CN104789553A - 一种血液游离dna文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液游离DNA文库的构建方法，包括末端修复，磁珠纯化，接头连接，磁珠筛选、纯化，文库混合，文库扩增、磁珠纯化等步骤。本发明方法与以往的基于Ion ProtonTM平台的建库方法相比，不需要提取游离DNA，同时采用Biocanal Magbeads磁珠，步骤简单，成本低，降低了文库的损失，减少了GC扩增偏好，提高了建库成功率，同时可提高后续检测结果的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种血液游离DNA文库的构建方法。
背景技术
我国为出生缺陷的高发国，在每年约两千多万的新生儿中，先天性致愚致残缺陷儿占每年出生人口总数的4％-6％，总数高达120万，占全世界每年500多万出生缺陷儿童的五分之一。我国政府每年支付一百亿元左右的经费用于唐氏综合征患儿的医疗和社会救济，存活下来的出生缺陷儿多为终生残疾或智力障碍，无法治愈，由此给社会造成了严重的经济负担，对家庭造成的心理负担和精神痛苦更是无法用金钱来衡量。
出生缺陷是指婴儿在出生之前，在母体子宫里就发生的发育异常以及存在于身体某些部位的畸形。这些缺陷大多是由各种各样的遗传病引起的。遗传病的种类大致可分为三类：单基因遗传、多基因遗传病、染色体病。由于染色体病累及的基因数目较多，故症状通常更严重。在众多染色体异常疾病中，染色体非整倍体导致的残疾及生活障碍尤为明显。染色体非整倍体是指细胞的染色体数目多或少了一条或多条。新生儿中染色体异常的发病率为1/160，临床上常见的非整倍体包括了21三体综合征(唐氏综合征)、18三体综合征(爱德华氏综合征)、13三体综合征(帕陶氏综合征)，以及一些性染色体畸变，例如X单体(Turner综合征)，或性染色体三体，如47XXX(X三体综合征)、47XXY(Klinefelter综合征)、47XYY(XYY综合征)。其中21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征新生儿发病率分别为1/800、1/6000、1/10000，是三种最主要的常染色体非整倍体疾病。目前此类疾病没有有效的治疗方法，只能通过产前诊断减少患儿的出生。
相对于该类疾病的传统的检测方法，利用第二代高通量测序技术对胎儿染色体非整倍体进行检测的方法具有明显的优势。第一，孕12周即可接受无创产前DNA检测：做产前诊断最佳穿刺抽取羊水时间是妊娠16～20周，而无创产前基因检测更是把时间提前到了12周，能够更早的检测出结果并做出相应对策。第二、只需抽取母体外周血进行检测，具有无创性的优点，避免胎儿宫内感染及流产，避免了传统的方法可能对母体和胎儿的危害。第三、通过高通量测序技术，实现了对孕妇外周血游离DNA的准确检测，减少了传统检测方法可能产生的假阳性及假阴性的概率。
高通量测序技术又称为下一代测序技术，第二代高通量Ion ProtonTM测序平台具有测序通量高、准确度高、成本低、操作简便等优点，在基于Ion ProtonTM平台进行高通量产前检测的流程中，文库的制备是非常重要的一步，文库质量的高低将直接影响测序质量的高低并对检测结果产生影响。
现有技术中基于Ion ProtonTM平台的文库构建方法主要包括以下步骤：
1、样本DNA提取；
2、将样品DNA与末端修复试剂混合，室温下孵育进行反应；
3、对步骤2所得的混匀DNA液进行片段筛选及纯化，得到片段集中的平末端DNA片段；
4、将步骤3所得到的DNA片段与连接酶试剂、接头、特异标签序列反应后纯化，得到加了接头的DNA片段；
5、将步骤4得到的DNA片段加入PCR扩增试剂进行PCR扩增，纯化，得到DNA文库；
上述构建的文库经过检测，之后进行高通量测序，选用Ion ProtonTM平台。上述基于IonProtonTM平台的文库构建方法的缺点：需要提取游离DNA；磁珠均采用Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠，成本高；不同样本之间的扩增偏差较大，对测序分析产生不利影响。
发明内容
本发明目的是提供一种血液游离DNA文库的构建方法，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种血液游离DNA文库的构建方法，包括以下步骤：
(1)末端修复：将孕妇外周血的血浆与末端修复试剂和末端修复酶混合进行反应；
(2)磁珠纯化：将步骤(1)所得到的反应产物进行磁珠纯化得到纯化后的DNA片段；
(3)接头连接：将步骤(2)所得到的DNA片段与连接酶、聚合酶、连接反应缓冲液、接头、标签接头混合进行接头连接反应；
(4)磁珠筛选、纯化：将步骤(3)所得到的反应产物进行磁珠筛选大小和纯化得到DNA文库；
(5)文库混合：QPCR检测文库浓度，不同样本进行等浓度混样；
(6)文库扩增、磁珠纯化：将步骤(5)得到的混合文库加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，再进行磁珠纯化得到游离DNA文库；
其中，步骤(1)中所用的末端修复试剂pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris-HCl、50mM的NaCl、10mM的MgCl2、3mM的二硫苏糖醇、10mM的ATP、10mM的dNTPs混合液，末端修复酶为10U/μl的End Repair酶；
步骤(2)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠；
步骤(3)中所用连接酶为400U/ul的T4DNA Ligase，聚合酶为8U/μl的Bst WarmStartDNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mM pH8.0的Tris-HCl，10mM的KCl，10mM的二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4；
步骤(4)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠；
步骤(6)中所用扩增试剂的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μl的Hot StartHigh-Fidelity DNA polymerase、66mM pH8.9的Tris-SO4、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μM的dNTPs混合液；
步骤(6)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠。
步骤(3)所述接头的两条链的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
步骤(3)所述标签接头的序列是由如下正反两个序列组成的AX Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3'
5'ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3'；
其中的AX Adapter选自：SEQ ID NO:3和4，或SEQ ID NO:5和6，或SEQ ID NO:7和8，或SEQ ID NO:9和10，或SEQ ID NO:11和12，或SEQ ID NO:13和14，或SEQ IDNO:15和16，或SEQ ID NO:17和18，或SEQ ID NO:19和20，或SEQ ID NO:21和22，或SEQ ID NO:23和24，或SEQ ID NO:25和26，或SEQ ID NO:27和28，或SEQ ID NO:29和30，或SEQ ID NO:31和32，或SEQ ID NO:33和34。
步骤(4)筛选片段大小为200-300bp。
步骤(6)中PCR所用的扩增引物序列为SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
本发明第二方面提供了一种血液游离DNA文库，由上述任一方法构建。
本发明第三方面提供了一种用于构建血液游离DNA文库的末端修复反应试剂，包括末端修复试剂和末端修复酶，所述末端修复试剂pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris-HCl、50mM的NaCl、10mM的MgCl2、3mM的二硫苏糖醇、10mM的ATP、10mM的dNTPs混合液，末端修复酶为10U/μl的End Repair酶。
本发明第四方面提供了一种用于构建血液游离DNA文库的接头连接反应试剂，包括连接酶、聚合酶和连接反应缓冲液，所述连接酶为400U/μl的T4DNA Ligase，聚合酶为8U/μl的Bst WarmStart DNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mMPH8.0的Tris-HCl，10mM的KCl，10mM的二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4。
本发明第五方面提供了一种用于构建血液游离DNA文库的扩增试剂，所述扩增试剂的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μl的Hot Start High-Fidelity DNA polymerase、66mMpH8.9的Tris-SO4、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μM的dNTPs混合液。
本发明第六方面提供了所述末端修复反应试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂在构建血液游离DNA文库中的应用。
本发明的有益效果：
本发明方法与以往的基于Ion ProtonTM平台的建库方法相比，不需要提取游离DNA，同时采用Biocanal Magbeads磁珠，步骤简单，成本低，降低了文库的损失，减少了GC扩增偏好，提高了建库成功率，同时可提高后续检测结果的准确度。
附图说明
图1是本发明血液游离DNA文库的构建流程图。
图2是采用Agilent Bioanalyzer2100对实施例1混合文库4的检测结果图(片段大小：260bp，质量浓度：1350.21pg/μl，摩尔浓度：7789.2pmol/l)。
图3是采用Agilent Bioanalyzer2100对实施例1混合文库5的检测结果图(片段大小：259bp，质量浓度：1439.73pg/μl，摩尔浓度：8298.0pmol/l)。
图4是采用Agilent Bioanalyzer2100对实施例1混合文库6的检测结果图(片段大小：255bp，质量浓度：1838.50pg/μl，摩尔浓度：10773.7pmol/l)。
图5是采用Agilent Bioanalyzer2100对实施例1混合文库7的检测结果图(片段大小：254bp，质量浓度：938.95pg/μl，摩尔浓度：5552.6pmol/l)。
图6是采用Agilent Bioanalyzer2100对实施例1混合文库8的检测结果图(片段大小：254bp，质量浓度：893.78pg/μl，摩尔浓度：5204.7pmol/l)。
图7是采用Agilent Bioanalyzer2100对实施例1阴性对照的检测结果图(浓度为0，没有目的片段)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库的构建
1、试剂
本实施例采用以下试剂：End Repair酶(Bioo Scientific)、T4DNA Ligase(New EnglandBiolabs)、Bst WarmStart DNA Polymerase(New England Biolabs)、Hot Start High-Fidelity DNApolymerase(New England Biolabs)、接头P1(Bioo Scientific)和标签接头Adapter(BiooScientific)。
末端修复试剂pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris-HCl、50mM的NaCl、10mM的MgCl2、3mM的二硫苏糖醇、10mM的ATP、10mM的dNTPs，末端修复酶为10U/μl的End Repair酶。
连接反应所用的连接酶为T4DNA Ligase(400U/μl)，聚合酶Bst WarmStart DNAPolymerase(8U/μl)，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mMTris-HCl(PH8.0)，10mM的KCl，10mM的二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4。
PCR扩增所用的扩增试剂pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μl的Hot StartHigh-Fidelity DNA polymerase、66mM的Tris-SO4(pH8.9)、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μM dNTPs混合液。
2、实验步骤
如图1所示：
(1)采集母体外周血，制备血浆。
在本实施例中，总共抽取了70名孕妇的外周血。血样经两步离心法得到去除了血细胞的血浆，每个血样的血浆量大约300ul，上述血样均经过染色体核型分析。实验中加入阴性对照，阴性对照以经过灭菌的超纯水代替血浆。
(2)将血浆DNA制成可供单端测序的文库。
末端修复
将上一步获取的血浆等分两管分别按照下面的表格配置反应体系。
PCR反应条件：22℃，30min；70℃，10min；4℃，holding。
分装的两管体系混合，Biocanal Magbeads磁珠纯化，32.5μl0.1X TE溶液溶解洗脱。
配置一下反应体系：
PCR反应条件：25℃，15min；65℃，5min；4℃，holding。连接完后Biocanal Magbeads磁珠筛选大小并纯化，15μl0.1X TE溶液溶解洗脱。
接头P1两条链的序列分别为SEQ ID NO:1：
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
和SEQ ID NO:2：
5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。
样品1-14的AX Adapter分别为A1Adapter-A14dapter，样品15-28的AX Adapter分别为A1Adapter-A14dapter，样品29-42的AX Adapter分别为A1Adapter-A14dapter，样品43-56的AX Adapter分别为A1Adapter-A14dapter，样品57-70的AX Adapter分别为A1Adapter-A14dapter，对照的AX Adapter为A15Adapter。
A1Adapter-A15dapter的序列分别为SEQ ID NO:3和4，SEQ ID NO:5和6，SEQ ID NO:7和8，SEQ ID NO:9和10，SEQ ID NO:11和12，SEQ ID NO:13和14，SEQ ID NO:15和16，SEQ ID NO:17和18，SEQ ID NO:19和20，SEQ ID NO:21和22，SEQ ID NO:23和24，SEQID NO:25和26，SEQ ID NO:27和28，SEQ ID NO:29和30，SEQ ID NO:31和32。
QPCR检测每个样品文库及阴性对照的浓度。
经检测阴性对照没有扩增，每14个样品文库等浓度混合(样品1-14为混合文库4、样品15-28为混合文库5、样品29-42为混合文库6、样品43-56为混合文库7、样品57-70为混合文库8)，之后进行文库扩增反应，阴性对照单独进行文库扩增反应。
配置如下体系进行PCR扩增：
PCR反应条件：98℃，30s；(98℃，10s；58℃，30s；72℃，30s)10cycles；72℃，5min；4℃，holding。PCR结束后，用Biocanal Magbeads磁珠进行纯化，20μl 0.1X TE溶液溶解洗脱。制备得到的游离DNA文库，保存备用。
PCR扩增引物序列为：
Primer 1如SEQ ID NO:35所示：5'CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'。
Primer 2如SEQ ID NO:36所示：5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC3'。
实施例2：构建的血液游离DNA文库在产前检测中的应用。
(1)文库检测。
用Qubit检测文库浓度，具体检测结果如下。
从上表中的数据可知，本发明的试剂组合溶液和文库构建方法所构建的文库浓度远远高于Ion ProtonTM测序平台上机浓度(100pM)。
用Agilent Bioanalyzer2100检测文库片段大小，结果见图2-7。
(2)高通量测序及结果分析。
每次测序反应检测14个样本，总共进行5次测序反应，测序平台为Ion ProtonTM平台。
通过对Ion ProtonTM平台的5次测序反应的测序结果进行分析，所有的样本的数据量都高于5M reads，每次测序反应的14个样本的数据量分布均匀。文库的GC含量正常范围是39％-42％，经过分析，所有样本的测序数据的GC含量均在正常的范围内，不需要重新进行文库构建，合格率100％。
70份血样的测序分析结果与医院核型结果完全一致，其中共有3个21三体样本，2个13三体样本，2个18三体样本及63个正常样本。
从上述分析结果可以看出，本发明能显著降低由于游离DNA提取及建库过程中对于DNA引入及扩增偏差导致的测序结果不合格的现象，省略了游离DNA提取的步骤，提高了文库构建的成功率，减少了文库扩增成本。
Claims (10)
1.一种血液游离DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)末端修复：将孕妇外周血的血浆与末端修复试剂和末端修复酶混合进行反应；
(2)磁珠纯化：将步骤(1)所得到的反应产物进行磁珠纯化得到纯化后的DNA片段；
(3)接头连接：将步骤(2)所得到的DNA片段与连接酶、聚合酶、连接反应缓冲液、接头、标签接头混合进行接头连接反应；
(4)磁珠筛选、纯化：将步骤(3)所得到的反应产物进行磁珠筛选大小和纯化得到DNA文库；
(5)文库混合：QPCR检测文库浓度，不同样本进行等浓度混样；
(6)文库扩增、磁珠纯化：将步骤(5)得到的混合文库加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，再进行磁珠纯化得到游离DNA文库；
其中，步骤(1)中所用的末端修复试剂pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris-HCl、50mM的NaCl、10mM的MgCl2、3mM的二硫苏糖醇、10mM的ATP、10mM的dNTPs混合液，末端修复酶为10U/μl的End Repair酶；
步骤(2)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠；
步骤(3)中所用连接酶为400U/ul的T4 DNA Ligase，聚合酶为8U/μl的Bst WarmStartDNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mM pH8.0的Tris-HCl，10mM的KCl，10mM的二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4；
步骤(4)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠；
步骤(6)中所用扩增试剂的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μl的Hot StartHigh-Fidelity DNA polymerase、66mM pH8.9的Tris-SO4、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μM的dNTPs混合液；
步骤(6)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠。
2.根据权利要求1所述的血液游离DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述接头的两条链的序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1所述的血液游离DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述标签接头的序列是由如下正反两个序列组成的AX Adapter：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3'
5'ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3'；
其中的AX Adapter选自：SEQ ID NO:3和4，或SEQ ID NO:5和6，或SEQ ID NO:7和8，或SEQ ID NO:9和10，或SEQ ID NO:11和12，或SEQ ID NO:13和14，或SEQ ID NO:15和16，或SEQ ID NO:17和18，或SEQ ID NO:19和20，或SEQ ID NO:21和22，或SEQ IDNO:23和24，或SEQ ID NO:25和26，或SEQ ID NO:27和28，或SEQ ID NO:29和30，或SEQ ID NO:31和32，或SEQ ID NO:33和34。
4.根据权利要求1所述的血液游离DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(4)筛选片段大小为200-300bp。
5.根据权利要求1所述的血液游离DNA文库的构建方法，其特征在于，步骤(6)中PCR所用的扩增引物序列为SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。
6.一种血液游离DNA文库，其特征在于，由权利要求1至5中任一项所述的方法构建。
7.一种用于构建血液游离DNA文库的末端修复反应试剂，其特征在于，包括末端修复试剂和末端修复酶，所述末端修复试剂pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris-HCl、50mM的NaCl、10mM的MgCl2、3mM的二硫苏糖醇、10mM的ATP、10mM的dNTPs混合液，末端修复酶为10U/μl的End Repair酶。
8.一种用于构建血液游离DNA文库的接头连接反应试剂，其特征在于，包括连接酶、聚合酶和连接反应缓冲液，所述连接酶为400U/μl的T4 DNA Ligase，聚合酶为8U/μl的BstWarmStart DNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mM PH8.0的Tris-HCl，10mM的KCl，10mM的二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4。
9.一种用于构建血液游离DNA文库的扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μl的Hot Start High-Fidelity DNA polymerase、66mM pH8.9的Tris-SO4、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μM的dNTPs混合液。
10.权利要求7至9中任一项所述的末端修复反应试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂在构建血液游离DNA文库中的应用。
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