CN111607004A - 一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法 - Google Patents
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Abstract
一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。本发明对多肽中需进行保护的精氨酸的两侧，选择适当的位点插入半胱氨酸或者将不重要的氨基酸突变为半胱氨酸，使两个半胱氨酸横跨拟保护的精氨酸形成二硫键。通过二硫键带来的构象变化，在酶切处形成空间位阻，降低胰蛋白酶和精氨酸羧基端的亲和力，大幅减弱甚至消除酶切效应。
Description
技术领域
本发明属酶工程技术领域，涉及一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法。
背景技术
胰蛋白酶是肽链内切酶，其酶切位点为/K/R-\P，可以对蛋白质氨基酸序列中的精氨酸和赖氨酸的C端进行酶切(如精氨酸/赖氨酸后面跟的是脯氨酸则不会发生酶切)。在酶切反应中，为了防止肽链中的赖氨酸被胰蛋白酶酶切，通常使用柠康酸酐或者马来酸酐与赖氨酸侧链上的ε氨基进行反应，保护赖氨酸C端不被胰蛋白酶酶切。但对于肽链中的精氨酸没有很好的保护手段，只能将精氨酸突变为其他氨基酸。如果氨基酸序列中精氨酸所处位置接近该蛋白本身的活性中心位点，或其本身为发挥其活性的关键残基，该突变可能导致目标蛋白的活性降低甚至失活。因此，有必要设计一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。
优选的技术方案为：所述半胱氨酸为插入或突变得到。
优选的技术方案为：在精氨酸的两侧均插入一半胱氨酸；或者将精氨酸的两侧的不重要的氨基酸突变为半胱氨酸；或者在精氨酸的一侧插入一半胱氨酸，另一侧的不重要的氨基酸突变为半胱氨酸；使两个半胱氨酸横跨待保护的精氨酸形成二硫键。
优选的技术方案为：两个半胱氨酸间隔的氨基酸数目为n，n为大于或等于1，小于20的整数。
优选的技术方案为：两个半胱氨酸间隔的氨基酸数目为n，n为大于或等于5，小于19的整数。
优选的技术方案为：所述多肽的序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明对多肽中需进行保护的精氨酸的两侧，选择适当的位点插入半胱氨酸或者将不重要的氨基酸突变为半胱氨酸，使两个半胱氨酸横跨拟保护的精氨酸形成二硫键。通过二硫键带来的构象变化，在酶切处形成空间位阻，降低胰蛋白酶和精氨酸羧基端的亲和力，大幅减弱甚至消除酶切效应。
附图说明
图1为多肽一酶切前后分子量检测图谱。
图2为多肽二酶切前后分子量检测图谱。
图3为多肽三酶切前后分子量检测图谱。
图4为多肽一序列。
图5为多肽二序列。
图6为多肽三序列。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-6。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法
一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，结构为：多肽一：SOD片段1+精氨酸+GLP1序列+GCGGGGGG+SOD片段2。
其中，SOD片段1序列为：
ATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；
GLP1(7-37aa)序列为：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRG，其中第33位的V被突变为C，为了和GCGGGGGG中的C交联形成二硫键。野生型GLP1的C端没GCGGGGGG这段序列，在设计基因时候连在后面，可以称为linker。
SOD片段2序列为：MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEG。
该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，所述二硫键横跨所述精氨酸。
其中“SOD片段1”和“GCGGGGGG+SOD片段2”为融合蛋白，目的是促进蛋白表达时包涵体的形成。在变复性完成后，通过胰酶的酶切效应，SOD片段1被切除。形成包含GLP1、link、C端融合片段的GLP-1类似物分子。该分子由于C端结构的变化，相比于野生型的GLP1，在抗DDP4降解的半衰期上有所延长，从而在体内降糖效果上相对于野生型GLP1有显著提高。
多肽一序列如图4所示。
对比例：多肽二：SOD蛋白片段1+精氨酸+GLP1序列+GCGGGGGG+SOD片段2
其中，
SOD片段1序列为：
ATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；
GLP1(7-37aa)序列为：HAEGTFTSDVSCYLEGQAACEFIAWLVKGRG；其中第18位的S、第26位的K被突变为C，为了交联形成链内二硫键。
SOD片段2的序列为：
MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；
多肽二序列如图5所示。
多肽二的分子设计原理和思路和多肽一类似，但在GLP1分子内突变二硫键的位点选择上有所区别。
实施例2：一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法
多肽三：SOD蛋白片段1+精氨酸+GLP1序列+GCGGGGGG+SOD片段2
SOD片段1序列为ATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；
GLP1序列为(7-37aa)HAEGTFTSDVSCYLEGQAAKEFIAWLVKGRGC。其中第18位的S被突变为C，在37位G后面加上一个C。
SOD片段2序列为MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEG。
多肽三序列如图6所示。
按以下步骤分别考察多肽一，多肽二和多肽三中的精氨酸能否被胰蛋白酶酶切。
合成编码基因：通过基因合成公司合肥吉象生物技术有限公司合成目的基因序列。序列如下：
序列1：
CATATGGGTAGCAGTCATCATCATCATCACCATAGCAGCATGGCCACCAAAGCAGTGAGTGTGCTGAAAGGTGATGGCCCGGTTCAGGGTATTATTAATTTTGAACAGAAGGAAAGCAACGGCCCGGTTAAAGTTTGGGGCAGTATTAAAGGTCTGACCGAAGGTCTGCATGGTTTTCATGTGCATGAATTTGGCGATAATACCGCCGGTAGCACCAGCGCCGGTCCGAGACATGCAGAAGGCACCTTTACCAGTGATGTGAGTAGCTATCTGGAAGGTCAGGCAGCAAAAGAATTTATTGCATGGCTGTGCAAAGGTCGTGGTGGTTGTGGTGGCGGCGGCGGTGGTATGGCgACcAAAGCgGTgagcGTgcTgAAAGGcGATGGcCCgGTgCAgGGcATTATTAAcTTcGAACAgAAAGAAAGcAAcGGcCCgGTgAAAGTgTGGGGcAGcATTAAAGGcCTgACcGAAGGTTAAGCTGAGC
序列2：
CATATGGGTAGCAGTCATCATCATCATCACCATAGCAGCATGGCCACCAAAGCAGTGAGTGTGCTGAAAGGTGATGGCCCGGTTCAGGGTATTATTAATTTTGAACAGAAGGAAAGCAACGGCCCGGTTAAAGTTTGGGGCAGTATTAAAGGTCTGACCGAAGGTCTGCATGGTTTTCATGTGCATGAATTTGGCGATAATACCGCCGGTAGCACCAGCGCCGGTCCGAGACATGCAGAAGGCACCTTTACCAGTGATGTGAGTTGCTATCTGGAAGGTCAGGCAGCATGTGAATTTATTGCATGGCTGGTGAAAGGTCGTGGTATGGCgACcAAAGCgGTgagcGTgcTgAAAGGcGATGGcCCgGTgCAgGGcATTATTAAcTTcGAACAgAAAGAAAGcAAcGGcCCgGTgAAAGTgTGGGGcAGcATTAAAGGcCTgACcGAAGGTCTGCATGGTTTTCATGTGCATGAATTTGGCGATAATACCGCCGGTAGCACCAGCGCCGGTCCGTAAGCTGAGC
序列3：
CATATGGGTAGCAGTCATCATCATCATCACCATAGCAGCATGGCCACCAAAGCAGTGAGTGTGCTGAAAGGTGATGGCCCGGTTCAGGGTATTATTAATTTTGAACAGAAGGAAAGCAACGGCCCGGTTAAAGTTTGGGGCAGTATTAAAGGTCTGACCGAAGGTCTGCATGGTTTTCATGTGCATGAATTTGGCGATAATACCGCCGGTAGCACCAGCGCCGGTCCGAGACATGCAGAAGGCACCTTTACCAGTGATGTGAGCTGTTATCTGGAAGGTCAGGCAGCAAAAGAATTTATTGCATGGCTGGTGAAAGGTCGTGGTTGTATGGCgACcAAAGCgGTgagcGTgcTgAAAGGcGATGGcCCgGTgCAgGGcATTATTAAcTTcGAACAgAAAGAAAGcAAcGGcCCgGTgAAAGTgTGGGGcAGcATTAAAGGcCTgACcGAAGGTTAAGCTGAGC
构建载体和菌株：编码基因与表达载体的连接方式为通过FD NdeI和FD Bpu1102I双酶切位点插入到质粒载体PET-24a(+)的相应酶切位点中获得重组表达载体。用重组表达载体转入到BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)中得到构建重组菌种。利用Kana抗性平板筛选含有目的基因质粒的重组工程菌。
将合成的基因用FD NdeI和FD Bpu1102I两种酶进行酶切，酶切体系为50μL，酶切温度为37℃，将酶切后的片段用核酸回收试剂盒进行回收；用FD NdeI和FD Bpu1102I两种酶对质粒载体PET-24a(+)进行酶切，酶切体系为50μL，酶切温度为37℃，将酶切后的片段用核酸回收试剂盒进行回收；将两种回收后的片段用连接酶进行连接，连接反应的体系为20μL，反应温度为16℃。
将连接产物使用热激法进行转化，转入到BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)中得到构建重组菌种。利用Kana抗性平板筛选含有目的基因质粒的重组工程菌。热激法具体步骤：
1.制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中(冷却止55摄氏度以下)加入Kana至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中。
2.取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化。
3.每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟。
4.热激：将离心管放置42℃水浴，热激90秒，注意：勿摇动离心管。
5.冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟。
6.复苏：每管加400μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；
7.布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素(Kana)的LB平板。
重组工程菌发酵：诱导胞内不溶性包涵体形式的融合蛋白的表达：将保存的菌株取出，吸取10μl加入含有抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养至菌体浑浊。之后转入1L摇菌瓶扩大培养至OD600≈0.8，然后降温至16℃后加入1mM IPTG，于16℃摇床培养至16-20小时后收集菌体。
菌体破碎：将菌体通过离心机离心收集，离心转速为8000rpm/min。将离心收集的菌体用破碎缓冲液进行重悬，将重悬后的1-2L菌液用压力均质机进行压力破碎，操作压力为900bar。均质时间为10-20min。均质完成后用离心机收集包涵体，离心转速为8000rpm/min。将离心收集后的包涵体沉淀用缓冲液进行洗涤2次。
包涵体变复性：将1-2L菌液收集的包涵体用10Mm Tris，10Mm NaCl，pH7.5的缓冲液重悬，终体积约80mL。在200RPM转速下用5M NaOH溶液调节pH至12.0。维持转速搅拌半小时后，用5M HCl调节pH至11.2。维持该转速搅拌3小时，用5M HCl调节pH至9。以上步骤都在室温进行。
柠康酐保护：根据计算公式计算柠康酐加入量：柠康酐加入量(uL)＝0.173*A280*溶液体积(mL)，按计算结果在搅拌条件下加入柠康酐。注意维持加入过程中pH在9.0±1.0之内。搅拌30分钟。加入柠康酐的目的是保护蛋白序列中的赖氨酸不被后续酶切步骤中的胰酶酶切。
乙醇胺中和：根据计算公式计算0.5M乙醇胺加入量：乙醇胺加入量(uL)＝5*溶液体积(mL)/2，按计算结果在搅拌条件下加入乙醇胺。注意维持加入过程中pH在9.0±1.0之内。搅拌30分钟。加入乙醇胺的目的是中和掉上一部反应中多余的柠康酐。
胰酶酶切：按照摩尔浓度40000(复性液)：1(胰蛋白酶)加入胰蛋白酶进行酶切。针对不同的目标蛋白，需摸索适合的浓度。在另一些实施方式中，有调整到20000:1，10000:1，5000:1等其它比例。通过调整胰蛋白酶的浓度将酶切时间控制在2小时以内。
酶切效果判断：将复性后(未开始酶切)、胰酶酶切后的样品分别跑液相质谱，通过质谱结果计算出分子量。通过酶切前后的分子量判断拟保护的精氨酸位点是否被酶切破坏。
试验结果：
在多肽一的实施方式中，包涵体复性后的前体蛋白，通过质谱测得的分子量约为16069，经过胰蛋白酶酶切，得到分子量约为7876和8214的片段。其中分子量7876的片段为融合蛋白，分子量8214目标蛋白。酶切的分子量检测结果和正确酶切会产生的理论分子量完全匹配：胰蛋白酶的酶切作用主要集中在位点一(也即多肽一序列中位点63)，而位点二(也即多肽一序列中位点93)处的精氨酸在酶切过程中被二硫键很好地保护起来。
在多肽二的实施方式中，包涵体复性后的前体蛋白，通过质谱测得的分子量约为17672，经过胰蛋白酶酶切，得到分子量约为7873和6547的片段。其中分子量7873的片段为融合蛋白，分子量6547的片段非完整的目标蛋白。通过分子量匹配分析发现，在位点二(也即多肽二序列中位点93)处的精氨酸在酶切过程中没有被二硫键保护，几乎完全被胰酶所切断，因此实际检测到产生的片段为C端的融合蛋白的片段，分子量完全匹配。
在多肽三的实施方式中，包涵体复性后的前体蛋白，通过质谱测得的分子量约为15682，经过胰蛋白酶酶切，得到分子量约为7873和7828的片段。其中分子量7873的片段为融合蛋白，分子量7828为目标蛋白的分子量。酶切的分子量检测结果和正确酶切会产生的理论分子量完全匹配：胰蛋白酶的酶切作用主要集中在位点一(也即多肽三序列中位点63)，位点二(也即多肽三序列中位点93)处的精氨酸在酶切过程中被二硫键很好地保护起来。
综上，在实施方式一和三中，由于位点二的精氨酸被二硫键横跨，因此在酶切过程中得到了保护。可分析得出二硫键跨度的长短不同，对精氨酸都能起到酶切保护左右。而在实施方式二中，由于二硫键的横跨区域不经过拟保护的精氨酸，因此形成的完整构象没有包裹精氨酸，因此该二硫键没有发挥出明显的酶切保护作用。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (6)
1.一种在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：包括一待用胰蛋白酶酶切的多肽，该多肽的精氨酸的两侧均设有一半胱氨酸，两个半胱氨酸形成二硫键，且所述二硫键横跨所述精氨酸。
2.根据权利要求1所述的在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：所述半胱氨酸为插入或突变得到。
3.根据权利要求2所述的在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：在精氨酸的两侧均插入一半胱氨酸；或者将精氨酸的两侧的不重要的氨基酸突变为半胱氨酸；或者在精氨酸的一侧插入一半胱氨酸，另一侧的不重要的氨基酸突变为半胱氨酸；使两个半胱氨酸横跨待保护的精氨酸形成二硫键。
4.根据权利要求1所述的在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：两个半胱氨酸间隔的氨基酸数目为n，n为大于或等于1，小于20的整数。
5.根据权利要求4所述的在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：两个半胱氨酸间隔的氨基酸数目为n，n为大于或等于5，小于19的整数。
6.根据权利要求4所述的在胰蛋白酶酶切过程中选择性保护酶切位点的方法，其特征在于：所述多肽的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3。
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