CN102056938A - 从复杂样品选择性富集n-末端修饰的肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过结合特定的多肽/肽标记和分级策略与靶向待分析的N-末端片段的特定化学和/或酶反应来允许从复杂样品中选择性富集多肽和/或肽的N-末端片段的方法。
Description
技术领域
本发明涉及通过组合特别的多肽/肽标记和分级策略与靶向待分析的N-末端片段(fragments)的特定化学和/或酶反应来允许从复杂样品中选择性富集(enrichment)多肽和/或肽的N-末端片段的方法。
背景技术
从复杂样品鉴定、分离和分析特别的蛋白质或蛋白质子集,对于阐明生物过程在分子水平如何发生或者各种细胞类型或不同生理状态之间蛋白质的差异程度,具有非常重要的价值。
现代生物学中的一个主要挑战涉及了解通过有机体编码的整个蛋白质组的表达、功能和调节,这一技术领域一般被称为蛋白质组学。然而,由于不可能扩增蛋白质,该领域中的研究通常是相当冗长乏味的,这是因为即使是相对简单的原核生物的细胞提取物也包含涵盖巨大浓度范围的许多蛋白质。因此,这种任务超出了目前任何单一分析方法的能力。
因此,由于方法学限制,蛋白质组分析不仅依赖于蛋白质的鉴定和定量方法,而且,在很大程度上,依赖于根据它们的结构和/或官能性能允许它们的精确和可靠分离的方法,这些子集(subsets)然后更能够进行进一步的分析。
蛋白质组具有动态性质,响应于外部刺激或者细胞环境中的变化在蛋白质合成、活化和/或翻译后修饰中会发生变化。因此,蛋白质组的固有复杂性超过了基因组或者转录组细胞的mRNA补体的复杂性。
由于在这种蛋白质组学的研究中要处理的特别大的数据量,蛋白质/肽鉴定过程需要极大的分辨能力。常用于分辨这种高度复杂的混合物的两种方法是二维凝胶电泳(2D-GE;参见,例如,O′Farrell,P.H.(1975)J.Biol.Chem.250,4007-4021)和(二维)液相色谱法((2D)-LC;参见,例如,Lipton,M.S.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,11049-11054)。采用2D-GE或者2D-LC分离的肽和蛋白质通常通过质谱法或者通过确定氨基酸组成和/或氨基酸序列来鉴定。
质谱法特别地允许以高处理量设置精确定性鉴定和定量确定蛋白质。然而,质谱法也存在一些固有的技术限制。目前,基于质谱法的蛋白质分析中最大的问题之一是待检测的蛋白质的动态范围和数目。特别地,在例如血清或者血浆的样品中,动态范围估计是大约1012,有几十万种蛋白质。鉴定蛋白质的典型工作流程涉及这些蛋白质的蛋白质组学消化和所得片段的分析。在人血浆或者血清的情况下,这会将复杂性增加为大概50倍,考虑到当用胰蛋白酶消化血浆或者血清蛋白质时,平均产生55种胰蛋白酶肽(tryptic peptides)。同时,大多数质谱仪的动态范围在单个谱中不超过100,因此可用的分离窗口不能允许检测所有存在的蛋白质,或者为此目的必须增大。
本领域中已经采取了不同的方法来通过标记待检测的蛋白质和在质谱分析之前仅分离得自例如胰蛋白酶消化的被标记的肽片段降低复杂性。在该方法之外的基本原理是,在绝大多数待检测的蛋白质中标记效率将是基本相等的,从而被标记的肽片段的分析将仅给出待分析的样品中存在的蛋白质的代表性图。
虽然这些方法已经允许降低蛋白质组学分析中待检测信号的复杂性,但是对有目的地选择用于质谱分析的特定的蛋白质和肽子集的进一步的方法仍然存在持续需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供从复杂样品中选择性富集多肽和/或肽的肽片段用于质谱分析的新型方法。更具体地,本发明的一个目的是提供允许选择性富集将由质谱法平行分析的多肽和/或肽的肽片段的方法。
这些目的以及由随后的描述将变得显而易见的其他目的通过独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方式通过从属权利要求的主题来限定。
在一个具体实施方式中,本发明涉及选择性富集和/或分离样品中的多肽和/或肽的N-末端片段的方法,包括:
(a)双重化学标记至少第一样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(b)双重化学标记至少第二样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(c)组合步骤(a)和(b)的被标记的蛋白质、多肽和/或肽;
(d)消化所述被标记的蛋白质、多肽和/或肽来产生它们的片段;
(e)分级所述片段;
(f)对所述片段进行甲基化反应;
(g)再分级所述片段;
(h)比较步骤(e)和(g)中获得的分级图案(fractionation patterns);以及
(i)基于步骤(h)中获得的结果,分离带有标记物(label)的所述多肽和/或肽的N-末端片段,
其中,步骤(a)和(b)中的双重化学标记包括同位素标记(isotopic labeling)和同量异序标记(isobaric labeling)。
在一个优选的具体实施方式中,通过等电聚焦进行步骤(e)和(g)的所述分级/再分级。
在另一个优选的具体实施方式中,步骤(a)和(b)中使用的至少一种化学标记物被构造成允许标记所述蛋白质、多肽和/或肽的伯胺基团。特别优选地,所述伯胺基团位于所述多肽和/或肽的N-末端。
在又一个优选的具体实施方式中,标记样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽将包括用至少两种不同的同位素标记物来标记。在本发明的另一个具体实施方式中,所述标记包括使用至少两种不同的同量异序标记物。
在一个优选的具体实施方式中,步骤(a)和(b)的标记物被用于在出现的所有可用的(available)游离胺基团处标记各样品中的蛋白质、多肽和/或肽,例如,在N-末端和在氨基酸赖氨酸和精氨酸中。
本发明的另一个优选的具体实施方式包括在步骤(f)中的允许伯胺基团甲基化的甲基化反应。
本发明的一个具体实施方式包括通过质谱法进一步分析在步骤(g)中鉴定的N-末端肽片段。这种质谱法分析可以包括MS/MS扫描。本发明的一个具体实施方式涉及以高处理量形式进行的所述方法。
本发明的方法可以用于进行定性和/或定量蛋白质组学分析。
本发明的其他具体实施方式由下文的详细描述将变得显而易见。
附图说明
图1:描述了应用本发明的一个优选具体实施方式来允许选择性富集蛋白质、多肽或肽的N-末端肽片段的示意性说明。在16O或者18O-标记的水的存在下(同位素标记),给定样品中包含的例如多肽被消化。在同位素标记之前,采用用于相对和绝对定量技术的同量异序标记物(iTraq,同量异序标记)来标记多肽或所得片段,其以标记样品的多肽中所有可用胺基团的量使用。通过等电聚焦(IEF)将被标记的片段分级。收集所有单独的级分,并且在反应中单独处理以甲基化N-末端胺基团。然后通过IEF将所有级分单独地再分级。在第一轮IEF之后分类到相同级分的肽没有因为甲基化而经过任何额外的修饰,并因此是最初已被iTraq标志物(marker)标记的N-末端片段。然而,分类到再分级的不同级分的肽在它们的在消化之后变得可用的N-末端经受了甲基化。因此比较第一分级步骤和再分级步骤允许鉴定是多肽和/或肽的N-末端片段的那些肽。
图2:描述了采用免疫-耗竭血浆样品中包含的被双重化学标记的肽的MALDI-MS和MALDI-MS/MS分析的结果。通过Multiple Affinity Removal LC Column-Human 7(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA),将血浆样品免疫-耗竭。基本上根据生产商的说明,采用ICAT试剂(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,美国)对蛋白质进行同位素标记,并且用胰蛋白酶消化(比例胰蛋白酶∶样品=1∶20)。随后,基本上按照建立的iTRAQ方案(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,美国),对所得肽进行同量异序标记。采用50-70-90-100-110-120-130-140-150-180-210-350mM KCl/10mMKH2PO4/25%乙腈,pH 3.0和RP-HPLC,通过强阳离子交换(SCX)分级处理被标记的肽(20s级分,380级分/SCX分级)。在4579个点上进行MALDI-MS和MALDI-MS/MS分析。图2a显示了RP-HPLC级分#12(SCX级分350mM KCl)的MS分析。指认了四个ICAT峰对:ICAT(轻):ICAT(重)之间的预期峰比=1.8。图2b显示了峰对#4的ICAT(轻)(1655.04Da)的MS/MS分析(参见图3A)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶0.1∶1∶1。图2c显示了峰对#4的ICAT(重)(1664.08Da)的MS/MS分析(参见图3A)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶1∶1∶1。图2d显示了RP-HPLC级分#39(SCX级分50mM KCL)的MS分析。指认了四个ICAT峰对;ICAT(轻):ICAT(重)之间的预期峰比=1.5。图2e显示了峰对#4的ICAT(轻)(1586.84Da)的MS/MS分析(参见图3D)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶0.1∶1∶1。图2f显示了峰对#4的ICAT(重)(1595.87Da)的MS/MS分析(参见图3D)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶1∶1∶1。
图3:描述了包括报告物和平衡基团的同量异序标记物的通式结构。
图4:描述了一组同位素标记物,这些标记物都采用聚-Leu-标签作为亲和基团(affinity group)。这些标记物例如在12C和13C的使用方面是不同的。
图5:描述了化学合成图4(a)中所示(Leu)3化合物的详细反应步骤。实施例2中给出了合成方案。
具体实施方式
本发明基于如下意想不到的发现,将特别的蛋白质/多肽/肽标记和分级策略与靶向伯胺的特定的化学和/或酶反应结合,使得可以从复杂样品中快速和高选择性地富集和/或分离这些多肽/肽的N-末端片段。
在下面说明性地描述的本发明,可以在不存在本文没有特别披露的任何一个或者多个要素,一个或多个限制的情况下合适地实施。
将关于特别的具体实施方式和参照某些附图描述本发明,但是本发明不局限于此,而仅受权利要求的限制。所描述的附图仅是说明性的和非限制性的。在附图中,为了说明目的,一些要素的尺寸可以被夸大并且没有按比例绘制。
在术语″包括(包含、含有)″用于本发明说明书和权利要求中的情况下,其并不排除其他要素。为了本发明的目的,术语″由......组成″被认为是术语″包括″的优选具体实施方式。在下文中,如果一个组被限定为包括至少一定数量的具体实施方式,则这也应该理解为披露了优选仅由这些具体实施方式组成的组。
在当提及单数名词时使用不定冠词或者定冠词的情况下,例如″a″,″an″或者″the″,这包括多个该名词,除非另有明确说明。本发明上下文中的术语″约″或者″大约″,表示本领域技术人员将理解为仍然确保所讨论特征的技术效果的准确区间。该术语典型地表示偏离所指数值±10%,优选±5%。
术语的进一步的定义将在后面使用术语的上下文中给出。
在一个具体实施方式中,本发明涉及选择性富集和/或分离样品中的多肽和/或肽的N-末端片段的方法,包括:
(a)双重化学标记(double chemical labeling)至少第一样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(b)双重化学标记至少第二样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(c)组合步骤(a)和(b)的被标记的蛋白质、多肽和/或肽;
(d)消化(digesting)所述被标记的蛋白质、多肽和/或肽来产生它们的片段;
(e)分级所述片段;
(f)对所述片段进行甲基化反应;
(g)再分级所述片段;
(h)比较步骤(e)和(g)中获得的分级图案;以及
(i)基于步骤(h)中获得的结果,分离带有标记物的所述多肽和/或肽的N-末端片段,
其中,步骤(a)和(b)中的双重化学标记包括同位素标记和同量异序标记。
本文所用术语″蛋白质″,是指任何天然产生的或者合成的(例如通过化学合成或者重组DNA技术产生的)大分子,包含通过肽键连接的多个天然或者修饰的氨基酸。类似地,术语″多肽″是指天然产生的或者合成的大分子,包含通过肽键连接的多个天然或者修饰的氨基酸。这种分子的长度可以延伸到多达几千个氨基酸。因此,所述术语也包括通常被称作寡肽的物质。典型地,术语″蛋白质″或者″多肽″涉及长度超过20个氨基酸的分子。因此,本发明中待分析的蛋白质可以具有约30至约500个氨基酸,约50至约1,000个氨基酸或者约100至约2,000个氨基酸,等等的长度。
本文所用的术语″肽″,是指包括通过肽键连接的不超过20个天然或者修饰的氨基酸的天然产生的或者合成的分子。典型地,本发明中待分析的肽可以具有约2至约20个氨基酸,约3至约18个氨基酸或者约5至约15个氨基酸的长度。
本文所用的术语″片段″,是指在一个或多个肽键裂解之后获得的上述蛋白质、多肽和肽的任何片段。如下文将描述的那样裂解可以化学地和/或酶促地进行。本发明所用片段关于其大小或者性质不受任何方式的限制,除了在其氨基酸序列方面其短于其所衍生的蛋白质、多肽或肽。
本文所用术语″N-末端片段″,表示蛋白质、多肽或肽的片段,其位于最接近前述蛋白质、多肽或肽的N-末端的位置,它们可通过步骤(b)中的化学和/或酶消化获得。
本文所用的术语″翻译后修饰″,表示在蛋白质翻译完成之后发生的根据本发明的蛋白质、多肽和/或肽的任何类型的化学修饰。这种修饰的例子尤其包括磷酸化(phosphorylation)、泛素化(ubiquitinylation)、乙酰化、糖基化、烷基化、异戊二烯化和lipoylation,特别优选磷酸化。该术语也被理解为在蛋白质和/或肽中包含的翻译后修饰的数目和/或类型方面不受限制。因此,给定的蛋白质在其序列中可以包括两个或更多个磷酸化氨基酸,或者一个或多个磷酸化氨基酸和一个或多个泛素化氨基酸残基。
本文所用术语″磷酸-蛋白质″,″磷-多肽(phosphor-polypeptides)″和″磷酸-肽″,表示在它们的主序列中包括一个或多个磷酸化(phosphorylated)氨基酸残基,特别是磷酸化丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸残基的任何蛋白质、多肽和/或肽。在本发明的范围内,氨基酸磷酸化可以在体内通过翻译后蛋白质修饰发生或者在体外通过采用特定的蛋白激酶发生。
本文所用术语″糖基化的蛋白质″(本文中也被称作″糖蛋白″),″糖基化的多肽″(本文中也被称作″糖多肽″)和″糖基化的肽″(本文中也被称作″糖肽″),表示在它们的主序列中包括一个或多个糖基化的氨基酸残基的任何蛋白质、多肽和/或肽,其中,糖基化可以是N-糖基化、O-糖基化或者糖基磷脂酰肌醇-锚定。本文所用术语″N-糖基化″(本文中也称作″N-连接的糖基化″),表示向天冬酰胺氨基酸残基的酰胺氮酶-定向和位点-特异性的加成任何糖部分(也就是说,碳水化合物或者糖部分,包括单糖例如葡萄糖或者半乳糖,二糖例如麦芽糖和蔗糖和寡糖或者多糖),而本文所用术语″O-糖基化″(本文中也称作″O-连接的糖基化″),是指向丝氨酸或者苏氨酸氨基酸残基的羟基-氧酶-定向和位点-特异性的加成任何糖部分。最后,本文所用术语″糖基磷脂酰肌醇-锚定″(本文中也称作″GPI-锚定″),表示通过包含碳水化合物的连接体连接的疏水磷脂酰肌醇基团(例如葡糖胺和甘露糖连接到磷酰基乙醇胺残基)加成到蛋白质和/或肽的C-末端氨基酸,其中,磷脂酰肌醇基团中的两个脂肪酸将蛋白质锚定到细胞膜。在本发明的范围内,氨基酸糖基化可以通过翻译后蛋白质修饰在体内发生或者通过采用特定的糖基转移酶在体外发生。
本文所用术语″样品″或者″复杂样品″,表示这样的事实,采用本发明方法分析的样品典型地包括以不同的浓度存在的多种不同的蛋白质、多肽和/或肽(或者这些蛋白质、多肽和/或肽的不同变体)。例如,本发明中的复杂样品可以包括至少约500,至少约1000,至少约5000或者至少约10000种蛋白质、多肽和/或肽。本发明中使用的典型的复杂样品尤其包括原核或者真核来源的细胞提取物或者溶胞产物以及人或者非-人体液例如全血、血清、血浆样品等。
在根据本发明的方法中,蛋白质、多肽和/或肽被化学标记。
本文所用术语″化学标记″,表示将一个或多个可检测的标志物(或″标记物″)连接或者加入到本发明使用的蛋白质、多肽和/或肽中。本文所用术语″可检测的标志物″,是指包含一种或多种合适的化学物质或者酶的任何化合物,其在化学、物理或者酶反应中直接或者间接产生可检测的化合物或者信号。如本文中所用的那样,该术语将理解为包括就这样的标记物(也就是说与蛋白质和/或肽结合的化合物或者部分)以及标记试剂(也就是说在与肽或者蛋白质结合之前的化合物或者部分)。本发明中使用的标记物可以通过共价或者非共价键合连接到蛋白质、多肽和/或肽的胺基团、羧基基团或者氨基酸残基。典型地,所述键合是共价键合。所述标记物尤其可以选自同位素标记物、同量异序标记物、酶标记物、着色的标记物、荧光标记物、发色标记物(chromogenic labels)、发光标记物、放射性标记物、半抗原、生物素、金属络合物、金属和胶态金,特别优选同位素标记物和同量异序标记物。所有这些类型的标记物在本领域中都已建立。
标记步骤(a)和(b)是双重化学标记步骤。
本文所用术语″双重化学标记″,表示用两种不同类型的标记物即同位素标记物和同量异序标记物的一个或多个可检测的标志物来标记蛋白质和/或肽。
本文所用术语″同量异序标记物″,是指一组至少两种标记物,其具有相同的质量,但是当碰撞诱导解离(CID)时可以产生不同质量的片段。为此,同量异序标记物由具有变化质量的报告基团和平衡基团组成,平衡基团补偿在CID时产生的各报告基团的不同质量。在一个优选的具体实施方式中,同量异序标记物在它们通过CID被片段化之前不仅具有相同质量,而且具有相同结构。通过同量异序标记物中的同位素的差异分布可以获得报告和平衡基团之间的差异质量分布。在图3中描述了这种同量异序标记物的一个示意性例子。
根据本发明的同量异序标记物的例子尤其包括相对和绝对定量同量异序标签(iTRAQ)标记物(参见Ross,P.L.等(2004)Mol.Cell.Proteomics 3,1154-1169)。该方法采用四种不同的iTRAQ试剂,各自包含报告基团、平衡基团和与伯胺基团反应的肽反应性基团。报告基团的质量为114、115、116或者117Da,取决于各试剂中12C/13C和16O/18O的差异同位素组合。平衡基团的质量从31至28Da变化,以确保报告基团和平衡基团的组合质量对于四种试剂保持恒定(145Da)。因此,用这些试剂中的每一种标记相同的肽得到这样的肽,其是同量异序的,并因此例如在液相色谱中共洗脱(co-elute)。因而,它们彼此之间通过色谱方式不能分辨。然而,在质谱过程中,当CID时至少各报告基团被释放,显示从114至117Da的独特质量。这些片段的强度可以用于单次量化单独的蛋白质和/或肽。
采用同量异序标记物的优点在于人们可以用不同的同量异序标记物来标记不同样品的相同蛋白质、多肽或肽并且在质谱法分析中分析它们。已经用这种同量异序标记物标记的来自不同样品的相同蛋白质、多肽或肽以及由其得到的片段在质谱法分析中将产生相同信号。然而,当CID时,质量信号将分裂成不同的信号,每个信号由得自不同报告基团质量的不同质量来表征,使得可以分析在最初使用的不同样品中这些相同蛋白质、多肽或肽的相对分布。
术语″同位素标记物″是指一组至少两种或更多种标记物,这些标记物具有相同的化学式但是对于一个或多个原子存在的同位素的数目和/或类型彼此不同。采用同位素标记物的优点在于人们可以用不同的同位素标记物来标记不同样品的相同蛋白质、多肽或肽并且在质谱法分析中分析它们。已经用这种同位素标记物标记的来自不同样品的相同蛋白质、多肽或肽以及由其得到的片段将在质谱法分析中产生这样的信号,这些信号的差别恰好在于由于使用不同的同位素所带来的同位素标记物的重量差。换句话说,用不同的同位素标记物标记的来自不同样品的否则相同的蛋白质、多肽和/或肽,基于不同的质量,可以在质谱法分析中如此被区分开来。
根据本发明的同位素标记物的例子尤其包括16O-或者18O-标记的水或者同位素-编码的亲和标签(ICAT)标记物(参见Gygi,S.P.等,(1999)Nat.Biotechnol.17,994-999)。ICAT试剂采用三种功能元件:硫醇-反应性基团,用于选择性标记被还原的半胱氨酸氨基酸残基;生物素亲和标签,以允许选择性分离被标记的肽;和以两种同位素形式,″轻″(非-同位素)和″重″(利用,例如,2H或者13C)形式,合成的同位素标签。在本发明的范围内,同位素标记可以在肽水平实施(例如,在16O-或者18O-标记的水的存在下,通过裂解待分析的样品中包含的蛋白质)或者直接在蛋白质水平实施(也就是说在裂解之前),例如通过采用市售可得的ICAT试剂(Applied Biosystems,Foster City,CA,美国)。
虽然同量异序标记物(参见上面)原则上构成特定类型的同位素标记物,但是在本发明的上下文中,术语″同位素标记物″将用于指非同量异序的标记物,在进行CID之前基于它们的分子量,在质谱法分析中可以就这样而被区分开来。
为了本发明的目的,标记物优选同位素和/或同量异序标记物可以进一步包括允许它们与蛋白质、多肽和/或肽偶联的反应性基团。所述反应性基团将优选允许同位素和/或同量异序标记物与蛋白质、多肽和/或肽之间的共价键合。所述反应性基团可以选自尤其包括羧基基团、胺基团、羟基基团、巯基基团等的偶联化学基团的组。其他共价连接化学基团也可用作反应性基团,并且包括但不限于酸酐、环氧化物、醛、酰肼、酰基叠氮化物、芳基叠氮化物、重氮化合物、二苯甲酮类、碳二亚胺类、亚氨酸酯、异硫氰酸酯、NHS酯、CNBr、马来酰亚胺类、甲苯磺酸酯类、三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)、马来酸酐类和羰基二咪唑。NHS酯优选作为偶联基团。
优选地,选择这些偶联化学基团,从而允许所述标记物与蛋白质、多肽和/或肽中的伯胺偶联,也就是说与位于蛋白质、多肽和/或肽的N-末端的氨基基团偶联。
因此,如果人们试图在蛋白质、多肽和肽的可用胺基团处标记它们,偶联化学基团可以优选是NHS酯。然而,如果蛋白质、多肽和/或肽中的靶基团是来自半胱氨酸的巯基基团,则人们可以使用硫醇反应性偶联化学基团例如碘乙酰胺。
所述同量异序和/或同位素标记物可以进一步包括所谓的亲和基团。本文所用的这种亲和基团允许通过特定的色谱方法分离蛋白质、多肽和/或肽的被标记的片段。为此,人们可以采用本领域已知的亲和基团来选择性富集蛋白质、多肽和/或肽。这些包括亲和标签(tags)例如谷胱甘肽-S-转移酶标签、聚-组氨酸-标签、生物素-标签、HA-标签、Flag-标签等。可以采用色谱介质例如谷胱甘肽-S-转移酶琼脂糖、固定的金属亲和色谱法树脂例如Nickel-NTA琼脂糖、抗生蛋白链菌素-琼脂糖、抗-HA-抗体基色谱法、抗-FLAG-抗体基色谱法等等,来分离已经用包括这些亲和基团的标志物标记的蛋白质、多肽和/或肽。
所述亲和和/或反应性基团可以有差别地设置在所述同量异序和/或同位素标记物中。这些基团在同量异序和/或同位素标记物中的非-排他性设置在以下式子中描述。
式II
式IV A-L-IB-IT-RG
其中,A表示至少一个用于可逆、共价或者非-共价地结合到亲和基质的亲和基团;IB是包含同量异序标签基团的基团;IT是包含同位素标签基团的基团;L表示包含可裂解部分的连接体;以及RG是用于选择性结合生物分子例如,但是不限于蛋白质或肽的反应性基团。在本发明的一个优选具体实施方式中,所述同量异序基团位于本发明分子的末端,如式I,II,III和V中所示。一个特别优选的具体实施方式涉及式V的标记物。
本领域技术人员将理解的是,可以优选使亲和基团尽可能小,从而允许更好的偶联功效等。人们也可以考虑在形成所述标记物的同位素部分的原子排列中并入亲和基团。例如,可以使用具有不同的同位素分布的组氨酸或者亮氨酸残基。在这种情况下,亲和基团和同位素基团变得相同,并且标记物的尺寸可以被进一步减小。在组氨酸的情况下,亲和标签可以通过IMAC(固定的金属亲和色谱法)树脂例如Ni-NTA-琼脂糖来识别。在聚-Leu-基标签的情况下,人们可以采用市售可得的抗-亮氨酸抗体。
因此,在一个优选的具体实施方式中,可以将同位素标记物和例如亲和基团合并。例如人们可以采用聚-His-标签或者聚-Leu-标签,其中单个的组氨酸或者亮氨酸氨基酸被用12C或者13C和/或14N和15N不同地标记。这种优选具体实施方式的一个代表性实例描述在图4中。图4中描述的标记物在本发明的上下文中可以是特别优选的。
因此,一个特别优选的具体实施方式通常采用式VI的标记物:
其中,RG、IT、A和IB是如前面所限定,并且,其中,IT和A由相同的分子实体(entity)形成。
本发明涉及组合使用同位素标记物和同量异序标记物,以用于多路蛋白质分析,也就是说用于平行地进行多个分析,例如2、4、8或者16个平行样品。特别地,这种组合标记策略也使得能够比较不同样品之间的相对蛋白质水平。同位素和同量异序标记的组合可以具有如下优点:仅需要例如通过MALDI-MS/MS分析或iTRAQ量化来特别分析观察到差异表达水平的那些肽,因此导致更快的和复杂性降低的样品分析。
例如,取自患有疾病的病人的四个样品可以用包括相同的同位素标记物但是四种不同的同量异序标记物的第一组标记物来标记。可以选择所述同量异序标记物以具有相同结构,但是在CID时得到四种不同的报告基团。人们可以采用上面描述的iTRAQ标记物。然后,人们可以用第二组标记物来标记得自参照人口的四个样品,该第二组标记物同样包括相同同位素标记物但是不同的同量异序标记物。所述同量异序标记物可以与用于所述第一四个样品的同量异序标记物精确相同。然而,所述同位素标记物可以与用于第一四个样品的同位素标记物不同,通过例如单一同位素12C/13C交换。通过首先经由质量差异来检测同位素标记物,相对于参照组,人们可以鉴别那些例如在病人中过-表达的蛋白质。然后,可以在MS/MS扫描中分析以这种方式鉴定的峰。在CID之后,通过检测同量异序标记物,可以分析病人组中的四种样品对例如单一峰的相对贡献。
本领域技术人员将理解一旦蛋白质、多肽和/或肽已经被标记,则剩余的可用胺基团,例如存在于例如赖氨酸和精氨酸中的那些,在蛋白质、多肽和/或肽被消化之前将必须被封闭。
因此,在一个优选的具体实施方式中,可以使用标记物,该标记物具有允许它们偶联到蛋白质、多肽和/或肽中的胺基团的偶联化学基团。如果过量使用这些标记物,则它们允许修饰蛋白质、多肽和/或肽的N-末端胺基团,以及在氨基酸例如赖氨酸或者精氨酸中发现的胺基团。在这种情况下,蛋白质、多肽和/或肽中的所有胺基团都被修饰,不需要进一步的封闭。在一个可选的具体实施方式中,可以不过量使用这种标记物,然后在蛋白质、多肽和/或肽被消化之前对尚未采用所述标记物进行修饰的剩余胺基团进行封闭。所述标记物可以优选是同位素标记物,其可以任选地包括同量异序标记物。
在另一个具体实施方式中,可以使用标记物,该标记物具有允许它们偶联到蛋白质、多肽和/或肽中不同于胺基团的基团的偶联化学基团。这种基团可以是半胱氨酸的巯基基团。在这种情况下,在蛋白质、多肽和/或肽被消化之前,蛋白质、多肽和/或肽中的所有胺基团都将必须被封闭。所述标记物可以优选是同位素标记物。
在标记之后,可以通过乙酰化,例如,采用磺基-N-羟基丁二酰亚胺乙酸酯,将仍然存在于蛋白质、多肽和/或肽中的游离胺基团封闭。
因此,在一个方面,本发明需要在消化之前修饰存在于蛋白质、多肽和/或肽中的任何游离胺基团,从而它们在后面不能被甲基化。
本文所用术语″消化被标记的蛋白质、多肽和/或肽来产生它们的片段″,是指化学和/或酶裂解来产生被标记的蛋白质、多肽和/或肽的片段。
这种例如蛋白质的裂解可以化学地实现,例如采用化学品通过酸或者碱处理,所述化学品例如溴化氰、2-(2′-硝基苯基磺酰基)-3-甲基-3-溴-假吲哚(BNPS)、甲酸、羟胺、碘苯甲酸和2-硝基-5-氰硫基苯甲酸),或通过蛋白酶酶促地实现,所述蛋白酶尤其包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、和蛋白酶K,这些都是本领域公知的。
本文所用术语″分级(fractionation)″和″再分级(re-fractionation)″,是指任何类型的分离方法,其中,以一定量在样品中存在的蛋白质、多肽和/或肽及其片段,根据它们的物理-化学性能,例如分子质量、它们的大小和它们的总净电荷的任何区别,被分离(也就是说分类)成大量的较小量(也就是说级分)。分级中的一个共同特性是需要找到收集的级分的量与期望的各级分的纯度之间的最佳点。分级使得可以在单一运行中分离混合物中的超过两种组分。该性能将分级与其他分离技术区别开来。本领域中存在数种公知的分级蛋白质和/或肽的方法,包括经典的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二维凝胶电泳、尺寸-排阻色谱法、(二维)液相色谱法,和等电聚焦,后一种是特别优选的。在分级已经进行之后分析,特别是可视化,蛋白质分子的方法是本领域公知的。
等电聚焦是通过不同分子的电荷区别来将它们分离的技术。等电聚焦是一种类型的区域电泳,通常在凝胶(例如,琼脂糖凝胶或,优选聚丙烯酰胺凝胶)或者液相中进行,其利用了分子的电荷随着其环境的pH而改变的事实。待聚焦的分子在具有pH梯度的介质中分布。使电流通过所述介质,产生″正″阳极和″负″阴极端。带负电的分子在介质中穿过pH梯度向″正″端迁移,而带正电的分子向″负″端移动。随着粒子向与其电荷相反的电极移动,它移动通过变化着的pH梯度,直到它到达其中达到该分子等电点(pI)的pH的点。在该点处,所述分子不再具有净电荷(由于相关官能团的质子化或者去质子化),并且这样在凝胶中将不会再前进。等电聚焦可以分辨pI值的差别小至0.01的蛋白质。
在二维凝胶电泳中,等电聚焦通常是第一步,其中,首先通过蛋白质的pI将它们分离,然后,通过标准SDS-PAGE,进一步通过分子量分离。
如果根据本发明的标记物包括亲和基团或者标签,为了分级目的,人们也可以采用对于亲和基团特异性的相应亲和树脂。例如,人们可以采用抗生蛋白链菌素基树脂来分级生物素-标记的片段。
本文所用术语″再分级″也表示本发明的方法可以采用单一类型的分级方法来进行,也就是说,在进行化学反应(例如甲基化和/或去除和/或改变特定的翻译后修饰,特别是磷酸酯基团(phosphate group))之前和之后,通过采用相同的方法,优选等电聚焦,分级样品中存在的蛋白质和/或肽。然而,取决于特定的方案,也可以采用不同的方法,例如等电聚焦和经典的SDS-PAGE、亲和分级等。
也可以考虑分级/再分级的其他方法和它们的组合。因此,分级/再分级可以依靠离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法和/或(免疫)亲和色谱法。
本文所用术语″甲基化反应″,是指通过化学或酶反应的伯胺基团的甲基化。本领域技术人员完全知晓如何进行这种甲基化反应,典型地通过采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)。
简言之,将干燥的消化的片段再溶解在50μl的50mM硼酸钠(pH 9.5)中。然后,将2μmol干燥的TNBS再溶解在200μl的50mM硼酸钠(pH 9.5)中,将15μl的所得溶液转移到各样品中。将肽用TNBS在37℃培养55min。将该反应重复一次,在此之后将样品干燥。重复一次所述修饰过程(包括两个反应步骤),以确保基本上定量TNBS修饰。
游离胺也可以在30℃在10mM的磺基-N-羟基丁二酰亚胺乙酸酯中乙酰化90min。通过向蛋白质混合物添加1μl的羟胺,丝氨酸和苏氨酸的部分乙酰化可以被逆转。
将选择甲基化试剂和反应条件,从而允许伯胺基团的甲基化。因此,可以选择甲基化试剂和甲基化反应的条件,从而允许标记在将被标记的蛋白质、多肽和/或肽化学或酶消化时产生的N-末端NH2基团。通过之前对这些基团的封闭或者用标记物对这些基团进行完全修饰(参见上文),防止了例如氨基酸赖氨酸和精氨酸的胺基团的甲基化。
采用根据本发明的方法,通过仅观察代表样品中蛋白质、多肽和/或肽的N-末端片段,可以降低质谱法分析的复杂性。因此,仅为了标记在蛋白质、多肽和/或肽的N-末端发现的伯胺而进行标记步骤。在消化这些被标记的物类之后,在所得片段的各个N-末端产生新伯胺。随后的甲基化反应改变这些新产生片段的物理-化学行为,从而在甲基化之前和之后,它们在色谱分离中应该有不同的行为。因此,如果被标记的片段首先进行分级步骤,然后甲基化,并然后再经历相同的色谱分离原则,则仅那些甲基化反应已经成功的级分关于色谱行为应该是不同的。然而,那些保持没有变化的级分,应该是在将蛋白质、多肽和/或肽消化之前已经被标记的N-末端肽。
因此,根据本发明的方法允许显著降低待分析信号的复杂性,同时分析的定性和定量结果原则上不应该变化,这是因为各蛋白质、多肽和/或肽的代表性片段都被分析了。
采用本发明方法的另一个优点是其允许分析差异剪切的蛋白质。例如据估计,所有转录中的30-50%导致剪切的mRNA,产生在一定程度上关于它们的N-末端有区别的不同蛋白质异形体。因此,已知许多蛋白质异形体以组织-特异性的方式表达,也就是说不同的剪切变体在专门的细胞类型中选择性表达,而不在其他细胞类型中表达。因此,疾病条件下蛋白质异形体的差异表达可衍生出组织-特异性的疾病标志物。然而,采用标准质谱法方法,难以监控特定蛋白质的不同剪切变体上的离子形成,这是因为变体-特异性信息往往仅包含在位于蛋白质的N-末端的少数胰蛋白酶肽中。
由于本发明允许特异性选择用于质谱分析的N-末端肽,所以其可能可以鉴定和表征疾病-特异性的剪切活性。
进一步公知的是,蛋白质、多肽和/或肽可以翻译后修饰,例如采用磷酸酯基团或者采用例如糖基部分。由于在例如疾病发展过程中可以涉及差异化的翻译后修饰,所以对鉴定这种其中发生差异化翻译后修饰的蛋白质存在兴趣。
因此,在一个具体实施方式中本发明涉及选择性富集和/或分离样品中的多肽和/或肽的N-末端片段的方法,包括:
(a)双重化学标记至少第一样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(b)双重化学标记至少第二样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(c)组合步骤(a)和(b)的被标记的蛋白质、多肽和/或肽;
(d)消化所述被标记的蛋白质、多肽和/或肽来产生它们的片段;
(e)分级所述片段;
(f)对所述片段进行甲基化反应;
(g)再分级所述片段;
(h)比较步骤(e)和(g)中获得的分级图案;
(i)基于步骤(h)中获得的结果,分离带有标记物的所述多肽和/或肽的N-末端片段,
(j)分级步骤(i)中获得的N-末端片段;
(k)从所述N-末端片段的至少第一子集去除或者改变磷酸酯-基团(phosphate-group);
(l)再分级所述N-末端片段;
(m)比较步骤(j)和(l)中获得的分级图案;以及
(n)基于步骤(m)中获得的结果,分离步骤(k)中修饰的N-末端磷酸-片段的所述至少第一子集;
其中,步骤(a)和(b)中的双重化学标记包括同位素标记和同量异序标记。
特别地,本发明因此涉及选择性富集和/或分离在N-末端片段中具有磷酸酯基团的磷酸-蛋白质(phospho-proteins)、磷酸-多肽和/或磷酸-肽。
本文所用术语″去除″,指的是完全消除磷酸酯-基团,例如通过化学裂解或者酶作用(还可参见下面的讨论)。本文所用术语″改变″,表示导致蛋白质、多肽和/或肽的物理-化学性能变化的磷酸酯-基团的任何修饰,所述物理-化学性能变化允许区分带有原始和经改变的翻译后磷酸酯-基团的变体。这种改变的例子尤其包括裂解磷酸酯基团中的一个或多个化学键而不将其从氨基酸主链去除,以及用任何部分结合磷酸酯基团,因此导致分子量增加。典型地,在确保去除和/或改变分子中包含的所有翻译后磷酸酯-基团的反应条件下处理蛋白质、多肽或肽以及它们的片段,以避免出现任何″中间分子″,其中,已经去除和/或改变一个或多个磷酸酯-基团,但是一个或多个其它磷酸酯-基团保持不变。
所述翻译后磷酸酯修饰的去除和/或改变,与样品中存在的蛋白质、多肽和/或肽的剩余N-末端片段相比,导致仅仅所述至少第一子集磷酸化N-末端片段的物理-化学性能的改变,所述至少第一子集磷酸化N-末端片段衍生自在N-末端片段中具有磷酸酯基团修饰的磷酸-蛋白质、-多肽和/或-肽,从而在随后的再分级步骤过程中可以鉴定该至少第一子集,因为只有该至少第一子集将分类到不同的级分中。不带有磷酸酯修饰的所有其他N-末端片段将分类到与在从所述至少第一子集N-末端片段去除/改变磷酸酯-基团之前最初分级步骤期间相同的级分中。
因此,为了鉴定和/或分离所述至少第一子集N-末端磷酸-蛋白质、-多肽和/或-肽,必须比较在最初和再分级步骤中获得的结果(例如,比较在着色用于电泳蛋白质分离的凝胶之后获得的特定图案)。
为了促进分类/分离过程,优选单独处理在最初分级步骤之后获得的级分,以在将它们应用于再分级之前去除/改变翻译后磷酸酯-基团。
在本发明的优选实施方式中,所述方法用于区分磷酸化N-末端片段的不同子集,即丝氨酸/苏氨酸-磷酸化(也就是说磷酸酯附着到丝氨酸或者苏氨酸氨基酸残基)和酪氨酸-磷酸化N-末端片段(也就是说磷酸酯附着到酪氨酸氨基酸残基)。由于通过不同的激酶和磷酸酶调控这些磷酸-蛋白质和/或-肽子集,所以它们也可能牵连在不同的细胞进程或者信号级联中。
重要的是,衍生自磷酸-蛋白质、-多肽和/或-肽的以上两个N-末端片段子集的区别还在于它们对去除和/或改变翻译后修饰方面的化学处理的可达到性(accessibility)。例如,丝氨酸-和苏氨酸-磷酸化蛋白质分子可达到通过β-消除(β-elimination)(也就是说,本领域公知的一类消除反应,其中,从底物的两个相邻原子去除原子或者原子团同时形成π键)化学去除磷酸酯基团,但是酪氨酸(tryrosine)-磷酸化蛋白质分子则不这样。该区别提供了区分磷酸-蛋白质和/或-肽的这两个N-末端片段子集的基础。
因此,在本发明的优选实施方式中,构造(configure)所述方法,以允许分别区分磷酸化蛋白质、多肽和/或肽的丝氨酸-和苏氨酸-磷酸化的和酪氨酸-磷酸化的N-末端片段。基于化学处理的上述可达到性,特别优选磷酸-蛋白质、-多肽和/或-肽的N-末端片段的所述至少第一子集包含丝氨酸-和苏氨酸-磷酸化的N-末端片段。换句话说,在最初分级步骤之后,将要从酪氨酸-磷酸化和未磷酸化N-末端片段富集和/或分离的所述第一子集包含丝氨酸-和苏氨酸-磷酸化的N-末端片段。
优选地,在本发明的涉及分析磷酸-蛋白质、-多肽和/或-肽的N-末端片段的任何实施方式中,通过β-消除化学地去除磷酸酯-基团。然而,也可以例如,通过特异性的或非-特异性的磷酸酶酶促地去除磷酸酯-基团。
为了从磷酸-丝氨酸和磷酸-苏氨酸氨基酸残基特别地去除磷酸酯部分,β-消除典型地通过碱水解引起。为了避免对半胱氨酸和蛋氨酸残基的侧链的任何不利作用,可以首先用过甲酸处理样品,导致氧化,并因此使这些残基失活。进行β-消除的典型的反应混合物包含H2O、二甲基亚砜、乙腈、250mM EDTA(pH 8.0)和5M NaOH。在N2气氛下,将样品在55℃培养1h,冷却至室温,和通过用乙酸中和淬灭。通过β-消除去除磷酸酯-基团,导致形成非天然氨基酸(例如,脱氢-丙氨酸、脱氢-2-氨基丁酸)。
在使最初分级步骤之后获得的单独级分接受以上处理之后,将它们再分级,典型地通过采用相同的分级方法,优选等电聚焦。
特别地从磷酸-丝氨酸和磷酸-苏氨酸氨基酸残基去除和/或改变磷酸酯基团,导致仅仅包含这种修饰的氨基酸残基的那些N-末端片段子集(也就是说所述至少第一子集)的物理-化学性能的改变,从而可以在随后的再分级步骤中鉴定它们,因为只有该子集将被分类到不同的级分中。
样品中包含的所有其他蛋白质和/或肽,包含酪氨酸-磷酸化的和-当然-未磷酸化的蛋白质、-多肽和/或-肽的N-末端片段,将分类到与去除/改变翻译后磷酸酯-基团之前最初分级步骤期间相同的级分中。因此,采用上述方法,通过比较进行的最初和再分级步骤的结果,可以从复杂样品中选择性富集丝氨酸-和苏氨酸-磷酸化-蛋白质、-多肽和/或-肽的N-末端片段。
在另一个具体实施方式中,在如上面所述的再分级步骤之后,本发明方法进一步包含从分离所述至少第一子集之后剩余的蛋白质和/或肽子集中选择性富集和/或分离磷酸-蛋白质、-多肽和/或-肽的N-末端片段的至少第二子集。为了实现该目标,对剩余的N-末端片段子集进行另一轮分级,去除或者改变翻译后磷酸酯修饰,和再分级,其中,从磷酸-蛋白质和/或-肽的N-末端片段的至少第二子集去除或者改变磷酸酯-基团。
特别优选地,所述磷酸-蛋白质、-多肽和/或-肽的至少第二子集N-末端片段是酪氨酸-磷酸化的分子。由于磷酸化酪氨酸残基不可达到通过β-消除化学裂解,所以优选酶促地去除磷酸酯基团。酶去除可以通过磷酸酶,特别地通过碱性磷酸酶(用于非-特异性去除磷酸酯-基团)或者通过蛋白质酪氨酸磷酸酶(用于特别地去磷酸化磷酸-酪氨酸残基)实现。这些磷酸酶是市售可得的。
基于与上面所述相同的原理,通过进行第二再分级步骤,可以将酪氨酸-磷酸化蛋白质、多肽和/或肽的N-末端片段与它们的未磷酸化对应物分离。剩余的蛋白质和/或肽子集可以任选地进行第三、第四轮等等的分级,去除/改变翻译后修饰,和再分级,其中,待去除或者改变的翻译后修饰的类型典型地不是磷酸化,而是,例如,泛素化或者糖基化。
附加地和/或可选择地,本发明涉及选择性富集和/或分离得自糖基化的蛋白质、多肽和/或肽的N-末端片段。这种片段的鉴定可以按照以上对磷酸-蛋白质已经描述的相同路线进行。
因此,本发明在一个进一步的具体实施方式中涉及选择性富集和/或分离样品中的多肽和/或肽的N-末端片段的方法,包括:
(a)双重化学标记至少第一样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(b)双重化学标记至少第二样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(c)组合步骤(a)和(b)的被标记的蛋白质、多肽和/或肽;
(d)消化所述被标记的蛋白质、多肽和/或肽来产生它们的片段;
(e)分级所述片段;
(f)对所述片段进行甲基化反应;
(g)再分级所述片段;
(h)比较步骤(e)和(g)中获得的分级图案;
(i)基于步骤(h)中获得的结果,分离带有标记物的所述多肽和/或肽的N-末端片段,
(j)捕获在步骤(i)中获得的糖基化的N-末端片段的子集;以及
(k)分离所述被捕获的糖基化的N-末端片段的子集,
其中,步骤(a)和(b)中的双重化学标记包括同位素标记和同量异序标记。
典型地,所述捕获步骤包含至少一个亲和纯化或者亲和色谱步骤,也就是说,将所述糖基化的N-末端片段的子集附着(即捕获)到对待选择的该子集N-末端片段具有特异性结合活性的结合单元。然而,所述捕获步骤也可以依赖于离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法和/或反相色谱法的一种或多种。在本发明的范围内,也可以组合两个或更多个相同或者不同类型的捕获步骤,例如两个亲和色谱步骤(采用相同类型或者不同类型的基质)或者亲和纯化步骤和离子交换色谱。
在涉及分析糖基化的N-末端片段的优选实施方式中,所述捕获步骤包括凝集素亲和捕获和糖蛋白化学捕获的至少之一。本文所用术语″凝集素亲和捕获″,表示采用凝集素作为结合单元的任何捕获方案。本文所用术语″凝集素″,指的是在植物、细菌、真菌、和动物中发现的已知结合特定的寡糖部分的一类蛋白质(综述于例如Lis,H.,和Sharon,N.(1998)Chem.Rev.98,637-674中)。不像抗原-抗体结合亲和,单糖和寡糖与大部分凝集素结合的亲和常数在低的微摩尔范围内,但是可以在毫摩尔范围内。对于亲和捕获目的,是寡糖和凝集素两者本身的多价性质使这些相互作用可用于色谱分离。合适的凝集素的例子尤其包括α-八叠球菌,rizin、刀豆蛋白A和钙联蛋白(calnexin)。本领域已知凝集素亲和捕获的几种方案(参见,例如,Kaji,H.等.(2003)Nat.Biotechnol.21,667-672;Hirabayashi,J.(2004)Glycoconj.J.21,35-40;Drake,R.R.等.(2006)Mol.Cell.Proteomics 5,1957-1967)。
本文所用术语″糖蛋白化学捕获″指的是不涉及使用凝集素的任何糖蛋白化学捕获过程。许多这些过程涉及离子交换色谱步骤。本领域已知几种方案(参见,例如,Zhang,H.等.(2003)Nat.Biotechnol.21,660-666;Sun,B.等.(2007)Mol.Cell.Proteomics 6,141-149)。
因此,在一个具体实施方式中,本发明也涉及选择性富集和/或分离样品中的多肽和/或肽的N-末端片段的方法,包括:
(a)双重化学标记至少第一样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(b)双重化学标记至少第二样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(c)组合步骤(a)和(b)的被标记的蛋白质、多肽和/或肽;
(d)消化所述被标记的蛋白质、多肽和/或肽来产生它们的片段;
(e)分级所述片段;
(f)对所述片段进行甲基化反应;
(g)再分级所述片段;
(h)比较步骤(e)和(g)中获得的分级图案;
(i)基于步骤(h)中获得的结果,分离带有标记物的所述多肽和/或肽的N-末端片段,
(j)分级步骤(i)中获得的N-末端片段;
(k)从步骤(j)中鉴定的N-末端片段的至少第一子集去除或者改变糖基-基团;
(l)再分级所述N-末端片段;
(m)比较步骤(j)和(l)中获得的分级图案;以及
(n)基于步骤(m)中获得的结果,分离步骤(k)中修饰的糖基化的N-末端片段的所述至少第一子集,
其中,步骤(a)和(b)中的双重化学标记包括同位素标记和同量异序标记。
优选地,化学地(例如,通过β-消除)或者酶促地(借助于特定的糖苷酶)去除糖基基团。
在涉及选择性富集和/或分离蛋白质、-多肽和/或-肽的糖基化的N-末端片段的本发明方法的一个具体实施方式中,所述被分离的糖基化的N-末端片段的所述至少第一子集包含N-糖基化的N-末端片段。
从N-末端片段去除N-连接的糖基(gycosyl)修饰可以通过以下方式实现:采用肽:N-糖苷酶F(PNGase F),以500U(1μl)PNGase F/2-6mg粗蛋白质的浓度,在37℃从糖基部分酶裂解N-连接的肽过夜。PNGase F是酰胺酶,其从N-连接的糖基(glycol)-蛋白质在最里面的GlcNAc和高甘露糖、杂交、和复合寡糖的天冬酰胺残基之间裂解。可以通过离心收集包含释放的去-糖基化的肽的上清液。因此,该过程允许选择性区分N-糖基化的蛋白质和/或肽与其他类型的糖-蛋白和/或-肽(也就是说,分别是O-糖基化和GPI-锚定的蛋白质和/或肽)。
尽管PNGase F去糖基化从糖-肽中去除了糖部分,但是仍然可以通过质谱分析检测糖基化位点,因为PNGase F去糖基化对于每一个天冬酰胺都导致天冬氨酸(相应于+1Da的质量差)。
在另一个典型的具体实施方式中,本发明方法,特别是分离步骤,进一步包含从分离的糖基化的N-末端片段的至少第二子集去除翻译后修饰。在本发明方法的涉及选择性富集和/或分离糖基化的N-末端片段的一个具体实施方式中,所述分离的糖基化的N-末端片段的至少第二子集包含O-糖基化的N-末端片段。
从这些片段去除O-连接的糖基(gycosyl)修饰可以采用特别的O-糖苷酶通过酶裂解实现或化学地例如通过β-消除(也就是说,本领域中公知的一类消除反应,其中,从底物的两个相邻原子去除原子或者原子团,同时形成π键)实现。
在其他具体实施方式中,以上方法进一步包含通过质谱法分析分离的N-末端片段(其可以是或者可以不是例如磷酸化和/或糖基化的N-末端片段),质谱法是用于测量离子的质量电荷比的分析技术。重要的是,对于磷酸-N-末端片段,通过去除不稳定的磷酸酯-基团促进了质谱分析,但是对于丝氨酸和苏氨酸-磷酸化物类,留下独特的非天然氨基酸。采用的特别质谱分析可以取决于在不同的样品中确定的蛋白质和/或肽表达的水平。在一些具体实施方式中,以高处理量形式进行本发明的方法。
在一个进一步的具体实施方式中,本发明涉及使用本文描述的方法进行定性和/或定量蛋白质组学分析。
如上所述组合使用同位素和同量异序标记物使得可以平行进行多个分析,例如,2、4、8或者16个平行样品。考虑到N-末端片段的选择性富集,进行结合降低的分析复杂性的多个质谱分析的能力在鉴定疾病标志物方面可以是强大的工具。例如,可以从4个已知不患有特定疾病的不同个体取样,并且如上面所述采用同位素和同量异序标记物双重标记这些分子。例如,通过采用iTRAQ标记物作为可以产生不同质量的最多4个报告基团的同量异序标记物,可以标记来自这4个个体的所有蛋白质。
平行地,可以从已知患有特定疾病的4个个体取样,并且采用组合的同位素同量异序标记物,其中,所述同位素标记物不同于已经用于标记健康个体的样品的同位素标记物,而所述同量异序标记物是相同的。如果组合这些被标记的样品,消化它们,并且进行所描述的本发明方法,将获得健康个体的四个样品和病人的四个样品的N-末端片段。通过由于不同的同位素标记物带来的质量改变,在病人与健康个体之间差异化表达的肽在质谱法分析中将是可识别的。如果在随后的分析中进行MS/MS-扫描,则可以关于四个健康个体和四个病人的单独峰分布来分析这种经鉴定的质量峰。
因此,可以大大增加这种分析的处理量,同时增加信噪比,考虑到有关分离N-末端片段所有8个样品已经进行了相同处理。因此显著减少了误差源。因此,本发明也涉及使用本文描述的方法进行定量和定性蛋白质组学分析。
虽然已经关于一些其优选具体实施方式描述了上述发明,但是这些实施方式绝不是用来限制本发明的范围。本领域技术人员完全清楚的是,进一步的具体实施方式和对前面描述的实施方式的改变仍然在本发明的范围内。
实施例
实施例1-N-末端片段的甲基化
2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)被用于将胰蛋白酶片段的游离氨基基团甲基化,所述胰蛋白酶片段得自已经用例如任选地包括同量异序标记物的同位素标记物进行了标记的蛋白质、多肽和/或肽。简言之,将干燥的肽再溶解在50μl的50mM硼酸钠(pH 9.5)中。然后,将2μmol的干燥的TNBS再溶解在200μl的50mM硼酸钠(pH 9.5)中,将15μl的该溶液转移到各样品中。将所述肽用TNBS在37℃培养55min。将该反应重复一次,在此之后将样品干燥。将所述修饰过程,包括所述两个反应步骤,重复一次以确保基本上定量的TNBS修饰。
游离胺也可以在30℃在10mM的磺基-N-羟基丁二酰亚胺乙酸酯中乙酰化90min。通过向蛋白质混合物添加1μl的羟胺,可以逆转丝氨酸和苏氨酸的部分乙酰化。
实施例2-(Leu)3标记化合物的合成
根据以下方案化学合成图4A和6A中所示的(Leu)3标记化合物。单独的合成步骤相应于图5中描述的反应方案。
步骤(1):将起始原料(S)-2-(叔-丁氧基羰基氨基)-4-甲基戊酸、(S)-2-氨基-4-甲基戊酸甲酯盐酸盐、1-(双(二甲基氨基)亚甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-1--3-氧化物六氟磷酸盐(V)、和N-乙基-N-异丙基丙-2-胺溶解在二氯甲烷(150ml)中,添加2.0ml DMF,并且将混合物搅拌2h,在此之后,Boc保护的胺已经消失(TLC洗脱液(eluens)EtOAc/庚烷 1∶1)。添加150ml的饱和氯化铵溶液,并且用二氯甲烷(8x30ml)萃取粗产品。有机层在硫酸钠上干燥并且在减压下浓缩。采用庚烷中40%EtOAc作为洗脱液,在具有硅胶的玻璃过滤器上纯化粗产品。这产生1.96g(84%)纯产品(S)-2-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-4-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊酸甲酯。
步骤(2):将步骤(1)的Boc保护的二肽溶解在DCM/TFA(44∶11ml)中,并且搅拌1.5h。在用饱和NaHCO3处理小样品之后,TLC显示反应完全。在减压下浓缩反应混合物,获得2.58g的淡黄色油。1H NMR显示产品中一定还含有一些游离三氟乙酸与产品在一起,通过蒸馏去除所述游离三氟乙酸的尝试失败了,因此,使用粗产品(S)-2-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐,而没有进行进一步提纯。
步骤(3):将步骤(2)的氨基三氟乙酸盐溶解在二氯甲烷(150ml)中。在0℃添加DIPEA,然后添加HATU和Boc-Leu-OH。在室温将混合物搅拌2h。根据TLC,反应完全。用饱和氯化铵溶液将混合物淬灭,并且用二氯甲烷(8x50ml)萃取水层。组合的有机层在硫酸钠上干燥并且在减压下浓缩。采用EtOAc∶庚烷(4∶6)作为洗脱液,在硅胶上纯化粗产品。以1.78g(3.77mmol;50%)的产率获得所产生的三肽(6S,9S,12S)-6,9-二异丁基-2,2-14-三甲基-4,7,10-三氧代-3-氧杂-5,8,11-三氮杂十五烷-12-羧酸甲酯。
步骤(4):将步骤(3)的Boc保护的三肽溶解在DCM/TFA(44∶11ml)中并且搅拌1.5h。在用饱和NaHCO3处理小样品之后,TLC显示反应完全(产品不用在庚烷中的50%EtOAc实施)。在减压下浓缩反应混合物,并且用二氯甲烷反萃取(stripped)一次。为了研磨,向产品中添加乙醚(20ml),5min之后,添加10ml庚烷,40min之后过滤固体,产生1,480g的白色粉末((S)-2-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐)。
步骤(5):向步骤(4)的三肽-TFA盐、N-甲基-哌嗪基乙酸、EDC和HOAt在甲苯(50ml,认为其是二氯甲烷)的混合物中添加DIPEA,并且将混合物搅拌1h,在此过程中,在烧瓶底部上形成黄色的固体。用饱和碳酸氢钠溶液(70ml)将混合物淬灭。将两相分离,并且用二氯甲烷(4x50ml)萃取水相。组合的有机层在硫酸钠上干燥,并且在减压下浓缩,产生0.203g的粗材料,其中包含期望产品以及起始材料(根据LC-MS和1H NMR)。用EDC,HOAt和DIPEA在二氯甲烷(25ml)中在2h期间将粗材料再处理一次。在处理之后(与以上描述的过程类似),获得0.231g的粗材料。根据LC-MS,反应完全。采用在二氯甲烷中的5-10%的0.5M NH3甲醇溶液的梯度在硅胶上纯化,得到0.158g的产品,为结晶的白色固体,((S)-4-甲基-2-((S)-4-甲基-2-((S)-4-甲基-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰胺基)戊酰胺基)-戊酰胺基)戊酸甲酯)。
步骤(6):将步骤(5)的起始材料溶解在Tesser′s碱(二氧六环/MeOH/4N NaOH水溶液 15∶4∶1)中,并且在室温搅拌混合物。在搅拌一夜之后,将溶液浓缩,获得粗产品(S)-4-甲基-2-((S)-4-甲基-2-((S)-4-甲基-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰胺基)戊酰胺基)戊酰胺基)戊酸钠。在接下来的步骤中使用该化合物而不进行进一步的提纯,实施Na-分析。
步骤(7):在0℃,向步骤(6)的粗产品在二氯甲烷(5ml)中的悬浮液顺序添加NHS和EDC,并且在0℃搅拌混合物3小时。浓缩混合物,获得粘性固体。将该粘性固体再溶解在二氯甲烷(7ml)中。然后,添加乙醚(7ml),并且蒸发溶剂直到体积减半。该添加乙醚然后部分蒸发的操作重复两次,在此之后,过滤沉淀物(乙基(N,N-二甲基氨基)丙基-ureum和氯化钠)。浓缩滤液,产生52mg的粘稠的油。当观察1H NMR谱时,似乎该级分可含有期望的琥珀酸酯((S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基-4-甲基-2-((S)-4-甲基-2-((S)-4-甲基-2-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰胺基)-戊酰胺基)戊酰胺基)戊酸酯),其尤其被乙基二异丙基ureum污染。过滤的沉淀物(33mg)可能包含所述期望的产品(在2.65ppm的单峰,琥珀酸酯质子)。
步骤(8):将步骤(6)的起始材料溶解在Tesser′s碱(二氧六环/MeOH/4N NaOH水溶液 15∶4∶1)中,并且在室温搅拌混合物。通过LC-MS(酸性方式)监控反应。在搅拌2h之后,浓缩溶液,产生粗产品。在接下来的步骤使用该化合物而不进行进一步的提纯。没有确定收率
步骤(9):在室温,向步骤(8)的粗产品在1∶1二氧六环(干燥)和二氯甲烷(2.0ml,干燥的)混合物的溶液中顺序添加NHS、DIPEA(26μl)和EDC(18.9mg),并且在室温搅拌混合物5小时。添加6-氨基己酸和2ml二氧六环(干燥)。将混合物搅拌过夜。第二天,添加更多的EDC(19mg)以产生被活化的丁二酰亚胺酯。将混合物再次搅拌过夜。第二天,从反应混合物取样,向样品中添加正丁胺,并且将所得混合物搅拌10min。在减压下浓缩溶液,并且通过LC-MS分析:粗产品由来自己酸加合物的预期丁基酰胺([M+H]+,m/z=666.4),己酸加成产物([M+H]+,m/z=611.4),来自起始材料的丁二酰亚胺酯([M+H]+,m/z=553.4)和其相应的甲基酯([M+H]+,m/z=512.4)组成。反应混合物在饱和碳酸氢钠溶液(25ml)中淬灭,并且添加水(5ml)。用二氯甲烷(5x20ml)萃取水相,并且组合的有机层在硫酸钠上干燥,并且在减压下浓缩。这产生41mg的固体。用LC-MS5分析该固体,显示出该固体是多种化合物的混合物。取样以进行与丁胺的试验反应(参见上文)。用LC-MS5分析得自该试验反应的产物。其包含预期的丁基酰胺,但是其丰度似乎低于在第一试验反应中的丰度。由于混合物的复杂性和有关产物组成的不确定性以及其潜在的不稳定性,决定不采用(ship)该产物。
步骤(10):通过制备型HPLC提纯步骤(9)的产物。这产生8mg的游离酸。
步骤(11):向步骤(10)的起始材料在DMF的溶液中添加EDC和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),并且将混合物在N2气氛下搅拌过夜。第二天,添加更多的NHS(4mg),并且将混合物再搅拌5h。取试验样品,并且使其与过量的正-丁胺反应以便分析。该样品的LC-MS显示形成产物(丁基酰胺,m/z=667)。在减压下浓缩混合物,并且再溶解在二氯甲烷(20ml)中。用饱和NaHCO3溶液(20ml)将该溶液淬灭。用饱和NaCl溶液清洗有机层并且在硫酸钠上干燥。取试验样品进行分析:添加过量的丁胺,并且将混合物搅拌15min。在减压下浓缩溶液,并且通过LC-MS分析。该分析显示产物具有良好的质量。将溶液浓缩,得到7mg期望的(Leu)3产品。
实施例3-磷酸化的肽的分离
下面的实施例说明了如何可以在复杂样品中鉴定磷酸化的肽。相当的条件可以应用于实施例1中分离的N-末端片段。
市售可得的仪器例如IPGPhor IEF单元(Amersham-Pharmacia,Piscataway,NJ,美国)被用于根据样品的等电点将它们电泳分离。依照已建立的方案,任选地实施将蛋白质化学或酶消化为肽。
为了从磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸氨基酸残基特别地去除磷酸酯部分,使用碱水解来引起β-消除。为了避免对半胱氨酸和蛋氨酸残基的侧链的任何不利影响,可以首先用过甲酸处理样品,导致这些残基氧化,因此使它们失活(Goshe,M.B.等.(2001)Anal.Chem.73,2578-2586)。
所使用的β-消除反应混合物如下:H2O、二甲基亚砜、乙腈、250mM EDTA(pH 8.0)和5M NaOH。在制备反应混合物之前和之后用N2对所有的溶剂进行脱气。
将β-消除反应混合物添加到在等电聚焦之后,从凝胶分离的冷冻干燥的蛋白质级分中。在55℃,在N2气氛下将样品培养1h,冷却至室温,并且通过用乙酸中和来淬灭反应(Goshe,M.B等.(2001),supra)。
市售可得的磷酸酯被用于特别地将磷酸-酪氨酸氨基酸残基脱磷酸。
通过以上述方式处理蛋白质和/或肽样品和随后根据各级分的等电点将它们电泳分离,可以选择性富集和分离丝氨酸/苏氨酸-磷酸化的蛋白质和/或肽以及酪氨酸-磷酸化的蛋白质和/或肽。
实施例3-ICAT和iTRAQ标记的肽的MS分析
下面的实施例用于解释如何可以将采用同量异序和同位素标记物的双重标记用在MS分析中。
最初,根据生产商的说明,采用Multiple Affinity Removal LC Column-Human 7(4.6x10mm;Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,美国),将人血液血浆样品免疫-耗竭。通过该处理去除七种高丰度的血浆蛋白质-白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、铁传递蛋白、纤维蛋白原、和结合珠蛋白-其构成人血浆总蛋白质质量的大约85%。所述柱需要两缓冲液系统来操作。优化缓冲液A和B,以最小化非-靶向蛋白质的共-吸附,和确保柱性能的再现性和长柱寿命。缓冲液A-含有盐的中性缓冲液,pH-7.4-用于加载、清洗和再平衡所述柱,和缓冲液B-低pH尿素缓冲液-用于从柱洗脱附着的高丰度蛋白质。采用Agilent 1200系列LC系统进行所述耗竭。在注入到柱上之前,来自男人无菌过滤的(Sigma-H4522)AB血浆的血清用缓冲液A稀释4X。将样品转移到0.22μm的旋转管,并且以16,000xg离心1min以去除颗粒。将稀释的血浆保持在4℃。
基本上根据生产商的说明,采用ICAT试剂(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,美国)将蛋白质进行同位素标记,并且用胰蛋白酶(胰蛋白酶∶样品比=1∶20)消化。随后,基本上按照已知iTRAQ方案(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,美国),将所得肽进行同量异序标记。
然而,用于ICAT的缓冲液与iTRAQ标记不相容,反之亦然。由于连续标记和提纯样品耗时而且不能充分利用多路过程,将缓冲液组合物优化,从而一种缓冲液组合物可以用于两种标记反应。而且,Agilent缓冲液A也与iTRAQ标记不相容。因此,采用5K MWCO旋转浓缩器(Agilent Technologies)使流过的级分进行缓冲液-交换过程,以确保采用与ICAT和iTRAQ标记化学都相容的合适的缓冲液。发现50mM三乙基碳酸氢铵(triethyl ammonium bicarbonate,TEAB)是最佳的。
标记的顺序也很重要,这是由于首先进行iTRAQ标记而不对半胱氨酸氨基酸残基(其用于ICAT标记)进行封闭,导致蛋白质消化的效率显著降低。起始材料的量为溶解在40μl 50mM三乙基碳酸氢铵(TEAB)中的50μg蛋白质(通过Bradford检测确定;Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,美国)(对于ICAT标记,浓度应该为1.2mg/ml)。向各样品中添加1μl 50mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)和2μl 2%SDS,并且使混合物沸腾10min。然后,向各样品中添加20μl乙腈。使样品冷却,并且将各样品添加到ICAT试剂的小瓶中。在37℃培养2小时。
为了裂解蛋白质,以1∶20的比例添加胰蛋白酶并且将样品培养12-16小时。然后,在speed-vac中将样品完全干燥。每种iTRAQ标记物预混合30μl 1M TEAB和70μl乙腈,并且添加到各ICAT标记的蛋白质消化物中。应该确保所述肽的再溶解。该混合物添加到iTRAQ试剂管中,并且在室温标记1hr。为了淬灭反应,向各管中添加100μl MilliQ-纯化的水,并且在室温将所述管培养30min。最后采用离心真空浓缩器干燥样品。
为了样品纯化,向各样品管添加250μl CEX加载缓冲液(10mM KH2PO4/25% 乙腈(ACN),pH 3.0)。在三个循环中使样品产生涡流并且声波处理,以最大化肽的再溶解。将样品组合和稀释至4ml的CEX加载缓冲液总体积。根据生产商的方案进行SCX和抗生物素蛋白样品清除,并且根据以下方案裂解ICAT:
●采用pH试纸检查pH。如果pH不在2.5和3.3之间,通过添加更多的阳离子交换缓冲液-加载来调节。
●为了调节CEX筒,注入2ml的阳离子交换缓冲液-加载。转向为废物。
●将稀释的样品混合物缓慢注入(~1滴/秒)到阳离子交换筒上,并且将流过物(flow-through)收集到样品管中。
●注射1ml的阳离子交换缓冲液-加载以从所述筒清洗TCEP、SDS、和过量的ICAT试剂。
●为了洗脱肽,缓慢注射(~1滴/秒)500μl的阳离子交换缓冲液-洗脱(10mM KH2PO4/500mM KCl/25%ACN,pH 3.0)。在新的1.5-mL管中捕获洗脱液。收集洗脱的肽作为单一级分。
如下进行生物素化的肽的纯化和生物素标记物的去除:
●将2ml的亲和缓冲液-洗脱(30%ACN/0.4%TFA)注入到抗生物素蛋白筒上。转向为废物。
●注射2ml的亲和缓冲液-加载(2xPBS,pH 7.2)。转向为废物。
●通过添加1ml的亲和缓冲液-加载,中和各阳离子-交换级分。
●采用pH试纸检查pH。如果pH不是7,通过添加更多的亲和缓冲液-加载调节。
●产生涡流以混合,然后离心几秒以将所有溶液送至管底部。
●标记三个级分-收集管:#1(流过),#2(清洗),和#3(洗脱),然后放在架子上。
●将中和的级分缓慢注入(~1滴/5秒)到抗生物素蛋白筒上,并且将流过物收集到管#1中(流过)。
●将500μl的亲和缓冲液-加载注入到所述筒上,并且继续收集到管#1中(流过)
●为了降低盐浓度,注入1ml的亲和缓冲液-清洗1(PBS,pH 7.2)。将排出物转向为废物。
●为了去除非特异结合的肽,注入1ml的亲和缓冲液-清洗2(50mM NH4HCO3/20%MeOH,pH 8.3)。将头500μl收集在管#2中(清洗)。将剩余的500μl转向为废物。
●注入1ml的MilliQ-纯化的水或者等效物。转向为废物。
●用800μl的亲和缓冲液-洗脱填充注射器。
●为了洗脱被标记的肽,缓慢注入(~1滴/5秒)50μl的亲和缓冲液-洗脱并且丢弃洗脱液。
●注入剩余的750μl的亲和缓冲液-洗脱并且将洗脱液收集在管#3中(洗脱)。
●产生涡流以混合,然后离心几秒以将所有溶液送至管底部
●在离心真空浓缩器中蒸发各亲和-洗脱的级分至干燥。
●在新的管中,通过以95∶5的比例结合TFA(裂解试剂A)和裂解试剂B(Applied Biosystems)制备最终裂解试剂。需要~90μl的最终裂解试剂/样品。
●产生涡流以混合,然后离心几秒以将所有溶液送至管底部。
●将~90μl的新鲜制备的裂解试剂转移到各样品管中。
●产生涡流以混合,然后离心几秒以将所有溶液送至管底部
●在37℃培养2小时。
●将所述管离心几秒以将所有溶液送至管底部。
●在离心真空浓缩器中蒸发样品至干燥(~30至60min)。
使用肽的多维液相色谱法(SCX-RP-LC),或可选地等电聚焦,然后进行反相液相色谱法(RF-LC),或者1D(RP)-LC来分离肽。采用4800MALDI-ToF-ToF分析器(Applied Biosystems,Inc.)在4579个点上进行MALDI-MS和MALDI-MS/MS分析。
图2a显示了RP-HPLC级分#12(SCX级分350mM KCl)的MS分析。指认了四个ICAT峰对:ICAT(轻)∶ICAT(重)之间的预期峰比=1.8。图2b显示了峰对#4的ICAT(轻)(1655.04Da)的MS/MS分析(参见图3A)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶0.1∶1∶1。图2c显示了峰对#4的ICAT(重)(1664.08Da)的MS/MS分析(参见图3A)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶1∶1∶1。图2d显示了RP-HPLC级分#39(SCX级分50mM KCL)的MS分析。指认了四个ICAT峰对;ICAT(轻)∶ICAT(重)之间的预期峰比=1.5。图2e显示了峰对#4的ICAT(轻)(1586.84Da)的MS/MS分析(参见图3D)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶0.1∶1∶1。图2f显示了峰对#4的ICAT(重)(1595.87Da)的MS/MS分析(参见图3D)。iTRAQ报告物m/z区域(114-117)被放大;预期iTRAQ比为:1∶1∶1∶1。
Claims (14)
1.选择性富集和/或分离样品中的多肽和/或肽的N-末端片段的方法,包括:
(a)双重化学标记至少第一样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(b)双重化学标记至少第二样品中包含的蛋白质、多肽和/或肽;
(c)组合步骤(a)和(b)的被标记的蛋白质、多肽和/或肽;
(d)消化所述被标记的蛋白质、多肽和/或肽来产生它们的片段;
(e)分级所述片段;
(f)对所述片段进行甲基化反应;
(g)再分级所述片段;
(h)比较步骤(e)和(g)中获得的分级图案;以及
(i)基于步骤(g)中获得的结果,分离带有标记物的所述多肽和/或肽的N-末端片段,
其中,步骤(a)和(b)中的所述双重化学标记包括同位素标记物和同量异序标记物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,将步骤(a)和(b)中使用的至少一种化学标记物构造为允许标记所述多肽和/或肽的伯胺基团。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述伯胺基团位于所述多肽和/或肽的N-末端。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中,在步骤(a)和(b)中使用至少两种不同的同位素标记物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中,步骤(a)和/或(b)中使用的所述同位素和/或同量异序标记物进一步包含亲和基团。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中,在标记之后,在步骤(d)之前,所述蛋白质、多肽和/或肽中存在的任何游离胺基团都被封闭,从而在步骤(f)中这些胺基团不能被甲基化。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中,通过等电聚焦进行步骤(e)和(g)的所述分级/再分级。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中,步骤(f)的所述甲基化反应允许伯胺基团的甲基化。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,所述甲基化反应允许位于步骤(d)中产生的片段的N-末端的伯胺基团的甲基化。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,进一步包括通过质谱法分析获得的N-末端片段。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述方法包括MS/MS扫描。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中,所述方法进一步包括:
(j)分级所述N-末端片段;
(k)从所述N-末端片段的至少第一子集中去除或者改变至少一个磷酸酯-基团;
(l)再分级所述N-末端片段;
(m)比较步骤(j)和(l)中获得的分级图案;以及
(n)基于步骤(m)中获得的结果,分离步骤(k)中修饰的N-末端磷酸-片段的至少第一子集。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,通过β-消除化学地去除所述磷酸酯-基团。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中,以高处理量形式进行所述方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105319116A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-10 | 复旦大学 | 基于磁性微球的蛋白质n末端肽段分离方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9388132B2 (en) | 2011-09-15 | 2016-07-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Isobaric tandem mass tags for quantitative proteomics and peptidomics |
CN114644734A (zh) * | 2020-12-02 | 2022-06-21 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种糖肽富集聚合物材料及制备与应用 |
CN114107254A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-01 | 武汉理工大学 | 一种重组蛋白DspB-SNa5及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040005633A1 (en) * | 2001-03-22 | 2004-01-08 | Joel Vandekerckhove | Methods and apparatuses for gel-free qualitative and quantitative proteome analysis, and uses therefore |
WO2005085869A2 (en) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Applera Corporation | Determination of analyte characteristics based upon binding properties |
WO2006084130A2 (en) * | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Perkinelmer Las, Inc. | Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals |
WO2007078229A1 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-12 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Kit and method for mass labelling |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005050226A1 (en) * | 2003-11-14 | 2005-06-02 | Irm Llc | Fluorous labeling for selective processing of biologically-derived samples |
EP2062912A1 (en) * | 2007-11-26 | 2009-05-27 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Selective enrichment of post-translationally modified proteins and/or peptides |
-
2008
- 2008-04-07 EP EP08103412A patent/EP2108654A1/en not_active Ceased
-
2009
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- 2009-04-02 JP JP2011502486A patent/JP2011516463A/ja not_active Withdrawn
- 2009-04-02 EP EP09729241A patent/EP2276777A2/en not_active Withdrawn
- 2009-04-02 US US12/936,417 patent/US20110045989A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040005633A1 (en) * | 2001-03-22 | 2004-01-08 | Joel Vandekerckhove | Methods and apparatuses for gel-free qualitative and quantitative proteome analysis, and uses therefore |
WO2005085869A2 (en) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Applera Corporation | Determination of analyte characteristics based upon binding properties |
WO2006084130A2 (en) * | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Perkinelmer Las, Inc. | Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals |
WO2007078229A1 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-12 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Kit and method for mass labelling |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105319116A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-10 | 复旦大学 | 基于磁性微球的蛋白质n末端肽段分离方法 |
CN105319116B (zh) * | 2015-11-18 | 2018-11-13 | 复旦大学 | 基于磁性微球的蛋白质n末端肽段分离方法 |
Also Published As
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