CN110106557A - 一种dna文库及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA文库及其构建方法与应用,具体涉及一种用于高通量测序的DNA文库及其构建方法与应用,属于基因高通量测序技术领域。本发明DNA文库的构建方法包括以下步骤:(1)提取孕妇外周血中的游离DNA;(2)末端修复:将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复,得到平末端DNA;(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头,混匀后加入预混液,再混合均匀;所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液;(4)进行连接反应,得到所述DNA文库。本发明DNA文库的构建过程中,加入接头混匀后再加入预混液,这样避免了正式连接反应之前DNA连接酶作用导致的DNA‑DNA无效连接,从而提高了有效连接的效率;采用本发明所述方法构建DNA文库后,建库成功率提高至98.58%。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA文库及其构建方法与应用,具体涉及一种用于高通量测序的DNA文库及其构建方法与应用,属于基因高通量测序技术领域。
背景技术
自从1997年卢煜明等首次发现孕妇外周血中存在胎儿游离DNA(cell free DNA,cfDNA)以来,人们对其研究不断加深。母体外周血中的胎儿游离DNA含量在5%-30%之间,人群中胎儿DNA含量呈正态分布。母体外周血中存在的胎儿游离DNA(cfDNA)可能来自于胎盘滋养层细胞脱落凋亡所产生的小分子DNA片段。外周血中母体DNA片段普遍大于胎儿DNA的片段,胎儿DNA片段长度大约在140-160bp之间,母体DNA普遍大于160bp。孕妇外周血中游离DNA平均长度约166bp。
常见的染色体非整倍体疾病包括唐氏综合征(21-三体),爱德华氏综合征(18-三体)和帕陶氏综合征(13-三体)。常见的染色体非整倍体疾病严重危害胎儿健康,给家庭和社会带来沉重负担。传统的唐氏血清学筛查染色体非整倍体的检出率在60%-80%之间,而且假阳性率较高,且存在一定的漏检率,筛查过程会给孕妇带来巨大的心理压力。
胎儿染色体非整倍体筛查(NIPT)检测技术是近年来出现的运用高通量基因测序方法检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段,以评估胎儿常见染色体非整倍体(21-三体、18-三体及13-三体)异常风险。NIPT阳性检出率远高于传统的唐氏血清学筛查方法。由于该技术具有准确性高、检出率高等特点,并且孕妇不用进行穿刺,只需抽取孕妇外周血即可进行检测,避免了感染和流产风险。目前NIPT检测技术是孕妇产前筛查应用最为广泛的技术之一。
NIPT实验室检测流程包括以下几步:1.提取孕妇外周血游离DNA;2.构建文库;3.定量和文库混合;4.高通量测序仪测序;5.数据分析。其中构建文库是NIPT检测过程中非常重要的一步,也是容易导致检测失败的一步。而接头连接又是构建文库的核心步骤,接头连接效率低会导致大量cfDNA-cfDNA或Adapter-Adapter无效连接,对检测结果造成影响。
现有构建文库接头连接方法如下:
1.1先将PCR管从普通PCR仪(或恒温金属浴)上取出放入冰盒。
1.2根据样本个数,按下表1的比例计算ENZ2和BUF2的用量,配成预混液。
表1
组分 | 加样量 |
BUF2 | 25μL |
ENZ2(T4 DNA连接酶) | 1μL |
1.3充分混匀,瞬间离心5秒钟,将改预混液加入到步骤1.1已完成末端补平的PCR管中,再分别加入2μL Adapter于PCR管壁上,待全部加完后瞬间离心5秒钟,然后快速混匀,瞬间离心5秒钟并轻弹去除气泡,再瞬间离心5秒钟,放置于冰盒中,试剂的用量如下表2所示。
表2
组分 | 加样量 |
末端补平反应终体积 | 49μL |
BUF2及ENZ2预混液 | 26μL |
Adapter | 2μL |
反应终体积 | 77μL |
1.4放入普通PCR仪(或恒温金属浴)中开始后续程序。
上述现有方法存在以下问题:
(1)该方法对所用孕妇cfDNA样本加入接头量为2μL。我们在实际操作中发现,由于每个孕妇cfDNA含量不同、接头量2μL的加入会导致cfDNA与Adapter比例过多或过少,影响建库效率,最终影响检测结果。
(2)接头连接过程有效的连接是游离DNA分子与Adapter分子连接;避免DNA分子与DNA分子连接或Adapter与Adapter分子无效连接。而连接过程中使用的酶(ENZ2)为T4DNA连接酶,该酶可连接DNA-DNA粘性末端或平头末端,且该酶对所连接的分子无选择特异性。游离DNA分子经过末端修复过程成为平头末端,在连接酶和Buffer存在下容易发生自我连接。
构建文库接头连接过程中,先加入预混液(ENZ2和BUF2),再加入Adapter。预混液和加入Adapter之间有时间差,这时间会导致预混液中酶发挥功能,导致大量DNA-DNA发生无效连接,影响建库质量。最终影响NIPT检测结果。并且实验室手工接头连接实际过程中,由于同时处理多个样本,延长了每个样本预混液和加入Adapter之间的时间。实际操作过程中,延长的预混液和加入Adapter之间时间引起大量DNA-DNA无效连接,导致建库失败。
在未改进的接头连接方法中,如若避免接头连接失败,需要两种方法:
①加入预混液和Adapter时间要快速,减少预混液反应时间。但在实际操作过程中,由于同时多个样本进行实验,无法做到快速;而且快速也容易导致加样错误。
②每个样本分别进行预混液-快速加入Adapter-混匀流程。该方法如若加入预混液后-快速加入Adapter,然后混匀,能有效避免无效连接。但在实际操作过程中试剂加入是在生物安全柜中进行,震荡离心是在生物安全柜以外地方进行。每个样本采有预混液-快速加入Adapter-混匀流程将导致浪费大量时间,效率低下。
综上,NIPT过程中DNA文库的构建存在以下缺点:
(1)没有根据cfDNA量确定加入的Adapter量,造成建库效率低下。
(2)接头连接过程先加入预混液(ENZ2和BUF2),造成大量DNA-DNA无效连接。
(3)实际操作过程中,由于同时进行多个临床样本,该方法加剧了DNA-DNA之间的无效连接,导致建库失败。
(4)在未改进的接头连接方法中,如若避免接头连接失败。加入Adapter需要快速,但同时处理多个样本,实际操作不可取,而且快速容易导致加样错误;而分别对每个样本进行整个流程需浪费大量时间,效率低下。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种建库成功率高的用于高通量测序的DNA文库的构建方法。
同时,本发明提供了上述方法构建得到的DNA文库及其在高通量测序中的应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种DNA文库的构建方法,其包括以下步骤:
(1)提取孕妇外周血中的游离DNA;
(2)末端修复:将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复,得到平末端DNA;
(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头,混匀后加入预混液,再混合均匀;所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液;
(4)进行连接反应,得到所述DNA文库。
本发明DNA文库的构建过程中,加入接头混匀后再加入预混液,这样避免了正式连接反应之前DNA连接酶作用导致的DNA-DNA无效连接,从而提高了有效连接的效率。研究表明,按照现有方法构建DNA文库,建库成功率仅有71.03%;采用本发明所述方法构建DNA文库后,建库成功率提高至98.58%。本发明所提供的DNA文库的构建方法,仅通过改变试剂加入的先后顺序,使得建库成功率大幅度提高,这是本领域的技术人员难以预料到的。
同时,采用本发明方法构建DNA文库,加样时无需快速,可以保证加样的准确性。该方法实际操作可行,有效,时间可以充分利用。
作为本发明所述DNA文库的构建方法的优选实施方式,所述步骤(1)中,采用血清游离DNA提取试剂盒提取孕妇外周血中的游离DNA。
作为本发明所述DNA文库的构建方法的优选实施方式,所述步骤(3)中,DNA连接酶为T4DNA连接酶。
作为本发明所述DNA文库的构建方法的优选实施方式,所述步骤(3)中,接头与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为(50~300):1。更优选地,所述步骤(3)中,接头与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为100:1。根据不同孕妇外周血中的游离DNA含量确定加入接头量,可以提高游离DNA建库效率,保证检测结果准确性。研究表明,当接头与游离DNA的摩尔比为100:1时,建库效率更佳。
另外,本发明还提供了采用上述构建方法得到的DNA文库。
最后,本发明还提供了上述DNA文库在采用高通量测序方法检测孕期母体外周血中游离DNA片段中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式,其包括以下步骤:
(a)对所得DNA文库进行定量和文库混合;
(b)采用高通量测序检测经步骤(a)处理的DNA文库;
(c)对步骤(b)的检测结果进行数据分析。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明DNA文库的构建方法改变了接头与预混液的加入顺序,提高了建库成功率,建库成功率从改进前71.03%提高至运用本发明后的98.58%。现有DNA文库构建方法是先加入预混液,再加入接头,T4DNA连接酶最适反应温度为20℃左右,实验室温度也是20℃左右,加入预混液后虽放置于冰盒上,但加样混匀过程依然会发生连接反应,由此在正式连接反应之前T4DNA连接酶作用导致DNA-DNA无效连接。本发明方法先加入接头充分混匀,这时加入预混液,混匀放置于冰盒上。在处理后续样本时,前面已加入预混液的样本即使发生连接反应,由于DNA与Adapter已充分混匀,这时发生连接反应依然是有效连接。
(2)本发明DNA文库的构建方法确定了游离DNA与接头的比例,提高建库效率。不同孕妇外周血中游离DNA浓度不同,现有方法未考虑游离DNA与Adapter连接最适比例问题,会导致建库效率低下,进而影响检测结果。本文明研究确定了游离DNA与Adapter最适比例为根据不同孕妇外周血中游离DNA含量确定加入Adapter量,提高cfDNA建库效率,保证检测结果准确性。
(3)本发明DNA文库的构建方法充分考虑试剂加入区以及震荡混匀区在实验操作过程中的时空关系,调整加试剂顺序,保证实际操作可行,节省时间,效率高。
附图说明
图1为采用本发明方法构建DNA文库的原理图;
图2为采用本发明方法和现有方法构建DNA文库的流程图;
图3为本发明DNA文库构建过程中接头与游离DNA比例对建库效率影响的结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术效果和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例1~3构建DNA文库的原理如图1所示。
实施例1
本发明DNA文库及其构建方法的一种实施例,本实施例所述DNA文库的构建方法为:
(1)采用血清游离DNA提取试剂盒提取孕妇外周血中的游离DNA;
(2)末端修复:将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复,得到平末端DNA,平末端DNA体积为49μL;
(3)将步骤(2)所采用的PCR管从普通PCR仪(或恒温金属浴)上取出放入冰盒;
(4)每个样本根据游离DNA含量计算所需Adaptor量,使Adapter与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为100:1,所有样本加完后;震荡充分混匀,瞬离5秒钟;
(5)根据样本个数,按下表3比例加入ENZ2(T4DNA连接酶)和BUF2,配成预混液,将预混液加入到步骤(4)PCR管中(反应终体积约77μL),每加入一个样本预混液,手指轻弹管壁,混匀,放置于冰盒中;
(6)待所有样本加完预混液后,瞬间离心5秒钟并轻弹去除气泡,再瞬间离心5秒钟,放置于冰盒中;
(7)放入普通PCR仪(或恒温金属浴)中进行连接反应,得到DNA文库。
表3
组分 | 加样量 |
BUF2 | 25μL |
ENZ2 | 1μL |
本实施例采用高通量测序方法检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段的方法为:
(a)对本实施例所得DNA文库进行定量和文库混合;
(b)采用高通量测序检测经步骤(a)处理的DNA文库;
(c)对步骤(b)的检测结果进行数据分析。
实施例2
本发明DNA文库及其构建方法的一种实施例,本实施例所述DNA文库的构建方法与实施例1DNA文库的构建方法的区别仅在于:本实施例的步骤(4)中,Adapter与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为50:1。
本实施例采用高通量测序方法检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段的方法同实施例1。
实施例3
本发明DNA文库及其构建方法的一种实施例,本实施例所述DNA文库的构建方法与实施例1DNA文库的构建方法的区别仅在于:本实施例的步骤(4)中,Adapter与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为300:1。
本实施例采用高通量测序方法检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段的方法同实施例1。
效果例1
本效果例考察了本发明方法以及现有方法构建DNA文库(本发明方法和现有方法构建DNA文库的流程如图2所示)的成功率。其中,本发明DNA文库的构建方法为:
(1)提取孕妇外周血中的游离DNA;
(2)末端修复:将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复,得到平末端DNA;
(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头,混匀后加入预混液,再混合均匀;所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液;
(4)在PCR仪中进行连接反应,得到所述DNA文库。
DNA文库构建的现有方法与本发明方法的区别仅在于:所示步骤(3)中,向步骤(2)所得平末端DNA中加入预混液,混匀后加入接头,再混合均匀;所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液。
按照本发明方法与现有方法构建DNA文库的成功率如下表4所示。
表4
样本例数 | 建库成功例 | 建库成功率 | |
现有方法 | 397 | 282 | 71.03% |
本发明方法 | 425 | 419 | 98.58% |
由表4可见,本发明方法可以有效提高DNA建库成功率。
效果例2
本效果例选取5例外周血中游离DNA为不同浓度的孕妇构建DNA文库,构建DNA文库的方法同实施例1,但是构建过程中Adapter与游离DNA的摩尔比与实施例1不同。本效果例中,Adapter与游离DNA的摩尔比分别为:10:1,20:1,50:1,70:1,100:1,120:1,150:1,200:1,250:1,300:1,400:1。本效果例考察了Adapter与游离DNA不同摩尔比时的建库效率,结果如图3所示。
由图3可见,接头与游离DNA的摩尔比为(10~400):1时,其文库浓度都有可能满足目前文库质控标准(≥10pM),但接头与游离DNA的摩尔比为(50~300):1时,建库效率较佳,尤其当接头与游离DNA的摩尔比为100:1时建库效率最高。
孕妇外周血游离DNA(cfDNA)的平均长度166bp,Adapter(接头)长度为61bp,据此也可以确定接头与游离DNA的质量比。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种DNA文库的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取孕妇外周血中的游离DNA;
(2)末端修复:将步骤(1)所得到的游离DNA进行末端修复,得到平末端DNA;
(3)向步骤(2)所得平末端DNA中加入接头,混匀后加入预混液,再混合均匀;所述预混液包括DNA连接酶和缓冲溶液;
(4)进行连接反应,得到所述DNA文库。
2.如权利要求1所述的DNA文库的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)中,采用血清游离DNA提取试剂盒提取孕妇外周血中的游离DNA。
3.如权利要求1所述的DNA文库的构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中,DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
4.如权利要求1所述的DNA文库的构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中,接头与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为(50~300):1。
5.如权利要求4所述的DNA文库的构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中,接头与步骤(1)提取的游离DNA的摩尔比为100:1。
6.采用权利要求1~5任一项所述构建方法得到的DNA文库。
7.如权利要求6所述DNA文库在采用高通量测序方法检测孕期母体外周血中游离DNA片段中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(a)对所得DNA文库进行定量和文库混合;
(b)采用高通量测序检测经步骤(a)处理的DNA文库;
(c)对步骤(b)的检测结果进行数据分析。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190809 |
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