CN109932444A - 一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法。该方法包括以下步骤：1）通过等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离；2）对多种电荷异质体分离后的条带进行切割并收集；3）收集后的多种异质体分别进行胶内酶切；4）提取胶内酶切后的肽段；5）对提取后的肽段进行质谱分析，确认氧化、脱酰胺、C末端Lys缺失和糖基化等翻译后修饰。本发明的方法克服了多种电荷异构体对翻译后修饰分析的难点，能够精确分析单一电荷糖蛋白的多种翻译后修饰，更有利于对多种电荷异构体相关的多种翻译后修饰进行精确分析，适用于糖蛋白多种电荷异质体翻译后修饰的分析及评价。

Description

一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法

技术领域

本发明涉及蛋白质医药生物工程与技术领域，涉及一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法。尤其涉及一种重组人血管内皮细胞生长因子受体Fc（VEGFR-Fc）融合蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法。

背景技术

成熟的蛋白质药物不但具有完整的氨基酸序列，而且常常需要经过一系列的翻译后修饰加工才具有特定的生物学活性。修饰与加工形式多样，种类繁多，包括氧化、脱酰胺化、末端Lys缺失、糖基化、二硫键等。这些翻译后修饰（PTMs）影响蛋白的活性和免疫原性，与药物在体内的药效、半衰期、稳定性和安全性有直接关系。如对于单克隆抗体或融合蛋白，高唾液酸糖基化水平，会影响药物效应动力学（pK），降低体内的清除效率，延长半衰期；通过对Fc端糖基化修饰水平的调整可以增加Fc受体和C1q与抗体的结合，从而增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性和补体依赖的细胞毒性（CDC）活性；脱酰胺化反映蛋白药物的降解情况，直接影响体外稳定性、体内生物活性及生物利用度；氧化主要发生于蛋氨酸和色氨酸位点，蛋氨酸氧化会导致体内半衰期的显著下降，同时可诱导聚体形成从而引起免疫原性问题等。

重组人VEGFR-Fc融合蛋白为同源二聚体糖蛋白，由中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达，并经高度纯化和病毒灭活步骤获得。该蛋白含有多个糖基化修饰位点，具有多种电荷异构体，翻译后修饰极为复杂，为保证各生产批次的一致性，需要稳定的生产工艺和有效的翻译后修饰分析方法。为了进一步对产品进行质量研究，并对纯化过程进行精细控制，提高产品质量，本文通过等电聚焦电泳将糖蛋白多种电荷异质体分离，并对分离的异构体进行胰蛋白酶（Trypsin）酶切获得混合肽段，结合液质联用技术对肽段分析，用于指导纯化过程中目的蛋白的收集，达到获得高质量糖蛋白药物的目的。

目前，糖蛋白中翻译后修饰的测定分析主要采用糖蛋白变性还原后对蛋白进行Trypsin酶切处理，结合使用C18色谱柱对混合肽段分离，进行质谱分析。而本发明人意外的发现通过采用等电聚焦电泳将多种电荷异构体分离，然后采用胶内酶切的方法将各异构体条带进行酶切，进一步纯化肽段，结合使用C18色谱柱对混合肽段进行分离，最后进行质谱分析，意外的发现其对于对多种电荷异构体分别进行多种翻译后修饰分析更加精准，可明显的呈现出不同电荷异构体之间的翻译后修饰差异，大大提高了生产工艺过程中对各种修饰引起的产品质量进行控制的效率，节约了开发成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法，该方法克服了多种电荷异构体对翻译后修饰分析的不准确和出现分析差异导致生产成本增高，可以对糖蛋白多种电荷异构体的翻译后修饰进行分析，能够精确分析单一电荷糖蛋白的多种翻译后修饰，大大提高了纯化过程中目的蛋白的收集效率，获得高质量糖蛋白药物的时间和成本均大幅缩减。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种糖蛋白翻译后修饰的评价方法。包括以下步骤：1、通过垂直等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离，对电泳后的凝胶进行固定并染色；2、对分离后的多种电荷异质体条带编号，切割并收集到离心管中；3、将收集后的多个凝胶条带样品脱色，再进行还原和烷基化处理，最后使用胰蛋白酶进行胶内酶切；4、酶切完毕后，对酶切后的肽段使用含甲酸的乙腈溶液进行提取；5、对提取后的肽段进行超高效液相串联质谱分析，确认多种翻译后修饰。

其中所述的糖蛋白为血管内皮细胞生长因子受体Fc（VEGFR-Fc）融合蛋白。

其中步骤1中等电聚焦电泳所用凝胶为IEF凝胶，固定液为三氯乙酸溶液，染色液为考马斯亮蓝染色液。

在一具体实施方式中，等电聚焦电泳可通过以下方式实现：取适量重组人VEGFR-Fc融合蛋白，用超滤管超滤换液至一定量超纯水中；取适量超滤后样品与2×样品缓冲液等体积混匀后上样，所用凝胶为pH3-10 IEF凝胶；电泳条件为100V电泳60min，200V电泳60min，500V电泳30min。

其中所述的步骤3中使用二硫苏糖醇（DTT）溶液对糖蛋白进行还原处理；加入DTT溶液的浓度为0.5M-1M，对蛋白进行还原处理的DTT终浓度为2-25mM；进一步优选DTT的终浓度5-20mM；更优选DTT终浓度10mM。

其中步骤3中使用碘乙酰胺（IAM）进行烷基化处理，其中所用的IAM的浓度为5-25Mm。

其中所述的步骤3中加入Trypsin酶与蛋白用量的质量比为1:25~1:100（w/w），某些实施例中 Trypsin与蛋白量的质量比为1:50（w/w）或者Trypsin与蛋白量的质量比为1:40（w/w）。

其中所述的步骤4中所用提取溶液为含甲酸、乙酸或三氟乙酸的50%乙腈溶液；优选含甲酸或三氟乙酸的50%乙腈溶液；更优选含甲酸的50%乙腈溶液。

在某些实施例中提取溶液为含0.1%-5%甲酸的50%乙腈溶液；进一步优选含0.5%-2%甲酸的50%乙腈溶液；更优选含1%甲酸的50%乙腈溶液。

在一具体实施方式中，液质联用使用Waters H-Class G2-XS QTof系统，色谱柱使用Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（130Å，1.7μm，2.1×100mm），然后进行QTof质谱分析，数据处理。

本发明通过采用分辨率很高的等电聚焦电泳将多种电荷异构体分离，并对凝胶条带进行收集，减少了多种翻译后修饰分析中多种电荷异构体的影响，有利于对单一电荷糖蛋白的翻译后修饰进行精准分析。

本发明通过采用胶内酶切的方法进行蛋白酶切，减少了胶内回收、纯化蛋白后再进行酶切等繁琐步骤，不需昂贵的耗材和设备，操作方便，能够简单、快速的完成酶切并收集混合肽段。

本发明与现有方法相比，采用了分别对糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰进行分析，有助于研究蛋白不同电荷异构体之间的修饰差异，更有利于生产工艺过程中对不同电荷异构体蛋白进行质量控制，对具有多种电荷异构体的糖蛋白翻译后修饰分析具有很好的借鉴意义。

附图说明

图1：重组人VEGFR-Fc融合蛋白分析样品的IEF电泳图谱。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面将结合本发明的具体实施例，对本发明实施例中的技术方法进行清楚、完整地描述。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1、重组人VEGFR-Fc融合蛋白电荷异构体翻译后修饰结构分析

（1）IEF分离电荷异质体

取重组人VEGFR-Fc融合蛋白1mg，用10kD，0.5ml超滤管超滤换液至100μl超纯水中，酶标仪蛋白浓度定量。取适量超滤后样品与2×样品缓冲液等体积混匀后上样，蛋白上样量为100μg/条带，所用凝胶为pH3-10 IEF凝胶。电泳条件如下。

表1 IEF电泳电压设置

电泳完毕，将凝胶用超纯水冲洗2遍，然后浸泡在12%三氯乙酸固定液中进行固定，室温振摇30min。之后将凝胶用超纯水清洗3遍后，加入适量考马斯亮蓝染色液，室温下振摇30min至条带明显、清晰。再将凝胶放入超纯水中振摇，10min更换一次超纯水至凝胶背景无明显颜色，电泳图谱见图1所示。

（2）胶内酶切

① 电荷异构体收集

将电泳后的凝胶条带自上而下（pI从高至低）标记为1-12，使用手术刀将各条带分别切下，并切成1×1mm小块，分别装入1.5ml离心管中；每管加入含50%乙腈的25mM碳酸氢铵的脱色溶液300μl，室温震荡30min进行脱色，重复脱色3-4次，直至凝胶颜色脱至无色或很淡；吸出脱色液，加入乙腈300μl，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块。

② 还原及烷基化

每管加入含10mM DTT的50mM碳酸氢铵溶液300μl，于56℃水浴30min，吸出DTT溶液，加入乙腈300μl，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；然后每管加入含25mM IAM的50mM碳酸氢铵溶液300μl，室温避光反应45min，吸出IAM溶液，加入乙腈300μl，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块。

③ 胶内酶切

每管加入含10μg/ml Trypsin酶（1:40）的50mM碳酸氢铵溶液200μl，于37℃水浴酶切15h。

（3）提取肽段

酶切完毕，吸取上清液，收集至新的1.5ml离心管中；剩余的胶粒中加入含1%甲酸的50%乙腈溶液200μl，室温震荡提取30min，吸取上清液与之前收集液合并，重复提取2次，并将最终合并的收集液于冷冻浓缩离心机中浓缩至约50μl。

（4）UPLC-ESI-Q-TOF鉴定

将提取浓缩后的样品经Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（130Å，1.7μm，2.1×100mm）分离后，ESI-Q-TOF质谱检测，Unifi软件分析。所述UPLC-ESI-Q-TOF分析参数包括液相参数、质谱采集参数和样品分析参数见表2~4。

表2 液相参数

表3 质谱采集参数

表4 样品分析参数

（5）实验结果

将质谱采集数据进行分析，在质谱系统可辨识的信号范围内，通过单同位素峰确认各肽段的保留时间。根据软件自动识别、积分修饰肽段离子信号响应，计算氧化位点、脱酰胺位点以及糖基化位点修饰肽段在该总肽段中所占比例，结果如表5和6所示。

表5 IEF各条带（pI从高至低）中部分翻译后修饰所占比例结果

表6 IEF各条带（pI从高至低）中糖基化修饰所占比例结果

命名法说明：A代表了五糖核心区上的一个N-乙酰葡萄糖胺和一个半乳糖单元，G代表半乳糖，S代表唾液酸，F代表盐藻糖，M代表甘露糖。

实施例2、高pI重组人VEGFR-Fc融合蛋白电荷异构体翻译后修饰结构分析

（1）IEF分离电荷异质体

取高pI重组人VEGFR-Fc融合蛋白1mg，用10kD，0.5ml超滤管超滤换液至100μl超纯水中，酶标仪蛋白浓度定量。取适量超滤后样品与2×样品缓冲液等体积混匀后上样，蛋白上样量为100μg/条带，所用凝胶为pH3-10 IEF凝胶。电泳条件如下。

表1 IEF电泳电压设置

电泳完毕，将凝胶用超纯水冲洗2遍，然后浸泡在12%三氯乙酸固定液中进行固定，室温振摇30min。之后将凝胶用超纯水清洗3遍后，加入适量考马斯亮蓝染色液，室温下振摇30min至条带明显、清晰。再将凝胶放入超纯水中振摇，10min更换一次超纯水至凝胶背景无明显颜色，电泳图谱见图1所示。

（2）胶内酶切

① 电荷异构体收集

将电泳后的凝胶条带自上而下（pI从高至低）标记为1-12，使用手术刀将各条带分别切下，并切成1×1mm小块，分别装入1.5ml离心管中；每管加入含50%乙腈的25mM碳酸氢铵的脱色溶液300μl，室温震荡30min进行脱色，重复脱色3-4次，直至凝胶颜色脱至无色或很淡；吸出脱色液，加入乙腈300μl，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块。

② 还原及烷基化

每管加入含2mM DTT的50mM碳酸氢铵溶液300μl，于56℃水浴30min，吸出DTT溶液，加入乙腈300μl，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；然后每管加入含5mMIAM的50mM碳酸氢铵溶液300μl，室温避光反应45min，吸出IAM溶液，加入乙腈300μl，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块。

③ 胶内酶切

每管加入含4μg/ml Trypsin酶（1:100）的50mM碳酸氢铵溶液200μl，于37℃水浴酶切15h。

（3）提取肽段

酶切完毕，吸取上清液，收集至新的1.5ml离心管中；剩余的胶粒中加入含0.5%甲酸的50%乙腈溶液200μl，室温震荡提取30min，吸取上清液与之前收集液合并，重复提取2次，并将最终合并的收集液于冷冻浓缩离心机中浓缩至约50μl。

（4）UPLC-ESI-Q-TOF鉴定

将提取浓缩后的样品经Waters ACQUITY UPLC Peptide BEH C18（130Å，1.7μm，2.1×100mm）分离后，ESI-Q-TOF质谱检测，Unifi软件分析。所述UPLC-ESI-Q-TOF分析参数包括液相参数、质谱采集参数和样品分析参数同“实施例1、重组人VEGFR-Fc融合蛋白电荷异构体翻译后修饰结构分析”表2~4。

（5）实验结果

将质谱采集数据进行分析，在质谱系统可辨识的信号范围内，通过单同位素峰确认各肽段的保留时间。根据软件自动识别、积分修饰肽段离子信号响应，计算氧化位点、脱酰胺位点以及糖基化位点修饰肽段在该总肽段中所占比例，结果如表7和8所示。

表7 IEF各条带（pI从高至低）中部分翻译后修饰所占比例结果

表8 IEF各条带（pI从高至低）中糖基化所占比例结果

Claims (9)

1.一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法,该方法包括以下步骤：（1）通过垂直等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离，对电泳后的凝胶进行固定并染色；（2）对分离后的多种电荷异质体条带编号，切割并收集到离心管中；（3）将收集后的多个凝胶条带样品脱色，再进行还原和烷基化处理，最后使用胰蛋白酶进行胶内酶切；（4）酶切完毕后，对酶切后的肽段使用含甲酸的乙腈溶液进行提取；（5）对提取后的肽段进行超高效液相串联质谱分析，确认多种翻译后修饰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖蛋白为血管内皮细胞生长因子受体Fc融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的等电聚焦电泳所用凝胶为IEF凝胶，固定液为三氯乙酸溶液，染色液为考马斯亮蓝染色液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中使用二硫苏糖醇溶液对糖蛋白进行还原处理，加入二硫苏糖醇溶液的浓度为0.5M-1M，对蛋白进行还原处理的二硫苏糖醇终浓度为2-25mM。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中使用碘乙酰胺（IAM）进行烷基化处理， 碘乙酰胺的浓度为5-25Mm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）使用胰蛋白酶与蛋白用量的质量比为1:25~1:100（w/w）。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中使用含甲酸、乙酸或三氟乙酸的50%乙腈溶液对肽段进行提取。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中使用含甲酸的50%乙腈溶液对肽段进行提取。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于使用含甲酸、乙酸或三氟乙酸的50%乙腈溶液对糖链进行提取，其中优选含有0.1%-5%甲酸的50%的乙腈溶液。