CN1461342A - 糖基化vegf－b和增加可溶性vegf－b量的方法 - Google Patents

Abstract

N－糖基化的VEGF－B蛋白，编码这些蛋白的核酸分子，含有它们的药物组合物以及增加可溶性VEGF－B蛋白量的方法。VEGF－B蛋白可用于刺激和维持血管生成。

Description

糖基化VEGF-B和增加可溶性VEGF-B量的方法

发明背景

本发明涉及VEGF-B的N-糖基化引起可溶性蛋白质升高的发现。

哺乳动物血管系统的两个主要成分是内皮细胞和平滑肌细胞。内皮细胞形成哺乳动物所有的血管和淋巴管的内表面层。新血管的生成可分为两个不同的过程，即血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)(综述参阅Risau，W.，自然386：671-674(1997))。血管发生的特征是内皮细胞的前体细胞在原位分化为成熟的内皮细胞并由这些细胞形成管腔，例如胚胎早期阶段的初级血管丛形成。与此不同的是，血管生成是指已有的管腔经过生长和分支而形成血管的过程，血管生成在胚胎发生的后期阶段占据主导地位，并且是成年后所出现的血管生长的最主要因素。血管生成是一个生理性的复杂过程，涉及到内皮细胞的增殖，细胞外基质的退化，血管腔的分支以及随后发生的细胞粘附等事件。成年后，血管生成在正常情况下被严格地控制和限制在女性的生殖系统。然而血管生成可作为对组织损伤的反应而被激活。实体瘤也可以在周围组织中诱导血管生成以维持肿瘤的生长并利于转移的发生(Folkman，J.，自然医学1：27-31(1995))。目前对血管生成过程的复杂分子机制还缺乏深入的了解。

血管生成还参与了一些病理情况并在其中具有一定的作用，或是直接影响到疾病的不同结果。例如包括各种肝脏疾病相关的新血管形成，糖尿病的血管病变，高血压的血管病变，创伤后的新血管形成，颅脑外伤引起的新血管形成，慢性肝脏感染性疾病中的新血管形成(例如慢性肝炎)，热或冷创伤引起的新血管形成，激素过多相关的功能异常，血管瘤的形成以及血管成型术之后的再狭窄等。在关节炎方面，新生的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病方面，视网膜新生的毛细血管侵入玻璃体，导致出血或失明(Folkman，J.和Shing，Y.，J.Biol.Chem.267：10931-10934(1992))。血管生成因子在这些以及其他疾病中的作用尚未明确。

由于血管生成在许多生理以及病理过程中所具有的关键作用，参与调控血管生成的因子受到了广泛的研究。已经发现很多生长因子参与了对血管生成的调节。包括成纤维细胞生长因子(FGFs)，血小板衍生的生长因子(PDGFs)，转化生长因子α(TGF)和肝细胞生长因子(HGF)等。参阅如Folkman等的综述(J.Biol.Chem.267：10931-10934(1992))。

有证据指出，被称为血管内皮生长因子(VEGF)的一组特殊的内皮细胞特异性生长因子及其相应的受体，在刺激内皮细胞的增殖和分化上起了主要的作用，并能影响已分化的内皮细胞的功能。这些因子属于PDGF/VEGF家族的成员，且主要通过内皮细胞受体酪氨酸激酶(RTKs)起作用。PDGF/VEGF生长因子家族属于胱氨酸结(cystine-knot)生长因子超家族，后者还包括向神经素和转化生长因子-β。

PDGF/VEGF生长因子家族中已经鉴定出8种不同的蛋白质，包括两种PDGF(A和B)，VEGF以及5种与VEGF密切相关的成员。这5种与VEGF密切相关的成员是：VEGF-B，见于国际专利申请No.WO96/26736和美国专利Nos.5,840,693和5,607,918(Ludwig Institute forCancer Research和The University of Helsinki)所述；VEGF-C或VEGF2，见于Joukov等(EMBO J.15：290-298(1996))、Lee等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1988-1992(1996))和美国专利5,932,540和5,935,540(Human Genome Sciences，Inc)所述；VEGF-D，见于国际专利申请No.PCT/US97/14696(WO 98/07832)和Achen等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：548-553(1998))所述；胎盘生长因子(PlGF)，见于Maglione等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9267-9271(1991))所述；以及VEGF3，见于国际专利申请No.PCT/US95/07283(WO 96/39421)(Human Genome Sciences，Inc.)所述。每种VEGF家族成员在其VEGF同源结构域(VHD)与VEGF具有30％-45％的氨基酸序列相同性。此VEGF同源结构域包含由8个保守的半胱氨酸残基所形成的胱氨酸结基序。这些蛋白质在其活性、生理性状态下形成双体。VEGF家族的功能特征包括对内皮细胞和相关细胞类型的不同程度的促有丝分裂作用、诱导血管的通透性以及血管生成和淋巴管生成活性。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种分离自多种来源的同源二聚体糖蛋白。VEGF对内皮细胞具有高度特异性的促有丝分裂活性。VEGF在胚胎阶段的血管发生和成年阶段的血管生成过程中形成新的血管具有重要的调节功能(Carmeliet等，Nature，380：435-439，(1996)；Ferrara等，Nature，380：439-442，(1996)；Ferrara和Davis-Smyth综述，Endocrine Rev.，18：4-25，(1997))。VEGF所起的重要作用已被研究所证实，这些研究显示，单一一条VEGF等位基因的失活可导致因脉管系统发育障碍所引起的胚胎死亡(Carmeliet等，Nature，380：435-439，(1996)；Ferrara等，Nature，380：439-442，(1996))。有关VEGF的分离和性质见于Ferrara等(J.Cellular Biochem.，47：211-218，(1991))和Connolly(J.CellularBiochem.，47：219-223，(1991))的综述。

此外，VEGF对单核细胞具有很强的化学引诱物活性，能诱导内皮细胞产生血纤维蛋白溶酶原激活剂以及血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂，还能诱导微血管的通透性。因其具有诱导微血管的通透性的活性，VEGF有时也被称为血管通透性因子(VPF)。VEGF也是某些造血细胞的趋化因子。近期的文献指出，VEGF可阻断树突状细胞的成熟，并因此降低针对肿瘤的免疫应答的效应(许多肿瘤细胞分泌VEGF)(Gabrilovich等，Blood 92：4150-4166，(1998)；Gabrilovich等，ClinicalCancer Research 5：2963-2970，(1999))。

血管内皮生长因子B(VEGF-B)具有与VEGF相似的血管生成和其他的作用，但在组织中的分布和表达不同于VEGF。特别是VEGF-B在心脏中的表达很强，但在肺中的表达很弱，而VEGF则与此相反(Olofsson，B.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：2576-2581(1996))。RT-PCR证实在黑色素瘤、正常皮肤以及肌肉中存在VEGF-B的mRNA。这提示尽管VEGF和VEGF-B共表达于许多组织，但可能在功能上存在差别。对PDGF/VEGF家族的生长因子的比较发现，167个氨基酸的VEGF-B异构体是唯一缺乏任何糖基化的家族成员。基因靶向研究显示，VEGF-B缺失导致轻度的心脏表型和冠状血管受损(Bellomo等，Circ.Res.86：E29-35(2000))。

人的VEGF-B是使用酵母双杂交相互作用捕获(interaction trap)筛选技术对可能与细胞内I型维甲酸结合蛋白(CRABP-I)相互作用的细胞内蛋白进行筛选而得到的。对人类和小鼠的VEGF-B的核苷酸和氨基酸序列的分离和特征的详尽描述见于国际专利申请No.WO 96/26736和美国专利No.5,840,693和5,607,918(Ludwig Institute for CancerResearch和The University of Helsinki)和Olofsson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：2576-2581(1996))所述。人类VEGF-B的核苷酸序列还见于GenBank Accession No.U48801。国际专利申请WO 96/26736，美国专利5,840,693和美国专利5,607,918的全文引入本文作参考。小鼠和人类的VEGF-B基因近乎完全相同，均为4 kb的DNA。这些基因由7个外显子组成，其外显子-内含子结构形式与VEGF和P1GF基因相类似(Grimmond等，Genome Res.6：124-131(1996)；Olofsson等，J.Biol.Chem.271：19310-19317(1996)；Townson等，Biochem.Biophys.Res.Commun.220：922-928(1996))。

VEGF-C分离自PC-3前列腺癌细胞系(CRL1435)的条件培养基中，其是使用经转染而表达内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)的细胞，通过对培养基诱导VEGFR-3酪氨酸磷酸化的能力的筛选进行分离。VEGF-C通过与重组VEGFR-3的亲和层析得到纯化，并自PC-3的cDNA文库中克隆。对其分离方法和特征的详尽描述见于Joukov等(EMBO J.，15：290-298，(1996))所述。

VEGF-D分离自人类乳腺癌cDNA文库，可自Clontech购得，通过使用一种从称为“Soares Breast 3NbHBst”的人类cDNA文库中得到的表达序列标记作为杂交探针进行筛选而分离(Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：548-553，(1998))。对其分离方法和特征的详尽描述见于国际专利申请No.W098/07832和美国专利No.6,235,713所述。这些文献还描述了一种由VEGF-D氨基酸残基93到201所组成的具有生物活性的VEGF-D的片段的分离过程。VEGF-D基因在成人体内广泛表达，但并非无所不在地表达。VEGF-D在心脏、肺和骨骼肌中高度表达，中等表达于脾脏、卵巢、小肠和结肠，在肾脏、胰腺、胸腺、前列腺和睾丸中表达较低。在脑、胎盘、肝脏和外周血白细胞的RNA中检测不到VEGF-D的mRNA。

PlGF分离自足孕胎盘的cDNA文库。对其分离方法和特征的详尽描述见于Maglione等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9267-9271，(1991))所述。目前对其生物学功能还缺乏了解。

VEGF3分离自得自结肠组织的cDNA文库。VEGF3据报道与VEGF具有36％的相同性和66％的相似性。分离编码VEGF3的基因的方法还不清楚，并且国际专利申请No.PCT/US95/07283(WO 96/39421)未公开其生物学活性特征。

两种蛋白质的相似性是通过将其中一种蛋白质的氨基酸序列和保守氨基酸取代与第二种进行比较而确定的，而在确定相同性时则不比较保守氨基酸取代。

如上所述，PDGF/VEGF家族成员主要通过与受体酪氨酸激酶结合而发挥功能。受体酪氨酸激酶通常为糖蛋白，并由下列结构组成：一个能结合特异性生长因子的细胞外结构域，一个通常为蛋白质的疏水部分的跨膜结构域，一个近膜结构域，其为受体被例如蛋白质磷酸化所调节的部位，一个是受体的酶活性成分的酪氨酸激酶结构域，以及一个羧基末端尾部，其为受体参与识别并结合酪氨酸激酶底物的成分。

已经鉴定出5种内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶，他们分属于2个亚型：VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt4)属于血管内细胞生长因子受体，Tie和Tie-2(Tek)属于Tie家族受体。这些受体具有不同的特异性和亲和性，但所有受体都具有信号传导所必需的内在的酪氨酸激酶活性。

目前已知能结合VEGF的受体酪氨酸激酶仅包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1、VEGFR-2能够高亲和性地结合VEGF，VEGFR-1还能结合PlGF。VEGF-B能够高亲和性地结合VEGFR-1，但不结合VEGFR-2或VEGFR-3(Olofsson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：11709-11714(1998))。已经发现VEGF-C是VEGFR-3的配体，其还能激活VEGFR-2(Joukov等，The EMBO Journal15：290-298(1996))。VEGF-D可结合VEGFR-2和VEGFR-3(Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：548-553(1998))。对于一种结合Tie/Tie-2(Tek)的配体的描述见于国际专利申请No.PCT/US95/12935(WO96/11269)(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)所述。尚未发现Tie的配体。

一种新的130-135kDa的VEGF的特异性受体异构体也已经被纯化和克隆(Soker等，Cell 92：735-745(1998))。VEGF受体通过外显子7所编码的序列与VEGF₁₆₅异构体特异性结合，该序列对肝素具有弱的亲和性(Soker等，Cell 92：735-745(1998))。令人惊讶的是，已经发现此受体与人类neuropilin-1(NP-1)相同，NP-1是参与早期神经形态发生的一种受体。P1GF-2也表现出可与NP-1相互作用(Migdal等，J.Biol.Chem.273：22272-22278(1998))。

VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3在内皮细胞有不同程度的表达。通常地，VEGFR-1和VEGFR-2表达于血管内皮(Oelrichs等，Oncogene 8：11-18(1992)；Kaipainen等，J.Exp.Med.178：2077-2088(1993)；Dumont等，Dev.Dyn.203：80-92(1995)和Fong等，Dev.Dyn.207：1-10(1996))，而VEGFR-3最主要地表达于成人组织的淋巴内皮系统(Kaipainen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9：3566-3570(1995))。VEGFR-3也表达于肿瘤周围的脉管系统。

尽管VEGFR-1在发育过程中主要表达于内皮细胞，其也见于早期胚胎形成阶段的造血前体细胞(Fong等，Nature 376：66-70(1995))。在成年阶段，单核细胞和巨噬细胞也表达此受体(Barleon等，Blood 87：3336-3343(1995))。在胚胎中，VEGFR-1表达于绝大多数(如果不是全部)血管(Breier等，Dev.Dyn.204：228-239(1995)；Fong等，Dev.Dyn.207：1-10(1996))。

自从VEGF被发现及其特征被描述后，在血管生长因子的活性和新的因子的阐述方面已有许多重要的发现。早期的发现显示正常的发育和生理需要血管生成。诸如胚胎发生、创伤愈合和黄体形成的过程均有血管生成和血管生长因子的参与。例如，在创伤愈合过程中，VEGF的mRNA水平升高，提示在VEGF的表达和创伤愈合过程之间存在直接的联系。同样的，VEGF调节作用的缺失可能伴有创伤愈合障碍(Frank，S.，等，J.Biol.Chem.2705：12607-12613(1995))。

另一个重要发现涉及血管生成和肿瘤发生之间的联系，肿瘤的生长和转移均依赖于血管生成(Folkman，J.和Shing，Y.-，J.Biol.Chem.267：10931-10934(1992))。例如，将肿瘤细胞引入动物时，VEGF的mRNA的表达方式显示其在坏死的肿瘤生长区域周边的细胞中表达水平最高。在这些区域内发现了大量的血管。VEGF在这些区域的表达提示，低氧血症(一种氧供不足的状态)触发了VEGF在坏死的肿瘤中的表达和释放。VEGF-B的表达也与肿瘤生长有直接的关联(参阅美国专利No.5,840,693)。在肿瘤相关的巨噬细胞中以及在卵巢上皮性肿瘤中，VEGF-B的表达被明显地上调(Sowter等，Lab Invest.77：607-14，(1997))。在绝大多数被研究的肿瘤细胞系中均能检测到VEGF-B的mRNA，这些细胞系包括腺癌、乳腺癌、淋巴瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤和神经鞘瘤(Salven等，Am J Pathol.153：103-8(1998))。

已经发现VEGF/PDGF家族成员可以产生不同的转录产物。VEGF可通过选择性的剪切作用展示不同的转录产物。人类的VEGF基因具有5种不同的mRNA(Neufeld等，FASEB J.13：9-22(1999))，导致其蛋白质具有不同的分子量和生物特性(Carmeliet，P.，Nat.Med.6：389-395(2000))。hVEGF-A₁₆₅异构体在绝大多数人体组织中是主要的转录产物，其产生的多肽除了结合VEGFR1和VEGFR2外，还对NP-1具有亲和性。hVEGF₁₂₁和hVEGF₁₈₉异构体在正常组织中表达水平较低。hVEGF₂₀₆异构体主要表达于胚胎组织(Houck等，Mol Endocrinol.5：1806-14(1991))，而hVEGF₁₄₅异构体则仅发现于肿瘤细胞系中(Poltorak等，J Biol Chem.272：7151-8(1997))。此外，在病理条件下，VEGF还可以被一种异构体特异性途径所调节。在肺和结肠的肿瘤中Hvegf₁₆₅和hVEGF₁₂₁异构体被上调，而hVEGF₁₈₉异构体不发生变化，提示VEGF在恶性疾病中具有异构体特异性作用(Cheung等，Hum Pathol.29：910-4(1998))。使用鼠VEGF-B进行的一个异构体特异性VEGF靶向实验显示，mVEGF₁₆₄和mVEGF₁₈₈对于出生后的生长以及维持正常的心血管系统的功能具有更为重要的作用，而mVEGF₁₂₀则是启动并促进血管生成(Carmeliet等，Nat Med.5：495-502(1999))。

胎盘生长因子(P1GF)具有3种不同的异构体，其表达方式具有组织和发育特异性(Maglione等，Oncogene 8：925-31(1993)；Cao等，Biochem Biophys Res Commun.235：493-8(1997))。

已经发现VEGF-B具有经mRNA的选择性剪切所产生的2种异构体(Grimmond等，Genome Res.6：124131(1996)；Olofsson等，J.Biol.Chem.271：19310-19317(1996)；Townson等，Biochem.Biophys.Res.Commun.220：922-928(1996))。他们分别是含有167个氨基酸残基的细胞结合形式的VEGF-B₁₆₇和含有186个氨基酸残基的分泌形式的VEGF-B₁₈₆。2种异构体具有一个不包括信号序列在内的、含有115个氨基酸残基的相同的N-端结构域。此共同的N-端结构域由外显子1-5编码。对其余的外显子6A、6B和7的不同利用导致产生了2种剪切异构体。使用外显子6的一个选择性剪切受体位点，一段101bp的插入引起VEGF-B₁₆₇的cDNA的编码区的框移和停止。因此，2种VEGF-B异构体具有不同的C-端结构域。

2种VEGF-B剪切异构体的不同的C-端结构域影响了它们的生化和细胞生物学特性。VEGF-B₁₆₇的C-端结构域在结构上与VEGF的相应区域相关，具有数个保守的半胱氨酸残基和数段碱性氨基酸残基。因此，这个结构域具有高度的亲水性和碱性，因而在被细胞分泌后，VEGF-B₁₆₇将保持与细胞结合的状态，直到细胞被肝素或高浓度的盐处理才分离。与VEGF-B₁₆₇结合的结合于细胞的分子可能是细胞表面或周围的肝素硫酸蛋白多糖。此种异构体的细胞结合性很可能是经由其独特的碱性C-端结构域而发生的。

VEGF-B₁₈₆的C-端结构域与数据库中的已知氨基酸序列没有显著的相似性。VEGF-B₁₈₆的C-端结构域的疏水特征与VEGF-B₁₆₇的C-端结构域的亲水性和碱性特征形成对照。VEGF-B₁₈₆经细胞分泌后不与细胞结合的现象也支持上述观点。近期的证据指出，此异构体可经蛋白裂解的过程而改变其生物活性(Olofsson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：11709-11714(1998))。

VEGF-B异构体的糖基化也存在区别。VEGF-B₁₆₇没有任何糖基化，而VEGF-B186具有O-糖基化而无N-糖基化。

VEGF-B的两种异构体均可以与VEGF形成异二聚体，这与所观察到的8个半胱氨酸残基参与形成PDGF样蛋白的分子间或分子内二硫键形成的现象是一致的。此外，在许多组织中共表达VEGF-B和VEGF发现两者可自然形成VEGF-B-VEGF异二聚体。VEGF-B₁₆₇-VEGF异二聚体仍然是细胞结合型的。与此相反，VEGF-B₁₈₆和VEGF形成的异二聚体可从细胞自由分泌到培养基中。VEGF还与PlGF形成异二聚体(DiSalvo，等，J.Biol.Chem.270：77177723(1995))。此类生长因子家族成员之间的异二聚体复合物的产生能够为血管生成或调节分子的多样的组合方式提供基础。

由于VEGF-B₁₆₇被分泌后仍然保持细胞结合状态，若想获得大量的可溶性VEGF-B₁₆₇有其固有的困难。因此，需要建立能够增加可溶性VEGF-B₁₆₇的方法。

发明概述

本发明涉及一种N-糖基化的VEGF-B和一种增加可溶性VEGF-B蛋白量的方法。

第一方面，本发明提供了一种经纯化和分离的核酸分子，所述核酸分子具有选自SEQ ID NO：1(编码VEGF-B₁₆₇的序列)、SEQ IDNO：3(编码VEGF-B₁₈₆的序列)和SEQ ID NO：5(编码VEGF-B_Exl-5的序列)的一个多核苷酸序列，所述序列中插入了一个编码至少一个推定的N-糖基化位点的核苷酸序列。含有该多核苷酸序列的所述核酸分子可以是裸露的和/或存在于载体或脂质体中的。推定的N-糖基化位点是-NXT-，-NXS-或-NXC-，在此N代表天冬酰胺，X可以是任何氨基酸，T，S和C分别代表苏氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。故所述编码N-糖基化位点的核苷酸序列可以包含aay-nnn¹-(wgy/wcn)-nnn²，附带条件是-nnn¹-不是tga，tar或cnn，并且-nnn²-优选地不是ccn，在此w代表腺嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶，g代表鸟嘌呤，y代表胞嘧啶或胸腺嘧啶/尿嘧啶，c代表胞嘧啶，n代表腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶/尿嘧啶；t代表胸腺嘧啶/尿嘧啶，a代表腺嘌呤，r代表鸟嘌呤或腺嘌呤。(N-糖基化的规律见于 http：//www.expasy.ch/cgi-bin/nicedoc.pl？PDOC00001所述)。优选地，此核苷酸序列包含aay-nnn¹-(agy/wcn)-nnn²。

本发明包括上述核酸分子和上述多核苷酸的片段和变体，所述片段和变体与上述多核苷酸的非编码链具有足够的相似性，可在严格的条件下与其杂交，并且所述片段和变体可以编码VEGF-B或其片段或类似物，所述片段或类似物显示出与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5具有至少90％的序列相同性并能与VEGFR-1结合。因此，含有编码至少一个推定的N-糖基化位点的一段插入核苷酸序列的此类多核苷酸的片段和变体属于本发明的范围之内。具有代表性的严格的杂交条件如下：在42℃，5×SSC，20mM NaPO4，pH 6.8，50％甲酰胺的条件下杂交；在42℃，0.2×SSC中漂洗。本领域的人员了解可以依据杂交序列的长度和GC含量对这些条件进行经验性地改动，以及现有的广为接受的用于确定此类改动的公式。例如参阅Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》，第二版，9.47-9.51章节(Cold Spring Harbor，New York：ColdSpring Harbor Laboratory(1989))。

此外，经纯化和分离的、含有编码其他非人类哺乳动物的VEGF-B的多核苷酸序列、并含有编码至少一个推定的N-糖基化位点的一段插入核苷酸序列的核酸分子属于本发明的范围之内，由所述核酸分子编码的多肽也属于本发明的范围之内。

本发明的第二方面涉及一种蛋白质的纯化和分离，所述蛋白质具有选自SEQ ID NO：2(VEGF-B₁₆₇)、SEQ ID NO：4(VEGF-B₁₈₆)和SEQID NO：6(VEGF-B_Exl-5)的氨基酸序列，并具有至少一个插入其中的推定的N-糖基化位点。此纯化和分离的蛋白质优选地由本发明的核酸分子表达产生。如上所述，所述至少一个推定的N-糖基化位点是-NXT-，-NXS-或-NXC-，在此N代表天冬酰胺，X可以是任何氨基酸，T，S和C分别代表苏氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。优选地，N-糖基化位点是-NXT-或-NXS-，特别优选地是-NXC-。同样优选地，X和T或S之后的氨基酸不是脯氨酸。

本文中，术语“VEGF-B”所指代的均为已知的VEGF-B₁₆₇和VEGF-B₁₈₆多肽异构体及其片段或类似物，所述片段或类似物显示出与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5具有至少90％的序列相同性，并能与VEGFR-1结合和/或具有VEGF-B的血管生成刺激活性。所述活性物质应优选地包括VEGF-B特征性的氨基酸序列Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(其中Xaa可以是任何氨基酸)。

包含保守取代、插入或缺失，但仍然保留VEGF-B的生物活性的多肽显然属于本发明的范围之内。本领域的人员应熟知用于产生此类多肽的方法，例如使用定点诱变、或特异性的酶切和连接。本领域的人员还应熟知拟肽(peptidomimetic)化合物，或一个或多个氨基酸残基被非自然存在的氨基酸或氨基酸类似物所取代的化合物，可保留VEGF-B的生物活性所需的方面。此类化合物可容易地通过本领域已知的方法制得或检测，并也属于本发明的范围之内。

此外，由选择性剪切(如已知出现于VEGF和VEGF-B的选择性剪切)所产生的、和由自然发生的编码VEGF-B的核苷酸序列的等位基因变体所产生的VEGF-B多肽的可能存在的变体形式，也涵盖于本发明的范围之内。等位基因变体为本领域所熟知，并代表了核苷酸序列的选择性形式，其包含一个或多个核苷酸的取代、缺失或增加，但并不导致所编码的多肽发生任何实质性的功能改变。

此类VEGF-B的变体形式可通过针对VEGF-B多肽的非重要区域的修饰而制备。这些非重要区域应在VEGF/PDGF生长因子家族的高度保守区域之外。特别地，包括VEGF-B在内的VEGF家族的生长因子均为双体，并且VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A和PDGF-B在N-端结构域，即PDGF/VEGF同源结构域的8个半胱氨酸残基呈现出完全的保守(Olofsson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93：2576-2581；Joukov等，EMBO J.，1996，15：290-298)。据信这些半胱氨酸参与分子间和分子内的二硫键结合。此外在C-端结构域也存在高度的但不完全的保守半胱氨酸残基。由分子间二硫键形成的每个亚基的环1、环2和环3，参与了PDGF/VEGF家族生长因子与受体的结合(Andersson等，Growth Factors，1995，12：159-164)。

本领域的人员因此应充分意识到，在绝大多数情况下，这些半胱氨酸残基在任何被提议的变体形式中均应是保留的，尽管仍可能存在例外，因为已知在具有受体结合性的VEGF-B类似物中便存在一个或多个不保守的半胱氨酸。相似地，本领域技术人员应意识到环1、环2和环3的活性位点也应该是保留的。但分子的其他区域对于生物功能的重要性可能较低，并因此为修饰提供了合适的靶向。经过修饰的多肽可通过常规的活性分析程序，如内皮细胞增殖测定，以检测其展示VEGF-B生物活性的能力。

优选地，所用氨基酸取代是保守的，即一个氨基酸被与其大小和电荷特征相似的另一个氨基酸取代。术语“保守取代”在此表示一个氨基酸残基被另一个在生物学上相似的，即具有相似特征的残基取代。保守取代包括例如疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸之间的相互取代，或是用一个极性残基取代另一个极性残基，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺，以及类似的取代。可以发生相互取代的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。术语“保守取代”还包括用一个被取代的氨基酸替代一个未被取代的亲代氨基酸。表A列出了具有代表性的保守氨基酸取代：

                 表A

           保守氨基酸取代I

侧链特征                   氨基酸

脂肪族

非极性                      GAP

                            ILV

极性不带电的                CSTM

                            NQ

极性带电的                  DE

                            KR

芳香族                      HFWY

其他                        NQDE

或者，保守氨基酸也可按照Lehninger(《生物化学》，第二版；Worth Publishers，Inc.NY：NY(1975)，pp.71-77)所述进行分组，如表B所示。

                   表B

            保守氨基酸取代II

  侧链特征                   氨基酸

  非极性(疏水性)

  A.脂肪族氨基酸：           ALIVP

  B.芳香族氨基酸：           FW

  C.含硫氨基酸：             M

  D.边界氨基酸：             G

  不带电极性

  A.羟基氨基酸：             STY

  B.酰胺氨基酸：             NQ

  C.巯基氨基酸：             C

  D.边界氨基酸：             G

  带正电荷的(碱性)：         KRH

  带负电荷的(酸性)：         DE表C也列出了代表性的保守氨基酸取代。

          表C

    保守氨基酸取代III

原有残基         代表性的取代

Ala(A)           Val，Leu，Ile

Arg(R)           Lys，Gln，Asn

Asn(N)           Gln，His，Lys，Arg

Asp(D)           Glu

Cys(C)           Ser

Gln(Q)           Asn

Glu(E)           Asp

His(H)           Asn，Gln，Lys，Arg

Ile(I)           Leu，Val，Met，

                 Ala，Phe，

Leu(L)           Ile，Val，Met，

                 Ala，Phe

Lys(K)           Arg，Gln，Asn

Met(M)           Leu，Phe，Ile

Phe(F)           Leu，Val，Ile，Ala

Pro(P)           Gly

Ser(S)           Thr

Thr(T)           Ser

Trp(W)           Tyr，Phe

Tyr(Y)           Trp，Phe，Thr，Ser

Val(V)           Ile，Leu，Met，

                 Phe，Ala

如有需要，本发明的VEGF-B蛋白可以被修饰，例如对本发明的多肽进行酰胺化、羧基化或磷酸化，或形成酸盐、酰胺、酯、特别是C-端的酯、和N-酰化的衍生物。蛋白质的修饰还可以通过与其它部分形成共价或非共价复合体以产生肽衍生物。共价结合的复合体可以通过将化学部分与多肽所包含的氨基酸侧链上的、或位于N-端或C-端的官能团连接而制备。

特别地，可以预见的是，VEGF-B蛋白可以缀合一个报告基团，所述报告基团包括但不限于放射性标记、荧光标记、酶(如催化比色或荧光反应的酶)、底物、固相基质、或是载体(如生物素或亲和素)。肽段可以连接上一个表位标签，例如FLAG八肽(Sigma，St.Louis，MO)或是组氨酸，以利于进行亲和纯化。本发明的多肽可以被标记上一个可检测的标志物。多肽可以共价或非共价地结合一个用于显像的适合的超磁性、顺磁性、电子致密物、ecogenic或放射性物质。放射性或非放射性标记可用于诊断检测。放射性标记物例如包括放射性原子或基团，如¹²⁵I或³²P。非放射性标记物例如包括酶标记，如辣根过氧化物酶，或荧光素标记，如异硫氰酸荧光素(FITC)。标记可以是直接或间接的、共价或非共价的。

经过修饰的多肽可通过常规的活性分析程序，如纤维母细胞增殖测定，以检测其展示VEGF-B生物活性的能力。

显然，本发明的核酸和多肽可以通过合成、重组手段或对天然物质的纯化而制备。

在此，术语“包含...的”(comprising)的意思是“包括但不限于...”。相应的意思也用于“包含”(comprise)一词。

本发明的第三方面提供了包含本发明第一方面所述的核酸分子的载体，和经本发明的核酸分子或载体转化或转染的宿主细胞。所述细胞可以来源于真核细胞或原核细胞。这些细胞特别适合于表达本发明的多肽，并包括经重组杆状病毒感染的昆虫细胞如Sf9或HF细胞，所述Sf9或HF细胞可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)获得，还包括经一种适当的表达质粒转染的人类胚肾细胞系293-EBNA。本发明的优选载体是表达载体，其中本发明的核酸被有效地连接于一个或多个启动子和/或其他控制序列，因此经所述载体转化或转染的适当的宿主细胞能够表达本发明的多肽。其他优选的载体是那些适于转染哺乳细胞、或适于基因治疗的载体，例如基于腺病毒、牛痘病毒或逆转录病毒的载体或是脂质体。多种此类载体为本领域所熟知。

本发明还提供了制造一种载体的方法，所述载体能够表达由本发明的核酸编码的多肽，该方法包含将第一方面的核酸分子有效连接于如前所述的一个或多个适当的启动子和/或其他控制序列的步骤。

本发明进一步提供了制造本发明的一种多肽的方法，该方法包含在宿主细胞中表达本发明的核酸或载体以及从宿主细胞或其培养基中分离所述的步骤。

本发明的多肽可以与一种适当的药用载体共同使用。所得到的组合物包含有效量的糖基化的VEGF-B或其可药用的非毒性的盐，以及可药用的固相或液相载体或佐剂。此载体或佐剂的实例包括但不限于盐、缓冲盐、林格氏液、矿物油、滑石粉、谷物淀粉、凝胶、乳糖、蔗糖、维晶纤维素、高岭土、甘露醇、二钙磷酸盐、氯化钠、褐藻酸、葡萄糖、水、甘油、乙醇、赋型剂、稳定剂、缓释剂及其组合。此类组合物的形式可以是溶液、悬浊液、片剂、胶囊、乳剂、药膏、酏剂、糖浆、干糊片、油膏或其他传统剂型。配方应适合于施用方式。组合物可包含一个糖基化的VEGF-B，并任选地进一步包含一个或多个PDGF-A、PDGF-B、VEGF、非糖基化的VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、P1GF和/或肝素。包含糖基化的VEGF-B的组合物将含有0.1％-90％重量比的活性成分，并最通常地含有10％-30％。

用于肌肉注射时，无菌成分可溶解于药用稀释剂如无热源的水(蒸馏水)、生理盐水或5％的葡萄糖溶液中并施用，优选地，所述的无菌成分是糖基化的VEGF-B的适当的可溶性盐。此成分的适当的不溶性形式可在水质或可药用的油质中配成悬液并施用，所述的可药用的油质例如为长链脂肪酸酯如油酸乙酯。

在另一方面，本发明提供了一种自宿主细胞制造可溶性VEGF-B₁₆₇的方法，和一种从宿主细胞增加可溶性VEGF-B₁₆₇，VEGF-B₁₈₆或VEGF-B_EXl-5蛋白的一种方法。这些方法包含在编码VEGF-B₁₆₇，VEGF-B₁₈₆或VEGF-B_EXl-5蛋白的核苷酸序列中插入至少一个推定的N-糖基化位点；用带有此插入的N-糖基化位点的该核苷酸序列转化或转染宿主细胞；在培养基中培养此转染的宿主细胞以表达插入N-糖基化位点的该核苷酸序列；并自该宿主细胞生长的培养基中分离此表达的多肽。这些方法可进一步包含，在该多肽表达后，将此培养的被转染的宿主细胞暴露于肝素。

附图简述

下面结合附图对本发明做更详细的说明：

图1是VEGF-A和PlGF与VEGF-B的同源结构域(VHD)的氨基酸序列的对比；

图2是含有编码VEGF-B₁₈₆的核苷酸序列的pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT质粒的示意图，所述核苷酸序列中插入了一个N-糖基化位点；

图3是含有编码VEGF-B₁₆₇的核苷酸序列的pSecTagA-hVEGF-B₁₆₇-H₆-NXT质粒的示意图，所述核苷酸序列中插入了一个N-糖基化位点；

图4是含有编码VEGF-B的外显子1-5的核苷酸序列的pSecTagA-hVEGF-B-Exonl-5-H₆-NXT质粒的示意图，所述核苷酸序列中插入了一个N-糖基化位点；

图5显示具有和不具有潜在糖基化位点(NXT)的hVEGF-B₁₆₇的表达；

图6显示具有和不具有潜在糖基化位点(NXT)的hVEGF-B₁₆₇和hVEGF-B₁₈₆的表达；

图7显示具有和不具有潜在糖基化位点(NXT)的hVEGF-B₁₆₇和hVEGF-B₁₈₆的表达及受体结合；和

图8显示由具有和不具有潜在糖基化位点(NXT)的hVEGF-B的外显子1-5编码的多肽的表达及受体结合。

优选实施方案详述实施例1：引入糖基化位点

如前所述，VEGF-B是一种完全缺乏N-糖基化的PDGF/VEGF的家族成员。为了分析N-糖基化对VEGF-B的影响，将一个N-糖基化位点引入VEGF-B。图1分别列出了VEGF-A、PlGF和VEGF-B的前99个氨基酸序列，以确定引入导致VEGF-B发生N-糖基化的突变的最适位点。VEGF-A和PlGF在65-67位氨基酸的N-糖基化位点在图1中以斜体字显示。编码一个推定的N-糖基化位点(NXT)的核苷酸被插入至对应于hVEGF-B(SEQ ID NO：1)的286-294位核苷酸的位置。被替换的原286-294位核苷酸编码氨基酸残基QVR，这些氨基酸残基在图1中以粗体字显示。实施例2：制备重组载体

为天然的VEGF-B异构体(即VEGF-B₁₆₇和VEGF-B₁₈₆)和一种人工剪切变体(仅包含外显子1-5)构建了6种含或不含推定的N-糖基化位点的哺乳细胞表达载体。

用PCR技术将编码组氨酸标记的核苷酸加入到编码VEGF-B₁₈₆的核苷酸序列的C-端末尾。然后将编码hVEGF-B₁₈₆-H₆的核酸序列用标准的克隆程序插入到pSecTagA(Invitrogen，Carlsbad，Califomia)中，以构建pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆。SEQ ID NO：7给出了pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆的全长序列。

为构建pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT，产生了一种覆盖GenebankAcc.No.U48801的1-325位核苷酸的PCR产物，其在289-297位核苷酸位置引入了一个N-糖基化位点，所述PCR使用的3′引物为：5′-TCGGTACCGGATCATGAGGATCTGCATGGTGACGTTGTGCTGCCCAGTGGCCA-3′(SEQ ID NO：8)。此PCR产物随后被克隆进一个含有hVEGF-B₁₈₆全长序列的质粒，其在质粒中取代了相应序列以形成hVEGF-B₁₈₆-NXT。然后用标准的克隆程序，通过将hVEGF-B₁₈₆-NXT的N-端部分与hVEGF-B₁₈₆-H₆的C-端部分克隆在一起，加上一个组氨酸标记，生成hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT。然后用标准的克隆程序，将编码hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT的核酸序列插入pSecTagA(Invitrogen)，以构建pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT。SEQ ID NO：9给出了pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT的全长序列，对此质粒的说明见图2。

为构建pSecTagA-hVEGF-B₁₆₇-H₆，产生了一种覆盖Genebank Acc.No.U48801的250-567位核苷酸的349bp的PCR产物，其编码组氨酸标记、一个终止密码子、NotI限制性位点和末端钳形核苷酸，所述PCR使用的5′引物是：5′-CCTGACGATGGCCTGGAGTGT-3′(SEQ ID NO：10)，3′引物是5′-GAGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGCCTTCGCAGCTTCCGGCAC-3′(SEQ ID NO 11)，以hVEGF-B₁₆₇为模板。此349bp的PCR产物被KpnI和NotI切开，并用标准的克隆程序将KpnI-NotI片段插入pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆，以取代自此载体中移去的KpnI-NotI片段。SEQ ID NO：12给出了pSecTagA-hVEGF-B₁₆₇-H₆的全长序列。

同样地，用上述方法构建pSecTagA-hVEGF-B₁₆₇-H₆-NXT，区别是将KpnI-NotI片段插入pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT，以取代自载体中移去的KpnI-NotI片段。SEQ ID NO：13给出了pSecTagA-hVEGF-B₁₆₇-H₆-NXT的全长序列，对此质粒的说明见图3。

为构建pSecTagA-hVEGF-B_Exl-5-H₆，产生了一种覆盖Genebank Acc.No.U48801的1-411位核苷酸的443bp的PCR产物，其编码组氨酸标记、一个终止密码子、NotI限制性位点和末端钳形核苷酸，所述PCR使用的5′引物是：5′-CACCATGAGCCCTCTGCTCC-3′(SEQ ID NO：14)，3′引物是：5′-GAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGATGATGGTCTGGCTTCACAGCACTG-3′(SEQ ID NO：15)，以hVEGF-B₁₆₇为模板。此PCR产物被KpnI和NotI切开，并用标准的克隆程序将KpnI-NotI片段插入pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT，以取代自此载体中移去的KpnI-NotI片段。SEQ ID NO：16给出了pSecTagA-hVEGF-B_Exl-5-H₆的全长序列。

用与前相同的方法构建pSecTagA-hVEGF-B_Exl-5-H₆-NXT，区别是将KpnI-NotI片段插入pSecTagA-hVEGF-B₁₈₆-H₆-NXT，以取代自载体中移去的KpnI-NotI片段。SEQ ID NO：17给出了pSecTagA-hVEGF-B₁₆₇-H₆-NXT的全长序列，对此质粒的说明见图4。

表4列出了用于表达天然的186和167个氨基酸的VEGF-B异构体和人工剪切变体(仅包含外显子1-5)的、构建为含或不含潜在的N-糖基化位点的表达质粒。

                          表4

构建体名称	蛋白质
		pSecTagA-hVEGF-B186-H6	组氨酸标记的VEGF-B186
pSecTagA-hVEGF-B186-H6-NXT	组氨酸标记的并N-糖基化的VEGF-B186
		pSecTagA-hVEGF-B167-H6	组氨酸标记的VEGF-B167
pSecTagA-hVEGF-B167-H6-NXT	组氨酸标记的并N-糖基化的VEGF-B167
		pSecTagA-hVEGF-B-Exonl-5-H6	组氨酸标记的VEGF-B仅为外显子1-5
pSecTagA-hVEGF-B-Exonl-5-H6-NXT	组氨酸标记的并N-糖基化的VEGF-B仅为外显子1-5

实施例3：转染并表达重组的蛋白质

用CaPO₄介导的转染方法，将上述6种人类VEGF-B的哺乳动物细胞表达载体，分别与含有组氨酸标记的VEGF(阳性对照)、组氨酸标记的VEGF-C的VHD(阴性对照)和组氨酸标记的杂交84-11(阳性对照)的表达载体一起，转染至293T细胞，CaPO₄介导的转染方法的步骤见Sambrook等《分子克隆试验指南》((Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)，16.33-16.36(1989))所述。

转然后48小时，细胞用S³⁵甲硫氨酸和S³⁵半胱氨酸进行代谢性标记12-24小时。经处理的上清液以人VEGF-B(874)的特异性抗血清和五组氨酸特异性单克隆抗体(H.mAb，Qiagen)进行免疫沉淀。

如图5-8所示，所产生的含有推定的N-糖基化插入位点的3种构建体发生了糖基化。

从图5-7可以看出，将上清液和裂解物以及用肝素释放细胞结合蛋白对照显示，VEGF-B₁₆₇几乎完全保留在细胞膜上或留在细胞内。监测发现，经糖基化后，上清液中的VEGF-B₁₆₇升高了50倍(图5)。如图6和7所示，在收集前用100微克/毫升的肝素处理2小时可使VEGF-B₁₆₇释放至上清液中。还发现，未用肝素处理的293T细胞的上清液中糖基化的VEGF-B₁₆₇，比在收集前用200微克/毫升肝素处理2小时的细胞的上清液中的非糖基化的VEGF-B₁₆₇大约增多2倍。此外，在收集前用200微克/毫升肝素处理2小时的上清液中的糖基化VEGF-B₁₆₇，比未用肝素处理的上清液中的糖基化VEGF-B₁₆₇大约提高了3倍，而在收集前用200微克/毫升肝素处理2小时的上清液中的糖基化VEGF-B₁₆₇，比同样经肝素处理的上清液中的非糖基化VEGF-B₁₆₇大约提高了6倍。

图6和7显示VEGF-B₁₈₆也部分保留在细胞表面或细胞内部。与VEGF-B₁₆₇不同，经糖基化和肝素处理后，几乎所有的VEGF-B₁₈₆均释放入上清液中(图6和7)。用肝素处理和不用肝素处理的293T细胞的上清液中的VEGF-B₁₈₆的量似乎没有明显的差别。因此，上清液中的VEGF-B₁₈₆和N-糖基化VEGF-B₁₈₆的蛋白水平的差别(糖基化VEGF-B₁₈₆要多3倍)，似乎主要是由于分泌和/或产量的增加所致，而不是由于细胞表面结合蛋白的释放。

图8显示VEGF-B_Exonl-5只有在N-糖基化后才能有效地释放至培养基中(可溶性蛋白增加50倍以上)。此结果出乎意料，因为将VEGF-B保留在细胞表面的信号被认为处于外显子6和7所编码的结构域中(图8)。基于同样的原因，未测定肝素处理的影响。实施例4：重组蛋白质的VEGF受体1结合能力

使用由VEGF受体1(VEGFR-1)的细胞外结构域和人IgGl的Fc部分组成的融合蛋白(VEGFR-1-Fc)对重组VEGF-B与VEGFR-1的结合能力进行分析。得自上述实施例3中经过转染的293T细胞的、生物合成标记的条件培养基，与结合了VEGFR-1-Ig的蛋白A凝胶(PAS)进行免疫沉淀。凝胶珠经PBS洗涤3次，将结合的蛋白洗脱并以还原的SDS-PAGE(15％)进行分离。干胶在phosphoimager plates上曝光12-24小时。此外，细胞裂解物以五组氨酸单克隆抗体(H₅mAb)免疫沉淀。

当上清液中存在大量的VEGF-B时，可以观察到其与VEGFR-1的结合。见于在收集前2小时用100微克/毫升肝素处理的VEGF-B₁₈₆-H₆、VEGF-B₁₈₆-NXT-H₆和VEGF-B_Exonl-5-NXT-H₆(图7和8)。实施例5：刺激BaF3 VEGFR-01EC/EpoR细胞的存活

将N-糖基化位点引入VEGF-B的影响可通过检测得自以下细胞的条件培养基刺激BaF3 VEGFR-01EC/EpoR细胞的存活的能力来进行测定，所述细胞为转染了VEGF-B₁₆₇和VEGF-B₁₆₇-NXT和/或VEGF-B₁₈₆和VEGF-B₁₈₆-NXT。用于测定的BaF3细胞被稳定地转染了一种嵌合受体，所述嵌合受体由VEGFR-1的细胞外结构域和促红细胞生成素受体的细胞内结构域组成。这些细胞的生存需要白细胞介素-3或任何一种能够结合VEGFR-1的生长因子，例如VEGF-A、VEGF-B或P1GF。细胞以20,000/孔的密度接种于96孔培养板，并在不同量的、得自293T细胞的条件培养基中生长，所述293T细胞已经被转染了VEGF-B₁₆₇和VEGF-B₁₆₇-NXT、VEGF-B₁₈₆和VEGF-B₁₈₆-NXT、或两者。得自经模拟载体(即空载体)转染的293T细胞的条件培养基可以用作对照。测定前，应使用适当的抗体通过免疫沉淀清除条件培养基内的潜在的干扰蛋白质。例如，在测定前可用单克隆和多克隆的抗hVEGF抗体(可购自R&DSystems，Minneapolis，Minnesota)的混合物自条件培养基中清除VEGF-A。COS细胞所表达的P1GF量可以忽略不计，且其影响也无法自本底中观察到，因此不必自培养基中预先清除P1GF。培养48小时后可进行MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物噻唑蓝)比色测定，用微量滴定板读出器在540纳米收集数据。

为在人类VEGFR-1的编码序列中产生一个刚好位于VEGFR-1跨膜结构域之前的BglII位点，使用了含有内源性BclI位点的5′-CCTCAGTGATCACACAGTGG-3′引物和含有内源性BglII位点的5′-CAGAGATCTATTAGACTTGTCC-3′引物，对VEGFR-1的1998-2268位碱基对进行PCR扩增，再将此PCR片段克隆至pBlueScript SKII+(Stratagene)载体内的VEGFR-1的BclI-BglII位点。将人类促红细胞生成素受体的跨膜和细胞内结构域自EpoR x B+B/pcDNAI中切下，并作为一个BglII/NotI片段亚克隆至所产生的质粒中。EpoR x B+B是EpoR的一个克隆，其具有一个加入到推定的跨膜(TM)/胞外(EC)结构连接处的内在的BglII位点，以形成和RTK胞外结构域的框内连接。此载体的骨架是pCDNAl-amp(约5.4kb，利用KpnI原1.75kb的EpoR克隆亚克隆至pCDNAl-amp，此序列由Lodish Laboratory，MIT报道)。利用BglII(5′)-NotI(3′)可将一个约1kb的片段自此克隆切下，此片段含有EpoR的TM和胞质结构域。

此VEGFR-1/EpoR构建体作为一个KpnI/NotI片段被最终亚克隆至pEF-BOS载体(Mizushima等，Nucleic Acids Research，18(17)：5322 Sept.11，1990)。产生的质粒被电穿孔导入BaF3细胞中，用250微克/毫升的zoecin筛选以产生稳定的细胞库。

前述说明和实施例仅用于阐述本发明，但并不限制本发明。由于本领域的技术人员可对上述所公开的、并入本发明精神实质的实施方案进行改良，因此本发明应该被宽泛地解释为包括所附权利要求及其等价要求范围之内的一切事物。

序列表<110>路德维格癌症研究所；

 莱森希亚有限公司<120>糖基化VEGF-B和增加可溶性VEGF-B量的方法<130>1064-48929PV马尔库·耶尔奇等<140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>567<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(567)<220><221>mat肽<222>(64)..(564)<400>1atg agc cct ctg ctc cgc cgc ctg ctg ctc gcc gca ctc ctg cag ctg            48Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu

-20                 -15                 -10gcc ccc gcc cag gcc cct gtc tcc cag cct gat gcc cct ggc cac cag   96Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln-5              -1   1               5                  10agg aaa gtg gtg tca tgg ata gat gtg tat act cgc gct acc tgc cag   144Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

         15                  20                  25ccc cgg gag gtg gtg gtg ccc ttg act gtg gag ctc atg ggc acc gtg   192Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

     30                  35                  40gcc aaa cag ctg gtg ccc agc tgc gtg act gtg cag cgc tgt ggt ggc   240Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

 45                  50                  55tgc tgc cct gac gat ggc ctg gag tgt gtg ccc act ggg cag cac caa   288Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln60                  65                  70                  75gtc cgg atg cag atc ctc atg atc cgg tac ccg agc agt cag ctg ggg   336Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

             80                  85                  90gag atg tcc ctg gaa gaa cac agc cag tgt gaa tgc aga cct aaa aaa   384Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

         95                 100                 105aag gac agt gct gtg aag cca gac agc ccc agg ccc ctc tgc cca cgc   432Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg

    110                 115                 120tgc acc cag cac cac cag cgc cct gac ccc cgg acc tgc cgc tgc cgc   480Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg

125                 130                 135tgc cga cgc cgc agc ttc ctc cgt tgc caa ggg cgg ggc tta gag ctc   528Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu140                 145                 150                 155aac cca gac acc tgc agg tgc cgg aag ctg cga agg tga               567Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

            160                 165<210>2<211>188<212>PRT<213>智人<400>2Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1               5                  10                  15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln

         20                  25                  30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

     35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

 50                  55                  60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln

             85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

    115                 120                 125Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg

130                135                  140Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg145                 150                 155                 160Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu

            165                 170                 175Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

        180                 185<210>3<211>624<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(621)<220><221>mat_肽<222>(64)..(621)<400>3atg agc cct ctg ctc cgc cgc ctg ctg ctc gcc gca ctc ctg cag ctg   48Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu

-20                 -15                 -10gcc ccc gcc cag gcc cct gtc tcc cag cct gat gcc cct ggc cac cag   96Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln-5              -1   1                   5                  10agg aaa gtg gtg tca tgg ata gat gtg tat act cgc gct acc tgc cag   144Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

         15                  20                  25ccc cgg gag gtg gtg gtg ccc ttg act gtg gag ctc atg ggc acc gtg   192Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

     30                  35                  40gcc aaa cag ctg gtg ccc agc tgc gtg act gtg cag cgc tgt ggt ggc   240Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

 45                  50                  55tgc tgc cct gac gat ggc ctg gag tgt gtg ccc act ggg cag cac caa   288Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln60                  65                  70                  75gtc cgg atg cag atc ctc atg atc cgg tac ccg agc agt cag ctg ggg   336Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

             80                  85                  90gag atg tcc ctg gaa gaa cac agc cag tgt gaa tgc aga cct aaa aaa   384Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

         95                 100                 105aag gac agt gct gtg aag cca gac agg gct gcc act ccc cac cac cgt   432Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg

    110                 115                 120ccc cag ccc cgt tct gtt ccg ggc tgg gac tct gcc ccc gga gca ccc   480Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro

125                 130                 135tcc cca gct gac atc acc cat ccc act cca gcc cca ggc ccc tct gcc   528Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala140                 145                 150                 155cac gct gca ccc agc acc acc agc gcc ctg acc ccc gga cct gcc gcc   576His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala

            160                 165                 170gcc gct gcc gac gcc gca gct tcc tcc gtt gcc aag ggc ggg gct tag   624Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

        175                 180                 185<210>4<21l>207<212>PRT<213>智人<400>4Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu

-20                 -15                 -10Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln-5              -1   1               5                  10Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

         15                  20                  25Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

     30                  35                  40Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

 45                  50                  55Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln60                  65                  70                  75Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

             80                  85                  90Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

         95                 100                 105Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg

    110                 115                 120Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro

125                 130                 135Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala140                 145                 150                 155His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala

            160                 165                 170Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

        175                 180                 185<210>5<211>408<212>DNA<213>智人<220><22l>CDS<222>(1)..(408)<220><221>mat_肽<222>(64)..(408)<400>5atg agc cct ctg ctc cgc cgc ctg ctg ctc gcc gca ctc ctg cag ctg   48Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu

-20                 -15                 -10gcc ccc gcc cag gcc cct gtc tcc cag cct gat gcc cct ggc cac cag   96Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln-5              -1   1               5                  10agg aaa gtg gtg tca tgg ata gat gtg tat act cgc gct acc tgc cag   144Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

         15                  20                  25ccc cgg gag gtg gtg gtg ccc ttg act gtg gag ctc atg ggc acc gtg   192Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

     30                  35                  40gcc aaa cag ctg gtg ccc agc tgc gtg act gtg cag cgc tgt ggt ggc   240Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

 45                  50                  55tgc tgc cct gac gat ggc ctg gag tgt gtg ccc act ggg cag cac caa   288Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln60                  65                  70                  75gtc cgg atg cag atc ctc atg atc cgg tac ccg agc agt cag ctg ggg   336Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

             80                  85                  90gag atg tcc ctg gaa gaa cac agc cag tgt gaa tgc aga cct aaa aaa   384Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

         95                 100                 105aag gac agt gct gtg aag cca gac                                   408Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp

    110                 115<210>6<211>136<212>PRT<213>智人<400>6Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu A1a Ala Leu Leu Gln Leu

-20                 -15                 -10Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln-5              -1   1               5                  10Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

         15                  20                  25Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

     30                  35                  40Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

 45                  50                  55Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln60                  65                  70                  75Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

             80                  85                  90Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

         95                 100                 105Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp

   110                  115<210>7<211>5614<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>描述人工合成序列：

 pSecTagA-VEGF-B167-H6<400>7gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagt 900ccagtgtggt ggaattcggc ttcaccatga gccctctgct ccgccgcctg ctgctcgccg 960cactcctgca gctggccccc gcccaggccc ctgtctccca gcctgatgcc cctggccacc 1020agaggaaagt ggtgtcatgg atagatgtgt atactcgcgc tacctgccag ccccgggagg 1080tggtggtgcc cttgactgtg gagctcatgg gcaccgtggc caaacagctg gtgcccagct 1140gcgtgactgt gcagcgctgt ggtggctgct gccctgacga tggcctggag tgtgtgccca 1200ctgggcagca ccaagtccgg atgcagatcc tcatgatccg gtacccgagc agtcagctgg 1260gggagatgtc cctggaagaa cacagccagt gtgaatgcag acctaaaaaa aaggacagtg 1320ctgtgaagcc agacagcccc aggcccctct gcccacgctg cacccagcac caccagcgcc 1380ctgacccccg gacctgccgc tgccgctgcc gacgccgcag cttcctccgt tgccaagggc 1440ggggcttaga gctcaaccca gacacctgca ggtgccggaa gctgcgaagg catcatcatc 1500atcatcattg agcggccgct cgagtctaga gggcccgaac aaaaactcat ctcagaagag 1560gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat catcatcatt gagtttaaac ccgctgatca 1620gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1680ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1740cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1800gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 1860gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta 1920agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 1980cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 2040gctctaaatc ggggcatccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 2100aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 2160cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 2220acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttggg gatttcggcc 2280tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg 2340tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 2400tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 2460gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 2520tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 2580ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 2640gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg 2700gatctgatca gcacgtgttg acaattaatc atcggcatag tatatcggca tagtataata 2760cgacaaggtg aggaactaaa ccatggccaa gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc 2820gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt 2880cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt 2940ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga 3000gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc 3060catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg 3120caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca ggactgacac gtgctacgag atttcgattc 3180caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat 3240gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc 3300agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 3360ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat 3420accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 3480ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 3540gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 3600gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 3660tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 3720gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 3780ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 3840ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 3900acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 3960tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4020ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 4080ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4140ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4200actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4260gttcttgaag tggtggcc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 pSecTagA-VEGF-BExl-5-H6<400>11gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg  60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc  420attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt  480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt  540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca  600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg  660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc  720aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg  780gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca  840ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagt  900ccagtgtggt ggaattcggc ttcaccatga gccctctgct ccgccgcctg ctgctcgccg  960cactcctgca gctggccccc gcccaggccc ctgtctccca gcctgatgcc cctggccacc 1020agaggaaagt ggtgtcatgg atagatgtgt atactcgcgc tacctgccag ccccgggagg 1080tggtggtgcc cttgactgtg gagctcatgg gcaccgtggc caaacagctg gtgcccagct 1140gcgtgactgt gcagcgctgt ggtggctgct gccctgacga tggcctggag tgtgtgccca 1200ctgggcagca ccaagtccgg atgcagatcc tcatgatccg gtacccgagc agtcagctgg 1260gggagatgtc cctggaagaa cacagccagt gtgaatgcag acctaaaaaa aaggacagtg 1320ctgtgaagcc agaccatcat catcatcacc actgagcggc cgctcgagtc tagagggccc 1380gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 1440cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 1500gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 1560taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 1620ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 1680gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc 1740cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 1800gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 1860acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcggggca tccctttagg gttccgattt 1920agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 1980ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 2040ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 2100taagggattt tggggatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 2160aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 2220cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 2280ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 2340tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 2400cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 2460agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 2520cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc 2580atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac 2640cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga 2700ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga 2760cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg 2820ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa 2880cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga 2940gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg 3000acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat 3060cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt 3120cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 3180aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 3240caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg 3300gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 3360cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 3420gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 3480cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 3540tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 3600aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3660gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 3720ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 3780ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 3840gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg 3900ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 3960cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4020cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4080gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4140aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4200tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 4260gcaga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pSecTagA-VEGF-BExl-5-H6-NXT<400>12gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg  60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt  480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt  540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca  600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg  660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc  720aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg  780gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca  840ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagt  900ccagtgtggt ggaattcggc ttcaccatga gccctctgct ccgccgcctg ctgctcgccg  960cactcctgca gctggccccc gcccaggccc ctgtctccca gcctgatgcc cctggccacc 1020agaggaaagt ggtgtcatgg atagatgtgt atactcgcgc tacctgccag ccccgggagg 1080tggtggtgcc cttgactgtg gagctcatgg gcaccgtggc caaacagctg gtgcccagct 1140gcgtgactgt gcagcgctgt ggtggctgct gccctgacga tggcctggag tgtgtgccca 1200ctgggcagca caacgtcacc atgcagatcc tcatgatccg gtacccgagc agtcagctgg 1260gggagatgtc cctggaagaa cacagccagt gtgaatgcag acctaaaaaa aaggacagtg 1320ctgtgaagcc agaccatcat catcatcacc actgagcggc cgctcgagtc tagagggccc 1380gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 1440cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 1500gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 1560taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 1620ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 1680gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc 1740cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 1800gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 1860acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcggggca tccctttagg gttccgattt 1920agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 1980ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 2040ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 2100taagggattt tggggatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 2160aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 2220cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 2280ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 2340tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 2400cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 2460agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 2520cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gttgacaatt aatcatcggc 2580atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac taaaccatgg ccaagttgac 2640cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga 2700ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga 2760cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg 2820ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa 2880cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga 2940gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg 3000acacgtgcta cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat 3060cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt 3120cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac 3180aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat 3240caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg 3300gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 3360cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 3420gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 3480cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 3540tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 3600aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3660gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 3720ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 3780ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 3840gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg 3900ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 3960cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4020cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4080gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4140aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4200tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 4260gca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以在SEQ ID NO：3(VEGF-B186)的289-297位

引入N-糖基化位点<400>13tcggtaccgg atcatgagga tctgcatggt gacgttgtgc tgcccagtgg cca        53<210>14<211>21<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>描述人工合成序列：PCR 5′引物

用于扩增Genebank Acc.No.U48801第250-567位的核酸<400>14cctgacgatg gcctggagtg t                                          21<210>15<211>50<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>描述人工合成序列：PCR 3′引物

用于扩增Genebank Acc.No.U48801第250-567位的核酸<400>15gagcggccgc tcaatgatga tgatgatgat gccttcgcag cttccggcac            50<210>16<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>描述人工合成序列：PCR 5′引物

用于扩增Genebank Acc.No.U48801第1-411位的核酸<400>16caccatgagc cctctgctcc                                            20<210>17<211>47<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>描述人工合成序列：PCR 3′引物

用于扩增Genebank Acc.No.U48801第1-411位的核酸<400>17gagcggccgc tcagtggtga tgatgatggt ctggcttcac agcactg             47

Claims (18)

1.一种核酸分子，其包含：

一种选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5的多核苷酸序列或一种在严格条件下与至少一个前述序列杂交的多核苷酸序列；和

插入其中的一种编码至少一个推定的N-糖基化位点的核苷酸序列。

2.一种分离的多肽，其含有选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列，并含有至少一个插入其中的、推定的N-糖基化位点。

3.权利要求1的分离的核酸分子，其中的至少一个推定的N-糖基化位点由编码氨基酸序列NXT的核苷酸序列组成。

4.权利要求1的分离的核酸分子，其中的至少一个推定的N-糖基化位点被插入至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的286-294位核苷酸。

5.一种由权利要求1的核酸分子表达产生的分离的多肽。

6.权利要求2的分离的多肽，其结合血管内皮生长因子受体-1。

7.一种包含权利要求1的核酸分子的载体。

8.一种用权利要求7的载体转化或转染的宿主细胞。

9.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求2的多肽。

10.权利要求9的药物组合物，还包含肝素。

11.一种自宿主细胞产生可溶性VEGF-B₁₆₇的方法，其包含：

在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中插入至少一个推定的N-糖基化位点；

将所述含有N-糖基化插入位点的核苷酸序列转化或转染至宿主细胞；

在培养基中培养此转染的宿主细胞使所述含有N-糖基化插入位点的核苷酸序列得以表达；和

自所述宿主细胞生长的培养基中分离所表达的多肽。

12.权利要求11的方法，还包含在所述多肽表达后，将此培养的、经转染的宿主细胞暴露于肝素。

13.权利要求11的方法，其中的至少一个推定的N-糖基化位点由编码氨基酸序列NXT的核苷酸序列组成。

14.权利要求11的方法，其中编码至少一个推定的N-糖基化位点的核苷酸序列被插入至SEQ ID NO：1的286-294位核苷酸。

15.一种自宿主细胞中增加可溶性VEGF-B₁₆₇、VEGF-B₁₈₆或VEGF-B_Exl-5多肽的量的方法，其包含：

在选自核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5的核苷酸序列中插入至少一个推定的N-糖基化位点；

将所述含有N-糖基化插入位点的核苷酸序列转化或转染至宿主细胞；

在培养基中培养此转染的宿主细胞使所述含有N-糖基化插入位点的核苷酸序列得以表达；和

自所述宿主细胞生长的培养基中分离所表达的多肽。

16.权利要求15的方法，还包含在所述多肽表达后，将此培养的、经转染的宿主细胞暴露于肝素。

17.权利要求15的方法，其中的至少一个推定的N-糖基化位点由编码氨基酸序列NXT的核苷酸序列组成。

18.权利要求15的方法，其中编码至少一个推定的N-糖基化位点的核苷酸序列被插入至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5的286-294位核苷酸。

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