CN107641648A - 一种用于检测染色体畸变的标准品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于染色体畸变检测的标准品及其制备方法。本发明的用于染色体畸变检测的标准品包括不同正常个体的基因组DNA；个体的数量至少为10个，优选为30个。本发明的标准品具有诸多优势：1)本标准品数据稳定性好，可以排除标准品中个别样本特定染色体区域发生变异时对标准品整体标准化效果的影响，提高数据准确性；2)本标准品可在多种检测技术的不同应用领域中使用，兼容性强，适用范围广；3)本标准品制备方法简单，只需要将不同个体DNA等质量混合即可；4)本标准品成本低廉；5)不同批次间混合DNA可以是不同个体的，对标准品最终的质量无影响；6)在本标准品的基础上，可以进行特定染色体畸变的阳性标准品的配制。

Description

一种用于检测染色体畸变的标准品及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测染色体畸变的标准品及其制备方法。

背景技术

随着基因组学的不断发展，人类对基因与健康的研究越来越深入，并且已经把基因组学的相关知识与技术应用到了临床实践中，比如胚胎植入前筛查(PGS)、无创产前筛查(NIPT)、产前诊断、肿瘤变异检测及个人基因组检测等。基因检测的目的主要是检测某个个体是否携带有一些临床意义明确的基因变异，基因变异主要分为三大类，即单核苷酸变异(SNV)、插入缺失变异(InDel，<50bp)和染色体畸变(chromosomal aberration)。其中，染色体畸变主要包括缺失(deletion)、重复(duplication)、倒位(inversion)和易位(translocation)等染色体结构变异和染色体数目变异。由于染色体畸变会同时导致较多的基因表达异常，因此，该种变异可对人体的健康产生较为严重的威胁。染色体畸变与不孕不育、胎儿发育异常、出生缺陷和肿瘤发生发展相关。

目前已经涌现出多种基因检测技术可以应用于染色体畸变的检测，比如高通量测序技术(NGS)、荧光定量PCR技术(QPCR)、BACs-on-Beads技术(BoBs)、比较基因组杂交技术(CGH)、染色体芯片分析(CMA)、荧光原位杂交技术(FISH)和多重连接探针扩增技术(MLPA)等。为了保证检测结果的准确性，几乎所有的染色体畸变检测技术均需要选择一种野生型的DNA作为标准品，尤其是临床常用的QPCR与CGH技术。

目前常用的标准品是选择一例表型正常的样本进行DNA提取后制备而成，存在诸多不足，包括：1)标准品中存在某些区域发生突变，不适合全基因组范围的染色体畸变检测。最新的研究表明，即使表型正常的健康人，每个人的基因组中平均存在有5％的区域发生了染色体畸变(参考文献PMID:28705883)，即如果采用这些看似正常但实际上携带有染色体畸变的样本DNA作为标准品，会导致待检测样本结果出现假阳性或假阴性结果。2)标准品制作成本高，不适合大样本量的基因检测。有些单位会采用某些染色体区域的基因型确定为野生型的DNA样本作为对照，但是该种标准品由于数量有限，不适合长期或大批量样本的基因检测。3)标准品来源不稳定，影响标准品的效果。有些单位为了获得持续稳定的DNA标准品，会使用永生化的细胞系进行体外培养的方式制作标准品，但是由于体外培养细胞的传代次数较多，DNA复制的次数远远多于正常体细胞，每次DNA复制会有一定量的错误并且不断积累，最终导致该种DNA标准品的组成发生变化，失去作为标准品的能力。

发明内容

本发明要解决现有技术中的染色体畸变检测技术中应用的标准品制作成本较高、来源不稳定、不适合全基因组范围内基因检测的问题。为了解决上述技术问题，本发明经过大量实验筛选与反复测试，提供了一种可以用于检测染色体畸变的标准品及其制备方法。

本发明提供的用于检测染色体畸变的标准品(记作标准品甲)包括不同正常个体的基因组DNA。本发明提供的上述标准品甲的制备方法是将不同个体的基因组DNA混匀得到的。

上述标准品甲或方法中，所述个体的数量至少为10个，所述个体的数量优选为至少30个，个体的数量越多，标准品的标准化效果越好，稳定性越好。

上述标准品甲或方法中，所述标准品甲中的每个个体的基因组DNA的质量相同。不同个体的基因组DNA等质量混匀，误差不超过±10％，每个个体的基因组DNA浓度不低于检测技术对标准品的浓度要求。在实际应用中，每个不同个体的基因组DNA在混匀前务必用相同溶剂进行溶解，然后再将不同个体的基因组DNA溶液混匀。

上述标准品甲或方法中，所述基因组DNA来源于正常个体的基因组DNA，所述正常个体的基因组DNA可以是随机的，可以使用来源于不同组织或体液的样本，为了防止微生物基因组的污染，优先选择表型正常的个体的全血DNA或者细胞系DNA。如果需要检测性染色体X或Y的结构变异，则需要按照性别分别配制标准品。

上述标准品甲或方法中，所述基因组DNA可以采用任何提取方法获得的DNA样本，优选使用与待检测DNA相同的提取方法。

上述标准品甲或方法中，所述基因组DNA可以采用任何提取方法获得的DNA样本，优选使用与待检测DNA相同的提取方法。

本发明还提供了一种用于检测染色体畸变的标准品(记作标准品乙)。

本发明提供的用于检测染色体畸变的标准品乙包括上述标准品甲和染色体畸变的基因组DNA。所述染色体畸变的基因组DNA来源于染色体畸变的个体的基因组DNA或人工合成的染色体畸变的DNA(Spike-in controls)。上述标准品乙的制备方法包括将上述标准品甲和染色体畸变的基因组DNA或人工合成的染色体畸变的DNA混匀的步骤。上述标准品乙的制备方法也属于本发明的保护范围。

本发明的标准品甲可以直接用于或经其它处理后用于QPCR、CGH、CMA、MLPA、NGS、BoBs等技术，一般作为阴性对照(染色体畸变基因型为野生型的基因组DNA)的标准品。也可以在标准品甲的基础上，按照所需比例，选择特定染色体畸变的DNA样本或人工合成的染色体畸变的DNA进行混合，配制出不同阳性对照的标准品乙，经配制得到的标准品乙也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种成套标准品。

本发明提供的成套标准品由上述标准品甲和上述标准品乙组成。

本发明最后提供了上述标准品甲或上述标准品乙或上述成套标准品的新用途。

本发明提供了上述标准品甲或上述标准品乙或上述成套标准品在检测染色体畸变中的应用。

本发明还提供了上述标准品甲或上述标准品乙或上述成套标准品在制备检测染色体畸变的产品中的应用。

本发明还提供了上述标准品甲或上述标准品乙或上述成套标准品在作为对照品或参考品或参照品或质控品中的应用。

本发明还提供了上述标准品甲或其处理后的物质作为阴性对照标准品在QPCR、CGH、CMA、MLPA、NGS或BoBs中的应用。

本发明还提供了上述标准品乙或其处理后的物质作为阳性对照标准品在QPCR、CGH、CMA、MLPA、NGS或BoBs中的应用。

本发明还提供了上述成套标准品作为对照标准品在QPCR、CGH、CMA、MLPA、NGS或BoBs中的应用。

上述染色体畸变包括但不限于染色体缺失或重复，所有的染色体畸变均属于本发明的保护范围，包括染色体易位、倒位和数目变异等。

本发明制备的标准品不仅可以用于人相关的染色体畸变检测，也可以应用于其它动植物物种。

本发明提供的标准品及其制备方法具有诸多优势：1)本标准品的数据稳定性好，可以排除标准品中个别样本特定染色体区域发生变异时对标准品整体标准化效果的影响，提高数据的准确性；2)本标准品可以在多种检测技术的不同应用领域中使用，兼容性强，适用范围广；3)本标准品的配制方法简单，只需要对不同个体DNA进行等质量混合操作即可；4)本标准品成本低廉，可以使用之前已经完成检测的DNA剩余样本进行配制；5)不同批次间混合DNA可以是不同个体的，对标准品最终的质量无影响；6)在本标准品的基础上，可以进行特定染色体畸变的阳性标准品的配制。

附图说明

图1为不同基因型样本作为标准品的标准化效果。

图2为含有突变型样本的标准品的理论标准化效果。

图3为含有突变型样本的标准品的实际标准化效果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、含有突变型样本的标准品的理论标准化效果

一、一例突变型样本作为标准品

1、标准品的制备

将一个某段染色体结构正常的样本记作野生型样本，其基因型记作野生型；将野生型样本两条同源染色体中的一条染色体发生缺失的样本记作杂合缺失样本，其基因型记作杂合缺失型；将野生型样本两条同源染色体均发生缺失的样本记作纯合缺失样本，其基因型记作纯合缺失型；将野生型样本两条同源染色体中的一条染色体发生重复的样本记作杂合重复1次样本，其基因型记作杂合重复1次型；将野生型样本两条同源染色体均发生重复的样本记作纯合重复1次样本，其基因型记作纯合重复1次型。由于人是二倍体，某些染色体区域发生重复或缺失的时候，会导致剂量增加或减少，那么如果定义正常人某个染色体区域的含量为1，则发生杂合缺失、纯合缺失、杂合重复1次和纯合重复各1次的该染色体区域含量分别是0.5、0、1.5和2.0。即野生型样本含量记作1，杂合缺失样本、纯合缺失样本、杂合重复1次样本和纯合重复1次样本的含量分别记作0.5、0、1.5和2.0。

分别以野生型样本(基因型为野生型)、杂合缺失样本(基因型为杂合缺失型)、杂合重复1次样本(基因型为杂合重复1次型)、纯合重复1次样本(基因型为纯合重复1次型)作为标准品。

2、标准化效果检测

以野生型样本作为待测样本进行标准化，即将一个某段染色体结构正常的野生型样本作为分子，分别将步骤1中的标准品作为分母，计算标准化值。标准化值＝待测样本含量/标准品含量。标准化值越接近于1.0，则标准化效果越好。

用1个突变型样本作为标准品的标准化效果如图1所示。若将野生型样本作为标准品，即分母，则标准化值为1.0，符合预期；若标准品发生了缺失或重复的变异，则标准化值偏离1.0，不能作为标准品发挥作用。在对一个野生型样本进行标准化时，野生型的标准品能够得出正常结果，而纯合缺失的样本无法得出标准化结果，杂合缺失的标准品会导致出现假阳性纯合重复的错误，杂合重复1次的标准品会导致结果处于灰区，纯合重复1次的标准品会导致出现假阳性杂合缺失的错误。

二、含有突变型样本的混合样本作为标准品

1、标准品的制备

分别将1个突变型样本与如下不同数量：0个、1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个、20个、30个、40个、50个的野生型样本混合，分别得到不同的混合样本。突变型样本分别为杂合缺失样本、纯合缺失样本、杂合重复1次样本和纯合重复1次样本。每个混合样本的终浓度均相同，每个混合样本中的各个样本的DNA质量相同。分别将不同的混合样本作为标准品。

2、理论标准化效果检测

以野生型样本作为待测样本进行标准化，即将一个某段染色体结构正常的野生型样本作为分子，分别将步骤1中的标准品作为分母，计算标准化值。标准化值＝待测样本含量/标准品含量。标准化值越接近于1.0，则标准化效果越好。

用1例突变型样本与不同数目的野生型样本等量混合作为标准品的理论标准化效果如图2所示。若采用缺失型样本(杂合缺失和纯合缺失)作为标准品，会导致标准化值大于1.0；若采用重复型样本(杂合重复和纯合重复)作为标准品，会导致标准化值小于1.0，说明杂合缺失样本和杂合重复1次样本对混合样本的标准化效果影响程度要小于纯合缺失样本和纯合重复1次样本。但随着混合样本数的增加，突变型样本所占比例越来越少，标准化值越接近1.0，即混入的突变样本对整体混合DNA的标准化效果影响会越来越小。当混合样本数大于10时，标准化值在1.0±0.1之间，小于常规检测技术的系统性误差。目前大多数的染色体畸变检测技术均不会达到±0.1倍的差异检测灵敏度，因此即使该种混合物中某个个体的DNA产生了染色体畸变，也不会影响到最终的检测结果。因此，采用该种方法制作标准品时，混合样本数的下限为10，优选30，样本数越多，标准化效果越好。

实施例2、含有突变型样本的标准品的实际标准化效果

一、杂合缺失突变检测

1、标准品的制备

分别将1例男性样本(XY)的DNA溶液与如下不同数量：0个、1个、4个、9个、19个、39个的女性样本(XX)的DNA溶液等量混匀，得到不同比例的混合样本。每个样本来源为表型正常的志愿者全血样本，不同数量的女性样本的DNA来源于不同女性个体。每个样本的DNA溶液是将样本的基因组DNA与双蒸水混匀得到的，每个混合样本中的各个样本的DNA质量相同，每个混合样本的终浓度均相同(终浓度均为25ng/μL)。分别将不同比例的混合样本作为杂合缺失突变(X染色体缺失)检测的标准品。

2、实际标准化效果检测

以X性染色体作为测试目标，X染色体中TAF1基因正常的女性样本作为待测样本，分别以步骤1中的标准品作为对照品；对X染色体TAF1基因进行QPCR检测，ACTB基因作为内参，得到待测样本和各个标准品中TAF1基因的相对表达量。分别计算标准化值，并对数据标准化后作图。标准化值＝待测样本中TAF1基因的相对表达量/标准品中TAF1基因的相对表达量。引物序列如下：

TAF1-F：CGATTTGCTGCTGCGGAC；

TAF1-R：AATCTTCGTCGCTGTCCGTG；

ACTB-F：GATGTGGATCAGCAAGCAGGAG；

ACTB-R：AAAGGGTGTAACGCAACTAAGTCAT。

二、纯合重复突变检测

1、标准品的制备

分别将1例女性样本(XX)的DNA与如下不同数目：0个、1个、4个、9个、19个、39个的男性样本(XY)的DNA混匀，得到不同比例的混合样本。每个样本来源为表型正常的志愿者全血样本，不同数量的男性样本的DNA来源于不同男性个体。每个混合样本的终浓度均相同，每个混合样本中的各个样本的DNA质量相同。分别将不同比例的混合样本作为纯合缺失突变(X染色体缺失)检测的标准品。

2、实际标准化效果检测

以X性染色体作为测试目标，X染色体中TAF1基因正常的女性样本作为待测样本，分别以步骤1中的标准品作为对照品；对X染色体TAF1基因进行QPCR检测，ACTB基因作为内参，得到待测样本和各个标准品中TAF1基因的相对表达量。分别计算标准化值，并对数据标准化后作图。标准化值＝待测样本中TAF1基因的相对表达量/标准品中TAF1基因的相对表达量。

结果如图3所示。从图中可以看出：随着混入标准品中的样本数的增加，标准品的标准化值越接近于1.0，标准化效果越好。TAF1基因在步骤一中的作用如下：它是X染色体上的一段序列，在杂合缺失突变检测中，它作为缺失的模型，即采用一个男性样本(XY，只有1条X染色体，只有1个TAF1基因的拷贝)混入不同数量的女性样本(XX，有2条X染色体，存在2个TAF1基因的拷贝)；而TAF1基因在步骤二中的作用如下：在纯合重复突变检测中，TAF1基因作为重复的模型，即一个女性样本(XX，有2条X染色体，存在2个TAF1基因的拷贝)混入不同数量的男性样本(XY，只有1条X染色体，只有1个TAF1基因的拷贝)中。

Claims (10)

1.一种用于检测染色体畸变的标准品，其包括不同正常个体的基因组DNA；

所述个体的数量至少为10个。

2.根据权利要求1所述的标准品，其特征在于：所述个体数量至少为30个。

3.根据权利要求1或2所述的标准品，其特征在于：所述标准品中的每个个体的基因组DNA的质量相同。

4.权利要求1-3中任一所述的标准品的制备方法，是将不同正常个体的基因组DNA混匀得到的；

所述个体的数量至少为10个。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述个体数量为30个。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述标准品中的每个个体的基因组DNA的质量相同。

7.一种用于检测染色体畸变的标准品，其包括权利要求1-3中任一所述的标准品或权利要求4-6任一所述的方法制备得到的标准品和染色体畸变的基因组DNA。

8.权利要求7所述的标准品的制备方法，包括将权利要求1-3中任一所述的标准品或权利要求4-6任一所述的方法制备得到的标准品和染色体畸变的基因组DNA或人工合成的染色体畸变的DNA混匀的步骤。

9.成套标准品，其由权利要求1-3中任一所述的标准品或权利要求4-6任一所述的方法制备得到的标准品与权利要求7所述的标准品或权利要求8所述的方法制备得到的标准品组成。

10.权利要求1-3中任一所述的标准品或权利要求4-6任一所述的方法制备得到的标准品或权利要求7所述的标准品或权利要求8所述的方法制备得到的标准品或权利要求9所述的成套标准品在检测染色体畸变中的应用；

或，权利要求1-3中任一所述的标准品或权利要求4-6任一所述的方法制备得到的标准品或权利要求7所述的标准品或权利要求8所述的方法制备得到的标准品或权利要求9所述的成套标准品在制备检测染色体畸变的产品中的应用；

或，权利要求1-3中任一所述的标准品或权利要求4-6任一所述的方法制备得到的标准品或权利要求7所述的标准品或权利要求8所述的方法制备得到的标准品在作为对照品或参考品或参照品或质控品中的应用；

或，权利要求1-3中任一所述的标准品或权利要求4-6任一所述的方法制备得到的标准品或其处理后的物质作为阴性对照标准品在QPCR、CGH、CMA、MLPA、NGS或BoBs中的应用；

或，权利要求7所述的标准品或权利要求8所述的方法制备得到的标准品或其处理后的物质作为阳性对照标准品在QPCR、CGH、CMA、MLPA、NGS或BoBs中的应用；

或，权利要求9所述的成套标准品或其处理后的物质作为对照标准品在QPCR、CGH、CMA、MLPA、NGS或BoBs中的应用。