（4）将100-1000倍重量的磁性纳米粒子加入巯基衍生后的蛋白酶解液中，置于20-60 ℃反应0.5-12 h，或者室温、20-37 ℃下过夜反应，含巯基的非末端肽被去除，N末端肽段在上清液中得到保留；
（5）取上清液，进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）进行分析鉴定。
本发明中，所述通过水热法合成Fe3O4磁性纳米粒子的流程为：称取一单位重量六水合三氯化铁（FeCl3· 6H2O）加入到55倍单位体积乙二醇中，磁力搅拌至完全溶解；称取2.7倍单位重量无水乙酸钠并将其与上述溶液混合，再搅拌至混合均匀；将溶液转移至 200mL反应釜中，200 ℃加热8-16 h。冷却至室温。将得到的磁性微球在磁铁的辅助下用乙醇洗涤数次；50 ℃烘干5 小时以上。
本发明中，所述对蛋白进行氨基封闭的具体操作步骤如下：
（1）将蛋白溶于高浓度（一般为4 M以上，如为4 M-10M）盐酸胍或尿素中进行变性处理；
（2）用等体积40-100 mM 三乙胺碳酸氢盐稀释后，再在溶液中加入5-8 mM 二硫苏糖醇，在60 ℃或以上温度（一般为60-80 oC）中反应至少0.5小时（一般为0.5-1小时）后，再加入2-2.5倍浓度（相较于二硫苏糖醇）的碘乙酰胺，闭光反应0.5-1小时；
（3）用50-100 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液（pH 6.5）对蛋白进行溶液置换，并重复2次以上（一般为2-3次）置换动作；
（4）加入40-60 mM 甲醛和一半浓度的氰基硼氢化钠反应4-16小时，或在反应4小时后，再加入0.5-1倍剂量甲醛和氰基硼氢化钠反应2-10小时；
（5）用20-100 mM 三乙胺碳酸氢盐对蛋白进行溶液置换，并重复2次以上（一般为2-3次）置换动作。
本发明中，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析与常规分析相同，具体步骤为，取0.1μg 蛋白酶解液于靶板上，再在蛋白靶点上添加1μL 4 mg/mlα-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质,待液体干燥后，进入机器进行分析。
利用本发明方法可以实现蛋白质N末端肽段高效快速地分离。
附图说明
图1为磁性纳米颗粒的扫面电镜图。
图2为GR和ER肽段混合液经磁性纳米粒子去除前后的MALDI-ToF图。
图3为实验流程图。
具体实施方式
实施例1：
一种基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法，具体步骤如下：
（1）将氨基封闭牛血清白蛋白的酶解液溶于（pH为7.2或更高）无氨的缓冲液中，包括三乙胺溶液等，在蛋白酶解液中添加5倍重量的特劳特试剂，置于60 ℃反应1 h；
（2） 将300倍重量的磁性纳米粒子加入巯基衍生后的蛋白酶解液中，置于60 ℃反应1 h，含巯基的非末端肽被去除，N末端肽段在上清液中得到保留；
（3）取上清液，进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定，得到人血清白蛋白的N末端肽段1249.6 Da。
实施例2：
一种基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法，具体步骤如下：
（1）将乙酰化肽段GR（1021.5 Da)和氨基游离肽段ER溶于（1282.6 Da)（pH为7.2或更高）无氨的缓冲液中，包括三乙胺溶液等，在肽段混合液中添加5倍重量的特劳特试剂，置于60 ℃反应1 h；
（2） 将500倍重量的磁性纳米粒子加入巯基衍生后的肽段混合液中，置于60 ℃反应2 h，含巯基的非末端肽ER被去除，乙酰化肽段GR（N末端肽段）在上清液中得到保留；
（3）取上清液，进入基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定，得到GR的信号1021.5 Da。

Claims (4)

1.一种基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）首先，合成磁性纳米粒子：Fe3O4；
（2）对蛋白进行氨基封闭，再加入胰蛋白酶，加入量为蛋白重量的2.5%-5%，得到氨基封闭蛋白的酶解液；
（3）然后，用特劳特试剂和氨基封闭蛋白的酶解液进行反应，非N末端肽段得到巯基衍生；
（4）加入磁性纳米粒子Fe3O4对含巯基的非N末端肽段进行分离富集；
（5）最后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析鉴定。
2.根据权利要求1所述的基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法，其特征在于，所述对蛋白进行氨基封闭的具体操作步骤如下：
（1）将蛋白溶于4 M以上的高浓度盐酸胍或尿素中进行变性处理；
（2）用等体积40-100 mM 三乙胺碳酸氢盐稀释后，再在溶液中加入5-8 mM 二硫苏糖醇，在60℃以上温度反应至少0.5小时后，再加入二硫苏糖醇2-2.5倍浓度的碘乙酰胺，闭光反应0.5-1小时；
（3）用50-100 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液 对蛋白进行溶液置换，并重复2次以上置换动作；
（4）加入40-60 mM 甲醛和甲醛一半浓度的氰基硼氢化钠反应4-16小时，或在反应4小时后，再加入0.5-1倍剂量甲醛和氰基硼氢化钠反应2-10小时；
（5）用20-100 mM 三乙胺碳酸氢盐对蛋白进行溶液置换，并重复2次以上置换动作。
3.根据权利要求1所述的基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法，其特征在于，所述用特劳特试剂和氨基封闭蛋白的酶解液进行反应，非N末端肽段得到巯基衍生的过程为：将氨基封闭蛋白的酶解液溶于无氨的缓冲液中，在蛋白酶解液中添加0.1-20倍重量的特劳特试剂，置于20-60 ℃反应0.5-12小时。
4.根据权利要求1所述的基于磁性微球的蛋白质N末端肽段分离方法，其特征在于，所述加入磁性纳米粒子Fe3O4对含巯基的非N末端肽段进行分离富集的过程为：将100-1000倍重量的磁性纳米粒子加入巯基衍生后的蛋白酶解液中，置于20-60 ℃反应0.5-12 h，或者20-37 ℃下过夜反应，含巯基的非末端肽被去除，N末端肽段在上清液中得到保留。
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