多倍染色体检测用的标准品产品及其制备方法
技术领域
本发明涉及第二代高通量测序,涉及遗传变异检测领域,特别是染色体数目异常,例如21三体综合症、18三体综合症、13三体综合症等的检测。
背景技术
21-三体综合征(又称唐氏综合征、T21)、18-三体综合征(又称Edwards综合征、T18)和13-三体综合征(又称Patau综合征、T13),是目前常见的出生缺陷染色体疾病,其新生儿出生发病率分别为1/600-1/800、1/6000、1/10000。目前产前检测主要是以血清学生化筛查为主,存在约为3.2-5.6%假阳性率,检出率仅为66-81%。
2008年开始有报道将高通量测序技术应用于孕妇血浆中游离DNA的全基因组地深度测序来检测胎儿是否患有染色体非整倍性疾病,如21三体综合征(T21)、18三体综合征(T18)和13三体综合征(T13)。其检测原理是对孕妇血浆上百万条DNA分子进行序列测定,通过生物信息统计计算比较待检孕妇在这三条染色体上的统计量与怀正常二倍体胎儿的孕妇人群相比是否存在显著性差异。
至2013年底,全球已经使用这一技术完成了超过70万例孕妇检测,报道检测特异性和灵敏度超过99%。到目前为止,美国、中国、意大利等国际产前诊断学会(ISPD)、中国产前诊断专家组、美国妇产科医师学会(ACOG)和美国母胎医学会(SMFM)、美国遗传咨询师协会(NSGC)、美国医学遗传学会(ACMG)等均先后发布了针对这一检测临床应用的指南与委员会指导意见。
虽然已有多个独立机构和行业指南对该方法的准确性给与了肯定,但由于目前该领域的行业协会尚未提供一套行之有效的标准品,可用于不同研究小组、不同测序平台、不同实验室之间的效能比较,因此无法得到一个全面系统的评估和室间质评参数,造成该技术无法大规模在临床医学检验中心大范围开展。因此,建立一套检测标准品对于评价检测方法、规范行业行为具有重要意义。
由于21三体综合征胎儿,18三体综合征胎儿和13三体综合征发生率在全球范围内为1/600-1/800、1/6000、1/10000,根据全球每年135,000,000新生儿而言,考虑上述T21、T18、T13的发病率,每年全球仅分别可以找到19万、2.2万、1.3万阳性孕妇,因此如果通过采集怀有21三体综合征胎儿,18三体综合征胎儿和13三体综合征胎儿的孕妇的外周血分离血浆样本来构建标准品,将面临采样困难、伦理争议、采血量有限且孕妇个体间胎儿浓度差异大,难以获得预期的浓度范围下的标准品等问题,故采集真实阳性孕妇血浆样本来构建标准品的方法由于实施性较差。
因此,本领域迫切需要开发一种新的建立三体测定标准品的方法,即可以避免繁复的大样本采集,又能使所获得标准品在最大程度上模拟真实样本质量并保证检测结果准确性。
发明内容
本发明提供了一种制备适用于所有二代测序平台的基于孕妇外周血血浆样本提取的DNA通过二代测序平台的全基因组测序,结合生物信息分析方法进行胎儿染色体非整倍性的的无创检测技术的标准品的方法以及具体的操作步骤。
本发明第一方面,提供了一种多倍染色体检测用标准品产品,所述产品包括各自位于独立容器内的:
第一标准品,所述的第一标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有3.5±0.2%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆;
任选的第二标准品,所述的第二标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有4-6%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆;和
任选的第三标准品,所述的第三标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有8-12%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆。
在另一优选例中,所述的多倍染色体来源于人。
在另一优选例中,所述的gDNA片段的大小均为100-300bp。
在另一优选例中,所述的gDNA片段的大小均为150-200bp。
在另一优选例中,所述的第一标准品为最低检出浓度标准品。
在另一优选例中,所述的第二标准品为早孕周检出浓度标准品。
在另一优选例中,所述的标准品产品包括:
第二标准品,所述的第二标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有4-6%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆;和
第三标准品,所述的第三标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有8-12%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆。
在另一优选例中,所述的第三标准品为要求检出浓度标准品。
在另一优选例中,所述的标准品产品还包括选自下组的一种或多种标准品:
阴性标准品:作为阴性对照的正常女性血浆。
在另一优选例中,所述阴性对照的Z值符合-3<Z<3。
在另一优选例中,所述的多倍染色体包括21三体、18三体、13三体、或其组合。
在另一优选例中,所述的多倍染色体gDNA来自多倍染色体细胞系gDNA。
在另一优选例中,所述产品中包括针对21三体、18三体、13三体中一种或多种染色体异常的标准品。
在另一优选例中,所述的18三体或13三体染色体异常的标准品是,基于标准品中DNA的总量(质量),含有8-12%的所述18三体或13三体染色体gDNA片段和正常女性血浆的标准品。
在另一优选例中,基于标准品中DNA的总量(质量),所述第一标准品中含有3.5%的多倍染色体gDNA;和/或
所述第二标准品中含有5%的多倍染色体gDNA;和/或
所述第三标准品中含有10%的多倍染色体gDNA。
在另一优选例中,所述的多倍染色体检测包括多平台的二代高通量测序检测。
在另一优选例中,所述的多平台包括Illumina Hiseq、ABISolid和Roche454测序平台、Complete Genomics BlackBird测序平台、LifeTech PGM/Proton测序平台。
本发明第二方面,提供了本发明第一方面所述的标准品产品的用途,用于制备检测多倍染色体的试剂盒。
本发明第三方面,提供了一种多倍染色体检测试剂盒,所述的试剂盒含有多倍染色体检测试剂,和本发明第一方面所述的标准品产品。
在另一优选例中,所述的多倍染色体检测试剂盒包括胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(联合探针锚定连接测序法)、胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法),血浆游离DNA提取试剂盒及通用的二代测序技术的建库及测序试剂盒。
本发明第四方面,提供了一种制备本发明第一方面所述标准品产品的方法,包括步骤:
(a)提供多倍染色体gDNA片段s1,和正常女性血浆s2;
(b)将(a)中s1和s2混合,从而形成标准品,且所述的标准品符合以下条件:
(b1)第一标准品,基于标准品中DNA的总量(质量),含有3.5±0.2%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆;和/或
(b2)第二标准品,基于标准品中DNA的总量(质量),含有4-6%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆;和/或
(b3)第三标准品,基于标准品中DNA的总量(质量),含有8-12%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆游离DNA。
在另一优选例中,所述s1和s2的大小为150-200bp。
在另一优选例中,还包括将正常女性血浆s2作为阴性对照标准品。
本发明第五方面,提供了一种体外非诊断性的检测方法的方法,包括步骤:
(i)将所述的样本与本发明第一方面所述标准品产品中的标准品分别进行二代高通量测序;
(ii)将(i)中所获得的测序结果与本发明第一方面所述标准品产品中的标准品进行比较,并计算Z值;
其中,当第一标准品检出率高于50%(较佳地≥60%,更佳地≥80%)时,当样本和标准品产品中第一、第二和第三标准品的检测结果均为Z值>3时,则判定检测结果为阳性,表明所述的样品为含有源自多倍染色体的核酸的样品,而当样本和标准品产品中第一、第二和第三标准品的检测结果均为Z值≤3时,则判定检测结果为阴性;
并且当第一标准品检出率<50%时,则表明该平台及实验方法灵敏度不足以满足检测含有源自多倍染色体的核酸的样品。
在另一优选例中,当样本和标准品产品中第一、第二和第三标准品的检测结果均为Z值=3时,判定检测结果为临界值,可对所述样本和所述标准品进行再次测定。
本发明第六方面,提供了一种诊断怀孕妇女是否怀有多倍染色体胎儿的方法,包括步骤:
(A)提供所述怀孕妇女的血液样本,按照两步离心法分离血浆的方法分离血浆,并进行二代高通量测序;
(B)将(A)中的测序结果与本发明第一方面所述标准品产品中的标准品比较,从而判断所述怀孕妇女是否怀有多倍染色体胎儿;
其中,当样本和标准品产品中第二和第三标准品的检测结果均为阳性且第一标准品检出率高于50%(较佳地≥60%,更佳地≥80%)时,则诊断该孕妇怀有多倍染色体胎儿为高风险。
本分那么第七方面,提供了一种多倍染色体检测用标准品,所述的标准品选自下组:
第一标准品,所述的第一标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有3.5±0.2%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆;
第二标准品,所述的第二标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有4-6%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆;和
第三标准品,所述的第三标准品中,基于标准品中DNA的总量(质量),含有8-12%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆。
在另一优选例中,所述的标准品还含有:基于标准品中DNA的总量(质量),含有8-12%三体染色体异常的gDNA片段和正常女性血浆。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
如非另行说明,本发明所有的%均为基于质量的百分比浓度(wt%)。
附图说明
图1显示了标准品配制流程。
图2显示了标准品信息分析流程。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,结合血浆DNA自身特点和性质,比如片段大小、总量、胎儿浓度等,经过大量参数组合的筛选,首次制备获得了能通用于多个二代测序平台染色体三体测定的标准品。本发明在模拟了三体细胞系gDNA与正常女性血浆在不同浓度比例、不同片段长度的组合,构建了不同检测梯度下的标准品,本发明标准品可有效应用于各平台均质性以及测定灵敏度的校准和鉴定。在此基础上,完成了本发明。
孕妇血浆游离DNA
孕妇血浆游离DNA存在以下4个特点:a)孕妇血浆或血清中存在游离于细胞外的DNA分子,其中大部分来自母体自身的白细胞DNA降解,小部分来自胎儿细胞降解;b)孕妇血浆游离DNA的片段范围在100-300bp;c)游离DNA中少量的来自胎儿DNA主要为胎盘组织或细胞降解产生的DNA分子释放到孕妇外周血循环中;d)孕妇血浆中胎儿游离DNA的比例约为5%-20%,随着孕周的增大而增多,且个体间差异较大;e)孕妇血浆中胎儿游离DNA在分娩并胎盘剥离后2个小时消失。f)孕妇血浆中游离DNA总量差异较大,每毫升血浆中可获得0.3-10ng DNA。
术语
多倍染色体
如本文所用,术语“多倍染色体”指的是来源于人类的多倍常染色体,例如21三体、18三体、13三体、或其组合。
正常女性血浆
如本文所用,所述正常女性血浆表示从正常的健康未怀孕的女性外周血中经离心去除血细胞后的血浆制品。本发明正常女性血浆的制备无特殊限制,可根据现有技术中常规的血浆制备方法进行制备,优选地,本发明正常女性血浆可制备如下:
采集正常女性外周血5mL于EDTA抗凝管中,轻微颠倒混匀。在4℃条件下以1600g离心10min,离心后将上清(血浆)分离到2.0mL的离心管中在4℃条件下以16000g离心10min去除残余细胞,将上清转入新的50mL离心管中(无白细胞混入),即得到所需的血浆,将所有血浆混合均匀,配制成血浆混合物。将血浆混合物分装至若干个50mL的离心管中。
Z值
如本文所用,术语“Z值”或“Z-score”可互换使用,指的是采用常规Z检验计算获得的Z值,在本发明中当Z值>3时,可以判断检测样本为阳性。
标准品产品
在本发明的标准品产品中,至少含有最低检测浓度的标准品,以及任选的阳性检测浓度的标准品。其中,优选地,所述最低检测浓度标准品为第一标准品,基于标准品中DNA的总量(质量),含有3.5±0.2%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆;所述阳性检测浓度的标准品为第二标准品,基于标准品中DNA的总量(质量),含有4-6%的多倍染色体gDNA片段和余量的正常女性血浆。
此外,本发明标准品产品中还可含有正常女性血浆游离DNA的片段作为阴性对照;以及作为强阳性对照的第三标准品,其中基于标准品中DNA的总量(质量),含有8-12%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆。
可用于本发明标准品产品中的DNA片段大小优选100-300bp,而本发明人通过实验证明,在DNA片段大小为150-200bp时,所获得的标准品效果更佳。
多倍染色体的检测及检测试剂盒
本发明提供了一种可用于对多平台进行质控和灵敏度检测的试剂盒。可用于本发明的多倍染色体试剂盒除了含有常规应用于多倍染色体检测试剂外,更重要的是,含有本发明标准品产品。例如至少含有第一标准品和第二标准品的本发明标准品产品物。
通常,可用于本发明多倍染色体试剂盒中的多倍染色体检测试剂包括胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(联合探针锚定连接测序法)、胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法),血浆游离DNA提取试剂盒及通用的二代测序技术的建库及测序试剂盒。
标准品产品的制备方法
从技术角度来讲,本发明通常有以下四种方法可以配制模拟样本:
1)使用已知为21三体综合征患者或21三体细胞系提取的基因组DNA与正常女性基因组DNA按比例混合,打断至血浆DNA片段大小分布范围内,备用;
2)使用已知为21三体综合征患者或21三体细胞系提取的基因组DNA打断至血浆DNA片段大小分布范围内,与正常女性基因组DNA的打断后产物按比例混合;
3)使用已知为21、18、13三体综合征患者或21、18、13三体细胞系提取的基因组DNA打断至血浆DNA片段大小分布范围内,与正常女性外周血分离的血浆DNA按比例混合;
4)使用已知为21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征患者外周血分离的血浆DNA与正常女性外周血分离的血浆DNA按比例混合。
考虑到一份总量为0.3-10ng DNA保存后复融会出现损耗情况,以及采样问题,(21三体患者存活率低,18三体综合征和13三体综合征几乎无法存活),因此征集人群有限,类型不全,采血量无法满足配置要求,且存在更大的伦理争议。
综合以上几种原因,最终本发明人采用了方法3来配置标准品,并通过对不同DNA片段的大小、浓度进行筛选后,最终获得了本发明标准品产品。
用于制备本发明标准品产品的方法包括步骤:
(a)提供多倍染色体gDNA片段s1,和正常女性血浆s2;
(b)将(a)中s1和s2混合,从而形成标准品,且所述的标准品符合以下条件:
(b1)第一标准品,基于标准品中DNA的总量(质量),含有3.5±0.2%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆;
(b2)第二标准品,基于标准品中DNA的总量(质量),含有4-6%的多倍染色体gDNA片段和正常女性血浆。
其中,DNA片段(包括gDNA和正常女性血浆游离DNA)的大小优选均为150-200bp。
应用
本发明标准品产品或检测试剂盒可作为不同二代测序平台,不同实验室间评价二代测序技术检测胎儿染色体异常流程的标准品。
其主要作用是:对体外样本进行检测,或用于诊断妇女是否怀有多倍染色体胎儿,或对不同检测平台的灵敏度进行检测和校准。
具体地,体外的检测方法包括步骤:
(i)将所述的样本与本发明第一方面任一所述标准品产品中的标准品分别进行二代高通量测序;
(ii)将(i)中所获得的测序结果与本发明第一方面任一所述标准品产品中的标准品进行比较,计算测试样本中多条常染色体的测序序列总数nj,则待测样本每条染色体的相对百分数为Ri,j,计算Z值,
其中,当第一标准品检出率高于50%(较佳地≥60%,更佳地≥80%)时,当样本和标准品产品中第一、第二和第三标准品的检测结果均为Z值>3时,则判定检测结果为阳性,表明所述的样品为含有源自多倍染色体的核酸的样品,而当当样本和标准品产品中第一、第二和第三标准品的检测结果均为Z值≤3时,则判定检测结果为阴性;
并且当第一标准品检出率<50%时,则表明该平台及实验方法灵敏度不足以满足检测含有源自多倍染色体的核酸的样品。
Z值(Z-score)
本发明数据采用Z检验进行数据标准化统计,而Z检验中的Z值计算方法可以根据本领域常规的Z值计算方法来获知。通常,可以计算测试样本中多条常染色体的测序序列总数nj,则待测样本每条染色体的相对百分数为Ri,j,其中:Ri,j=ri,j/nj,
染色体数目异常判定:
令Z-score服从标准正态分布,取0.001与0.999处的分位点(即-3与3)作为判定染色体数目异常的阈值。当某条染色体Z-score大于3时为该染色体数目增加,当Z-score小于-3时,为染色体数目减少。
诊断方法包括步骤:
(A)提供所述怀孕妇女的血液样本,利用两步离心法分离出血浆进而提取血浆中游离的DNA,并进行二代高通量测序;
(B)将(A)中的测序结果与本发明第一方面任一所述标准品产品中的标准品比较,从而判断所述怀孕妇女是否怀有多倍染色体胎儿;
其中,当第一标准品检出率高于50%(较佳地≥60%,更佳地≥80%)时,当样本和标准品产品中第一、第二和第三标准品的检测结果均为Z值>3时,则判定检测结果为阳性,表明所述的样品为含有源自多倍染色体的核酸的样品,而当当样本和标准品产品中第一、第二和第三标准品的检测结果均为Z值≤3时,则判定检测结果为阴性。
本发明有益效果
本发明通过往正常女性血浆中加入三体gDNA,通过筛选DNA片段大小、模拟不同胎儿浓度的血浆样本,从而获得了通用于多种高通量测序检测平台的标准通用品。方法操作简单、材料来源丰富,便于大批量制备,所获得的结果灵敏度和特异性均为100%。
具体地,本发明标准品的优点如下:
1)配置的原料取材方便,易获得;2)配置的方法简单,易操作;3)配置的标准品稳定性好,重复性高;4)需使用于多个平台,需求量大;5)可保存较长时间,不易变质;6)尽可能与真实血浆样本性质相似,比如片段大小、样本类型、总量等;7)包含阳性标准品、阴性标准品、最低检测限等类型标准品。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
1.标准品的配制
标准品配制流程见图1,详细配制步骤如下:
1.1三体gDNA样本获取
1.1.1样本gDNA提取
本步骤可通过常规购买三体细胞系的gDNA,也可制备如下:分别选取已知核型结果的T21、T18、T13细胞系,以及已经知道核型结果的微缺失微重复细胞系,使用Qiagen DNAprep kit,提取基因组DNA(gDNA)
1.1.2样品打断及纯化
本步骤可通过常规方法进行,优选地,步骤如下:
1)将1-10μg步骤1.1.1提取到的gDNA样品打断至主带为100bp-250bp。
2)打断后三体样本gDNA的片段选择及浓度测定
a.使用Agencourt AMPure XP beads进行片段选择,使用前将磁珠置于室温下平衡30min;
b.将100μL打断后的DNA转入1.5mL的不黏管中,加入120μL的磁珠,吹打混匀;
c.室温下静置5min;
d.将不黏管置于磁力架上至液体澄清;
e.将上清转移至一个新的装有30μL磁珠的1.5mL的EP管中,吹打混匀。
g.室温下静置10min;
h.将EP管放到磁力架上至液体澄清。
i.弃上清,加入500μL 75%的乙醇洗涤磁珠表面。
j除去乙醇。
k重复步骤i-j。
l.尽量完全去除乙醇,并将磁珠置于37℃干燥直至乙醇完全挥发;
m.加入32μL TE,吹打混匀。室温静置10min以使DNA完全从磁珠上洗脱下来。
n.将EP管放到磁力架上至液体澄清。
o.将上清转入一个新的EP管中。
1.2血浆样本准备
征集>100名正常健康女性,充分知情同意后采集一定体积的外周血样本于EDTA抗凝管中,轻微颠倒混匀后,按以下两步离心法分离血浆样本,具体步骤如下:
将低温低速冷冻离心机的温度设定在4℃,1600g条件下,将采血管放入,离心10min,完成后小心将上清(黄色血浆)分离到预冷的2.0mL离心管中(避免吸到中层的白细胞及其他细胞);将低温高速冷冻离心机的温度设定在4℃,16000g条件下,将2.0mL离心管放入,离心10min,将上清转入新的50mL离心管中(不要吸到管底的细胞沉积物)。
按照以上操作将多个健康女性的血浆样本混合至已灭菌烘干的5L塑料瓶中颠倒混匀,排除个体血液成分如血浆蛋白、血脂、血糖等的影响,配制成正常健康女性血浆混合物。将血浆混合物分装至若干个50mL的离心管中;
1.3血浆DNA的定量
从50mL离心管中取200μL血浆至2mL离心管中,按照以下步骤提取血浆DNA,并进行游离DNA总量测定;
本步骤可以采用其他的可用于提取血浆游离DNA的试剂盒替代。
优选利用SnoMagTMCirculating DNA kit提取血浆样本DNA,操作步骤如下:
1)从﹣80℃冰箱中取出样品,置于室温下溶解,同时将提取磁珠从4℃冰箱取出室温平衡30min,充分振荡混匀。
2)向200μL血浆中加入600μL的LSB缓冲液和20μL磁珠,充分吹打混匀,静置10min(在10min的结合过程中,每隔3-4min振荡一次以上混合液);
3)将样本管置于磁力架上1min至溶液澄清,弃上清;
4)将样本管从磁力架上取下,加入150μL WA吹打混匀;
5)将样本管置于磁力架上1min至溶液澄清,弃上清;
6)向样本管中加入150μL 75%乙醇,吹打清洗3次,弃上清;
7)重复操作步骤6)一次;
8)室温静置5min至磁珠干燥;
9)向样本管中加入21μL 1×TE缓冲液,充分吹打混匀,静置5min;
10)将样本管置于磁力架上1min至溶液澄清,将上清转入新的1.5mL EP管中。
1.4计算向正常女性血浆中加入片段化DNA的体积
使用BMG酶标仪通过picogreen染料对片段选择后的三体gDNA以及提取的血浆DNA进行定量。
根据公式A/(A+B)=C,其中A为需要加入到一定体积血浆中的三体DNA总量,B为相应体积血浆DNA总量,C为最终模拟的三体DNA的浓度。按照模拟的不同胎儿浓度加入相应的打断纯化后的三体DNA。
1.5标准品的配制及分装
配制成相应浓度的血浆混合物后取600μL分装至2mL EP管中。阴性样本血浆无需加入任何gDNA,直接分装即可。
2.标准品在不同测序平台上文库制备、测序、信息分析
2.1标准品在Illumina Hiseq2000、LifeTech Proton、Complete GenomicsBlackbird平台上的建库、上机
分别按照三个不同测序平台提供的文库构建操作说明书进行文库构建、测序。
2.2.数据分析
通过对测序得到的序列,对样本的染色体数目进行分析,其流程如图2所示,详细步骤如下:
a)将测序获得的数据比对到人类参考基因组,去除比对不上的序列、比对到多个位置的序列、重复比对的序列,获得唯一比对的序列。统计参考唯一比对序列的数目,将人类参考基因组序列按染色体进行划分,统计落在每个染色体上的实际测序序列数ri,j,其中下标i和j分别代表染色体编号和样本编号;
b)数据标准化:计算测试样本中多条常染色体的测序序列总数nj,则待测样本每条染色体的相对百分数为Ri,j,其中:Ri,j=ri,j/nj。
c)Z-score统计:
d)染色体数目异常判定:
令Z-score服从标准正态分布,取0.001与0.999处的分位点(即-3与3)作为判定染色体数目异常的阈值。当某条染色体Z-score大于3时为该染色体数目增加,当Z-score小于-3时,为染色体数目减少。
实施例1不同大小三体DNA片段对标准品的影响
本实施例模拟了当胎儿浓度为10%时,3种T21的gDNA打断片段大小(100-150bp,150-200bp,200-250bp)对配制的模拟胎儿染色体数目异常血浆样品的影响。
结果见表1,结果可见,由3种片段大小的DNA配制的血浆样品均能检测出胎儿染色体数目异常,对比数据,当选择片段大小为150-200bp时,三个平台测试的Z值均能稳定在3.50以上且150-200bp为血浆中游离DNA的片段分布大小的真实情况,综合上述考虑,优先选择片段大小为150-200bp的三体gDNA打断纯化后DNA与正常女性血浆混合以配制标准品。
表1
实施例2不同多倍染色体浓度对标准品检测准确性的影响
根据已有报道的三倍体占母体血浆游离DNA浓度百分比(3-20%),利用通用方法,本实施例模拟了胎儿浓度为1%、2%、3%、3.5%、4%、5%、7%、10%、12%等9个浓度梯度的T21血浆样品,以选择最适合的梯度作为标准品。
结果可见表2,结合测序及信息分析结果,可见在3.5%左右时,21号染色体的Z值出现了临界值,因此可以选择3.5%左右作为最低检测浓度值;而当浓度为4%以上时,Z值即可表现出较稳定的检出率;当胎儿浓度为10%时,3个平台检出率均为100%,设胎儿浓度10%的模拟血浆样品为要求检出浓度的标准品。因此,这三个浓度梯度可以使是最适合的3个浓度梯度。
表2
实施例3不同浓度的三体染色体以及其他染色体的样本检测
方法与实施例2相同,对不同浓度13三体、18三体,以及3、4、7、8、9、10、11、12、14、15、16、22三体(10%)的染色体样本进行了检测验证。结果见表3。
表3
结果可见:
1)模拟浓度为10%的T21、T18、T13标准品在3个不同平台Blackbird、Hiseq2000、Proton上21、18、13号染色体上统计学检验计算的Z值均大于3,其他染色体上检验Z值均小于3,符合10%浓度下阳性标准品要求;
2)模拟浓度为5%的T21、T18、T13标准品在3个不同平台Blackbird、Hiseq2000、Proton上21、18、13号染色体上统计学检验计算的Z值均大于3,其他染色体上检验Z值均小于3,符合5%浓度下阳性标准品要求;
3)模拟浓度为10%浓度的其他染色体三体或单体标准品在3个不同平台Blackbird、Hiseq2000、Proton上相对应染色体上的统计检验Z值均大于3,满足其他染色体阳性10%浓度下标准品要求;
4)模拟浓度为3.5%的21三体、18三体、13三体样本的Z值3个不同平台Blackbird、Hiseq2000、Proton上有不同,其中在Blackbird上90%的阳性标准品的统计检验Z值均大于3,在Hiseq2000上仅有30.8%比例阳性标准品检验Z值大于3,在Proton仅有17.9%比例阳性标准品检验Z值大于3,符合最低检出限的标准品要求。
实施例4阴性对照的检测
实施例4采用了15份正常女性血浆作为阴性样本来进行阴性对照验证,真实的阴性孕妇血浆样本在1~22号、X和Y染色体上的统计检验Z值均小于3,即没有染色体非整倍体异常,没有假阳性出现,符合阴性标准品要求。结果可见表4
表4
结果可见,阴性对照的统计检验Z值均小于3,没有假阳性出现,符合阴性标准品要求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。